JPH0254079B2 - - Google Patents

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JPH0254079B2
JPH0254079B2 JP60074563A JP7456385A JPH0254079B2 JP H0254079 B2 JPH0254079 B2 JP H0254079B2 JP 60074563 A JP60074563 A JP 60074563A JP 7456385 A JP7456385 A JP 7456385A JP H0254079 B2 JPH0254079 B2 JP H0254079B2
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buffer
oxidase
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peroxidase
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Zaideru Hansu
Rangu Guntaa
Reedaa Aruberuto
Tsuiigenhorun Yoahimu
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一定のグリセリンオキシダーゼを用い
てグリセリンを酵素的に測定するための試薬に関
する。
トリグリセリド（長鎖脂肪酸のグリセリンエス
テル）の測定は医学的診断学にとつて非常に重要
である。血中の上昇したトリグリセリド含量は動
脈硬化症の主要な危険因子である。高いトリグリ
セリド値、すなわち高トリグリセリド症の場合、
低いトリグリセリド値におけるより冠状動脈不全
及び心臓硬塞がしばしば起こる。高トリグリセリ
ド症により動脈硬化症及び冠状動脈症にかかりや
すくなるので、これを早期に発見し、ちようどよ
い時期に治療を開始しなければならない。従つ
て、迅速で信頼のできるトリグリセリドもしくは
グリセリンの測定法は大きな意義を有する。
使用可能な公知のトリグリセリド測定法はリパ
ーゼ及びエステラーゼを用いてのトリグリセリド
の酵素的加水分解及び例えばグリセロキナーゼ及
びピルビン酸キナーゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼ
を用いての又はグリセリンオキシダーゼを用いて
の遊離グリセリン測定を基礎とする（西ドイツ国
特許公告第2817087号公報）。
しかしながら、この公知法は大きな欠点を示
す。すなわち、グリセロキナーゼ法においてのこ
の試薬の安定性は多くの不安定な補酵素及び酵素
が存在するので僅かであり、常に試料の空値測定
を実施しなければならない。公知のグリセリンオ
キシダーゼ法においては、この酵素がこれを含有
する公知の微生物中に全くわずかにしか存在せ
ず、更に30U／mg程度の低い比活性を示すという
重要な欠点がある。
従つて、本発明の課題は従来公知のグリセリン
オキシダーゼ法の欠点を示さず、かつその利点を
保持するようなトリグリセリドもしくはグリセリ
ンの測定試薬をみいだすことである。この課題は
特許請求の範囲に記載したグリセリンの測定試薬
により解決する。
本発明は公知のグリセリンオキシダーゼ含有微
生物に比較して約数10倍高いグリセリンオキシダ
ーゼ含量を示すだけでなく、更に非常に高い比活
性を有するグリセリンオキシダーゼをを含有する
微生物アスペルギルスspec.BMTU1997―１
（DSM1729）の意想外な発見に基づく。
本発明の試薬を用いる方法では、自体公知の方
法により酸素消費量又は生じたH2O2を測定する
ことが出来る。酸素消費量は酸素電極を用いてポ
ラロメトリーにより測定するのが有利である。そ
れというのもこの方法が特に自動操作に好適であ
るためである。これに関して西ドイツ国特許公開
第2130340号、同第2130308号公報に記載された水
性媒体中の酸素消費量のポラロメトリー測定法が
好適である。他の好適な方法はガスクロマトグラ
フイーである。
形成されたH2O2は滴定法によつても、ポテン
シオメトリー、ポーラログラフイー及び比色定量
法並びに酵素法によつても測定できる。カタラー
ゼ及びペルオキシダーゼを使用しての酵素法は有
利である。それというのもこれは非常に特異的で
あり、かつ信頼出来るものであるだけでなく、過
酸化水素を形成する主反応と最も簡単な方法で組
合わせることができる。特にβ―ジケトン、例え
ばアセチルアセトン及びメタノールもしくはエタ
ノール又はメチレングリコールの存在下でのカタ
ラーゼを用いての測定並びに１個以上の色原体の
存在下でのペルオキシダーゼを用いての測定が好
適であることが判明する。カタラーゼ、アセチル
アセトン及びメタノールを用いての測定におい
て、メタノールはアセチルアセトンと共に呈色反
応を起こすホルムアルデヒドに酸化され、これを
測定することができる。ペルオキシダーゼを用い
て測定を行なう場合、反応後、測光法により測定
することができる化合物を色原体として使用す
る。
好適な色原体の例は２，2′―アミノベンズチア
ゾリン―スルホン酸である。他の有利な例はトリ
ンダー（Trinder）による指示薬システムであり
（Ann.Clin.Biochem.第６巻（1969年）、第24〜27
頁）、ここではフエノールを４―アミノアンチピ
リン（４―AAp）とペルオキシダーゼ（POD）
の存在下に、H2O2の作用下に酸化的に結合させ
色素とする。フエノールのかわりにフエノール誘
導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール
誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導
体、アミノキノリン、ヒドロキシキノリン、ジヒ
ドロキシフエニル酢酸及び同じように反応する物
質を使用することができる。４―アミノアンチピ
リンの代わりに４―アミノアンチピリン誘導体、
フエニレンジアミンスルホン酸、MBTH（メチル
ベンゾチアゾロンヒドラゾン）、Ｓ―MBTH（ス
ルホン化メチルベンゾチアゾロンヒドラゾン）、
MBTH誘導体、Ｓ―MBTH誘導体並びに同様に
反応する物質を使用することができる。
本発明の課題はグリセリンの測定試薬であり、
これはアスペルギルスspec.BMTU1997―１
（DSM1729）からのグリセリンオキシダーゼ及び
H2O2の測定システムから成る。有利にこの試薬
はエステル化グリセリンの鹸化のための付加的な
薬剤、特にリパーゼ及びエステラーゼ又はエステ
ラーゼを含有する。このために好適な試薬は専門
家に公知であり、ここで更に詳細に説明する必要
はない。
有利な実施形式によれば、本発明による試薬は
主にグリセリンオキシダーゼ、カタラーゼ、アセ
チルアセトン、メタノール及び緩衝剤から、個別
に又は混合してなる。もう１つの有利な実施形式
は主にグリセリンオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ、少なくとも１種の色原体及び緩衝剤から、個
別に又は混合してなる。グリセリンオキシダーゼ
とは以下常にアスペルギルスspec.BMTU1997―
１（DSM1729）からのグリセリンオキシダーゼの
ことを示す。色指示システムはトリンダーによる
システムが有利である。
前記の有利な試薬組成物は前記の必須成分の他
に付加的に常用の溶剤、安定剤又は／及び界面活
性物質を含有してよい。これら添加物すべては専
門家に公知であり、過酸化水素のための検出シス
テムにおいて常用である。緩衝剤としてはPH５〜
10、有利にPH６〜９を緩衝する物質が好適であ
る。好適な緩衝剤の典型的な例は燐酸塩緩衝剤、
トリス―緩衝剤、TRM―緩衝剤、酢酸塩緩衝
剤、クエン酸塩緩衝剤及びHepes―緩衝剤（Ｎ―
２―ヒドロキシエチルピペラジン―Ｎ―エタン―
スルホン酸）である。
前記の試薬配合物は次の量比で主なる成分を含
有する： グリセリンオキシダーゼ ２〜150U／ml、 ペルオキシダーゼ 0.5〜100U／ml、 少なくとも１種の色原体0.05〜20ミリモル／、 並びに 少なくとも１種の界面活性剤0.001〜0.1ｇ／ml、 緩衝剤 PH６〜９。
動力学的測定のために試薬配合物を使用すべき
場合、次の量比が有利である： グリセリンオキシダーゼ 100〜250KU／、 ペルオキシダーゼ ５〜50KU／、 色原体 0.2〜５ミリモル／ 及び場合により 少なくとも１種の界面活性剤 １〜５ｇ／ 又はこれらの数倍量、及び緩衝剤 PH6.8〜8.0 グリセリンオキシダーゼを獲得するために使用
した微生物アスペルギルスspec.BMTU1997―１
（DSM1729）の培養は主成分としてグリセリン、
麦芽エキス及び酵母エキス、その他に緩衝剤、塩
及び微量元素を含有する培地を使用して自体公知
法で行なう。予培地としては有利にグリセリン１
〜100ｇ／、麦芽エキス１〜50ｇ／、酵母エ
キス１〜10ｇ／、綿の実粉１〜100ｇ／並び
にK2HPO4・3H2O0.2〜５ｇ／（又は他の
K2HPO4―調剤の当量）、KNO30.2〜５ｇ／、
CaCO30.1〜５ｇ／、NaCl0.1〜１ｇ／、
FeSO40.001〜0.1ｇ／（７水和物として測定）
及びMgSO40.1〜５ｇ／（７水和物として測
定）を有する培地を使用する。
主培地にはグリセリン20〜200ｇ／、麦芽エ
キス５〜100ｇ／、酵母エキス0.5〜５ｇ／、
燐酸一水素カリウム0.2〜５ｇ／、KNO30.2〜
５ｇ／、CaCO30.1〜５ｇ／、NaCl0.1〜１
ｇ／、硫酸第１鉄0.001〜0.1ｇ／及び硫酸マ
グネシウム0.1〜５ｇ／を有する培地を使用す
るのが有利である。個々の塩は前記予培地で記載
したものと相応するものである。
予培地は通気下に25〜40℃の温度で振盪培地と
して行なうのがよい。培養期間は一般に20〜60時
間である。
温度及び培養期間は主培地においても同様であ
る。小さな発酵器中で空気0.5〜１／分／培
地を導入する際特に良好な結果が得られる。
培養終了後、この生物塊を常法で分離し、この
細胞を砕解する。常用の砕解法を使用することが
できるが、機械的に砕解するのが有利である。砕
解溶液から不溶部を例えば遠心分離又は吸引瀘過
することにより除去する。この得られた溶液をそ
のまま直接グリセリン測定に使用することができ
る。しかし更にこの酵素を精製するのが有利であ
る。
精製は酵素分割のために常用の生物学的方法に
より行なうことができる。しかし特に好適である
のは酵素分割において常用されない方法、つまり
トリクロル酢酸での沈殿であることが判明した。
通常、トリクロル酢酸添加は、蛋白質を有さない
溶液にのみ興味がある場合、蛋白質の完全な沈
殿、すなわち蛋白質除去のためのみ行なわれる。
意想外にも、本発明による酵素がトリクロル酢酸
により活性損失なしに、かつ高い濃縮効率で沈殿
するということが判明した。この際、この沈殿
を、PH5.4〜4.6の範囲のPH値までトリクロル酢酸
を添加することにより行なう。分離した沈殿中に
比活性約300U／mgを有する所望の酵素が見い出
された。
更に精製が所望の場合には、アセトン沈殿、引
き続き硫酸アンモニウム分割並びに弱塩基性交換
樹脂での最後の処理により行なうのが有利であ
る。アセトン沈殿の際、この溶液にアセトン0.25
〜0.35容量を加える。硫酸アンモニウム分割を
0.5〜2.0のモル濃度で実施するのが有利である。
この操作はすでに800U／mgよ高い比活性に導び
く。弱塩基性イオン交換樹脂、有利にジエチルア
ミノエタノール基含有網状デキストラン（DEAE
Sephadex）での処理は更に３〜10倍の精製を与
え、約2500〜8000U／mgの比活性を有するグリセ
リンオキシダーゼに導びく。本発明により使用し
た微生物をもちいて、すでに150000〜200000U／
培地の活性が得られるので、この方法でグリセ
リン測定に必要なグリセリンオキシダーゼ量が急
激に減少し、この製造は著しく安くなる。
前記培養法及び精製法は酵素を培養の間培地に
放出しないということを前提とする。しかしなが
ら、界面活性剤の存在下に培養することにより培
地に少なくとも活性の１部が移る。同様に、得ら
れた細胞からの界面活性剤での抽出も可能であ
る。しかしながら、この結果は機械的砕解、例え
ば高圧分散における結果より劣つている。
本発明に使用する酵素は従来公知のグリセリン
オキシダーゼと特に著しく低い分子量により異な
つている。例えば従来グリセリン測定に使用した
グリセリンアルデヒド形成グリセリンオキシダー
ゼが分子量少なくとも300000を示すのに対し、本
発明に使用する酵素はわずか約90000の分子量を
示す。更に、酵素の活性は硫酸銅又は酢酸鉛によ
り抑制されず、一方SH―試薬は阻止する。それ
に反し、前記の公知グリセリンオキシダーゼの場
合はSH―試薬は安定化させ、硫酸銅及び酢酸鉛
は活性を約90％まで抑制する。その他の主な差は
公知の酵素の比活性が約30U／mgであるのに対し
本発明に使用する酵素の比活性は2000〜8000U／
mgであるということである。更に、該酵素の安定
性はPH5.0〜PH10.0で著しくより良好であり、37
℃における10分後の活性はこの条件下でなお50〜
55％を有し、それに対し公知の酵素は６もしくは
３％を示す。
本発明の試薬はすべての種類の水性媒体、例え
ば食品抽出物、体液及び特に血清中のグリセリン
もしくはグリセリンエステル（トリグリセリド）
の測定に好適である。この方法は大きな特異性に
より遊離のグリセリンだけが測定される。先ず第
１に興味のあるエステル化グリセリンの測定は、
この化合物の鹸化により行なわれる。鹸化を酵素
により行なうのが有利である。それというのも、
こうして鹸化を本来のグリセリン測定と同時に行
なうことができる。
本発明において使用した微生物アスペルギルス
spec，BMTU1997―（DSM1729）の培養物につ
いて次の性質を記載する。
サブロー寒天培地上 28℃において発芽後３日 基質菌糸：黄褐色 気中菌糸：明褐色、中心は灰緑色 分生子柄：卵形 胞子 ：球形 温度範囲／サブロー液状培地 10℃：生育なし 23℃：良好な生育 31℃：良好な生育 37℃：弱い生育 PH範囲／サブロー液状培地 PH５〜６〜７〜８：すべてにおいて良好な生育 第２の寒天培地としてのツアペツク・ドツク
ス（Czapec Dox）培地上に急速冷凍保存した
菌から直接接種したところ３日間の範囲におい
て全く生育を見ることができなかつた。
次に実施例につき本発明を詳細に説明する。
例 １ １ 微生物の培養 グリセリン10ｇ／、麦芽エキス10ｇ／、酵
母エキス５ｇ／、綿実粉10ｇ／、K2PO4・
3H2O1.5ｇ／、KNO31ｇ／、CaCO32.0ｇ／
、NaCl0.5ｇ／、FeSO4・7H2O0.01ｇ／、
及びMgSO4・7H2O1.0ｇ／を含有する予培地
60mlをアスペルギルスspec.BMTU1997―１
（DSM1729）の胞子で接種し、30℃で48時間通気
下に振盪する。
このようにして得られた予培地360mlをグリセ
リン100ｇ／、麦芽エキス40ｇ／、酵母エキ
ス2.5ｇ／、K2HPO4・3H2O1.5ｇ／、
KNO31.0ｇ／、CaCO32.0ｇ／、NaCl0.5
ｇ／、FeSO4・7H2O0.01ｇ／及びMgSO4・
7H2O1.0ｇ／を含有する主培地15中に加え
る。600r.p.m.で撹拌し、空気10／分で通気さ
れた25発酵器中で30℃で主培養を行なつた。培
養期間22時間後、活性は174800U／であつた。
活性測定を0.1モルTRA―緩衝剤中、PH８で、温
度25℃でｐ―クロルフエノール及び４―アミノア
ンチピリンを用いて546nmで行なつた。
２ 酵素の精製 前記のようにして得られた乾燥塊100ｇを0.02
モル酢酸塩緩衝剤、PH6.0、５中に懸濁させ高
圧分散により砕解する。引き続き、遠心分離を行
ない、沈殿をすてる。
上澄に0.1モルトリクロル酢酸溶液を加え、PH
値を4.8とする。この沈殿を遠心分離する。これ
は比活性300U／mgを示す。
３ 精密な精製 トリクロル酢酸沈殿による沈殿を0.1モル酢酸
塩緩衝剤、PH6.0、500mlに溶かし、０℃でアセト
ン0.3容量を加える。生じた沈殿を遠心分離し、
新たに0.1モル酢酸塩緩衝剤、PH6.0に溶かす。こ
のようにして得られた酵素溶液に硫酸アンモニウ
ムをモル濃度1.0まで添加する。この沈殿を遠心
分離する。その比活性は約800U／mgである。
この沈殿を新たに硫酸アンモニウム分割におけ
ると同じ緩衝剤中に溶かし、同じ緩衝剤に対し透
析し、次いでDEAE―セフアデツクス
（Sephadex、同じ緩衝剤に対し平衡にする）と混
合し、１時間撹拌する。次いで、交換樹脂を同じ
緩衝剤で洗浄し、0.2モル酢酸塩緩衝剤、PH6.0で
分別溶離する。活性のフラクシヨンを合併する。
このようにして得られた生成物の比活性は個々の
フラクシヨンにおいて2500〜8000U／mgの間であ
る。
例 ２ H2O2―形成を介してのグリセリンの測定；２
種類の試薬を製造する： 試薬１： トリエタノールアミン／HCl―緩衝剤
PH8.0 0.1モル／、 イソトリデシルエーテル
3.6ミリモル／もしくは２ｇ／、 コール酸ナトリウム
4.7ミリモル／もしくは２ｇ／、 ｐ―クロルフエノール 10ミリモル／、 アミノ置換 ４―アミノアンチピリン
0.5ミリモル／、 ペルオキシダーゼ 10U／ml。
試薬２： グリセリンオキシダーゼ 500U／ml。
測定を実施するために試薬１ ２ml試薬２
0.2mlをクベツト中に測り入れる。吸光度E1、を
測定器を用いて546nmで読み取る。引き続き、試
料20μを添加し、反応を開始する。遊離のグリ
セリンを測定するために、試料としてすべての種
類の水性媒体、例えば食品抽出物、体液及び特に
血清を使用することができ、トリグリセリドの測
定のためには鹸化の後、使用することができる。
20分間の反応時間後、吸光度E2を読みとる。
恒温保持温度は25℃である。
評価は、グリセリン標準容液の測定吸光度差△
Ｅ＝E2−E1をグリセリン濃度もしくはトリグリ
セリド濃度に関連させた検量線により行なう（第
２図参照）。
試験配合物中の濃度は次のようである： トリエタノールアミン／HCl―緩衝剤、PH8.0
0.09モル／、 イソトリデシルエーテル
1.8ｇ／、（3.2ミリモル／）、 コール酸ナトリウム 4.3ミリモル／、 ｐ―クロルフエノールアミノ置換４―アミノアン
チピリン 0.45ミリモル／、 ペルオキシダーゼ 9U／ml、 グリセリンオキシダーゼ 45U／ml。
例 ３ 酸素消費量を用いてのグリセリンの測定 第１図に示した装置を使用する。この装置は内
径143mm及び内高220mmを有する透明なプラスチツ
ク製の円筒状の室のかたちの反応容器１からな
る。この室は0.2モルカリウム燐酸緩衝剤、PH6.8
中の沃化カリウム18ミリモル、七モリブデン酸ア
ンモニウム7.5ミリモル、塩化ナトリウム800ミリ
モル及びグリセリンオキシダーゼ50Uの溶液1.8
mlを含有する。反応容器中には、酸素感受性電極
から成るデイテクタ３（WTW：OXI―
Elektrode E016）が突出している。このデイテ
クタは分析器４と結合している（WTW：挿入物
OXI610Dを有するデイジタルメーターDIGI610）。
反応容器１の底には磁気撹拌器５を有する。
充填口６を介してグリセリン含有水溶液20μ
を試料として加える。磁気撹拌器で強力な撹拌下
に溶液の酸素濃度の減少を測定する。観測された
酸素消費量をグリセリン濃度に対して記載する。
例 ４ 動力学的測定 試料： 水性標準液（グリセリン含有量10〜100mg／dl） 試薬： Pipes―緩衝剤0.1モル／、H3BC31.7モル／、
PH＝7.0 イソトリデシルエーテル 3.0ｇ／、 コール酸ナトリウム 3.0ｇ／、 アミノ置換４―アミノアンチピリン
0.5ミリモル／、 ｐ―クロルフエノール 10.0ミリモル／、 ペルオキシダーゼ 10.0KU／、 グリセリンオキシダーゼ 121.0KU／。
ゲムゼクーフアスト―アナリユーザー
（Gemsaec―Fast―Analyzer）自動分析器で実
施。
温度 ：25℃ 測定波長 ：546nm 試料容量 ：10μ 希釈剤（水） ：50μ 試薬容量 ：500μ 測定時間 １回目の測定：開始後35秒 ２回目の測定：開始後315秒。
次の結果が得られた。： 試料：水性標準液 グリセリン（UV―試験） 再び検出された％ （mg／dl）
（本発明によるグリセリンオキシダーゼ） 11 105 21 101 32 100 43 101 54 100 65 99 76 99 87 99 96 102 動力学的測定において試薬中の次の量比で作業
するのが有利である： Pipes―緩衝剤0.05〜0.5モル／、H3BO30.5〜
2.0モル／、PH6.8〜8.0 イソトリデシルエーテル １〜５ｇ／、 コール酸ナトリウム １〜５ｇ／、 アミノ置換４―アミノアンチピリン
0.2〜５ミリモル／、 ｐ―クロルフエノール ５〜50ミリモル／、 ペルオキシダーゼ ５〜50KU／、 グリセリンオキシダーゼ 100〜250KU／。
この例は、本発明を臨床化学的慣用診断実験室
中にある重要な字動分析器で実施することができ
ることを示す。
【図面の簡単な説明】
第１図は酸素消費量によりグリセリンを測定す
る装置を示す略図である。１…反応容器、３…デ
イテクタ、４…分析器、５…磁気撹拌器。 第２図はH2O2―形成によりグリセリンを測定
する際の、グリセリン標準液の測定吸光度差△Ｅ
＝E2−E1をグリセリンもしくはトリグリセリド
濃度に関連させた検量線を示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ アスペルギルスspec.（Aspergillus spec.）
    BMTU1997―１（DSM1729）（微工研菌寄第5860
    号）からのグリセリンオキシダーゼ及びH2O2を
    測定するためのシステムから成ることを特徴とす
    るグリセリンの測定試薬。 ２ エステル化グリセリンを鹸化するための薬剤
    を付加的に含有する特許請求の範囲第１項記載の
    試薬。 ３ H2O2測定システムがカタラーゼ、アセチル
    アセトン、メタノール及び緩衝剤よりなる特許請
    求の範囲第１項又は第２項記載の試薬。 ４ H2O2測定システムがペルオキシダーゼ、少
    なくとも１種の色原体及び緩衝剤よりなる特許請
    求の範囲第１項又は第２項記載の試薬。 ５ グリセリンオキシダーゼ２〜150U／ml、ペ
    ルオキシダーゼ0.5〜100U／ml、色原体0.05〜20
    ミリモル／及び場合により少なくとも一種の界
    面活性剤0.001〜0.1ｇ／ml又はこれらの数倍量及
    び緩衝剤、PH６〜９、を含有する特許請求の範囲
    第４項記載の試薬。 ６ グリセリンオキシダーゼ100〜250KU／、
    ペルオキシダーゼ５〜50KU／、色原体0.2〜５
    ミリモル／及び場合により少なくとも一種の界
    面活性剤１〜５ｇ／又はこれらの数倍量及び緩
    衝剤、PH6.8〜8.0、を含有する特許請求の範囲第
    ４項記載の試薬。 ７ 担体材料、例えば紙上に含浸されている特許
    請求の範囲第１項から第６項までのいずれか１項
    に記載の試薬。
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