JPS6041481A - プトレシンオキシダ−ゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプトレシンオキシダーゼの製造方法に関する〇 プトレシンはスペルミジン、スペルミンと共にポリアミ
ンと総称される１し合物であり、ｍ胞増殖に関−”ｉ−
ｆるとされている。

また近年、血液、尿等におけるポリアミン濃度の増加と
幇ノ失患との間係が注目され、ポリアミンは癌失患の診
断のためのマーカーとして有用と考えＬ−）れている。

このポリアミンの定ｈｉ方法としてはいくつかの方法が
開発されているが、臨床検査に使用される方法としては
その簡便さからして酵素法が優れている。この場合、こ
のポリアミンの中で主としてプトレシン、ガダベリン、
スペルミジンにイ′１用才る酸化酵素としてプトレシン
オキシダーゼが知られている。

これまで微生物由来のプトレシンオキシダーゼのＩＪ（
給ψ式としては、マイクロコツカス属の微生物〔アグリ
カルチユラル・バイオロジカル・ケミス！・リー　、第
Ｊθ巻、ｌλＯｕ　’（／　９６６）、および１）開昭
３−７−　／　ｇ　９　ｇ１号公報〕、およびノカルデ
・ｆアト、４の微生物（特開昭Ｊ−６−／　Ａ　＜＋’
　７　ｇ６号公報）が知られている。

ポリアミン定量用酵素としてのプトレシン」キシダーゼ
に要求される性質としては、まずプトレシンに対するＫ
ｍ値が少な（とも１０．Ｍのオーダーであることが挙げ
られる。

本発明者らは、この条件を満足さぜるプトレシンオキシ
ダーゼおよびその生産菌を土壌より分離した微生物を対
象に広く検索した結果、アル・スロバククー属に属する
微生物が目的と１−るプトレシンオキシダーゼを生産し
つることを見い出し１本発明を児成した。

即ち１本発明はアルスロバクタ−属に属しプトレシンオ
キシダーゼへ生産申時能鬼を有する微生物を培地に培養
し、培養物からプトレシンオキシダーゼを採取すること
を特徴とするプトレシンオキシダーゼの製造方法である
。

以下、本発明について詳細に説明する。

まず１本発明で用いられるアルスロバクタ−属に属しプ
トレシンオキシダーゼ生産能を有する微生物の具体例と
しては、例えばアルスロバクタ−・スピーシーズＮｏ、
１３−ｔ、−１が挙げられる。

本菌株は本発明者らが東京都八王子市の土壌より分離し
たものであって、下記の菌学的性質を有している。

（Ｉ）形態学的性状 肉汁寒天培地上でＪＯＣ，ｌ、〜コ＆　１１を間培養し
、観察した所見は下記の辿りである。

約、乙時間培養後の若い細胞は、真直ぐまたはやや曲っ
た桿菌または短桿菌で端は丸（、単独、二連ｊ己たは短
連鎖をなしており、その大きさはＱ　、　Ｊ　Ｘ　／〜
３μｍである０ ２７時間以上」Ｍ養した古い細胞は１球ないし１１、’
Ｊ　ｄλ１稈菌で端は九（、単独、二連またはＩＡ１連
鎖をなしており、その大きさは０．３×０．オ〜０．７
μｍ１１である０ 木菌は運動性がな（、芽胞を形成せず、ダラム染色は陽
性であるが、培養１１ｇＦ間により陰性を示すことがあ
るｏまた抗酸性染色は陰性を示した。

（ＩＩ）培養性状 各種培地上で、：ｊＯＣ，／〜７日間培養した所見は下
記の辿りである。

肉Ｚ１寒天平板培地：円形で縁が波状で乎ｉ１Ｊな湿潤
性のあ仝集落を形成し１色相は灰白色である。

肉汁寒天斜面培地：糸状に生育し、生育度は中程度。色
は灰白色０水溶性色素の生成なし０肉汁液体培地：生育
良好、菌膜を形成し、沈渣も認められろ０ 肉汁ゼラチン穿刺培地：糸状１表面に生育１−るが、生
育度は悪い。

リドマスミルク培地：培地はわずかに酸性となり、ペプ
トン化が認められる。

（ＩＩＩ　）生理的注状 硝酸塩の還元　陽性 脱窒反応　陰性 ＭＲテスト　陰性 ｖｐテスト　陽性 インドールの生成　陰性 硫化水素の生成　陰性 澱粉の加水分解　陽性 クエン酸の利用 コーザー培地　陽性 クリステン七ン培地　陽性 無機窒素源の利用 硝酸塩　陽性 アンモニウム塩　陽性 色素の生成　生成しない ウレアーゼ　陰性 オニＶシダーゼ　陰性 カタラーゼ　陽性 生育のｐｎ範囲　５〜９ｊ 生貴温度範囲　ｊ−グＯＣ 酸素に対する態度　好気性 ０１ｉ′デスト（Ｉｌｕｇｂ−Ｌｅｉｆｓｏｎ　培地）
　不変Ｊ７．ｌｉのｌからの酸およびガスの生成酸およ
びガスの生成が認められないものは下記のとおりである
。

１〕−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクト−ス
、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ギシロース、Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−リボース、ラクトース、マルト−ス、セロビオ
ース、メリビオース、シュクロース、Ｄ−マンニトール
、Ｄ−ンルビトール、イノシトール、ンルボース、ラム
ノース、ラフイノース、α−メチルグルコシド、イヌリ
ン、ザリシン、アルブチン、澱粉、グリセロール０ＤＮ
Ａのグアニン、シトシン含量は６６．６係（Ｔｍ法によ
る）であった。

以」二の性質をもとに、「バージニーズ・マニュ　“ア
ル・オブ・デターミネイティブ・バクテリ゛オロ　′ジ
ー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　’Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）
　１版（１９２グ）」を参照して　′分類すると、木菌
はアルスロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　）属
のアルスロバクタ−・グロビフオルミス（Ａｒｔｈｒｏ
ｂａｃｔｅｒ　ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ　）とい（つか
の点で　３類似性が認められる。しかしながら、木菌は
多形性がほとんど認められないこと、ｙｏＣでも生育　
１できること、Ｄ−キシロース、イノシトール、べ　３
タイン、チラミン、クレアチンの資１し性が認められな
いこと等においてアルスロバクタ−・グロビフォルミス
と明らかに相違点が認められることに　−より、本菌株
を新菌と認めアルスロバクタ−・ス　１ビーシーズＮｏ
、　／　ｊ　−６２（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ
、　’ＮＱ、／Ｊ−Ａλ）と命名した。なお、本菌株は
工　′上：ｉ己しブこアルスロバクタ−・スピーシーズ
Ｎｏ。

１３−６λは本発明で使用する微生物の具体例であって
、本発明においては、この菌およびその変陣、変異株ば
か９でな（、アルスロバクタ−属に１鳴しプトレシンオ
キシダーゼを生産する能力を有−「る微生物であれば、
すべて使用することができる０ 本発明において使用菌の培養は、通常の微生物２）　”
ｒｓ　’に方法に従って液体培養、固体培養１．ｃどで
行うことができる。そして液体培養の場合には、静１り
培Ｉすでも良いが、振盪培養または通気撹拌培養ノ）方
が好ましい。

」ハ養に用いられる培地としては、アルスロバクタ−属
に属する微生物が必要とてる栄養源を含量１するもので
あれば、合成層地、半合成培地、天然者地のいずれも用
いることができるが、これらのＩＳ地にプトレシンオキ
シダーゼの生産に有効な誘導基質、例えばプトレシンあ
るいはアセチルプトレシン等を添加するのが好ましい０ 本発明において使用される培地の好ましい具体　・例と
しては１例えば可溶性澱粉ｌ係、ポリヘット　・７０．
３％、醇刊エキスＱ−／幅、リン酸二カリ　イウムＱ、
Ｉ％、硫酸マグネシウム・２水塩ｏ　、ｏ、ｓ％、アセ
チルプトレシン０．３係よりなるｐＩ（７，２ｃｎ　ｌ
！培地を挙げることができる。

培養は、一般的にはｐＨ４〜りに調整した培地、　−好
’ｆ　Ｌ　＜　ｕプトレシンオキシダーゼの生産に有効
　：１、ｃ誘導基質を含む培地に、アルスロバクタ−属
に　′属しプトレシンオキシダーゼ生産能力をイ１゛１
−る微　′生物を植菌し、２！〜Ｊ７ｔＺ’でｉｓ−グ
ｇ　１１を間の培養が行われる０この場合、プトレシン
オキシダ　−一ゼは王として菌体内に蓄積されるｏ　ブ
このようにして得られた培養物から通常の酵素即ち、培
養物を２１１過または遠心分離等により培養１１１液と
国体とに分離する０この菌体はそのまま　−あるいは乾
燥して用いても良いが、プトレシンオ、■シダーゼをよ
り精製した形で使用する必要があう場合には、まず菌体
を機械的方法、屏素処理す５方法、自己浴解法等公知の
方法により破壊して１［抽出７改をイひる。

次に、一般的に酵素の精製に用いられる透析、艮外Ｄｉ
過、ゲル沢過クロマトグラフィー、吸着り」マドグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点分画、ア
フィニイティークロマトグラフイー等の手段で、または
これらの手段を組み合ｉりぜて適用することにより上記
粗抽出液より更に２ｖ　ｊＬＥのイ′ｎ製標品をイυる
ことができる。

また、上記のようにしてに’４た粗酵素７佼や精製酵（
４液は例えば凍結乾燥法などによす粗酵素わ）末まこは
鞘製酵素扮末にすることもできる。更にこの［うにして
得られたプトレシンオキシダーゼは適！＋　７．［、ｌ
ｊ体に固定１しすることにより固定化酵素とすにともで
きる。

次に本発明により得られたプトレシンオキシダーゼの諸
性質について述べる。

■作用 ｌモルのプトレシンより、１モルの酸素を消費して、１
モルのｌ−ピロリン、１モルのアンモニア、７モルの過
酸化水素を生成する。即ち、プトレシンを酸比して／−
ヒロリン、アンモニア。

過酸化水素を生ｆｆｌ’ｆる反応を触ｆｉする作用を有
する０ ■基質特異性 後記するプトレシンオキシダーゼの活性測定法において
、／　ｍＭ条件下で各種の基質に対する反応速度をめ、
プトレシンを用いた場合を７００として表示し、本酵素
の基質特異性を第１表に示した。

第　１　表 糸　質　相対活性（ｑ！Ｉ） プトレシン　１００ カダベリン　ＩＯ スペルミジン　ｏ０ｇ スペルミン　Ｏ ■至適ｐＨ 後記のプトレシンオキシダーゼの活性測定法におい゛Ｃ
，緩衝液のｐＨを６〜９まで変えてＣｐｉｔ６〜ｇはリ
ン酸緩衝液、ｐＩ−Ｉ　７　、　ｓ　−９はトリス塩酸
緩ｉＩｌ＋ｊ　７Ｌり）作用至適ｐ■■をめた。その結
果を第７図に示す。この結果１本酵素の至適ｐＨ８’；
Ｊニア　、　ｔ〜ｇ、ｏにあった。

（４）安定ｐＨ範囲 本酵素を予め各ｐＨ（ｐＩ−１＆　１．ｔ〜６は酢酸緩
イーｐｉ故、９１１６〜ｇはりン醒緩衝液、ｐ）ｌ　ｇ
〜９はトリス塩酸緩衝液、　ｐｉ−１９〜１０は硼ｅ緩
Ｉｉｊ液）について３２′Ｃで３０分間処理した後、残
存活性を測定した。その結果は第２図に示すとおりで、
木醇累ばｐｉｌ　３．Ｊ〜９．０の範囲で安定であつブ
こ〇■至至適温 水酵素の作用の至適温度は第３図に示すとお９６０Ｃイ
り近であった。

９つ熱安定性 本酵素の熱安定性を調べるため、ｐＨ７，０のリン酸緩
衝液中で各温度に１０分間保った後の残存活性を測定し
た０その結果は第を図に示すとおりで、、７Ｊ−’Ｃま
で安定であった０■活性６１１１定法 本酵素の活性測定は／　Ｄ　Ｄ　ｍＭ　！Ｊン酸緩衝２
「り（ｐＨ７，３）０　、ｊｍＡ、　／　ＯｍＭプトレ
シンニ塩ｍ　４　Ｒｉ　／ｌｉ　Ｏ、Ｊ　＋＋＋６．０
．．２％（Ｖ／Ｖ）Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリンｆｆｌ液
０　、６ｍｂ、　ｏ　、２　％　（Ｗ／Ｖ　）クーアミ
ノアンチピリン溶１（ｌ　ｏ　−ａｍｂ、　ヘルオ±シ
ダーゼｆＪ７Ｊ　（ｓ　ｏ　Ｕ／ｍｅ　）　ｏ　、　ａ
ｍｂ、水θ　９Ｊ−ｎ＋１の反応系をキュベツトの中に
組み、３０Ｃで３分間予熱した後、酵素溶液０．０オｍ
ｂを添加し１、？ＯＣで反応させ１分間当りの３６ｊ　
ｌ１ｍの吸光度増加量を分光々度泪にて測定する。プト
レシンオキシダーゼ活性の単位は１分間にｌマイクロモ
ルの過酸化水素を生じる酵素蚕をｌ単位とする。

■分子量 セファクリル５−−１ＯＯ（ファルマシア社製）を用い
たゲル８二１過法による分子量は約／／ＱＱりＯである
。また、ＳＤＳディスク電気泳動法によりめたザブユニ
ットの分子量は約、３−０００θである０ ■等電点 キャリアーアンホライトを用いる焦点電気泳動法により
めた本酵素の等電点はり、−であった。

（＄　１青製方　ｌ去 本酵素の精製は通常一般的に酵素の１１７製に用いられ
台ところの各種の方法、即ち、硫安塩析、イ」′機浴媒
沈澱、透析、限外ｌ−ｉ過、ゲルδ゛草過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点分画、
アフイニイテイークロマトグラフイー姶な組み合わぜる
ことによジ行うことができる。

その具体例は後記実施例１に示すとおりである。

リリ　［ぐ１ｎ　イ直 ｐＨ７、ｊの条件下、本酵素のプトレシンに対するＪ（
ｎ＋値をラインライ−バー嗜バーク・プロット（Ｌｊｎ
ｅｗｅａｖｅｒ　−Ｂｕｒｋ　ｐｌｏｔ　）によりめた
ところ、３．ｇｘｉｏ　Ｍであった０ 次にこのプトレシンオキシダーゼの使用方法について述
べる。本酵素は、プトレシン、カダベリン、スペルミジ
ンに作用することにより、これらのポリアミンを含む検
体に本酵素を加えて反応させ、その際に消費される自！
２索あるいは生成する過酸化水素を公知の方法により定
量することＱこより、もとのポリアミン量を定量するこ
とができるＯ具体的１．【定ｈ１、方法Ｖこついては、
下記する実施例２−ご詳細に述べる０ 実施１り１」１ 可溶性戯わ）／憾、ポリペプトン０．３係、酵ＩＵ。

エギスＱ、／％、リン酸二カリウム０．／係、仙Ｈ−＝
ｒｙネシウムａ、ｏｔ４．プトレシン０．３幅を含む培
地（ｐＨ７，７）ユ０〃を、３０ｐ容ジャーファーメン
タ−に入れ−１ｘｏＣ−−１ｏ分間加熱殺菌する。しか
る後に、これに、同じ３％地で２１時間培養したアルス
ロバクターースビーシーズＮｏ−７３−６ユのシードｊ
“θｏ　ｍｂを加え、３０Ｃにて通気量ｉｏｎ／分、回
転数ａＯＯ回転／分σ〕条件で、二〇時間辿気攪４；ｌ
゛培養するｏしかる後、遠心分離にて菌体な集め、０．
０ユＭリン酸緩衝液（ｐｉ（７、ユ）にて菌体な洗浄す
る。

このようにして得られた菌体ｊθノを０．０２Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，コ）−００ｍ８に懸濁し、水冷下超７
１１波破壊を行う。この破壊７夜を１ｏｏｏ。

回転、−０分の遠心・分離にかけ、上澄（抽１］胃夜）
を・潜る。これには＜ｌ’　Ｄ　Ｊ−０単位のプトレシ
ンオキシダーゼが存在した。

次にこの抽出液を、予め００２　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（
ｐＬＬ　、７−２）で緩ｆｉ化したＤ　Ｅ　Ａ　Ｅセル
ロースカラム（２，Ｊ−Ｘ、？Ｏｃｔ＋＋）に辿″ｒ０
このカラムを同じ緩雨１ｊｋで充分洗浄した後、食塩籏
度を０から１ＭまＱ　ｉｔ’、ｌ線画に」−昇させるグ
ラジェント溶出法によＶ醇５（へを浴出した０この際、
得られた酵素浴／佼の酵７（−活性はＪ６λ０単位であ
った。しかる後。

この酵素浴液を限外１４過法にて鎖線し１次に予め０．
０−２Ｍリン酸緩衝孜（ｐＨ７、ユ）で緩衝化したウル
トロゲルＡｃＡａ＜のカラム（２，３−３−Ｘ１Ｏ０Ｃ
にかげ、ゲルｅ過を行った。この際、得られた酵素浴１
夜の酵素活性は３なコ０単位であった。次にこの酵素浴
牧を予め同じ緩衝液で緩衝化したｌ、／Ｄ−ジアミノデ
カンセファロースｘＢのカラム（ｔ、３Ｘ、２０ｃｒｎ
）に通し酵素を吸着せしめた０次いで食塩濃度なＯから
／Ｍまで直線的に上げるグ性は３ａ７０単位であったＯ
なおこの酵素様６もののよう１工方法にＪ−９定量した
Ｏ 反応ｌ没組成 ０．７Ｍリン酸緩衝１’１（１）Ｉ−Ｌ　７．ｊ）　ｏ
　、ｔ　ｍｔｏ、２％（Ｗ／Ｖ）’１−−７ミ／’Ｔ’
５−ビＰ４ｆ（ｌ　ｏ　、ｙ　ｍｂｏ、８（ｖ／Ｖ）Ｎ
、Ｎ−ジメブフＬ＋プーニリ７Ｍ（ｌ　ｏ　、　ｂ　ｍ
ｂペルオキシダーゼ浴液（！θＵ／ｍｌ）　０　、Ｊ　
ｊｎｆｆ水　０．＋２ワ〃Ｌ乙 上記のような組成の反応ｌ翫をキュベツト中に組み、プ
トレシンオキシダーゼ溶液ｏ、ｏｉｍｂ（ｏ、ｉ単位）
を加え１．ＩＤＣ”’Ｑ１０分反応させ、Δ”／、Ｊ’
ｎｍの吸光度の増加量（Ａ３６５　）を測定したＯこの
結果、得られたＡ、６．より　／　ｎ　ｍｏｌ　７ｍ６
の過酸１し水素は吸光度Ｑ、０／Ｊを与えるという関係
から、もとの検体中のプトレシン（戯１及をめたところ
、ｔ　、７　、−２　ｔｔ　ｍｏｌ　／ｍｌという結果
が得しｉｔ、１こ。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明で製造されるプトレシンオキシダーゼに関
−「るもので、第１図は至適ｐＨを示す図であり１．第
一図は安定ｐＨ範囲を示す図“Ｃあり。 第３図は至適温度を示す図であり、第９図は熱安定性を
示す図であるＯ 第１図 １　回 ４　５　６　ｇ　？　ＩＱ ｌ−１ 第　３　口 ９Ｒ〜（Ｃ） 隼４図 藩鮎（’ｃ、）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）アルスロバクタ−属に属しプトレシンオキシダー
   ゼ生産能な有する微生物を培地に培養し。 培養物からプトレシンオキシダーゼを採取することをｌ
   Ｎｊ徴とするプトレシンオキシダーゼの製造方法０ （ｚ）Ｊ’ａ地として、プトレシンあるいはアセチルプ
   トレシンのようなプトレシンオキシダーゼの生産に有効
   な誘導基質を添加した培地を用いる特ｔ′ト請求の範囲
   第１項記載の方法０ に３）微生物がアルスロバクタ−・スピーシーズＮｏ、
   ＩＪ−１，２であることを特徴とする特Ｊｒ請求の１Ｉ
   Ｉｌ）囲第１項または第二項記載の方法０