JPS6050436B2 - ウロキナ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト尿より分離精製したウロキナーゼは現在治療医薬
として広く、かつ多量に使用されている一種の蛋白分解
酵素てある。

従来、この酵素の分離精製はヒト尿を合成イオン交換体
の層を接触せしめてウロキナーゼを吸着せしめるか、あ
るいはます尿を塩析し、得られる沈澱より塩類を除いた
のち、上述の如く合成イオン交換体て処理して同イオン
交換体にウロキナーゼを吸着せしめ、次いでイオン交換
体よりウロキナーゼを溶出し、それをさらに他種のイオ
ン交換体あるいは分子篩にて、処理するなどの方法によ
つて行われている。 しかしイオン交換体によるウロキ
ナーゼの吸着 は決して特異的でなく、尿中の他の種の
蛋白も吸着されるため一挙に高度に純化することは困難
である。近年ウロキナーゼの分離にアフイニテー、クロ
マトグラフィーの技術が適用されているが、リガント及
びスペーサーを導入した酵素精製資材は高価であり、一
方ヒト尿中のウロキナーゼの濃度は極めて低く、しかも
尿は極めて腐敗し易い原料であるため、直接尿を原料と
してウロキナーゼをアフイニテイークロマトグラフイー
で分離することは経済的にも成立し難い。 本発明者は
廉価かつ容易に入手が可能でしかもヒト尿ウロキナーゼ
と特異的に結合する天然資材を種々検討した結果、鋸屑
はヒト尿ウロキナーゼ中、分子量５万とみなされるウロ
キナーゼ成分を特異的に吸着し、吸着されたウロキナー
ゼは稀薄食塩水あるいはイオン強度を調節した緩衝液で
容易に溶出され、純度は一挙に数千倍にも高め得ること
を見出した。使用する鋸屑は樹種を問はないが、テルペ
ン類その他いわゆる樹脂の少ない樹種ヨの鋸屑が良好で
あり、また吸着能は当然のことながら細い程よいが３０
メッシュ以下の粒度のものならば充分使用に供し得る。
吸着に使用する鋸屑は使用に先立つて室温で０．５〜
△塩酸数倍量に２〜６時間浸漬して溶解物を除き、沈渣
区分を充分水洗したのちそれに０．４〜１．０Ｎの苛性
ソーダー数倍量を加え同じく室温で２〜６時間浸漬した
のち再度水洗する。

鋸屑は空気泡を含みしばしば浮上するが、減圧状態とす
れば次後完全に沈澱性となり容易に上述の洗滌を行うこ
とができる。なお鋸屑にアミノ基など導入するときは洗
滌鋸屑を一旦乾燥し、常法に従い、例えばジアミノヘキ
サンなどをリガント乃至スペーサーリガンドとすること
が出来る。次に米栂材鋸屑を上記方法に従い洗滌し、こ
れを直接またはアミノ基導入後、ウロキナーゼ吸着剤と
した実施例を示す。

実施例１ 上述の如く予め塩酸および苛性ソーダで処理した鋸屑を
充分量の０．１５１Ｓ−４食塩を含む０．０１Ｍリン酸
緩衝液、ＰＨ７．４、で洗滌し、のちそれをカラム（１
．３×１０ＣＴｒＬ）に充填し、数名の成人男子より取
得した尿約１．５′を等容の水で希釈し、ＰＨを苛性ソ
ーダで７．４に調節して、上記鋸屑カラムに１時間３０
０ＴＬ１の流下速度て負荷した。

負荷総カラムを上述の０．１５Ｍ食塩を含む燐酸緩衝液
で充分洗滌した。次いて１．５Ｍ食塩を含む０．０２Ｍ
ホウ酸緩衝液、ＰＨｌＯ．Ｏを流下した。水によりウロ
キナーゼを溶出した。溶出したウロキナーゼの回収率は
ブラスミノーゲン活性化力で約７０％、比活性の上昇は
約１００＠あり、溶出ウロキナーゼについて分子量分子
篩法て検討し約５万と推定された。図１は上記条件で行
つた鋸屑カラム・クロマトグラフィーに於けるヒト尿ウ
ロキナーゼの溶出パターンである。第１図において左縦
座Ｙａは鋸屑を通過した洗滌液または溶出液に含まれる
蛋白質の吸光度（２８０ｎ７ＴＬ）を示す。

横座（Ｘ）は溶出画分番号を示し、各々の画分には５ｍ
１づつの洗滌液または溶出液が順を追つて採取される。

右縦座Ｙｂは洗滌液または溶出液中に含まれるウロキナ
ーゼの活性を１．Ｕ．ＩｍＬ単位で示す。（１）の範囲
は前記０。

１５モル、食塩を含む０．０１モルリン酸緩衝液ＰＨ７
．４による洗滌液中の蛋白質の含有量およびウロキナー
ゼの活性を示している。

（２）の範囲は前記１．５モル食塩を含む０．０２モル
硼酸硼砂緩衝液ＰＨｌＯ．Ｏによる溶出液中の蛋白質の
量およびそのウロキナーゼ活性を示している。実施例２
数名の成人男子より防腐剤として少量のブタノール添加
の下に採取した尿に、７５％飽和の硫安を加え冷所に一
夜放置したのち、生じた沈澱を集め、０．１５ｒ！４食
塩を含む０．０ＩＭリン酸緩衝液に対し充分透析した後
透析内液を遠心分離して不溶性物質を除去し、その上澄
液を実施例１と同じ条件で調製した鋸屑カラムに負荷し
た。

この場合負荷した尿の総ウロキナーゼ活性中、約４０％
は鋸屑カラムを素通りし、残り６０％は鋸屑カラムに吸
着された。吸着された区分のウロキナーゼは実施例１と
同じ条件で溶出された。素通り画分のウロキナーゼの分
子量は分子篩法で約３万、また吸着溶出画分のウロキナ
ーゼの分子量は約５万とそれぞれ推定された。図２に透
析尿について鋸屑カラムクロマトグラフィーを行つた場
合の素通りするウロキナーゼと吸着され１．５Ｍ食塩水
で溶出されるウロキナーゼの溶出パターンを示す。第２
図において左縦座標（Ｙａ）右縦座標（Ｙｂ）横座標（
Ｘ）の指標は第１図の場合と同じである。

（１）の範囲はヒト尿の硫安塩析物を０．１５モル食塩
を含む０．０１モル燐酸緩衝液に対し透析した透析内液
の遠心分離上澄液を鋸屑カラムに負荷し、しかる後実施
例１と同じ組成の洗滌液で洗滌した場合、カラムを素通
りして流下した前記上澄液および洗滌液を採取した各画
分の蛋白質含有量とそのウロキナーゼの活性を示す。

（２）の範囲は１．５モル食塩を含む０．０２モル硼酸
一硼砂緩衝液ＰＨｌＯ．Ｏで鋸屑カラムから溶出した蛋
白質とそのウロキナーゼ活性を示す。

実施例３ 塩酸、力性ソーダて処理した鋸屑１０ｙ（乾燥物換算）
を水にひたし、臭化シアン５ｑを添加し、へー苛性ソー
ダでＰＨを１０−１１に保つ。

温度は氷冷により１０−２０℃にする。２紛後０．１Ｍ
重炭酸ナトリウムで洗浄し、１０ｙのヘキサメチレンジ
アミンを含む０．１Ｍ一重炭酸ナトリウム５０ｍＬと混
合し、２叫間ゆるやかに攪拌する。

次いで１Ｍ一食塩水、０．０１Ｎ塩酸、０．１Ｍ重炭酸
ナトリウムで充分洗浄する。上記のヘキサメチレンジア
ミンを導入した鋸屑（鋸屑１ｙ当り約１ｒＷＬモルのヘ
キサメチレンジアミンを含む）を２．０Ｘ１１．８ｃｍ
のカラムに充填し、同量の水て希しやくした男子尿（ウ
ロキナーゼ活性４．５■ＵＩｍＬ．Ｅ２８Ｏ＝２２．２
）６ｅを１時間５００ｍＬの流下速度で負荷した。

次いで０．０２Ｍ一燐酸緩衝液（ＰＨ７．５）で洗浄し
、１Ｍ一食塩を含む０．０２Ｍ硼酸緩衝液（ＰＨｌＯ．
Ｏ）でウロキナーゼを溶出した。

溶出したウロキナーゼの回収率は９０％、比活性の上昇
は約１８（１）倍であつた。その試験結果は第１表の通
りである。

第１表の試験は第１、第２実施例と同様に行なわれた。

すなわち、第１表における項目は次のことを意味する。
画分番号（各２０ＴｆＬｔ）各々の画分は２０ｍ１づつ
の洗浄液または溶出液が順を追つて採取される。

２８亡吸収度： 鋸屑を通過した洗浄液または溶出液に含まれる蛋白質の
吸光度（２８０Ｔｗ１）を示す。

ウロキナーゼ活性（１．Ｕ．１ｍ１） 洗浄液または溶出液中に含まれるウロキナーゼの活性を
１．Ｕ．ＩｍＬ単位で示す。

０．０２Ｍ燐酸緩衝液（ＰＨ７．５）〔第１表の（１）
〕０．０２Ｍ一燐酸緩衝液（ＰＨ７．５）て洗浄した時
の第１図、第２図の（１）の範囲に相当する。

０．０２Ｍ８酸一硼砂緩衝液（ＰＨｌＯ．Ｏ）〔第１表
の（２））１Ｍ一食塩を含む０．０２Ｍ硼酸緩衝液（Ｐ
Ｈ＝１０．０）でウロキナーゼを溶出したときの第１、
第２図の（２）の範囲に相当する。

【図面の簡単な説明】

第１図：実施例１の鋸屑カラム・クロマトグラフィーに
おけるヒト尿ウロキナーゼの溶出パターンを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒト尿、ヒト尿から導かれた粗製ウロキナーゼ中の
   ウロキナーゼの分離精製に際し、鋸屑を特異的吸着剤と
   して使用することを特徴とするウロキナーゼの製造法。 ２ ヒト尿、ヒト尿から導かれた粗製ウロキナーゼ中の
   ウロキナーゼの分離精製に際し、鋸屑にジ・アミノ・ヘ
   キサンを導入して化学的修飾物を構成し、該化学的修飾
   物を特異吸着剤として使用することを特徴とするウロキ
   ナーゼの製造法。