JPS6057830B2 - グリセロール脱水素酵素の製造法 - Google Patents
グリセロール脱水素酵素の製造法Info
- Publication number
- JPS6057830B2 JPS6057830B2 JP54084130A JP8413079A JPS6057830B2 JP S6057830 B2 JPS6057830 B2 JP S6057830B2 JP 54084130 A JP54084130 A JP 54084130A JP 8413079 A JP8413079 A JP 8413079A JP S6057830 B2 JPS6057830 B2 JP S6057830B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- gdh
- glycerol dehydrogenase
- activity
- glycerol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、グリセロール脱水素酵素生産能を有する菌株
を用いて、グリセロール脱水素酵素を効率良く製造する
方法に関し、更に詳しくは、アスペルギルス属、ペニシ
リウム属、ノイロスポーラ属、フザリウム属に属する糸
状菌類又はスタフイロコツカス属、ミクロコッカス属、
アエロモナス属、コリネバクテリウム属に属する細菌の
生産するグリセロール脱水素酵素の製造方法に関するも
のである。
を用いて、グリセロール脱水素酵素を効率良く製造する
方法に関し、更に詳しくは、アスペルギルス属、ペニシ
リウム属、ノイロスポーラ属、フザリウム属に属する糸
状菌類又はスタフイロコツカス属、ミクロコッカス属、
アエロモナス属、コリネバクテリウム属に属する細菌の
生産するグリセロール脱水素酵素の製造方法に関するも
のである。
従来、グリセロール脱水素酵素〔１．１．１．６〕（以
下ＧＤＨと略する）は、アエロバクター・アエロゲネス
、エシエリヒア・コリ、バチルス・ズブチリス等の菌体
に所在することが古くから知られている。
下ＧＤＨと略する）は、アエロバクター・アエロゲネス
、エシエリヒア・コリ、バチルス・ズブチリス等の菌体
に所在することが古くから知られている。
またその他の微生物起源のものとしては、プロテウス属
、エルビニア属、セラチア属に属する微生物（特公昭５
０−２１５５３）、あるいはアクロモバクタ属、アルス
ロバクタ属、プレビバクテリウム属、シュードモナス属
に属する微生物によるもの（特開昭５８−１２７８８）
が知られている。近年、酵素の性質、特に高い特異性が
注目され、臨床検査分野では酵素法を利用する検査薬が
、その簡便さと相俟つて多大の関心を集めている。ＧＤ
Ｈもリポプロテイン・リパーゼとの共役により、体液中
のトリグリセラードの定量に、あるいはグリセロリン酸
を基質とするホスフアターゼの活性測定用等に利用でき
ることが知られており、ＧＤＨを安価に工業的に製造す
る方法を提供することが強く望まれている。本発明者は
かかる展望に応えるべく、該酵素活性を広く微生物界に
検索した結果、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ノ
イロスポーラ属、フザリウム属に属する糸状菌又はスタ
フイロコツカス属、ミクロコッカス属、アエロモナス属
、コリネバクテリウム属に属する細菌類に著しいＧＤＨ
生産能が存在することを見出し、本発明を完成させるに
到つた。
、エルビニア属、セラチア属に属する微生物（特公昭５
０−２１５５３）、あるいはアクロモバクタ属、アルス
ロバクタ属、プレビバクテリウム属、シュードモナス属
に属する微生物によるもの（特開昭５８−１２７８８）
が知られている。近年、酵素の性質、特に高い特異性が
注目され、臨床検査分野では酵素法を利用する検査薬が
、その簡便さと相俟つて多大の関心を集めている。ＧＤ
Ｈもリポプロテイン・リパーゼとの共役により、体液中
のトリグリセラードの定量に、あるいはグリセロリン酸
を基質とするホスフアターゼの活性測定用等に利用でき
ることが知られており、ＧＤＨを安価に工業的に製造す
る方法を提供することが強く望まれている。本発明者は
かかる展望に応えるべく、該酵素活性を広く微生物界に
検索した結果、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ノ
イロスポーラ属、フザリウム属に属する糸状菌又はスタ
フイロコツカス属、ミクロコッカス属、アエロモナス属
、コリネバクテリウム属に属する細菌類に著しいＧＤＨ
生産能が存在することを見出し、本発明を完成させるに
到つた。
本発明において使用可能な菌株は例えばアスペルギルス
●オリゼー（ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓＯｒｙｚａｅ）Ｉ
ＦＯ４ｌ７７、アスペルギルス●ソーヤ（ＡｓｐｓＯｊ
ａｅ）ＩＦ′０４３８６、ペニシリウム●ノターツム（
ＰｅｎｎｉｃｌｌｌｌｕｍｒｌＯｔａｔｕｍ）ＩＦ′０
４６４０、ペニシリウム エクスパンサム（Ｐｅｎ．ｅ
ｘｐａｎｓｌＯｎ）ＩＦ′０６０９６、ノイロスポーラ
クロッサ（ＮｅＬｌｒ″０ｓｐ０ｒａｃｒａｓｓａ）
ＩＦＯ６Ｏ６８、フザリウム●クルモラム（Ｆｕｓａｒ
ｉｕｎｌｃｕｌｍＯｒｕｍ）ＩＦＯ５９Ｏ２等の糸状菌
及びスタフイロコツカス●アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌ
ＯｃＯｃｃｕｅａｕｅｕｓ）ＩＦＯ３Ｏ３６、ミクロコ
ッカス●バリアンス（ＭｉｃｒＯｃＯｃｃｕｓｖａｒｉ
ａｎｓ）ＩＦＯ３７６５、アエロモナス・ハイドロフイ
ラ、（ＡｅｒＯｍＯｎａｓｈｙｄＯｒＯｐｈｌｌａ）１
Ｆ０１２９７＆ミクロコッカス ルテウス（ＭｉｃｒＯ
ｃＯｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）ＦＯｌ２７Ｏ８、コリネバ
クテリウム●フアシアンス（ＣＯｒｙｒｌｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｆａｓｃｉａｒｌｓ）ＩＦＯｌ２Ｏ７７などが
挙げられるが、これらの菌の他、アスペルギルス属、ペ
ニシリウム属、ノイロスポーラ属、フザリウム属等の糸
状菌及びスタフイロコツカス属、ミクロコッカス属、ア
エロモナス属、コリネバクテリウム属等の細菌に属し、
ＧＤＨを生産する菌は、すべて本発明方法において使用
することができる。
●オリゼー（ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓＯｒｙｚａｅ）Ｉ
ＦＯ４ｌ７７、アスペルギルス●ソーヤ（ＡｓｐｓＯｊ
ａｅ）ＩＦ′０４３８６、ペニシリウム●ノターツム（
ＰｅｎｎｉｃｌｌｌｌｕｍｒｌＯｔａｔｕｍ）ＩＦ′０
４６４０、ペニシリウム エクスパンサム（Ｐｅｎ．ｅ
ｘｐａｎｓｌＯｎ）ＩＦ′０６０９６、ノイロスポーラ
クロッサ（ＮｅＬｌｒ″０ｓｐ０ｒａｃｒａｓｓａ）
ＩＦＯ６Ｏ６８、フザリウム●クルモラム（Ｆｕｓａｒ
ｉｕｎｌｃｕｌｍＯｒｕｍ）ＩＦＯ５９Ｏ２等の糸状菌
及びスタフイロコツカス●アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌ
ＯｃＯｃｃｕｅａｕｅｕｓ）ＩＦＯ３Ｏ３６、ミクロコ
ッカス●バリアンス（ＭｉｃｒＯｃＯｃｃｕｓｖａｒｉ
ａｎｓ）ＩＦＯ３７６５、アエロモナス・ハイドロフイ
ラ、（ＡｅｒＯｍＯｎａｓｈｙｄＯｒＯｐｈｌｌａ）１
Ｆ０１２９７＆ミクロコッカス ルテウス（ＭｉｃｒＯ
ｃＯｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）ＦＯｌ２７Ｏ８、コリネバ
クテリウム●フアシアンス（ＣＯｒｙｒｌｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍｆａｓｃｉａｒｌｓ）ＩＦＯｌ２Ｏ７７などが
挙げられるが、これらの菌の他、アスペルギルス属、ペ
ニシリウム属、ノイロスポーラ属、フザリウム属等の糸
状菌及びスタフイロコツカス属、ミクロコッカス属、ア
エロモナス属、コリネバクテリウム属等の細菌に属し、
ＧＤＨを生産する菌は、すべて本発明方法において使用
することができる。
本発明によれば、アスペルギルス属、ペニーシリウム属
、ノイロスポーラ属、フザリウム属に属する糸状菌及び
スタフイロコツカス属、ミクロコッカス属、アエロモナ
ス属、コリネバクテリウム属に属する細菌類を、栄養培
地で培養することにより、ＧＤＨが菌体中に生産蓄積さ
れるので、公知の方法及び今後開発されるであろう改良
方法で抽出、精製、乾燥することによつて酵素粉末を得
ることができる。更に具体的に説明すると、前記各属の
ＧＤＨ生産菌を適当な栄養培地、例えば適当な糖質、窒
素源、無機塩類を含む培地又はＧＤＨが誘導酵素の場合
には、酵素生産能を高めるためにグリセロールおよび有
機促進物質を含む培地で培養し、ＧＤＨを菌体中に蓄積
せしめるのであるが、ここで糖質にはグルコース、ガラ
クトース、マンノース、フラクトース、シユクロース、
ラクトース、マルトース、廃糖密、デンプン加水分解物
などの糖類、更にはグリセロール、ソルビトール、マン
ニトールなどの糖アルコール類・などが使用できる。窒
素源としては、酵母工キズ、ペプトン、肉工キズ、コー
ンスチープリカー、力ティン加水分解物、脱脂大豆、ア
ンモニウム塩などが使用される。無機塩類としては、ナ
トリウム、マンガン、マグネシウム、カルシウム、コバ
ルト、ニッケル、亜鉛などの金属塩類や硫酸、リン酸、
塩酸、硝酸などの塩類が使用できる。有機促進物質とし
ては酵母工キズやペプトン、肉工キズ、コーンスチープ
リカーなどが良い。かくして得られたＧＤＨを含む菌体
をろ過または遠心分離によつて分別し、適当な緩衝液に
懸濁、磨砕、超音波処理、機械的圧縮または自己消化な
どの公知の方法で破砕して酵素を抽出する。
、ノイロスポーラ属、フザリウム属に属する糸状菌及び
スタフイロコツカス属、ミクロコッカス属、アエロモナ
ス属、コリネバクテリウム属に属する細菌類を、栄養培
地で培養することにより、ＧＤＨが菌体中に生産蓄積さ
れるので、公知の方法及び今後開発されるであろう改良
方法で抽出、精製、乾燥することによつて酵素粉末を得
ることができる。更に具体的に説明すると、前記各属の
ＧＤＨ生産菌を適当な栄養培地、例えば適当な糖質、窒
素源、無機塩類を含む培地又はＧＤＨが誘導酵素の場合
には、酵素生産能を高めるためにグリセロールおよび有
機促進物質を含む培地で培養し、ＧＤＨを菌体中に蓄積
せしめるのであるが、ここで糖質にはグルコース、ガラ
クトース、マンノース、フラクトース、シユクロース、
ラクトース、マルトース、廃糖密、デンプン加水分解物
などの糖類、更にはグリセロール、ソルビトール、マン
ニトールなどの糖アルコール類・などが使用できる。窒
素源としては、酵母工キズ、ペプトン、肉工キズ、コー
ンスチープリカー、力ティン加水分解物、脱脂大豆、ア
ンモニウム塩などが使用される。無機塩類としては、ナ
トリウム、マンガン、マグネシウム、カルシウム、コバ
ルト、ニッケル、亜鉛などの金属塩類や硫酸、リン酸、
塩酸、硝酸などの塩類が使用できる。有機促進物質とし
ては酵母工キズやペプトン、肉工キズ、コーンスチープ
リカーなどが良い。かくして得られたＧＤＨを含む菌体
をろ過または遠心分離によつて分別し、適当な緩衝液に
懸濁、磨砕、超音波処理、機械的圧縮または自己消化な
どの公知の方法で破砕して酵素を抽出する。
その抽出液から不溶物をろ過または遠心分離によつて分
別した後、得られる戸液または上清から硫酸アンモニウ
ム、芒硝などによる塩析あるいはアセトン、アルコール
等を用いる溶媒沈殿などの公知の方法で酵素製品を得る
。さらに高度に精製された酵素標品を得るには、イオン
交換を応用した吸着溶出法およびゲル淵過法などを用い
れば良い。細菌類の生産するＧＤＨの活性はグリセロー
ルとＮ．ＡＤを基質として反応した場合、生成するＮ，
ＡＤＨｆ）３４０ｒ１ｍにおける吸着度の増加を分光光
度計で測定することによつて算出する。
別した後、得られる戸液または上清から硫酸アンモニウ
ム、芒硝などによる塩析あるいはアセトン、アルコール
等を用いる溶媒沈殿などの公知の方法で酵素製品を得る
。さらに高度に精製された酵素標品を得るには、イオン
交換を応用した吸着溶出法およびゲル淵過法などを用い
れば良い。細菌類の生産するＧＤＨの活性はグリセロー
ルとＮ．ＡＤを基質として反応した場合、生成するＮ，
ＡＤＨｆ）３４０ｒ１ｍにおける吸着度の増加を分光光
度計で測定することによつて算出する。
すなわち、グリセロール８００μモル、Ｎ，ＡＤＯ．５
μモル、炭酸緩衝液（ＰＨ９．Ｏ）３０μモルを含む反
応混液２．ｂｕＬに酵素液０．１ｍ１を混合し、２５℃
で反応させ、反応開始から４分間３４０ｒ１ｍの波長に
おける紫外部吸の増加を測定し、その直線部分から１分
間当りの吸光度の増加を算出する。
μモル、炭酸緩衝液（ＰＨ９．Ｏ）３０μモルを含む反
応混液２．ｂｕＬに酵素液０．１ｍ１を混合し、２５℃
で反応させ、反応開始から４分間３４０ｒ１ｍの波長に
おける紫外部吸の増加を測定し、その直線部分から１分
間当りの吸光度の増加を算出する。
すなわち対照としては上記組成でグリセロールの代りに
水を用いて同様の操作を行ない、試験液の３４０ｒ１ｍ
の吸光度の増加から対照のそれを差し引く。ＮＡＤＨの
３４０ｒ１ｍにおける分子吸光係数として（ε＝６．２
２×１０３）を用い、差し引いた吸光度値から生成する
Ｎ，ＡＤＨ量を求め、これをもとにして試料中の酵素力
価を算出する。但し糸状菌の生産するＧＤＨの場合は、
ＮＡＤＰを補酵素にするため、糸状菌類のＧＤＨを測定
するときには、ＮＡＤの代りにＮＡＤＰを使用する外は
、前述の測定法と全く同様に行う。酵素力価の表示は上
記条件下で１分間に１μモルのＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ
を生成せしめる酵素量を１単位として行なう。
水を用いて同様の操作を行ない、試験液の３４０ｒ１ｍ
の吸光度の増加から対照のそれを差し引く。ＮＡＤＨの
３４０ｒ１ｍにおける分子吸光係数として（ε＝６．２
２×１０３）を用い、差し引いた吸光度値から生成する
Ｎ，ＡＤＨ量を求め、これをもとにして試料中の酵素力
価を算出する。但し糸状菌の生産するＧＤＨの場合は、
ＮＡＤＰを補酵素にするため、糸状菌類のＧＤＨを測定
するときには、ＮＡＤの代りにＮＡＤＰを使用する外は
、前述の測定法と全く同様に行う。酵素力価の表示は上
記条件下で１分間に１μモルのＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ
を生成せしめる酵素量を１単位として行なう。
本発明の予備試験のための糸状菌類及び細菌類の生産す
るＧＤＨの培養力価と比活性は表８に示す。
るＧＤＨの培養力価と比活性は表８に示す。
なお、この予備試験のための菌類の培組成は表１、力価
の検定法は表２のとおりである。本発明によつて得られ
るＧＤＨの理化学的性質をスタフイロコツカス●アウレ
ウスＩＦ′０３０６喝源のもの（後記の実施例１で得ら
れた比活性１００単位／Ｍ９の精製酵素）を代表例とし
て示す。（１）作用本酵素はＮＡＤの共存下にグリセロ
ールを脱水素し、ジヒドロキシアセトンとＮＡＤＨを生
成する反応を触媒する（２）基質特異性 本酵素はグリセロール以外にも、１，２−プロパンジオ
ール、２，３−ブタンジオール、グリセロ−ルーｄ−モ
ノクロロヒドリン等にも作用しうるが、メタノール、エ
タノール、プロパノール等のアルコール類は脱水素でき
なかつた（表４参照）。
の検定法は表２のとおりである。本発明によつて得られ
るＧＤＨの理化学的性質をスタフイロコツカス●アウレ
ウスＩＦ′０３０６喝源のもの（後記の実施例１で得ら
れた比活性１００単位／Ｍ９の精製酵素）を代表例とし
て示す。（１）作用本酵素はＮＡＤの共存下にグリセロ
ールを脱水素し、ジヒドロキシアセトンとＮＡＤＨを生
成する反応を触媒する（２）基質特異性 本酵素はグリセロール以外にも、１，２−プロパンジオ
ール、２，３−ブタンジオール、グリセロ−ルーｄ−モ
ノクロロヒドリン等にも作用しうるが、メタノール、エ
タノール、プロパノール等のアルコール類は脱水素でき
なかつた（表４参照）。
また補酵素としてＮ，ＡＤＰを用いた場合はＮ，ＡＤに
比べて、活性は全く無かつた。
比べて、活性は全く無かつた。
またグリセロール、ＮＡＤに対するＫＴｒｌ，値は夫々
１．０９×１０−２Ｍおよび８．９３×１０−５Ｍであ
つた。（３）至適ＰＨおよび安定ＰＨ範囲本酵素の至適
ＰＨは９．附近にある（逆反応の至適ＰＨは６．附近で
ある）。
１．０９×１０−２Ｍおよび８．９３×１０−５Ｍであ
つた。（３）至適ＰＨおよび安定ＰＨ範囲本酵素の至適
ＰＨは９．附近にある（逆反応の至適ＰＨは６．附近で
ある）。
本酵素の安定ＰＨ域は３０℃、１時間処理でＰＨ６．Ｏ
〜１０．０の範囲にある。更に最も安定なＰＨは７．０
ｆｔ近で、該ＰＨでは５５℃、１紛間処理でも１００％
の活性が残存する。（４）作用過程の範囲 本酵素の作用最適温度は前記の活性測定条件下において
４５〜５０℃付近にある。
〜１０．０の範囲にある。更に最も安定なＰＨは７．０
ｆｔ近で、該ＰＨでは５５℃、１紛間処理でも１００％
の活性が残存する。（４）作用過程の範囲 本酵素の作用最適温度は前記の活性測定条件下において
４５〜５０℃付近にある。
（５）ＰＨｌ温度などによる失格条件
本酵素はＰＨ７．へ１紛間の処理の場合、６０℃まで安
定、７５℃では完全に失活する。
定、７５℃では完全に失活する。
（６）種々薬剤の影響
本酵素活性は表５に示す如くＣｕ２＋イオン、Ｚｎ２＋
イオン、Ｃｄ２＋イオンによつて顕著に阻害される。
イオン、Ｃｄ２＋イオンによつて顕著に阻害される。
他方、表６に示す如くＫ＋、Ｒｂ＋、ＮＨ４＋によつて
顕著な活性化が認められた。ＥＤＴＡのような金属キレ
ート剤では阻害されないが、Ｏ−フエナンスロリンのよ
うな金属レート剤では顕著な阻害が認められた。またＰ
ＣＭＢのようなＳＨ阻害剤によつて活性が顕著に阻害さ
れることから、本酵素の活性発現にはＳＨ基が関与して
いるものと推察される。
顕著な活性化が認められた。ＥＤＴＡのような金属キレ
ート剤では阻害されないが、Ｏ−フエナンスロリンのよ
うな金属レート剤では顕著な阻害が認められた。またＰ
ＣＭＢのようなＳＨ阻害剤によつて活性が顕著に阻害さ
れることから、本酵素の活性発現にはＳＨ基が関与して
いるものと推察される。
（７）分子量
セフアロース戊のろ過法により、本酵素の分子量は約３
９００００と算出され、またＳＤＳを用いた電気泳動法
では約４２０００と算出される。
９００００と算出され、またＳＤＳを用いた電気泳動法
では約４２０００と算出される。
これらから、本酵素はｗ個のサブユニットからなるもの
と推察される。次に本発明を実施例により説明する。
と推察される。次に本発明を実施例により説明する。
実施例１
グリセロール１．０％（重量％、以下同じ）、ポリペプ
トン１．５％、リン酸２カリウム０．３％、塩化ナトリ
ウム０．２％、硫酸マグネシウム（７Ｈ２０）０．０２
％、酵母エキストラクト０．１％（ＰＨ７．Ｏ〜７．２
）の混合物２０ｅを３０ｅ容のジヤーフアメンターに仕
込み１２０′Ｃで３紛間蒸気滅菌して培地を得た。
トン１．５％、リン酸２カリウム０．３％、塩化ナトリ
ウム０．２％、硫酸マグネシウム（７Ｈ２０）０．０２
％、酵母エキストラクト０．１％（ＰＨ７．Ｏ〜７．２
）の混合物２０ｅを３０ｅ容のジヤーフアメンターに仕
込み１２０′Ｃで３紛間蒸気滅菌して培地を得た。
他方同組成培地を用いた２８℃、４満間、振とう培養し
ておいたスタフイロコツカス属・アウレウスＩＦＯ３Ｏ
６Ｏの培養物２５０ｎＬを前記培地に無菌的に植菌し、
２８℃で２鋳間、通気培養する。
ておいたスタフイロコツカス属・アウレウスＩＦＯ３Ｏ
６Ｏの培養物２５０ｎＬを前記培地に無菌的に植菌し、
２８℃で２鋳間、通気培養する。
培養液４０ｅを連続遠心分離機にて処理し、菌体を集め
、この菌体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）５ｅ
に懸濁する。この懸濁液を超音波破砕機にかけ菌体を破
砕する。破砕した後、遠心分離によつて不容物の除去を
行ない、得られた上清に１％になる様にストレプトマイ
シン流酸塩を添加し、生じる不溶物を遠心分離で除去す
る。得られた上清にまず４０％飽和に硫酸アンモニウム
を加え、不溶物を遠心分離で沈殿として除去した後、そ
の上清に更に終末６０％飽和になる様に硫酸アンモニウ
ムを加えＧＤＨを沈殿として回収する。この沈殿として
の活性回収率は９０％で比活性は７市倍に上昇している
。得られた沈殿を６００ｍ１の０．１Ｍリン酸緩衝液（
ＰＨ７．Ｏ）に溶解し、セロファンチューブに入れ、０
．０１Ｍリン酸カリ緩衝液で１時間透析する。得られた
脱塩酵素液を、予め０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ”７
．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロース（ブラ
ウン社製）を充填したカラムに流し、ＧＤＨを吸着する
。更に樹脂の平衡化に使用した緩衝液で不純物を洗い流
した後、０．２５ｒ！４の食塩を溶解した同緩衝液と０
．４Ｍの食塩を溶解した同緩衝液とで濃度勾配をつくり
、徐々に食塩濃度を上げながらＧＤＨを溶出させた。溶
出されたＧＤＨ活性区分を集め、硫酸アンモニウムの４
５〜５６％飽和で前記と同様に塩析分画を行なう。５５
％飽和の硫酸アンモニウムで沈殿するＧＤＨを遠心分離
で集め、少・量の０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）
に溶解後、同緩衝液で緩衝化したセフアデツクスＧ−２
５で分子篩脱塩を行ない、得られる脱脱液を凍結乾燥す
る。
、この菌体を０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）５ｅ
に懸濁する。この懸濁液を超音波破砕機にかけ菌体を破
砕する。破砕した後、遠心分離によつて不容物の除去を
行ない、得られた上清に１％になる様にストレプトマイ
シン流酸塩を添加し、生じる不溶物を遠心分離で除去す
る。得られた上清にまず４０％飽和に硫酸アンモニウム
を加え、不溶物を遠心分離で沈殿として除去した後、そ
の上清に更に終末６０％飽和になる様に硫酸アンモニウ
ムを加えＧＤＨを沈殿として回収する。この沈殿として
の活性回収率は９０％で比活性は７市倍に上昇している
。得られた沈殿を６００ｍ１の０．１Ｍリン酸緩衝液（
ＰＨ７．Ｏ）に溶解し、セロファンチューブに入れ、０
．０１Ｍリン酸カリ緩衝液で１時間透析する。得られた
脱塩酵素液を、予め０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ”７
．０）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロース（ブラ
ウン社製）を充填したカラムに流し、ＧＤＨを吸着する
。更に樹脂の平衡化に使用した緩衝液で不純物を洗い流
した後、０．２５ｒ！４の食塩を溶解した同緩衝液と０
．４Ｍの食塩を溶解した同緩衝液とで濃度勾配をつくり
、徐々に食塩濃度を上げながらＧＤＨを溶出させた。溶
出されたＧＤＨ活性区分を集め、硫酸アンモニウムの４
５〜５６％飽和で前記と同様に塩析分画を行なう。５５
％飽和の硫酸アンモニウムで沈殿するＧＤＨを遠心分離
で集め、少・量の０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）
に溶解後、同緩衝液で緩衝化したセフアデツクスＧ−２
５で分子篩脱塩を行ない、得られる脱脱液を凍結乾燥す
る。
かくして比活性２＆７単位／Ｍ９のＧＤＨ約１．４４ｙ
が得られる。阻抽出液からの活性回収率は５９％であり
、比活性の上昇は１８皓に達した。実施例２ 使用菌株にミクロコッカス、バリアンス ＩＦ′Ｃ３７６５を用い、培地としてグルコース１％、
ポリペプトン１．５％、リン酸２カリウム０．３％、塩
化ｋナトリウム０．２％、硫酸マグネシウム（７Ｈ２０
）０．０２％、酵母工キズ０．１％（ＰＨ７．Ｏ〜７．
２）からなる溶液２０ｅを３０ｅ容のジヤーフアーメン
ターに仕込み、実施例１と同様の条件で減菌し、予め同
組成の培地で２（代）、４ｍ間振とう培養しておいたミ
ク口コッカス・パリアンスＩＦＯ３７６５の培養物２５
０ｗＬιを無菌的に植菌し、２肛、２四間通気攪拌培養
する。
が得られる。阻抽出液からの活性回収率は５９％であり
、比活性の上昇は１８皓に達した。実施例２ 使用菌株にミクロコッカス、バリアンス ＩＦ′Ｃ３７６５を用い、培地としてグルコース１％、
ポリペプトン１．５％、リン酸２カリウム０．３％、塩
化ｋナトリウム０．２％、硫酸マグネシウム（７Ｈ２０
）０．０２％、酵母工キズ０．１％（ＰＨ７．Ｏ〜７．
２）からなる溶液２０ｅを３０ｅ容のジヤーフアーメン
ターに仕込み、実施例１と同様の条件で減菌し、予め同
組成の培地で２（代）、４ｍ間振とう培養しておいたミ
ク口コッカス・パリアンスＩＦＯ３７６５の培養物２５
０ｗＬιを無菌的に植菌し、２肛、２四間通気攪拌培養
する。
得られた培養液４０１を実施例１と同様な方法で集菌し
、懸濁させた後、ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ（ウイリー．工ー
．ブツコーフエン社製、スイス）で菌体を破砕する。
、懸濁させた後、ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ（ウイリー．工ー
．ブツコーフエン社製、スイス）で菌体を破砕する。
磨砕した後、遠心分離によつて不溶物を除去し、得られ
た上清に１％になる様にストレプトマイシン硫酸塩を加
え、不純物を遠心分離し沈殿として除去した後、その上
清に終末３５％飽和になるように硫酸アンモニウムを加
え、更に不純物を遠心分離し沈殿として除去した後、そ
の上清に終末６５％飽和になる様に硫酸アンモニウムを
加え、ＧＤＨを沈殿として回収する。この沈殿の活性回
収率は８５％で比活性は７倍に上昇した。得られた沈殿
を実施例１と同様な方法で透析、イオン交換体処理をし
、比活性２５．０＄位／ＷＩｇの凍結乾燥ＧＤＨ約１．
２ｙを得た。実施例３ 使用菌株としてフエロモナス・ハイドロフイラＩＦＯｌ
２９７８、ミクロコッカス・ルテウスＩＦＯｌ２７Ｏ８
、コリネバクテリウム．フアシアンスＩＦＯｌ２Ｏ７７
を用い、実施例１と同様に培養、精製を行ない次の様な
比活性の凍結乾燥ＧＤＨを得た。
た上清に１％になる様にストレプトマイシン硫酸塩を加
え、不純物を遠心分離し沈殿として除去した後、その上
清に終末３５％飽和になるように硫酸アンモニウムを加
え、更に不純物を遠心分離し沈殿として除去した後、そ
の上清に終末６５％飽和になる様に硫酸アンモニウムを
加え、ＧＤＨを沈殿として回収する。この沈殿の活性回
収率は８５％で比活性は７倍に上昇した。得られた沈殿
を実施例１と同様な方法で透析、イオン交換体処理をし
、比活性２５．０＄位／ＷＩｇの凍結乾燥ＧＤＨ約１．
２ｙを得た。実施例３ 使用菌株としてフエロモナス・ハイドロフイラＩＦＯｌ
２９７８、ミクロコッカス・ルテウスＩＦＯｌ２７Ｏ８
、コリネバクテリウム．フアシアンスＩＦＯｌ２Ｏ７７
を用い、実施例１と同様に培養、精製を行ない次の様な
比活性の凍結乾燥ＧＤＨを得た。
実施例４
使用菌株に、アスペルギルス．オリゼーＩＦＯ４ｌ７７
、アスペルギルス・ソーヤＩＦＯ４８８臥ペニシリウム
．ノターツムＩＦＯ４６４Ｏ）ノイロスポーラ・クラツ
サＩＦＯ６ＯＢ）フザリウム・クルモラムＩＦＯ５９Ｏ
２を実施例１と同様に培養、精製を行ない次の様な比活
性の凍結乾燥ＧＤＨを得た。
、アスペルギルス・ソーヤＩＦＯ４８８臥ペニシリウム
．ノターツムＩＦＯ４６４Ｏ）ノイロスポーラ・クラツ
サＩＦＯ６ＯＢ）フザリウム・クルモラムＩＦＯ５９Ｏ
２を実施例１と同様に培養、精製を行ない次の様な比活
性の凍結乾燥ＧＤＨを得た。
Claims (1)
- １ アスペルギルス属、ペニシリウム属、ノイロスポー
ラ属、フザリウム属、スタフイロコツカス属、ミクロコ
ッカス属、アエロモナス属、コリネバクテリウム属に属
するグリセロール脱水素酵素生産菌を栄養培地に培養し
、該培養物中からグリセロール脱水素酵素を採取するこ
とを特徴とするグリセロール脱水素酵素の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP54084130A JPS6057830B2 (ja) | 1979-07-02 | 1979-07-02 | グリセロール脱水素酵素の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP54084130A JPS6057830B2 (ja) | 1979-07-02 | 1979-07-02 | グリセロール脱水素酵素の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS568685A JPS568685A (en) | 1981-01-29 |
| JPS6057830B2 true JPS6057830B2 (ja) | 1985-12-17 |
Family
ID=13821917
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP54084130A Expired JPS6057830B2 (ja) | 1979-07-02 | 1979-07-02 | グリセロール脱水素酵素の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6057830B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0442601U (ja) * | 1990-08-07 | 1992-04-10 | ||
| CN105112335B (zh) * | 2015-09-06 | 2018-09-25 | 中国农业科学院烟草研究所 | 耐受高浓度葡萄糖的葡萄球菌CGMCC No.10671及其应用 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5917980A (ja) * | 1982-06-28 | 1984-01-30 | エクソン・リサ−チ・アンド・エンヂニアリング・コムパニ− | 微生物細胞および酸化生成物製造のためのその使用 |
| DE3311027A1 (de) * | 1983-03-25 | 1984-09-27 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Nad(p)-unabhaengige glycerindehydrogenase, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung von glycerin und triglyceriden |
-
1979
- 1979-07-02 JP JP54084130A patent/JPS6057830B2/ja not_active Expired
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0442601U (ja) * | 1990-08-07 | 1992-04-10 | ||
| CN105112335B (zh) * | 2015-09-06 | 2018-09-25 | 中国农业科学院烟草研究所 | 耐受高浓度葡萄糖的葡萄球菌CGMCC No.10671及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS568685A (en) | 1981-01-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPS6057830B2 (ja) | グリセロール脱水素酵素の製造法 | |
| JP3076856B2 (ja) | 細菌によるアルギン酸の分解法 | |
| JPH09224660A (ja) | アルデヒド脱水素酵素 | |
| US4463095A (en) | Process for producing α-glycerophosphate oxidase | |
| JP3122990B2 (ja) | Ｏ−メチル−ｌ−チロシン及びｌ−３−（１−ナフチル）アラニンの製造方法 | |
| JP3093039B2 (ja) | 新規エステル分解酵素ａおよびその製造方法 | |
| JP3602162B2 (ja) | ３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法 | |
| JPS6012028B2 (ja) | グリセロ−ル脱水素酵素の製造法 | |
| JP4139502B2 (ja) | ピロール−２−カルボン酸の製造法 | |
| JP3065175B2 (ja) | ３−シクロヘキシル−ｌ−アラニンの製造方法 | |
| JPH07108219B2 (ja) | Ｎａｄｈオキシダ−ゼの製造法 | |
| JPH0795947B2 (ja) | α−１，３−グルカナーゼの製造方法 | |
| JPS59156281A (ja) | Ｎ−アセチルヘキソサミン酸化酵素及びその製造法 | |
| JPS5840467B2 (ja) | グリセロ−ル脱水素酵素の製造法 | |
| JP3820617B2 (ja) | ε−ポリ−Ｌ−リシン分解酵素とそれを用いた低重合度ε−ポリ−Ｌ−リシンの製造法 | |
| JPH0657148B2 (ja) | クレアチン・アミジノ−ロラ−ゼの製造法 | |
| JPS6012027B2 (ja) | 新規なグリセロ−ル脱水素酵素およびその製造法 | |
| JPH0358273B2 (ja) | ||
| JPS6016233B2 (ja) | グリセロ−ルキナ−ゼの製造法 | |
| JPS6121074B2 (ja) | ||
| JPS5840470B2 (ja) | ザルコシン酸化酵素の製造法 | |
| JP3917723B2 (ja) | ラクトン加水分解酵素およびその製造法 | |
| JPS584551B2 (ja) | コリン酸化酵素の製造法 | |
| JPS6121073B2 (ja) | ||
| JPH05236961A (ja) | アルギニノコハク酸リアーゼの製造方法 |