JPS6087787A - 固定化酵素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素の溶出が少なくかつ高い活性を有する固
定化酵素、特に膜状固定化酵素の製造法に関する。

酵素は特定の物質と反応するという選択性によって、医
薬品、食品工業、分析化学等に利用されている。しかし
酵素は一般に微生物から複雑な手段によって抽出精製さ
れるため高価であり、また酵素を工業的に利用する場合
には、非連続方式によらざるを得ないので、その利用が
制限される。これに関し酵素を水不溶性担体上に保持さ
せるいわゆる固定化のための研究が１９５０年頃に始ま
り、１９６０年代には工業的実用化が可能となり、現在
では固定化酵素が広く利用されている。

酵素の固定化の方法は種々開発されており、それらは包
括法、吸着法、架橋化法及び共有結合法に大別される。

このうち包括法とは、高分子格子内の空間に酵素を包括
するか、マイクロカプセル内に酵素を封入する方法であ
る。すなわち酵素分子は、高分子が形成する三次元網目
構造内に、あるいは高分子膜が形成する殻内に、物理的
に固定化される。この場合の高分子物質としては、合成
高分子例えばポリアクリルアミド、エチレン−酢酸ビニ
ル共重合体、ポリビニルアルコール等、天然高分子例え
ばコラーゲン、セルロース、アルギン酸及びその塩、寒
天、カラギーナン等が用いられる。包括法は操作が比較
的簡単で、酵素は溶出し難い利点があるが、後記の共有
結合法に比べると若干の不利がある。

更に包括法において留意すべき点は、基質と酵素の高分
子格子内における拡散速度が、全体の反応、を律速する
ことが多（、特に高分子量の基質や酵素が関与する場合
には適用が困難である。

また重合性単量体と酵素の混合液を適当な方法で重合す
る場合には、酵素を失活させないような条件を設定すべ
きこと、また天然高分子内に酵素を包括する場合にも、
同様に酵素活性を低減させないように低温で操作する等
の配慮が必要である。

吸着法とは、不溶性担体に酵素を吸着固定化する方法で
ある。不溶性担体としてはＤＥＡＥセルロース、セルロ
ースエステル、ホリメタクリレート等の有機高分子、ガ
ラス、活性炭、アルミナ、珪藻土等の無機物質が挙げら
れる。この方法は操作が簡単でかつ担体表面で酵素反応
が進行するために、前記の包括性と異なり基質や生成物
の拡散の問題がないだけでなく、吸脱着が可逆的である
ために、担体の繰り返し使用が可能になるという利点が
あるが、他方において酵素が溶出し易いという欠点を有
している。

架橋化法とは、低分子量の多官能性物質を酵素溶液又は
酵素と不溶性担体の混合液に加え、酵素分子間又は酵素
と不溶性担体の間に共有結合による架橋構造を形成する
ことにより、酵素を不溶化する方法である。多官能性物
質としてはグルタルアルデヒドが最も一般的である。ま
た不溶性担体としては、アルキルアミノ化多孔性ガラス
、ポリエチレンイミンを被覆したガラス、ゼラチン、コ
ラーゲン等が挙げられる。この方法は比較的操作が簡単
であるが、多量の酵素を要して効率が低く、また多官能
性物質による酵素の失活がしばしば問題になる。

共有結合法とは、不溶性担体が有する活性基と酵素分子
が有する活性基とを、直接あるいは何らかの化学物質を
介して化学結合させることにより、酵素を不溶化するも
のであり、化学結合様式によりペプチド結合法、ジアゾ
法、アルキル化法、シッフ塩形成法、Ｕｇｉ反応法等が
挙げられる。不溶性担体としてはデキストラン、セルロ
ース、コラーゲン等の天然有機高分子、ナイロン、ポリ
スチレン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール
等の合成有機高分子、シリカ、チタニア、ジルコニア等
の無機物質等が挙げられる。この方法により固定化され
た酵素は一般に高活性を示し、元の酵素よりも高い活性
を呈することもある。また酵素の溶出が極めて少ないと
いう利点を有する。しかし固定化に使用する物質による
酵素の活性を低下するおそれがあり、更には操作が複雑
であることが欠点である。

固定化酵素の形態としては粒状、繊維状、膜状等が挙げ
られる。このうち膜状固定化酵素は酵素反応容器内の圧
力損失がほとんどないという利点があり、酵素電極等の
酵素反応を利用したセンサーなどに用いられている。膜
状固定化酵素は合成有機高分子膜を基材として吸着法、
架橋法、共有結合法の各種の方法で製造されてきた。し
かしこれらの方法で製造される固定化酵素は前記の欠点
を有しており、まだ十分な性能を有しているとはいえな
い。

本発明者らは、包括法の場合に酵素の活性が高いという
特色に着目し、包括法の欠点を改善すべく研究を重ねた
結果、酸性多糖類が包括法の基材として極めて優れてい
ること、また４級アンモニウム塩と反応させると不溶化
すること、更には該反応物が高分子物質の透過を阻止す
るが低分子物質は自由に透過しうるという極めて特異な
性質を有することを見出して本発明を完成した。

本発明は、酵素を含有する酸性多糖類溶液を炭素原子数
５以上の置換基を少なくとも１個有する４級アンモニウ
ム塩で処理することを特徴とする、固定化酵素の製造法
である。

本発明に用いられる酵素としては任意のものが用いられ
、例えば酸化酵素例えばカタラーゼ、クルコースオキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ等、転移酵素例えばグリシン
アミノトランスフェラーゼ、ロイシンアミノペプチダー
ゼ等、加水分解酵素例えばアスパラギナーゼ、インベル
ターゼ、ウレアーゼ、リパーゼ等、リアーゼ例えばアス
パルターゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、フマー
ル酸ヒドラーゼ等、異性化酵素例えばグルコースイソメ
ラーゼ、アラニンラセマーゼ、グルタミン酸ラセマーゼ
等、リガーゼ例えばグルタチオンシンテ衆ターゼ、アス
パラギンシンテターゼ等が挙げられる。

酸性多糖類としては、カルボキシル基、硫酸基等の酸性
基を有する水溶性多糖類、例えばアルギン酸ソーダ、カ
ラギーナン、ファーセレラン、寒天、ペクチン、アラビ
アガム、更にヘパリン、コンドロイチン硫酸塩等のムコ
多糖類、中性多糖類に酸性基を導入した多糖類変性物等
が用いられる。中性多糖類としてはセルロース、殿粉、
グアガム、ローカストビーンガムなどが挙げられる。酸
性基はカルボキシメチル化又は硫酸化反応により導入す
ることができる。

本発明を実施するに際しては、酸性多糖類を常法により
水に溶解する。この際必要に応じて加温する。固定化し
ようとする酵素は酸性多糖類と同時あるいは前後のいず
れの時期に添加してもよい。ただし酵素が加えられた状
態で酸性多糖類を加温溶解する際には酵素の活性が低下
しない温度範囲で行うことが必要である。また酸性多糖
類溶液に酵素を加える方法の場合には該溶液は加える酵
素の活性が十分に高い温度範囲で十分な流動性を有する
ことが必要であり、ゲル化能力が大きい酸性多糖類溶液
を用いる場合は、その濃度は低い方がよい。

次いで酵素を含有する多糖類水溶液を４級ア個有するこ
とが必要であり、これ以外の４級アンモニウム塩では不
溶化がよく進行しない。好適な４級アンモニウム塩とし
ては、塩化ベンザルコニウム、セチルトリメチルアンモ
ニウムフロマイト、セチルピリジニウムクロライド、メ
チレンブルー等が〆単独で又は２種以上の混合物として
用いられる。４級アンモニウム塩は水溶液でも固体のま
までも使用できる。

処理の方法としては両者が接触するのであればいかなる
方法でもよい。特に膜状固定化酵素を製造する場合には
、Ｕζ素を含有する多糖類溶液な液膜状としたのち水溶
化処理すればよい。

液膜状とするにはガラス板、ステンレス板、合成樹カ旨
板など水不浴性板状物上に流延するなどの方法が用いら
れる。不溶化処理は数秒で完了する。

不溶化処理することにより、酸性多糖類と４級アンモニ
ウム塩との不溶性反応生成物の薄い層及び酸性多糖類溶
液から成る二重構造が形成される。このうち外層の不溶
性反応生成物は分子量分画能を有し、内部の酵素の流出
が完全に抑制御されると共に、基質及び反応物の移動が
極めて自由に行われるので、この構造は理想的な点とし
て挙げられる。ｍ方法により得られた固定化酵素は、前
記の特色を生かしながら酵素流出を防ぐことができる。

公知の包括法では基材としての多糖類はゲル化能力が要
求されるため、基材の選択範囲が著しく限定されていた
が、本発明方法ではゲル化能力を有しない酸性多糖類を
用いることもで・きるので、広い範囲から選択できる。

さらに公知の包括法では基材がゲル化することな要件と
しているので、多糖類溶液の濃度は十分に高いことが必
要である。一般に包括法では基質の移動速度が極めて重
要であり、基材としての多糖類の濃度を高（することは
、基質の移動を阻害するだけでな（、酵素の立体構造に
も制約が加えられ、酵素活性が低下することがある。こ
れに対し本発明方法では低濃度の多糖類溶液を用いるこ
とができるので、従来法の欠点を解消することができる
。

本発明方法によ快得られる固定化酵素は、例えばバイオ
リアクターあるいはセンサーに用いられ、高い活性が長
期間維持される。

実施例１ カリウムな′カチオンとして含有するカッパカラギーナ
ンを４０℃で水に溶解し、得られた１゜０％、カラギー
ナン溶液５０ｇにストレッドマイセスファエオクロモゲ
ネスより得た部分精製グルコースイソメラーゼ（２２５
単位／〜）５＃ｙを加えて混合した溶液をガラス板上に
流し厚さ２龍になるようにした。これに１０％塩化ベン
ザルコニウム溶液を静かに加えて表層を不溶化し、膜状
固定化酵素４２．９を得た（固定化グルコースイソメラ
ーゼＡ）。

別に前記の部分精製グルコースイソメラーゼ５Ｔｎｇを
水”ｌ　ｍｌに分散し、これに４０℃に保温した２、５
％カッパカラギーナン溶液を加えて混合し、同様にガラ
ス板上に厚さ２龍になるように流したのち、１％塩化カ
リウムを加えてゲル化させ固定化酵素５５ｇを得た（固
定化グルコースイソメラーゼＢ：比較例）。

Ａ及びＢの固定化グルコースイソメラーゼそぞぞれ１０
ｇを０．１Ｍグルコース溶液３’　ＯＯｍｌに入れ、ｐ
Ｈ７、温度３７℃で４時間振盪し反応液を取り代える。

この操作を繰り返しフラクトース生成量の変化を調べた
。その結果を第１表及び２表に示す。本発明のグルコー
スイソメラーゼＡは比較例Ｂに比べて活性が高くかつ長
く持続されることが知られる。なお第１表中の１単位は
フラクトースを１μｇ／分の割合で生成する活性を意味
する。

第　１　表 第　２　表 実施例２ 実施例１０カツパカラギーナンの代わりに１゜２％アル
ギン酸ソーダ溶液及び塩化ベンザルコニウムの代わりに
８％セチルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液を用
いて同様にして固定化グルコースイソメラーゼを得た。

これを実施例１と同様に反応に供した結果、２５回目反
応における活性残存率は９６％であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　酵素を含有する酸性多糖類溶液を炭素原子数５以
   上の置換基を少なくとも１個有する４級アンモニウム塩
   で処理することを特徴とする、固定化酵素の製造法。 ２、　酵素を含有する酸性多糖類溶液を液膜状として処
   理することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
   方法。