JPH0353920B2 - - Google Patents
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- JPH0353920B2 JPH0353920B2 JP58199928A JP19992883A JPH0353920B2 JP H0353920 B2 JPH0353920 B2 JP H0353920B2 JP 58199928 A JP58199928 A JP 58199928A JP 19992883 A JP19992883 A JP 19992883A JP H0353920 B2 JPH0353920 B2 JP H0353920B2
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- Japan
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- acid
- hydroxybutyric acid
- absorbance
- measurement
- measuring
- Prior art date
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
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- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
（産業上の利用分野）
本発明は体液、殊に血清や血漿又は尿中のＤ−
３−ヒドロキシ酪酸の測定法であつて、酵素を利
用する簡易測定法並びにそのための測定試薬に係
る。 （従来の技術及びその課題） 糖質の供給不足乃至利用障害、ストレス、運動
過多、糖尿病等に起因して脂質分解及び脂肪酸の
酸化が亢進すると血中及び尿中におけるＤ−３−
ヒドロキシ酪酸やアセト酢酸量の増加することが
知られている。これらの化合物を測定すること
は、殊に糖尿病の病態把握に有用な指標となるの
で、臨床的に極めて意義のあることとされてい
る。 本発明者等も、これらの化合物の測定法につい
て従来から研究しており、本発明が対象としてい
るＤ−３−ヒドロキシ酪酸の測定に関しては、Ｄ
−３−ヒドロキシ酪酸を酵素反応によりアセト酢
酸に変換し、これを既存のアセト酢酸と共にｐ−
ニトロフエニルジアゾニウムフルオロボレートの
ジアゾニウム塩とカツプリング反応させることに
より呈色させ、ケトン体化合物総量として比色分
析により定量し、次いで上記の既存のアセト酢酸
量を減じてＤ−３−ヒドロキシ酪酸を定量する方
法を提案し（特開昭55−15004）、又その改良法と
して、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸を酵素反応により
脱水素するに際して、電子伝達体及びテトラゾリ
ウム塩を存在させ、生成するホルマザンの呈色度
を測定することによりＤ−３−ヒドロキシ酪酸を
定量する方法を提案した（特開昭59−162899）。 これらの方法は感度、精度共に優れているが、
前者の方法を実施する場合には測定操作に先だつ
て検体に除蛋白処理又は透析処理を施す必要性が
あり、又後者の方法においては生成するホルマザ
ンによる測定用セルの汚染、即ちセル壁へのホル
マザン色素の沈着が認められ、従つて上記の両方
法は多数の検体を対象とする自動分析装置への適
用に難があつた。 処で、酵素を用いるＤ−３−ヒドロキシ酪酸又
はアセト酢酸の測定法は、原理的には、下記の式
にて示される反応を利用している。 Ｄ−３−OHBA＋NAD+３−OHBADH ――――――――――→ ←―――――――――― AcAc＋NADH＋H+ Ｄ−３−OHBA：Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸、 NAD：ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイ
ド、 ３−OHBADH：３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素、 AcAc：アセト酢酸、 NADH：ニコチンアミドアデニンジヌクレオタ
イド還元体。 即ち、本発明の測定対象であるＤ−３−ヒドロ
キシ酪酸は、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の存
在下にNADと反応してアセト酢酸に変換され、
その際に生成するNADH量を例えば波長340nｍ
による吸光度測定を通じて定量することにより、
Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸が定量される。この場合
に、反応を更に完全に進行させるためには、反応
系中に硫酸ヒドラジンを添加し、アセト酢酸と硫
酸ヒドラジンとを反応させることによりアセト酢
酸を反応系から除去している。 しかしながら、上記の測定法は実際には、検体
の前処理として除蛋白や透析等の操作を行わなけ
れば、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸を特異的に定量す
ることはできない。 （課題を解決するための手段及び作用） 上記の、即ち検体に前処理を施すことを必要と
する原因は、主として、体液及び尿中に存在する
乳酸脱水素酵素、乳酸、ビルビン酸等が反応系に
緩衝を及ぼすためであろうと考えられる。そこ
で、本発明者等は、この原因を解明するために鋭
意検討を重ねた。 上記の酵素反応系はNAD又はその還元体であ
るNADHを補酵素とするものである。これらを
補酵素としており且つ検体である体液や尿中に存
在する他の酵素反応系は既に知られているものだ
けでも多数存在するので、ケトン体の測定に障害
となりそうな酵素反応系を先ず理論面から絞り込
み、次いでこれらの各酵素反応系に関して実験に
よる検討・確認を重ねた結果、ケトン体を精度良
好に測定しようとする場合に障害を及ぼしような
酵素反応系の殆どが乳酸脱水素酵素（LDH）反
応系に属するものであることを突き止め、これに
より測定系への乳酸脱水素酵素阻害剤の添加を考
えるに至り、乳酸脱水素酵素阻害剤として公知の
オキサミン酸、蓚酸等を測定系に共存させて種々
の実験を行い、その結果、オキサミン酸や蓚酸が
或る一定量以上反応系に存在すれば、検体に除蛋
白等の前処理を施さなくとも且つジアゾ化反応の
ような新たな呈色反応に導かなくとも、即ち
NADHの増減（本発明が対象としているＤ−３
−ヒドロキシ酪酸の定量の場合には増加であり、
又アセト酢酸の定量の場合には減少）を340nｍ
での吸光度測定を通じて調べることにより、測定
値にバラツキを生じることなしに、従つて精度良
好に定量することができ、又自動分析への途が開
かれ、本発明を完成するに至つた。 従つて、本発明によるＤ−３−ヒドロキシ酪酸
の測定法は、検体としての体液及び尿中のＤ−３
−ヒドロキシ酪酸をニコチンアミドアデニンジヌ
クレオタイド及び３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
の存在下でアセト酢酸に変換させ、その際生成す
るニコチンアミドアデニンジヌクレオタイド還元
体の量変化の測定により、Ｄ−３−ヒドロキシ酪
酸を定量するに際して、測定系にオキサミン酸及
び蓚酸から選ばれた乳酸脱水素酵素阻害剤を56
mg／dl以上の濃度で存在させ、これによつて検体
の除蛋白或は透析操作等の前処理を省略すること
を特徴としている。 一方、本発明によるＤ−３−ヒドロキシ酪酸の
測定試薬はニコチンアミドアデニンジヌクレオタ
イド、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素並びにオキ
サミン酸及び蓚酸から選ばれた乳酸脱水素酵素阻
害剤を含有していることを特徴としている。 尚、乳酸脱水素酵素阻害剤の濃度として、56
mg／dl以上となつており、通常は56mg／dl程度の
濃度で充分であるが、時には異常検体が測定対象
となる場合があるので、実用的には当該値の10倍
程度の濃度に設定するのが望ましく、1000mg／dl
又はそれ以上に設定しても測定自体に何等問題は
生じない。 一方、本発明方法において使用される３−ヒド
ロキシ酪酸脱水素酵素（３−OHBADH）として
はロドスピリルム・ルブルム（Rhodospirillum
rubrum）、プソイドモナス・レモイグネイ
（Pseudomonas lemoignei）等の細菌由来のもの
が用いられるが、動物由来のものを用いることも
できる。 （実施例等） 次に、試験例及び実施例［用手法と遠心式自動
分析装置（セントリフイケム・システム500）に
適用した場合］により本発明を更に詳細に且つ具
体的に説明する。 以下の実施例においてはNADHの量変化を測
定する方法として最も基本的なものである波長
340nｍでの吸光度測定を例にとつて説明するが、
電子伝達体やテトラゾリウム塩を共存させ、生成
するホルマザンの呈色度を水溶液又は試験紙等で
調べる方法（特開昭59−162899）や、同様に
NADHを直接的に又はその還元力を利用して調
べる蛍光法を利用することもできる。 尚、試薬としては下記のものが使用された。 (1) 補酵素試薬 0.2M／トリス塩酸緩衝液（PH8.5）23.7ml
に、20M／NAD3.0ml及び上記のトリス塩酸
緩衝液で溶解させた0.5％（Ｗ／Ｖ）硫酸ヒド
ラジン溶液３mlを添加して混和し、更にオキサ
ミン酸250mgを添加して溶解させた後に蒸留水
を添加して全量を33.5mlとしたもの。 (2) 酵素試薬 ドイツ国在、ベーリンガー・マンハイム社製
の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（グレード
、約15単位／ml）。 実施例 １ （用手法による測定） 上記の補酵素試薬と酵素試薬とを67：３の割合
で混合した試薬1050μに検体300μを添加して
測定液とし、直ちに波長340nｍにて吸光度を測
定する（この場合の吸光度をAxとする）。次い
で、上記の測定液を37℃において５分間振盪させ
た後に、再び波長340nｍにて吸光度測定を行い、
この吸光度をAyとする。一方、上記と同様にし
て、但し検体の代わりに蒸留水又は６％アルブミ
ン溶液を用いて調製した500μM／のＤ−３−
ヒドロキシ酪酸ナトリウム標準液で吸光度を測定
し、これらの吸光度をそれぞれBx及びBy並びに
Sx及びSyとし、これらの数値を下記の算式に代
入することにより、検体におけるＤ−３−ヒドロ
キシ酪酸の含有量（Ea）を算出する。 ［Ay−Ax−（By−Bx）］／［Sy−Sx −（By−Bx）］×500＝Ea（μM／） 尚、酵素試薬を別途に添加する場合には、補酵
素測定試薬1005μに検体300μを添加した後に
吸光度を測定し（この場合の吸光度をAx′とす
る）、その後に酵素試薬45μを添加して37℃で
５分間振盪させる。蒸留水又は６％アルブミン溶
液を用いて調製した500μM／のＤ−３−ヒド
ロキシ酪酸標準液に関する吸光度測定も同様に行
い、これらの吸光度をBx′及びSx′とする。この
場合には、上記の算式に代入するに当たつてAx、
Bx及びSxの代わりに下記を用いる。 Ax′x（1050／1005）、 Bx′x（1050／1005）及び Sx′x（1050／1005）。 試験例 １ 血清を検体としてＤ−３−ヒドロキシ酪酸を測
定する場合に、乳酸が存在すると、波長340nｍ
での吸光度がどのように変化するかについて調
べ、又乳酸を添加して乳酸の濃度と吸光度との関
係を調べた。 結果は第１図及び第２図に示される通りであつ
た。これらの図において、曲線１は３−ヒドロキ
シ酪酸脱水素酵素を添加したが、乳酸脱水素酵素
阻害剤であるオキサミン酸を添加しなかつた場合
に得られた曲線であり、曲線２は３−ヒドロキシ
酪酸脱水素酵素及びオキサミン酸を添加しなかつ
た場合に得らえた曲線であり、曲線３は３−ヒド
ロキシ酪酸脱水素酵素とオキサミン酸とを添加し
た場合に得られた曲線を示している。 この第１図及び第２図から、測定系中に乳酸が
存在すると、波長340nｍでの吸光度が変化する
ことが認められるが、その影響は、測定系中に乳
酸脱水素酵素阻害剤であるオキサミン酸を共存さ
せることにより、ほぼ完全に抑制し得ることが判
る。 試験例 ２ 試験例１と同様に、但し検体として尿を用いて
乳酸が吸光度に及ぼす影響を調べた結果は第３図
に示される通りであつた（この図中における曲線
１，２及び３の意味は試験例１におけるものと同
様である）。 尿中においては乳酸脱水素酵素の活性が血中と
比較して低く、乳酸の緩衝作用も低いためにオキ
サミン酸による効果が余り明確なものとは云えな
いが、オキサミン酸が測定系中に存在していると
測定結果に信頼性の向上することは明らかであ
る。 試験例 ３ オキサミン酸による乳酸脱水素酵素活性の阻害
率を調べた結果は第４図に示される通りであり、
乳酸脱水素酵素の活性を95％以上阻害するために
はオキサミン酸を56mg／dl以上の濃度で用いるべ
きことが判明した。尚、乳酸脱水素酵素阻害剤と
して蓚酸を用いる場合にも、オキサミン酸の場合
と同様であつた。 試験例 ４ オキサミン酸を共存させた条件下で、又はオキ
サミン酸を存在させない条件下で且つ標準溶液を
用いて吸光度の測定を行い、吸光度とＤ−３−ヒ
ドロキシ酪酸との関係を調べた結果は第５図に示
される通りであつた。 この第５図に示されている結果は、オキサミン
酸の存在自体が吸光度に及ぼす影響はないことを
強く示唆しており且つＤ−３−ヒドロキシ酪酸の
濃度と吸光度とは良好な直線性を示すので、第５
図のグラフは標準検量線として用いることができ
る。 試験例 ５ 26検体（血清）について本発明方法と、特開昭
59−5959公報に記載の方法（ジアゾニウム塩によ
りアゾ化合物を生成させて比色定量する方法）と
で測定し、相関関係を調べた結果は第６図に示さ
れている通りであり、両者は良好な相関を有する
ことが判明した。 尚、この場合に、本発明方法を実施するに際し
て使用されたオキサミン酸の濃度は、乳酸脱水素
酵素を95％以上阻害する濃度の10倍の濃度、即ち
560mg／dlであつた。 実施例 ２ （自動分析装置への適用） 検体100μ、６％アルブミン溶液を用いて調
製された500μM／のＤ−３−ヒドロキシ酪酸
ナトリウム標準液100μ及び試薬ブランクとし
ての蒸留水100μをセントリフイケム・システ
ム500アナライザーのサンプル・キヤビテイーに
正確に分注する。同様にして、Ｄ−３−ヒドロキ
シ酪酸測定用補酵素試薬と酵素試薬とを67：３の
割合で混合した試薬350μを、上記のシステム
500用のピペツターにより、トランスフアーデイ
スク上の試薬キヤビテイーに分注する。次いで、
トランスフアーデイスクをアナライザーのロータ
ー・チヤンバー内のローターにセツトして測定を
開始する。 尚、アナライザーを稼働させるための条件設定
は下記の通りである。 Temperature：37℃、 Filter：340nｍ、 To：3sec、 ΔT：6min、 Blank：Auto、 Test mode：Term、 Standard：500μM／ No.of print： 以上により、検体である血清等の体液や尿に除
蛋白や透析等の前処理を施すことなしに、波長
340nｍでの吸光度測定を通じてエンドポイント
法でNADHの増加度を調べることによりＤ−３
−ヒドロキシ酪酸を定量することができる。定量
の直線性は800μM／Ｉ迄認められ、同時再現性
はCV＝２−４％であり、添加回収率は血清及び
尿に関して共に98−108％であつた。尚、血清検
体に関して特開昭59−5959公報に開示されている
方法との相関を調べた処、相関係数γ＝0.99であ
り、極めて良好であつた。 従つて、本発明方法に従い測定系中に乳酸脱水
素酵素阻害剤を共存させれば、検体の前処理が不
要となり、自動分析装置へ適用の可能なことが明
らかとなつた 尚、検体の分注をシステム500用ピペツターに
より実施する際には、サンプル量を45μに且つ
トータル量を90μに設定する。この場合に感度
は約半分に低下するが、検量線の直線性は約２倍
となる。 上記のようにして、健常人20名を対象として血
清中に含有されているＤ−３−ヒドロキシ酪酸を
定量し、その濃度を平均値±標準偏差値（S.D.）
で調べた結果は下記の通りであつた。 40.6±17.15μM／ 更に、ケトアシドーシス検体１例を含む糖尿病
患者の10名を対象とし、血清中のＤ−３−ヒドロ
キシ酪酸を定量した結果は下記の表１に示される
通りであつた。
３−ヒドロキシ酪酸の測定法であつて、酵素を利
用する簡易測定法並びにそのための測定試薬に係
る。 （従来の技術及びその課題） 糖質の供給不足乃至利用障害、ストレス、運動
過多、糖尿病等に起因して脂質分解及び脂肪酸の
酸化が亢進すると血中及び尿中におけるＤ−３−
ヒドロキシ酪酸やアセト酢酸量の増加することが
知られている。これらの化合物を測定すること
は、殊に糖尿病の病態把握に有用な指標となるの
で、臨床的に極めて意義のあることとされてい
る。 本発明者等も、これらの化合物の測定法につい
て従来から研究しており、本発明が対象としてい
るＤ−３−ヒドロキシ酪酸の測定に関しては、Ｄ
−３−ヒドロキシ酪酸を酵素反応によりアセト酢
酸に変換し、これを既存のアセト酢酸と共にｐ−
ニトロフエニルジアゾニウムフルオロボレートの
ジアゾニウム塩とカツプリング反応させることに
より呈色させ、ケトン体化合物総量として比色分
析により定量し、次いで上記の既存のアセト酢酸
量を減じてＤ−３−ヒドロキシ酪酸を定量する方
法を提案し（特開昭55−15004）、又その改良法と
して、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸を酵素反応により
脱水素するに際して、電子伝達体及びテトラゾリ
ウム塩を存在させ、生成するホルマザンの呈色度
を測定することによりＤ−３−ヒドロキシ酪酸を
定量する方法を提案した（特開昭59−162899）。 これらの方法は感度、精度共に優れているが、
前者の方法を実施する場合には測定操作に先だつ
て検体に除蛋白処理又は透析処理を施す必要性が
あり、又後者の方法においては生成するホルマザ
ンによる測定用セルの汚染、即ちセル壁へのホル
マザン色素の沈着が認められ、従つて上記の両方
法は多数の検体を対象とする自動分析装置への適
用に難があつた。 処で、酵素を用いるＤ−３−ヒドロキシ酪酸又
はアセト酢酸の測定法は、原理的には、下記の式
にて示される反応を利用している。 Ｄ−３−OHBA＋NAD+３−OHBADH ――――――――――→ ←―――――――――― AcAc＋NADH＋H+ Ｄ−３−OHBA：Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸、 NAD：ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイ
ド、 ３−OHBADH：３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵
素、 AcAc：アセト酢酸、 NADH：ニコチンアミドアデニンジヌクレオタ
イド還元体。 即ち、本発明の測定対象であるＤ−３−ヒドロ
キシ酪酸は、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の存
在下にNADと反応してアセト酢酸に変換され、
その際に生成するNADH量を例えば波長340nｍ
による吸光度測定を通じて定量することにより、
Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸が定量される。この場合
に、反応を更に完全に進行させるためには、反応
系中に硫酸ヒドラジンを添加し、アセト酢酸と硫
酸ヒドラジンとを反応させることによりアセト酢
酸を反応系から除去している。 しかしながら、上記の測定法は実際には、検体
の前処理として除蛋白や透析等の操作を行わなけ
れば、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸を特異的に定量す
ることはできない。 （課題を解決するための手段及び作用） 上記の、即ち検体に前処理を施すことを必要と
する原因は、主として、体液及び尿中に存在する
乳酸脱水素酵素、乳酸、ビルビン酸等が反応系に
緩衝を及ぼすためであろうと考えられる。そこ
で、本発明者等は、この原因を解明するために鋭
意検討を重ねた。 上記の酵素反応系はNAD又はその還元体であ
るNADHを補酵素とするものである。これらを
補酵素としており且つ検体である体液や尿中に存
在する他の酵素反応系は既に知られているものだ
けでも多数存在するので、ケトン体の測定に障害
となりそうな酵素反応系を先ず理論面から絞り込
み、次いでこれらの各酵素反応系に関して実験に
よる検討・確認を重ねた結果、ケトン体を精度良
好に測定しようとする場合に障害を及ぼしような
酵素反応系の殆どが乳酸脱水素酵素（LDH）反
応系に属するものであることを突き止め、これに
より測定系への乳酸脱水素酵素阻害剤の添加を考
えるに至り、乳酸脱水素酵素阻害剤として公知の
オキサミン酸、蓚酸等を測定系に共存させて種々
の実験を行い、その結果、オキサミン酸や蓚酸が
或る一定量以上反応系に存在すれば、検体に除蛋
白等の前処理を施さなくとも且つジアゾ化反応の
ような新たな呈色反応に導かなくとも、即ち
NADHの増減（本発明が対象としているＤ−３
−ヒドロキシ酪酸の定量の場合には増加であり、
又アセト酢酸の定量の場合には減少）を340nｍ
での吸光度測定を通じて調べることにより、測定
値にバラツキを生じることなしに、従つて精度良
好に定量することができ、又自動分析への途が開
かれ、本発明を完成するに至つた。 従つて、本発明によるＤ−３−ヒドロキシ酪酸
の測定法は、検体としての体液及び尿中のＤ−３
−ヒドロキシ酪酸をニコチンアミドアデニンジヌ
クレオタイド及び３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
の存在下でアセト酢酸に変換させ、その際生成す
るニコチンアミドアデニンジヌクレオタイド還元
体の量変化の測定により、Ｄ−３−ヒドロキシ酪
酸を定量するに際して、測定系にオキサミン酸及
び蓚酸から選ばれた乳酸脱水素酵素阻害剤を56
mg／dl以上の濃度で存在させ、これによつて検体
の除蛋白或は透析操作等の前処理を省略すること
を特徴としている。 一方、本発明によるＤ−３−ヒドロキシ酪酸の
測定試薬はニコチンアミドアデニンジヌクレオタ
イド、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素並びにオキ
サミン酸及び蓚酸から選ばれた乳酸脱水素酵素阻
害剤を含有していることを特徴としている。 尚、乳酸脱水素酵素阻害剤の濃度として、56
mg／dl以上となつており、通常は56mg／dl程度の
濃度で充分であるが、時には異常検体が測定対象
となる場合があるので、実用的には当該値の10倍
程度の濃度に設定するのが望ましく、1000mg／dl
又はそれ以上に設定しても測定自体に何等問題は
生じない。 一方、本発明方法において使用される３−ヒド
ロキシ酪酸脱水素酵素（３−OHBADH）として
はロドスピリルム・ルブルム（Rhodospirillum
rubrum）、プソイドモナス・レモイグネイ
（Pseudomonas lemoignei）等の細菌由来のもの
が用いられるが、動物由来のものを用いることも
できる。 （実施例等） 次に、試験例及び実施例［用手法と遠心式自動
分析装置（セントリフイケム・システム500）に
適用した場合］により本発明を更に詳細に且つ具
体的に説明する。 以下の実施例においてはNADHの量変化を測
定する方法として最も基本的なものである波長
340nｍでの吸光度測定を例にとつて説明するが、
電子伝達体やテトラゾリウム塩を共存させ、生成
するホルマザンの呈色度を水溶液又は試験紙等で
調べる方法（特開昭59−162899）や、同様に
NADHを直接的に又はその還元力を利用して調
べる蛍光法を利用することもできる。 尚、試薬としては下記のものが使用された。 (1) 補酵素試薬 0.2M／トリス塩酸緩衝液（PH8.5）23.7ml
に、20M／NAD3.0ml及び上記のトリス塩酸
緩衝液で溶解させた0.5％（Ｗ／Ｖ）硫酸ヒド
ラジン溶液３mlを添加して混和し、更にオキサ
ミン酸250mgを添加して溶解させた後に蒸留水
を添加して全量を33.5mlとしたもの。 (2) 酵素試薬 ドイツ国在、ベーリンガー・マンハイム社製
の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（グレード
、約15単位／ml）。 実施例 １ （用手法による測定） 上記の補酵素試薬と酵素試薬とを67：３の割合
で混合した試薬1050μに検体300μを添加して
測定液とし、直ちに波長340nｍにて吸光度を測
定する（この場合の吸光度をAxとする）。次い
で、上記の測定液を37℃において５分間振盪させ
た後に、再び波長340nｍにて吸光度測定を行い、
この吸光度をAyとする。一方、上記と同様にし
て、但し検体の代わりに蒸留水又は６％アルブミ
ン溶液を用いて調製した500μM／のＤ−３−
ヒドロキシ酪酸ナトリウム標準液で吸光度を測定
し、これらの吸光度をそれぞれBx及びBy並びに
Sx及びSyとし、これらの数値を下記の算式に代
入することにより、検体におけるＤ−３−ヒドロ
キシ酪酸の含有量（Ea）を算出する。 ［Ay−Ax−（By−Bx）］／［Sy−Sx −（By−Bx）］×500＝Ea（μM／） 尚、酵素試薬を別途に添加する場合には、補酵
素測定試薬1005μに検体300μを添加した後に
吸光度を測定し（この場合の吸光度をAx′とす
る）、その後に酵素試薬45μを添加して37℃で
５分間振盪させる。蒸留水又は６％アルブミン溶
液を用いて調製した500μM／のＤ−３−ヒド
ロキシ酪酸標準液に関する吸光度測定も同様に行
い、これらの吸光度をBx′及びSx′とする。この
場合には、上記の算式に代入するに当たつてAx、
Bx及びSxの代わりに下記を用いる。 Ax′x（1050／1005）、 Bx′x（1050／1005）及び Sx′x（1050／1005）。 試験例 １ 血清を検体としてＤ−３−ヒドロキシ酪酸を測
定する場合に、乳酸が存在すると、波長340nｍ
での吸光度がどのように変化するかについて調
べ、又乳酸を添加して乳酸の濃度と吸光度との関
係を調べた。 結果は第１図及び第２図に示される通りであつ
た。これらの図において、曲線１は３−ヒドロキ
シ酪酸脱水素酵素を添加したが、乳酸脱水素酵素
阻害剤であるオキサミン酸を添加しなかつた場合
に得られた曲線であり、曲線２は３−ヒドロキシ
酪酸脱水素酵素及びオキサミン酸を添加しなかつ
た場合に得らえた曲線であり、曲線３は３−ヒド
ロキシ酪酸脱水素酵素とオキサミン酸とを添加し
た場合に得られた曲線を示している。 この第１図及び第２図から、測定系中に乳酸が
存在すると、波長340nｍでの吸光度が変化する
ことが認められるが、その影響は、測定系中に乳
酸脱水素酵素阻害剤であるオキサミン酸を共存さ
せることにより、ほぼ完全に抑制し得ることが判
る。 試験例 ２ 試験例１と同様に、但し検体として尿を用いて
乳酸が吸光度に及ぼす影響を調べた結果は第３図
に示される通りであつた（この図中における曲線
１，２及び３の意味は試験例１におけるものと同
様である）。 尿中においては乳酸脱水素酵素の活性が血中と
比較して低く、乳酸の緩衝作用も低いためにオキ
サミン酸による効果が余り明確なものとは云えな
いが、オキサミン酸が測定系中に存在していると
測定結果に信頼性の向上することは明らかであ
る。 試験例 ３ オキサミン酸による乳酸脱水素酵素活性の阻害
率を調べた結果は第４図に示される通りであり、
乳酸脱水素酵素の活性を95％以上阻害するために
はオキサミン酸を56mg／dl以上の濃度で用いるべ
きことが判明した。尚、乳酸脱水素酵素阻害剤と
して蓚酸を用いる場合にも、オキサミン酸の場合
と同様であつた。 試験例 ４ オキサミン酸を共存させた条件下で、又はオキ
サミン酸を存在させない条件下で且つ標準溶液を
用いて吸光度の測定を行い、吸光度とＤ−３−ヒ
ドロキシ酪酸との関係を調べた結果は第５図に示
される通りであつた。 この第５図に示されている結果は、オキサミン
酸の存在自体が吸光度に及ぼす影響はないことを
強く示唆しており且つＤ−３−ヒドロキシ酪酸の
濃度と吸光度とは良好な直線性を示すので、第５
図のグラフは標準検量線として用いることができ
る。 試験例 ５ 26検体（血清）について本発明方法と、特開昭
59−5959公報に記載の方法（ジアゾニウム塩によ
りアゾ化合物を生成させて比色定量する方法）と
で測定し、相関関係を調べた結果は第６図に示さ
れている通りであり、両者は良好な相関を有する
ことが判明した。 尚、この場合に、本発明方法を実施するに際し
て使用されたオキサミン酸の濃度は、乳酸脱水素
酵素を95％以上阻害する濃度の10倍の濃度、即ち
560mg／dlであつた。 実施例 ２ （自動分析装置への適用） 検体100μ、６％アルブミン溶液を用いて調
製された500μM／のＤ−３−ヒドロキシ酪酸
ナトリウム標準液100μ及び試薬ブランクとし
ての蒸留水100μをセントリフイケム・システ
ム500アナライザーのサンプル・キヤビテイーに
正確に分注する。同様にして、Ｄ−３−ヒドロキ
シ酪酸測定用補酵素試薬と酵素試薬とを67：３の
割合で混合した試薬350μを、上記のシステム
500用のピペツターにより、トランスフアーデイ
スク上の試薬キヤビテイーに分注する。次いで、
トランスフアーデイスクをアナライザーのロータ
ー・チヤンバー内のローターにセツトして測定を
開始する。 尚、アナライザーを稼働させるための条件設定
は下記の通りである。 Temperature：37℃、 Filter：340nｍ、 To：3sec、 ΔT：6min、 Blank：Auto、 Test mode：Term、 Standard：500μM／ No.of print： 以上により、検体である血清等の体液や尿に除
蛋白や透析等の前処理を施すことなしに、波長
340nｍでの吸光度測定を通じてエンドポイント
法でNADHの増加度を調べることによりＤ−３
−ヒドロキシ酪酸を定量することができる。定量
の直線性は800μM／Ｉ迄認められ、同時再現性
はCV＝２−４％であり、添加回収率は血清及び
尿に関して共に98−108％であつた。尚、血清検
体に関して特開昭59−5959公報に開示されている
方法との相関を調べた処、相関係数γ＝0.99であ
り、極めて良好であつた。 従つて、本発明方法に従い測定系中に乳酸脱水
素酵素阻害剤を共存させれば、検体の前処理が不
要となり、自動分析装置へ適用の可能なことが明
らかとなつた 尚、検体の分注をシステム500用ピペツターに
より実施する際には、サンプル量を45μに且つ
トータル量を90μに設定する。この場合に感度
は約半分に低下するが、検量線の直線性は約２倍
となる。 上記のようにして、健常人20名を対象として血
清中に含有されているＤ−３−ヒドロキシ酪酸を
定量し、その濃度を平均値±標準偏差値（S.D.）
で調べた結果は下記の通りであつた。 40.6±17.15μM／ 更に、ケトアシドーシス検体１例を含む糖尿病
患者の10名を対象とし、血清中のＤ−３−ヒドロ
キシ酪酸を定量した結果は下記の表１に示される
通りであつた。
【表】
【表】
尚、ニトロプルシツド法で測定した場合に陽性
を示す検体２例を含む尿検体５例について測定し
た結果は下記の表２に示される通りであつた。
を示す検体２例を含む尿検体５例について測定し
た結果は下記の表２に示される通りであつた。
【表】
（発明の効果）
体液又は尿を検体としてＤ−３−ヒドロキシ酪
酸を定量する場合に、本発明方法に従い、測定系
中にオキサミン酸及び蓚酸から選択された乳酸脱
水素酵素阻害剤を共存させれば、従来必要とされ
てきた検体の除蛋白や透析処理が不要となり、従
つて測定所要時間が短縮されるのみならず、操作
が簡易となるので自動分析装置への適用が可能と
なる。
酸を定量する場合に、本発明方法に従い、測定系
中にオキサミン酸及び蓚酸から選択された乳酸脱
水素酵素阻害剤を共存させれば、従来必要とされ
てきた検体の除蛋白や透析処理が不要となり、従
つて測定所要時間が短縮されるのみならず、操作
が簡易となるので自動分析装置への適用が可能と
なる。
第１図及び第２図は血清中のＤ−３−ヒドロキ
シ酪酸の測定系に乳酸が存在又は添加されている
場合に乳酸が吸光度に及ぼす影響を調べた結果を
示すグラフであり、第１図は一定量の乳酸が測定
系に存在する場合に吸光度を経時的に測定して吸
光度の変化を調べた結果を示すグラフであり、第
２図は乳酸の添加量を変化させて吸光度へ及ぼす
影響を調べた結果を示すグラフ、第３図は第２図
と同様の、但し尿を検体とする場合に乳酸が吸光
度に及ぼす影響を示すグラフ、第４図はオキサミ
ン酸による血清中での乳酸脱水素酵素阻害率を示
すグラフ、第５図はＤ−３−ヒドロキシ酪酸の量
と吸光度との関係を示す、検量線となるべきグラ
フであり、又オキサミン酸が測定精度に影響を与
えないことを示すグラフ、第６図は本発明方法と
特開昭59−5959公報に記載されている方法との相
関関係を示すグラフである。
シ酪酸の測定系に乳酸が存在又は添加されている
場合に乳酸が吸光度に及ぼす影響を調べた結果を
示すグラフであり、第１図は一定量の乳酸が測定
系に存在する場合に吸光度を経時的に測定して吸
光度の変化を調べた結果を示すグラフであり、第
２図は乳酸の添加量を変化させて吸光度へ及ぼす
影響を調べた結果を示すグラフ、第３図は第２図
と同様の、但し尿を検体とする場合に乳酸が吸光
度に及ぼす影響を示すグラフ、第４図はオキサミ
ン酸による血清中での乳酸脱水素酵素阻害率を示
すグラフ、第５図はＤ−３−ヒドロキシ酪酸の量
と吸光度との関係を示す、検量線となるべきグラ
フであり、又オキサミン酸が測定精度に影響を与
えないことを示すグラフ、第６図は本発明方法と
特開昭59−5959公報に記載されている方法との相
関関係を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 検体としての体液及び尿中のＤ−３−ヒドロ
キシ酪酸をニコチンアミドアデニンジヌクレオタ
イド及び３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の存在下
でアセト酢酸に変換させ、その際生成するニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオタイド還元体の量変
化の測定により、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸を定量
するに際して、測定系にオキサミン酸及び蓚酸か
ら選ばれた乳酸脱水素酵素阻害剤を56mg／dl以上
の濃度で存在させ、これによつて検体の除蛋白或
は透析操作等の前処理を省略することを特徴とす
る、体液及び尿中のＤ−３−ヒドロキシ酪酸の測
定法。 ２ ニコチンアミドアデニンジヌクレオタイド、
３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素並びにオキサミン
酸及び蓚酸から選ばれた乳酸脱水素酵素阻害剤を
含有していることを特徴とする、体液及び尿中の
Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸の測定試薬。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19992883A JPS6091998A (ja) | 1983-10-27 | 1983-10-27 | 体液及び尿中のｄ―３―ヒドロキシ酪酸の測定法並びにそのための測定試薬 |
| EP19840306671 EP0140589B1 (en) | 1983-10-27 | 1984-09-28 | Enzymatic determination of d-3-hydroxybutyric acid or acetoacetic acid, and reagents therefor |
| DE8484306671T DE3471496D1 (en) | 1983-10-27 | 1984-09-28 | Enzymatic determination of d-3-hydroxybutyric acid or acetoacetic acid, and reagents therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19992883A JPS6091998A (ja) | 1983-10-27 | 1983-10-27 | 体液及び尿中のｄ―３―ヒドロキシ酪酸の測定法並びにそのための測定試薬 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8456591A Division JPH0673480B2 (ja) | 1991-03-26 | 1991-03-26 | 体液及び尿中のアセト酢酸の測定法並びにそのための測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6091998A JPS6091998A (ja) | 1985-05-23 |
| JPH0353920B2 true JPH0353920B2 (ja) | 1991-08-16 |
Family
ID=16415923
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19992883A Granted JPS6091998A (ja) | 1983-10-27 | 1983-10-27 | 体液及び尿中のｄ―３―ヒドロキシ酪酸の測定法並びにそのための測定試薬 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0140589B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6091998A (ja) |
| DE (1) | DE3471496D1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| JPH0673473B2 (ja) * | 1986-04-01 | 1994-09-21 | コニカ株式会社 | 分析素子 |
| US4937047A (en) * | 1986-04-01 | 1990-06-26 | Konishiroku Photo Industry Co., Ltd. | Analytical element |
| FR2596865B1 (fr) * | 1986-04-04 | 1989-09-01 | Elf Aquitaine | Nouveau procede et dispositif pour le dosage de la carnitine |
| JPH01117799A (ja) * | 1987-10-30 | 1989-05-10 | Sekisui Chem Co Ltd | 生体成分測定用試験紙 |
| US5190863A (en) * | 1990-06-29 | 1993-03-02 | Miles Inc. | Composition for determining the presence or concentration of D-β-hydroxybutyrate |
| US5690944A (en) * | 1994-12-20 | 1997-11-25 | Chesebrough-Pond's Usa Co., Division Of Conopco, Inc. | Cosmetic compositions containing lactate dehydrogenase inhibitors |
| ES2189888T3 (es) * | 1995-11-02 | 2003-07-16 | Dade Behring Marburg Gmbh | Metodos para eliminar interferencias debidas a deshidrogenasas endogenas en ensayos enzimaticos. |
| US5861269A (en) * | 1996-11-01 | 1999-01-19 | Dade Behring Marburg Gmbh | Methods for removing interferences due to endogenous dehydrogenases in enzyme assays |
| EP2253711B1 (en) * | 2009-04-28 | 2014-01-01 | Bühlmann Laboratories AG | Methods, compositions and a kit suitable for determining the concentration of gamma-hydroxy butyric acid (GHB) in a sample |
| US20210003564A1 (en) * | 2017-03-06 | 2021-01-07 | Medtronic Minimed, Inc. | Ketone body sensing device and method |
| CN116018084A (zh) * | 2020-09-18 | 2023-04-25 | 美敦力迷你迈德公司 | 酮体感测装置和方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3956069A (en) * | 1974-04-29 | 1976-05-11 | Abbott Laboratories | Enzymatic assays for glucose, creatine phosphokinase or plasma ammonia |
| US4242446A (en) * | 1978-07-26 | 1980-12-30 | Coulter Electronics, Inc. | Method for determining a substance in a biological fluid and reagent combination for use in the method |
| JPS5844211B2 (ja) * | 1978-09-05 | 1983-10-01 | 幸男 繁田 | 血中ケトン体の高感度簡易比色分別定量法 |
-
1983
- 1983-10-27 JP JP19992883A patent/JPS6091998A/ja active Granted
-
1984
- 1984-09-28 EP EP19840306671 patent/EP0140589B1/en not_active Expired
- 1984-09-28 DE DE8484306671T patent/DE3471496D1/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3471496D1 (en) | 1988-06-30 |
| JPS6091998A (ja) | 1985-05-23 |
| EP0140589A1 (en) | 1985-05-08 |
| EP0140589B1 (en) | 1988-05-25 |
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