JPS61124382A

JPS61124382A - 線維素溶解活性酵素の固定化方法

Info

Publication number: JPS61124382A
Application number: JP24270584A
Authority: JP
Inventors: Yasuki Yabushita; 薮下　安紀; Katsuhiko Suyama; 陶山　勝彦; Kunihiko Takagi; 邦彦高木
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1984-11-16
Filing date: 1984-11-16
Publication date: 1986-06-12
Also published as: JPH0431668B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、担体に線維素溶解活性酵素を固定化する方法
に関するものである。

近年、各種血栓症や塞栓性疾患の治療等にフィブリン（
線維素）および血栓の溶解酵素である線維素溶解活性酵
素が広く用いられており、優れただ９床効果をもたらし
ている。また、線維素溶解活性酵素の優れた血栓の溶解
力を利用して高分子材料表面にこの酵素を固定化して抗
血栓性材料に使用するという報告もなされている（医学
のあゆみ１０１巻、１４４頁１９７７年）。

通常、担体に酵素を固定化する場合の固定化収率は３０
％前後といわれている。しかも、線維素溶解活性酵素は
活性安定性が必ずしも良好でなく固定化収率が低いため
、高単位量の酵素活性を担体に固定化しようとする場合
は、かなり多量の酵素が必要である。このように、固定
化時における線維素溶解活性酵素の失活による低固定化
収率は経済性も含め大きな問題である６したがって本発明の目的は、線維素溶解活性酵素の担体
への固定化時における失活を防ぎ固定化収率を高くする
方法を提供することにある。

本発明者等はかかる目的を達成すべ（鋭意研究を重ねた
結果、担体に線維素溶解活性酵素を固定化する際に、酵
素溶液に塩基性アミノ酸を含有せしめることにより、線
維素溶解活性酵素の固定化時の失活、変性を防止し、固
定化収率を高くできることを見出し１本発明を完成した
ものである。

すなわち本発明は、担体を線維素溶解活性酵素溶液で処
理して担体に線維素溶解活性酵素を固定化するに際し、
線維素溶解活性酵素溶液として塩基性アミノ酸を含有す
る線維素溶解活性酵素溶液を用いることを特徴とする線
維素溶解活性酵素の固定化方法である。

本発明に用いられる担体は、固体であればどのようなも
のでもよいが、好ましい担体としては。

たとえばガラス、カオリナイト、ベントナイト。

活性炭などの無機物質、天然ゴム、セルロース。

デンプン、コラーゲン、アガロース、デキストラン、タ
ンパク質などの天然高分子、ポリスチレン。

ポリアミド、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリエチレ
ン、ポリウレタン、ポリプロピレン、シリコン樹脂、ポ
リ塩化ビニル、ポリメタクリル酸エステル、ポリビニル
アルコール、エチレン酢酸ビ・ニル共重合体などの合成
高分子などからなる担体があげられる。

担体の形状は、と（に限定されず、たとえば繊維、中空
糸、チューブ、フィルム、皮膜、透過性膜、ピース、粉
末など目的に応じて種々の形状のものを用いることがで
きる。

本発明に用いられる線維素溶解活性酵素とは。

線維素の溶解に関与する酵素を意味する。そのような酵
素としては、たとえば、プラスミン、ブリクラーゼ。ウ
ロキナーゼ、ストレプトキナーゼ。

組織プラスミノーゲン・アクチベーターなどがあげられ
る。

本発明に用いられる塩基性アミノ酸とは２例えばアルギ
ニン、ヒスチジン、リジンなどのような塩基性側鎖を有
するアミノ酸を意味する。また。

本発明に用いられる塩基性アミノ酸にはそのエステル、
塩等の誘導体も含まれる。

本発明によって線維素溶解活性酵素を担体に固定化する
には、すでに知られている酵素の固定化方法が利用でき
、たとえば「固定化酵素」　（千畑一部編、講談社）、
特開昭５３−８８３９０号公報、特開昭５４−２６３９
４号公報などに記載されている方法が利用できる。たと
えば、担体を線維素溶解活性酵素溶液で処理する従来公
知の方法で担体に線維素溶解活性酵素を固定化する際に
、その酵素溶液に塩基性アミノ酸を含有せしめればよい
。酵素溶液に含有させる塩基性アミノ酸の濃度は、　１
０−”〜３０重量％、とくに１０−＠〜１０重景％であ
ることが好ましい。本発明において塩基性アミノ酸を含
有する線維素溶解活性酵素溶液としては、普通は水溶液
が用いられるが、場合によっては、塩あるいは水と混合
する有機溶媒を添加したものであってもよい。また、固
定化に際して好ましい温度は０〜５０℃であり、必要に
応じて攪拌、振とうなどを行なえばよい。

本発明によれば固定化時における線維素溶解活性酵素の
失活を防止し、固定化収率を著しく向上させることがで
きる。

以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明する
。

なお、線維製溶解活性は、金井、金井編著「臨床検査提
要」改訂第２７版（金属出版）Ｖｌ−１１０を参照し２
人フィブリノーゲン水溶液にトロンビン生理食塩水溶液
を添加して作成したフィブリン平板にて測定した。すな
わち、試料をフィブリン平板上におき、３７℃で２４時
間放置した後、試料のまわりのフィブリンの溶解の程度
（面積）を測定した。

実施例１直径５ｍｍの円形に切断したアミノアセクール化ポリビ
ニルアルコール・フィルム片（アミノアセタール化度５
．２モル％、厚さ１２０μ）を、エチレン−無水マレイ
ン酸共重合体の５ｗｔ％アセトン溶液中に浸漬して、室
温で５時間放置した。放置後のフィルム片をアセトンで
洗浄したのち乾燥した。

乾燥後のフィルム片を０．００５ｗｔ％のアルギニンを
含有したウロキナーゼ生理食塩水溶液（６００単位／ｍ
１）中に浸漬して７℃で２４時間放置した後２生理食塩
水にて洗浄した。

このようにして得られたウロキナーゼ固定化フィルム片
及びウロキナーゼ溶液の線維製溶解活性を測定したとこ
ろ、フィルム片には、用いたウロキナーゼの５０％が固
定化されており、また溶液中には３５％のウロキナーゼ
活性が残存していた。

比較のため、アルギニンを含有していないウロキナーゼ
溶液を用いた場合は、フィルム片は２５％、溶液は３０
％のウロキナーゼ活性を示した。

実施例２直径５ｍｍの円形に切断したポリウレタンフィルム（厚
さ１５０μ）を、無水マレイン酸−メチルビニルエーテ
ル共重合体２　（ｗｔ／ｖ）％と分子量４００のポリエ
チレングリコール１　　（ｗｔ／ｖ）％を溶解したアセ
トン溶液に室温で３０秒間浸漬し、ついで９０〜１００
℃で２時間減圧加熱した。このフィルムをアルギニンＯ
，００１ｗｔ％とヒスチジン０．（１０１ｗｔ％を含有
したウロキナーゼ酢酸緩衝溶液（６００単位／ｍｅ、０
．０１Ｍ酢酸、　ｐＨ４，０）中に浸漬して７℃で２４
時間放置した後、生理食塩水にて洗浄した。

このようにして得られたウロキナーゼ固定化フィルム及
びウロキナーゼ溶液の線維製溶解活性を測定したところ
、フィルム片には用いたウロキナーゼの６５％が固定化
されており、また溶液中には２５％のウロキナーゼ活性
が残存していた。

比較のため、アルギニン及びヒスチジンを含有していな
いウロキナーゼ溶液を用いた場合は、フィルムは４０％
、溶液は１０％のウロキナーゼ活性を示した。

実施例３内径２ｍ＋ａ、外径３．５　ｍｍ、長さ２０口のポリ塩
化ビニルチューブを、無水マレイン酸−メチルビニルエ
ーテル共重合体２　（ｗｔ／ν）％と分子量４００のポ
リエチレングリコール１　　（ｗｔ／ｖ）％を溶解した
アセトン溶液に室温で１分間浸漬し、ついで９０〜１０
０℃で２時間減圧加熱した。このチューブをＯ，Ｌ　　
ｗｔ％リジンを含有したＨｕｍａｎＭｅｌａｎｏｍａ　
Ｃｅ１ｌｌｉｎｅから分離精製した組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターの生理食塩水溶液（６００車位／ｍ１
）中に浸漬して７℃で２４時間放置した後、生理食塩水
にて洗浄した。

このようにして得られた組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター固定化ポリ塩化ビニルチューブの線維製溶解活性
を測定した。測定には２組織ブラスミノーゲンアクチベ
ーター固定化ポリ塩化ビニルチューブを長さ２１ｗＩＩ
＋の輪切に切断して行った。

その結果、チューブには、用いた組織ブラスミノーゲン
アクチベーターの５０％が固定化されており、溶液中に
は３５％の組織ブラスミノーゲンアクチベーター活性が
残存していた。

比較のため、リジンを含有していない組織プラスミノー
ゲンアクチベーター溶液を用いた場合はチューブは２０
％、溶液は３０％の組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー活性を示した。

実施例４市販のＣＮＢｒ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（ファルマシア
社）樹脂をＩｍＭ　ＨＣＩで数回洗浄後、この樹脂を０
．００１袈ｔ％ヒスチジンを含有したストレプトキナー
ゼの生理食塩水溶液（６００単位／　ｍ　ｌ　）中に浸
漬して４℃で２４時間放置した後、生理食塩水にて洗浄
した。

このようにして得られたストレプトキナーゼ固定化樹脂
の線維製溶解活性を測定したところ、樹脂には用いたス
トレプトキナーゼの５５％が固定化されており、また溶
液°中には３５％のストレプトキナーゼ活性が残存して
いた。

比較のため、ヒスチジンを含有していないストレプトキ
ナーゼ溶液を用いた場合は、樹脂は２５％、溶液は２０
％のストレプトキナーゼ活性を示した。

実施例５１ｗｔ％リジンを含有したウロキナーゼ酢酸緩衝溶液（
１２００単位／ｍ　６　、０．０５Ｍ酢酸、　ｐＨ４，
０）　　９ｍ（ｌに、アクリルアミド０．４７ｇ　　と
Ｎ、Ｎ’　　−メチレンビスアクリルアミド０．０３ｇ
を加え、過硫酸カリウム’ｌ　Ｑ　ｍ　（ｌとβ−ジメ
チルアミノプロピオニトリル８０μｌを加えたのち、０
℃で脱気し。

１夜冷室に放置後、生成したゲルを粉砕し、大量の酢酸
緩衝液（ｐｌ（４，０）で洗浄した。

このようにし才得られたウロキナーゼ包括（固定化）ゲ
ルの線維製溶解活性を測定したところ。

ゲルには、用いたウロキナーゼの５０％が固定化されて
いた。

比較例のため、リジンを含有していないウロキナーゼを
用いた場合、ゲルは２０％のウロキナ−ゼ活性を示した
。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）担体を線維素溶解活性酵素溶液で処理して担体に
線維素溶解活性酵素を固定化するに際し、線維素溶解活
性酵素溶液として塩基性アミノ酸を含有する線維素溶解
活性酵素溶液を用いることを特徴とする線維素溶解活性
酵素の固定化方法。
（２）塩基性アミノ酸を１０＾−＾１＾０〜３０重量％
含有する線維素溶解活性酵素溶液を用いる特許請求の範
囲第１項記載の方法。