JPS647788B2

JPS647788B2 -

Info

Publication number: JPS647788B2
Application number: JP56213389A
Authority: JP
Inventors: Takashi Kawasaki; Yoshiatsu Miura
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1981-12-30
Filing date: 1981-12-30
Publication date: 1989-02-10
Also published as: JPS58118763A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗血栓性材料に関し、詳しくは血液中
の内因性血液凝固因子の活性化を抑えた抗血栓性
材料に関する。人工臓器やカテーテル等の使用時に生ずる内因
性血液凝固は、血液と異物表面との接触による凝
固系第XII因子の活性化により初期反応が開始さ
れ、凝固系因子のカスケード的活性化の結果、
Xaやトロンビン等が生成され、最終的にはフイ
ブリン網が形成されることにより生じる。これらの活性化された凝固系因子は、血液中の
阻害物質であるアンチトロンビンによりその作
用が徐々に阻害されるが、ヘパリンの共存により
その阻害効果が著しく高められる、従つて、臨床
的に血液凝固の惹起が懸念される場合には、ヘパ
リンを投与することが常套手段となつている。こ
のため、人工心肺や人工腎臓等の人工臓器を利用
する場合には多量のヘパリンを投与することとな
るが、このような場合、出血傾向が顕著となる等
の多くの副作用を伴ない、これらの副作用は人工
臓器の長期使用により更に著しくなる。そこで、近時においては、ヘパリンを適宜の水
不溶性高分子担体に固定化し、これに血液を接触
させることにより、ヘパリンを血液中に混入しな
い状態に保持しつつ、これに血液中のトロンビン
等を捕捉せしめて血液の凝固を防止する方法が提
案されているが、ヘパリンのモービリテイや血液
中への脱離等のために満足すべき抗凝血性が発現
されない。一方、線溶系賦活化酵素であるウロキナーゼを
固定化し、生じたフイブリン網を溶解するように
した抗血栓材料も提案されているが、急激に生じ
るフイブリン塊等には効果が発揮されないままに
血栓が形成される問題がある。そこで、本発明者らは、従来の抗血栓性材料に
おける上記した種々の問題を解決すべく鋭意研究
した結果、ある種の塩基性タンパク質を固定化す
れば、血液中の内因性凝固因子の活性化を阻害す
ることができ、かくしてすぐれた抗血栓性材料を
得ることができることを見出して、本発明に至つ
たものである。従つて、本発明による抗血栓性材料は、プロタ
ミン、ヒストン、ポリリジン、ポリアルギニン及
びポリヒスチジンから選ばれる少なくとも一種の
塩基性タンパク質が固定化されていることを特徴
とする。本発明において塩基性タンパク質が固定化され
る材料は、生理学的に許容し得る材料、即ち生体
に対して実質的に有害に作用せず、且つ、上記塩
基性タンパク質の少なくとも一種が固定化されれ
ばどのような材料でも用いることができるが、通
常、高分子材料が用いられる。このような高分子
重合体材料としては、例えばポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリイソブチレン、ポリメチルペン
テン、ポリスチレン、天然ゴム、クロロプレンゴ
ム、ポリ塩化ビニル、ポリフツ化ビニル、ポリテ
トラフルオロエチレン、ポリ塩化ビニリデン、ポ
リ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、エチレン
−ビニルアルコール共重合体、ポリアクリロニト
リル、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリド
ン、ポリビニルホルマール、ポリビニルブチラー
ル、アセタール樹脂、アクリル樹脂、ポリアクリ
ルアミド、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタ
レート、ポリアミド、ポリイミド、セルロース、
ニトロセルロース、セロハン、コラーゲン、ゼラ
チン、多糖類等の合成及び天然重合体を例示する
ことができる。本発明の抗血栓性材料はこのような材料上にプ
ロタミン、ヒストン、ポリリジン、ポリアルギニ
ン及びポリヒスチジンから選ばれる少なくとも一
種の塩基性タンパク質が固定化されて形成されて
いる。材料への塩基性タンパク質の固定化の方法
は何ら制限されず、従来より知られているタンパ
ク質固定化方法を任意に用いることができ、例え
ば、共有結合法、イオン結合法等の適宜の方法が
用いられる。例えばカルボジイミド試薬或いはウ
ツドワード試薬と共に上記タンパク質を材料に反
応させれば容易に共有結合にて固定化され、ま
た、上記タンパク質の水溶液又は懸濁液に材料を
浸漬すればイオン結合にて固定化される。材料に固定化される塩基性タンパク質の量につ
いては特に制限はないが、好ましくは材料の表面
の大部分乃至全部を被覆するように固定化され
る。また、本発明においては、材料には上記塩基
性タンパク質と共に他の抗凝血物質、例えばヘパ
リン、アンチトロンビンやウロキナーゼ等が固
定化されていてもよい。一般に高分子材料と血液との接触によつて惹起
される血栓形成の一つの重要な原因は、高分子材
料表面における凝固系第XII因子の活性化である。
この第XII因子の詳細な活性化機序は未だ十分にな
されていないが、第XII因子の活性化にはプレカリ
クレインと高分子キニノーゲンの存在が必要であ
り、これら三者が材料の固相表面上である種の複
合体を形成して活性化反応に関与すると考えられ
ている。本発明による抗血栓材料は、何ら理論に
より制約を受けるものではないが、材料に固定化
された塩基性タンパク質が材料表面への上記三つ
の因子の少なくとも一つの付着を妨げて、活性化
反応に関与する複合体の形成を阻止することによ
つて、抗血栓性を発現するのであろう。尚、塩基性タンパク質の代わりに塩基性アミノ
酸を担体に固定化しても、抗血栓性は発現され
ず、高分子量の塩基性タンパク質を固定化して初
めて抗血栓性が発現される。本発明による抗血栓性材料は、使用目的に応じ
て、担体を予め所要形状に形成しておけば、粒子
状、シート状、管状等のいずれの形態でも調製で
きる。本発明による抗血栓性材料は以上のように材料
表面に塩基性タンパク質が固定化されており、こ
の塩基性タンパク質が材料表面での血栓形成を未
然に阻止するので、血行回路、反応器等の直接血
液と接触する人工臓器に使用すれば、血液凝固系
の活性化に伴う血栓形成を効果的に阻止すること
ができる。以下に実施例により本発明を説明するが、本発
明はこれら実施例により何ら制限されるものでは
ない。実施例１ (1) 固定化材料としてアガロースゲル（CM−セフアロ
ーズCL−6B、Phamacia Fine Chemicals社）
を用い、この材料上にメチルアミン、グリシ
ン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アルブ
ミン、プロタミン、ヒストン、ポリリジン（分
子量約10000）、ポリアルギニン（分子量約
60000）又はポリヒスチジン（分子量約15000）
を固定化した。固定化は次のようにして行なつた。即ち、材
料を2.0M塩化カリウム水溶液に懸濁、洗浄後、
蒸留水（PH4.5）で洗浄し、蒸留水（PH4.5）に
５ｇ／50ml量で懸濁した。この懸濁液にＮ−エ
チル−N′−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド塩酸塩（EDC）の0.2M溶液（PH
4.5）50mlを混合し、更に上記アミノ酸又は塩
基性タンパク質10mg乃至１ｇを添加し、PHを
4.5に調整しつつ、室温で約４時間反応させた。反応後、0.1M酢酸緩衝液（PH4.0）と0.1M
NaHCO₃緩衝液（0.5M NaCl、PH8.3）で交互
に２回ずつ洗浄し、更に10ｍＭリン酸緩衝液
（0.145M NaCl、PH7.4）にて洗浄し、この緩衝
液中に懸濁させて、４℃の温度で使用まで保存
した。 (2) 試験 (a) 上で得た各固定化ゲル10mg（乾燥重量）
と、0.2重量％のカオリンとを含有する10ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（0.145M NaCl、PH
7.4）100μと、家兎クエン酸処理血漿100μ
に合成基質Carbobenzoxy−phenyl−
arginyl−４−methylco−umaryl−７−
amide（ｚ−Phe−Arg−AMC）を加えた上
記と同じトリス−塩酸緩衝液1.0mlとをポリ
エチレン試験管に入れ、37℃の温度で45分間
反応させた後、17重量％酢酸水溶液2.0mlを
加えて反応を停止させ、螢光分光光度計（励
起波長380nｍ、反射波長460nｍ）にて遊離
したAmino−me−thyl−Coumarin（AMC）
の濃度を測定した。結果を第１表に示す。 (b) 上で得た各固定化ゲル20mg（乾燥重量）を
含有する50ｍＭリン酸緩衝液（PH7.4）200μ
と、家兎クエン酸処理血漿100μと、上
記合成基質を含有する上記と同じリン酸緩衝
液1.0mlとをポリエチレン試験管に入れ、37
℃の温度で60分間反応させた後、17重量％酢
酸水溶液2.0mlを加えて反応を停止させ、(a)
と同様にして遊離AMC量を測定した。結果
を第１表に示す。尚、本試験で用いた合成基質は凝固系第XII
因子に対するものではなく、カリクレインに
対するものであるが、第XII因子の活性化に伴
つてプレカリクレインも活性化されてカリク
レインとなることが知られており、従つて、
遊離AMC量によつて凝固系の活性化の程度
を知ることが

【表】できる（三浦喜温ら、人工臓器、９、907
（1980））。第１表から明らかなように、試験(a)におい
ては凝固系の活性化を顕著にするカオリンが
存在するにもかかわらず、本発明に従つて塩
基性タンパク質又は塩基性アミノ酸ポリマー
が固定化されている材料によれば、凝固系の
活性化が著しく抑制されている。また、試験
(b)においてはアガロースゲルにより凝固系の
活性化が惹起されやすいように系のイオン強
度を低くしたが、同様に本発明の固定化材料
によれば凝固系の活性化が著しく抑えられて
いる。この結果と対照的に、塩基性アミノ酸
モノマーの場合には凝固系の活性化を抑える
効果は全く認められない。 (c) 固定化ゲルの抗血栓性を凝固時間法により
評価した。 10ｍＭリン酸緩衝液（0.145M NaCl、PH
7.4）に各固定化ゲル６mgを含有する懸濁液
100μ、リン脂質を10mg／100ml濃度で含有
する25ｍMCa²⁺溶液100μ、及びプラズマ
（クエン酸処理家兎全血を1500Gで15分間遠
心分離して得られる上澄液）100μをシリ
コン処理試

【表】験管に入れ、室温で緩やかに振とうしながら
反応させて凝固時間を測定した。結果を第２
表に示す。塩基性タンパク質及び塩基性アミ
ノ酸ポリマーの固定化された材料のみが血液
凝固を阻害することが明らかである。参考例本発明の抗血栓性材料は、材料に固定化された
塩基性タンパク質に凝固系第XII因子、プレカリク
レイン又は高分子キニノーゲンの少なくとも一種
が結合し、これによつて凝固系の活性化が阻害さ
れると考えられるので、この点を明らかにした。プラズマ（クエン酸処理した家兎全血を1500G
で15分間遠心分離して得られる上澄液）400μ
と、10ｍＭリン酸緩衝液（0.145M NaCl、PH7.4）
に固定化プロタミンゲルを６mg（乾燥重量）／
100μの量で懸濁せた懸濁液400μと、10ｍＭ
リン酸緩衝液（0.145M NaCl、PH4.5）400μと
をポリスチレン試験管に入れ、室温で10分間振と
うした後、700Gで５分間遠心分離して上澄液○イ
を得た。次に、上記遠心分離後の固定化プロタミ
ンゲルに2.0M塩化ナトリウム1.0mlを加え、室温
で10分間振とうした後、700Gで５分間遠心分離
して上澄液○ロを得た。上記上澄液○イ及び○ロを用い、次の反応系１〜３
を調製した。反応系１上澄液○イ200μ、10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.4）
550μ及び1.0M NaCl250μ 反応系２上澄液○ロ200μ、10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.4）
750μ及び1.0M NaCl50μ 反応系３上澄液○イ200μ、上澄液○ロ200μ及び10ｍＭ
リン酸緩衝液（PH7.4）600μ これらの各反応系に0.2ｍＭの合成基質ｚ−Phe
−Arg−MCAを含有する10ｍＭリン酸緩衝液
（PH7.4）1.0mlを加え、表面で凝固系の活性化が
顕著に起こるガラス管内で37℃の温度で30分間反
応させた後、17重量％酢酸3.0mlを加えて反応を
停止させた。この後、生成AMC量を前記と同様
にして測定した。結果を第３表に示す。以上の結果から、プロタミン固定化ゲルにより
第XII因子、プレカリクレイン又は高分子キニノー
ゲンの少なくとも一種が除かれたプラズマ上澄液
（反応系１）と、プロタミン固定化ゲルから2.0M
NaClによつて遊離された因子（反応系２）とは、
それらのみによつては凝固系を活性化しないが、
反応系１及び２を共存させることにより上記三因
子をすべて共存させた場合に凝固系が活性化され
た（反応系３）。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１プロタミン、ヒストン、ポリリジン、ポリア
ルギニン及びポリヒスチジンから選ばれる少なく
とも一種の塩基性タンパク質が固定化されている
ことを特徴とする抗血栓性材料。