JPS61128896A - 発酵法によるｌ−チロシンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−チロシンの製造法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の目的〕
〈産業上の利用分野〉
本発明は発酵法によるＬ−チロシン（以下、チロシンと
記す）の製造法に関する。チロシンは副腎髄質ホルモン
、チロキシン、メラニン、アルカロイドなどの前駆体と
して利用される。従来発酵法によるチロシンの製造法と
してはブレビバクテリウム属細菌のＬ〜フヱニルアラニ
ン要要求中フェニルアラニンアナログに耐性を有する変
異株を使用する方法（Ａｇｒｉｃ、 Ｂｌｏｔ、 Ｃｈ
ｅｍ、 、 ３７ （１０）２３２７〜２３３６ （１
９７３） 、特公昭４９−３８８３７）などが知られて
いる。
記す）の製造法に関する。チロシンは副腎髄質ホルモン
、チロキシン、メラニン、アルカロイドなどの前駆体と
して利用される。従来発酵法によるチロシンの製造法と
してはブレビバクテリウム属細菌のＬ〜フヱニルアラニ
ン要要求中フェニルアラニンアナログに耐性を有する変
異株を使用する方法（Ａｇｒｉｃ、 Ｂｌｏｔ、 Ｃｈ
ｅｍ、 、 ３７ （１０）２３２７〜２３３６ （１
９７３） 、特公昭４９−３８８３７）などが知られて
いる。
〈本発明が解決しようとする問題点〉
本発明が解決しようとする問題点は更に安価にチロシン
を製造することにある。
を製造することにある。
〈問題点を解決するための手段〉
本発明者等は発酵法によシ更に安価にチロシンを製造す
る方法を開発すべく研究を行なった結果、ブレビバクテ
リウム属細菌にチロシン生産能とともにぎルピン酸キナ
ーゼ活性の低下という性質を併せ持たせたところ、従来
のピルビン酸キナーゼ活性の低下を持たないチロシン生
率菌より更に大量にチロシンを生産することを見い出し
た。こＱ２発明はこの知見に基づいて更に研究の結果完
成されたものである。
る方法を開発すべく研究を行なった結果、ブレビバクテ
リウム属細菌にチロシン生産能とともにぎルピン酸キナ
ーゼ活性の低下という性質を併せ持たせたところ、従来
のピルビン酸キナーゼ活性の低下を持たないチロシン生
率菌より更に大量にチロシンを生産することを見い出し
た。こＱ２発明はこの知見に基づいて更に研究の結果完
成されたものである。
本発明のチロシン製造法において用いられる微生物は、
ブレビバクテリウム属に属しピルビン１、酸キナーゼ活
性が低下していてかつチロシン生産能に必要な性質、例
えばｍ−７０ロフェニルアラニン耐性を有する変異株で
ある。それらの性質の他に更にＬ−フェニルアラニン要
求性、他のフェニルアラニンアナログ耐性、チロシンア
ナログ耐性などを゛付与すると生産能を更に向上さぜる
ことができる。
ブレビバクテリウム属に属しピルビン１、酸キナーゼ活
性が低下していてかつチロシン生産能に必要な性質、例
えばｍ−７０ロフェニルアラニン耐性を有する変異株で
ある。それらの性質の他に更にＬ−フェニルアラニン要
求性、他のフェニルアラニンアナログ耐性、チロシンア
ナログ耐性などを゛付与すると生産能を更に向上さぜる
ことができる。
本発明の変異株の親株は、いわゆるＬ−グルタミン酸生
産菌として知られているブレビバクテリウム属の微生物
であシ、例えば次のような菌株をあげることができる。
産菌として知られているブレビバクテリウム属の微生物
であシ、例えば次のような菌株をあげることができる。
ブレビバクテリウム ７ラパムＡＴＣＣ１４０６７プレ
ビパクテリウム ディバリオタムＡＴＣＣ１４０２０ブ
レビバクテリウム ラクトファーメンタムＡＴｃｃ１３
８６９ブレヒハクテリウム ロゼラムＡＴＣＣ１３８２
５本発明で用いる変異株はこれら上述の菌株を親株とし
て変異操作を施して、ピルビン酸キナーゼ活性の低下及
びチロシン生産能を付与することによって得られる。な
お変異操作は通常の方法、例えば紫外線照射或いはＮ−
メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下
、ＮＧと略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理によって行な
うことができる。
ビパクテリウム ディバリオタムＡＴＣＣ１４０２０ブ
レビバクテリウム ラクトファーメンタムＡＴｃｃ１３
８６９ブレヒハクテリウム ロゼラムＡＴＣＣ１３８２
５本発明で用いる変異株はこれら上述の菌株を親株とし
て変異操作を施して、ピルビン酸キナーゼ活性の低下及
びチロシン生産能を付与することによって得られる。な
お変異操作は通常の方法、例えば紫外線照射或いはＮ−
メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下
、ＮＧと略す）、亜硝酸等の化学薬剤処理によって行な
うことができる。
なおピルビン酸キナーゼ活性の低下した変異株は親株を
変異処理し変異処理した菌体のピルビン酸キナーゼ活性
を測定し、選択することによって得ることができる（特
開昭５８−１７０４８７）。
変異処理し変異処理した菌体のピルビン酸キナーゼ活性
を測定し、選択することによって得ることができる（特
開昭５８−１７０４８７）。
以下に本発明の使用菌株の一例プレビパクテリウムフラ
パムＡＪ−１２１７９（ＦＥＲＭ−Ｐ ’ＩＱＩ３
）の具体的誘導方法を示す。即ち特願昭５８−１７０
４８７記載のピルビン酸キナーゼ活性低下株プレビバク
テリウムフラパムＡＪ−１１９５５（ＦＥＲＭ−Ｐ６６
６５）を親株として、これよりフェニルアラニンアナロ
グ耐性株を誘導した。ブレビバクテリウムフラバムＡＪ
−１１９５５ｕ１５０μＷのＮＧで３０℃１５分間処理
しｆｃ（生残率２、０ ％ ）。ついで第−表に示す合
成培地に親株が生育できない濃度の８００μｇＡｎｌに
々るようにフェニルアラニンのアナログの一つであるＤ
Ｌ −ｍ−フロロフェニルアラニンを添加して平板培地
を作製し、これに変異処理したＡＪ−１１９５５株を塗
布し、３０℃１０日間放置後、コロニーとして生育する
菌株即ちｍ−フロロフェニルアラニン耐性変異株を採取
し、このうち、チロシン生産能のすぐれた変異株ＡＪ−
１２１７９（ＦＥＲＭ−Ｐ ７Ｑｔ３ ）（ヒルピン
酸キナーゼ低下、ｍ−）′ロロフェニルアラニン耐性、
５−（２−アミノエチル） −Ｌ−システィン耐性）を
採取した。この変異株は実施例に示すようにピルビン酸
キナーゼ活性を有するｍ−フロロフェニルアラニン耐性
チロシン生産変異株ＡＪ−１２１８０（ＦＥＲＭ−Ｐ
７’／／４ ）よシチロシンを１．７倍も多く生成し
た。
パムＡＪ−１２１７９（ＦＥＲＭ−Ｐ ’ＩＱＩ３
）の具体的誘導方法を示す。即ち特願昭５８−１７０
４８７記載のピルビン酸キナーゼ活性低下株プレビバク
テリウムフラパムＡＪ−１１９５５（ＦＥＲＭ−Ｐ６６
６５）を親株として、これよりフェニルアラニンアナロ
グ耐性株を誘導した。ブレビバクテリウムフラバムＡＪ
−１１９５５ｕ１５０μＷのＮＧで３０℃１５分間処理
しｆｃ（生残率２、０ ％ ）。ついで第−表に示す合
成培地に親株が生育できない濃度の８００μｇＡｎｌに
々るようにフェニルアラニンのアナログの一つであるＤ
Ｌ −ｍ−フロロフェニルアラニンを添加して平板培地
を作製し、これに変異処理したＡＪ−１１９５５株を塗
布し、３０℃１０日間放置後、コロニーとして生育する
菌株即ちｍ−フロロフェニルアラニン耐性変異株を採取
し、このうち、チロシン生産能のすぐれた変異株ＡＪ−
１２１７９（ＦＥＲＭ−Ｐ ７Ｑｔ３ ）（ヒルピン
酸キナーゼ低下、ｍ−）′ロロフェニルアラニン耐性、
５−（２−アミノエチル） −Ｌ−システィン耐性）を
採取した。この変異株は実施例に示すようにピルビン酸
キナーゼ活性を有するｍ−フロロフェニルアラニン耐性
チロシン生産変異株ＡＪ−１２１８０（ＦＥＲＭ−Ｐ
７’／／４ ）よシチロシンを１．７倍も多く生成し
た。
次にこの操作によって得られた変異株ＡＪ−１２１７９
のピルビン酸キナーゼ活性及びｍ−フロロフェニルアラ
ニンに対する耐性の度合を親株ＡＪ−１１９５５、野生
株ＡＴＣＣ−１４０６７、ピルビン酸キナーゼ活性を有
するチロシン生産株ＡＪ−１２１８０と比較した結果を
それぞれ第三表、第三表に示した。
のピルビン酸キナーゼ活性及びｍ−フロロフェニルアラ
ニンに対する耐性の度合を親株ＡＪ−１１９５５、野生
株ＡＴＣＣ−１４０６７、ピルビン酸キナーゼ活性を有
するチロシン生産株ＡＪ−１２１８０と比較した結果を
それぞれ第三表、第三表に示した。
なお、ピルビン酸キナーゼ活性の測定はＡｇｒｉｃ。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 、４８ 、 （５） １１８
９〜１１９７（１９８４）に従って行なった。またｍ−
７０ロフエニルアラニンに対する耐性の度合は次のよう
罠調べた。第−表に示す合成培地にＤＬ −ｍ−７０ロ
フエニルアラニンな第三表に示した濃度になるように溶
解して、平板培地（直径８．５ 、 ）を作り、各々の
培地に第四衣に示した培地に生育した菌をおよそ１０７
コ接種した後３０℃で４日間培養を行ない生成したコロ
ニー数を調べた。
９〜１１９７（１９８４）に従って行なった。またｍ−
７０ロフエニルアラニンに対する耐性の度合は次のよう
罠調べた。第−表に示す合成培地にＤＬ −ｍ−７０ロ
フエニルアラニンな第三表に示した濃度になるように溶
解して、平板培地（直径８．５ 、 ）を作り、各々の
培地に第四衣に示した培地に生育した菌をおよそ１０７
コ接種した後３０℃で４日間培養を行ない生成したコロ
ニー数を調べた。
第三表及び第三表に示すようにＡＪ−１２１７９株はピ
ルビン酸キナーゼの低下及びｍ−７０ロフエニルアラニ
ンに対して耐性の両性質を有していることが判明した。
ルビン酸キナーゼの低下及びｍ−７０ロフエニルアラニ
ンに対して耐性の両性質を有していることが判明した。
なお本発明で言うｍ−７０ロフエニルアラニン耐性とは
上記培養条件下でＤＬ −ｍ−７０ロフエニルアラニン
を３０００４／ｍｌ含む上−記培地に微生物をおよそ１
０ ：＝７接種し３０℃で４日間培養後１０００コ以上
のコロニーを生成する場合を言う。
上記培養条件下でＤＬ −ｍ−７０ロフエニルアラニン
を３０００４／ｍｌ含む上−記培地に微生物をおよそ１
０ ：＝７接種し３０℃で４日間培養後１０００コ以上
のコロニーを生成する場合を言う。
チロシン生産用の培貴培地は特に制限するところは力く
、炭素源、窒素源、無機塩及び必要ならば有機微量栄養
素を含有する通常の培地である。
、炭素源、窒素源、無機塩及び必要ならば有機微量栄養
素を含有する通常の培地である。
炭素源としては炭水化物（グルコース、フラクトース或
いはデンプン、セルロース等の加水分解物、糖蜜等）、
有機酸（酢酸、クエン酸等）、アルコ−／ｌ”＋ ル（グリセリン、エタノール等）、或いは炭化水素（ノ
ルマルパラフィン等）が使用できる。窒素源としては硫
酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、アンモニアガス、その他
を、無機塩としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩、鉄塩、マンガン塩、その他微量金属塩等を必要
に応じて使用する。有機微量栄養素としては、栄養要求
性のある場合には該当するアミノ酸、ビタミン、脂肪酸
類、有機塩基物質等を適量添加し、必要に応じて更に生
育促進物質としてアミノ酸、ビタミン、味液（登録商標
、大豆加水分解物）、酵母エキス、ベノトン、カザミノ
酸等が使用できる。
いはデンプン、セルロース等の加水分解物、糖蜜等）、
有機酸（酢酸、クエン酸等）、アルコ−／ｌ”＋ ル（グリセリン、エタノール等）、或いは炭化水素（ノ
ルマルパラフィン等）が使用できる。窒素源としては硫
酸アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、アンモニアガス、その他
を、無機塩としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシ
ウム塩、鉄塩、マンガン塩、その他微量金属塩等を必要
に応じて使用する。有機微量栄養素としては、栄養要求
性のある場合には該当するアミノ酸、ビタミン、脂肪酸
類、有機塩基物質等を適量添加し、必要に応じて更に生
育促進物質としてアミノ酸、ビタミン、味液（登録商標
、大豆加水分解物）、酵母エキス、ベノトン、カザミノ
酸等が使用できる。
培養条件は通常の方法でＰＨ５ないし９、温度は２０な
いし４０℃で好気的条件下に２４ないし７２時間培養す
れば良い。培養中に−が下がる場合には炭酸カルシウム
を別殺菌して加えるか又はアンモニア水、アンモニアガ
ス等のアルカリで中和する。又有機酸を炭素源とする場
合は−の上昇を鉱酸又は有機酸で中和する。
いし４０℃で好気的条件下に２４ないし７２時間培養す
れば良い。培養中に−が下がる場合には炭酸カルシウム
を別殺菌して加えるか又はアンモニア水、アンモニアガ
ス等のアルカリで中和する。又有機酸を炭素源とする場
合は−の上昇を鉱酸又は有機酸で中和する。
チロシンの単離採取は常法によって行いつる。
得られたものはペーパークロマトグラム上のＲｆ値及び
微生物定量法による生物活性値にょシ、チロシン標品の
それらと一致することを確めチロシンと同定した。
微生物定量法による生物活性値にょシ、チロシン標品の
それらと一致することを確めチロシンと同定した。
チロシンの定量はロイコノストックメセンテロイデス（
ＡＴＣＣ８０４２）を用いる微生物定量法に従って行な
った。
ＡＴＣＣ８０４２）を用いる微生物定量法に従って行な
った。
以下、実施例にて説明する。
実施例１
下記第五衣に示した組成のチロシン生産用培地２０ｍ１
を５００ ｔｎｌ容のフラスコに分注し、これに第六表
に示す微生物をそれぞれ１白金耳植えつけ３０℃で７２
時間振盪培養した。それぞれの培養液中のチロシン生成
量は第六表の如くであった。
を５００ ｔｎｌ容のフラスコに分注し、これに第六表
に示す微生物をそれぞれ１白金耳植えつけ３０℃で７２
時間振盪培養した。それぞれの培養液中のチロシン生成
量は第六表の如くであった。
第−表 合成培地組成
グルコース ２０９／を
硫酸アンモニウム ５ 〃尿 素
２ 〃リン酸１カリウム
ＩＩノ硫酸マグネシウム
ｌ ｇ硫酸第１鉄 １０１ｎ９／を硫
酸マンガン ８ 〃 ｄ−ビオチン ５０μＶＬビタミンＢ、・
塩酸塩 ２０００μＶｔ寒 天
２０ ｇ／ｌｐＨ６，６ 第二衣 菌株のピルビン酸キナーゼ活性ＡＴＣＣ１４０
６７（野生株） １００ＡＪ−１１９５５０，
２ ＡＪ−１２１８０９８ ＡＪ−１２１７９０，１ （ｑ） 第三衣 菌株のｍ−７０口フェニルアラニン耐性度０
＋ ＋ ＋（ト）はコロニー
数１０００以上を表わし、←）はコロニー数が０の場合
を示す。
２ 〃リン酸１カリウム
ＩＩノ硫酸マグネシウム
ｌ ｇ硫酸第１鉄 １０１ｎ９／を硫
酸マンガン ８ 〃 ｄ−ビオチン ５０μＶＬビタミンＢ、・
塩酸塩 ２０００μＶｔ寒 天
２０ ｇ／ｌｐＨ６，６ 第二衣 菌株のピルビン酸キナーゼ活性ＡＴＣＣ１４０
６７（野生株） １００ＡＪ−１１９５５０，
２ ＡＪ−１２１８０９８ ＡＪ−１２１７９０，１ （ｑ） 第三衣 菌株のｍ−７０口フェニルアラニン耐性度０
＋ ＋ ＋（ト）はコロニー
数１０００以上を表わし、←）はコロニー数が０の場合
を示す。
第四衣 シード培養培地
グルコース ２０９／を
硫酸アンモニウム １ｏｇ７を尿
素 ３ １７／ｌリン酸１
カリウム Ｉ Ｖｔ硫酸マグネシウム
０．４Ｖｔ硫酸第１鉄 １０ｒＩ
ｖｔ 硫酸マンガン ｓ ｍｙｔｄ−ビオチン
３００μ！９／ｌビタミンＢ１・塩酸塩
１００ μｇ／ｌＰＨ７，３ 第五衣 チロシン生産用培地 グルコース １３０ｇ／２ 硫酸アンモニウム ２５９／ｌフマル酸
１２ｆＪ／を 酢 酸 ３ ｍＶｔリ
ン酸１カリウム １ ｇ／を硫酸マグ
ネシウム １９／を硫酸第一鉄
１０鴫
素 ３ １７／ｌリン酸１
カリウム Ｉ Ｖｔ硫酸マグネシウム
０．４Ｖｔ硫酸第１鉄 １０ｒＩ
ｖｔ 硫酸マンガン ｓ ｍｙｔｄ−ビオチン
３００μ！９／ｌビタミンＢ１・塩酸塩
１００ μｇ／ｌＰＨ７，３ 第五衣 チロシン生産用培地 グルコース １３０ｇ／２ 硫酸アンモニウム ２５９／ｌフマル酸
１２ｆＪ／を 酢 酸 ３ ｍＶｔリ
ン酸１カリウム １ ｇ／を硫酸マグ
ネシウム １９／を硫酸第一鉄
１０鴫
Claims (1)
- ブレビバクテリウム属に属し、ピルビン酸キナーゼ活性
が低下し、かつＬ−チロシン生産能を有する微生物を液
体培地中に好気的に培養し、培養液中にＬ−チロシンを
生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−
チロシンの製造法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25004084A JPS61128896A (ja) | 1984-11-27 | 1984-11-27 | 発酵法によるｌ−チロシンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25004084A JPS61128896A (ja) | 1984-11-27 | 1984-11-27 | 発酵法によるｌ−チロシンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61128896A true JPS61128896A (ja) | 1986-06-16 |
Family
ID=17201928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25004084A Pending JPS61128896A (ja) | 1984-11-27 | 1984-11-27 | 発酵法によるｌ−チロシンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61128896A (ja) |
-
1984
- 1984-11-27 JP JP25004084A patent/JPS61128896A/ja active Pending
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