JPS61199794A - 発酵法によるｌ−トリプトフアンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 〈産業上の利用分野〉 本発明は、発酵法によるＬ−トリプトファン（以下トリ
プトファンと記す。）の製造法に関する。トリプトファ
ンは動物の必須アミノ酸の１つであシ、飼料添加剤とし
て重要な物質である。

〈従来の技術〉 従来トリプトファンの製造法としては、トリシトファン
の前駆物質であるアントラニル酸、インドール或は３−
インドールピルビン酸よシトリブトファンを製造する方
法が知られている。これら前駆物質を使用する方法に対
し、前駆物質を使用しないで糖類等を炭素源とし、バチ
ルス属に属しトリプトファンアナログに耐性を有する変
異株を使用して直接発酵法によりトリシトファンを生産
する方法（特公昭４８−１８８２８、特公昭５３−３９
５１７）が開発されている。

〈本発明が解決しようとする問題点〉 本発明が解決しようとする問題点はバチルス属に属する
微生物を用いて、糖類等の炭素源からトリプトファンを
直接発酵法によシ安価に製造する方法を開発することに
ある。

〔発明の構成〕

〈問題点を解決するための手段〉 本発明者らは上述の問題点を解決すべく鋭意研究を行っ
た結果、バチルス属に属し、トリシトファン生産能を有
する微生物にビタミンＢ１２耐性を付与することによシ
、従来知られているトリプトファン生産能よシも更に大
量にトリプトファンを生産する能力を有する菌株が存在
することを見いだした。本発明はこの知見に基づいて完
成されたものである。

本発明において使用される微生物はバチルス属に属し、
ビタミンＢ１□に耐性を有し、かつトリプトファン生産
能を有する変異株である。本発明でいうトリプトファン
生産能を有する変異株とは例えばトリプトファンアナロ
グに耐性を有する変異株であり、更にＬ−フェニルアラ
ニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジンもしくはＬ−ロイシ
ン等の栄養要求性又はフェニルアラニンアナログ耐性、
インドールマイシン耐性等の薬剤耐性を併せもつ変異株
をいう。

本発明でいうトリプトファンアナログとはトリプトファ
ンに化学構造が類似しバチルス属に属する微生物の生育
を阻害するがトリプトファンの存在によってその阻害が
解除されるような化学物質をいい、例えば４−低級アル
キルトリプトファン、５−低級アルキルトリプトファン
、６−低級アルキルトリプトファン、７−低級アルキル
トリプトファン、５−ハロダノトリフトファン、６−へ
ログノトリプトファン、トリプトファンハイドロキサメ
ート、α−低級アルキルトリプトファン、７−アザトリ
プトファン等がある。

まり、フェニルアラニンアナログとはフェニルアラニン
に化学構造が類似しバチルス属に属する微生物の生育を
阻害するがフェニルアラニンによってその阻害が解除さ
れるような物質をいう。例えば、３−チアゾールアラニ
ン１２−チアゾールアラニン１２−ピリジンアラニン１
２−ナフタレンアラニン、１−ナフタレンアラニン、β
−３−エテルアラニン、β−２−チェニルアラニン、４
−二トロフェニルアラニン１２−ニトロフェニルアラニ
ン、４−アミノフェニルアラニン、３−アミノフェニル
アラニン１２−アミノフェニルアラニン、５−ハイドロ
キシ−２−ピリジンアラニン、チロシンハイドロキサメ
ート、フェニルアラニンハイドロキサメート、３−アミ
ノチロシン、３−フルオロチロシン、３−ハイドロキシ
チロシン、３−ニトロチロシン？ｌｆ６る。

本発明でいうビタミンＢ１２とは肝臓から分離されるジ
アノコバラミンで、ビタミンＢ１□はシアン化物でなく
、水酸化物、硝酸塩、塩化物、硫酸塩としても得られる
。このビタミンは補酵素Ｂ１２として分解してヒドロキ
シコバラミン、アミノコバラミンになる。またシュドビ
タミンＢ１２を含む補酵素も・あシ、上記これらの物質
を含めてビタミンＢ１２と称する。

本発明において使用される微生物は例えば次のような変
異株がある。

バチルス・ズブチリス　ＡＪ　１２２００（５−ｐＴｒ
　、　ｖＢ、ｆ） バチルス・ズブチリス　ＡＪ　１２２０１（５−ＦＴ’
　＋　ＩＭｒ＋　ＳＧ　ｒ＋　ＶＢ　１２ｒ）５−ＦＴ
ｒ　：　５−フルオロトリフトファン耐性ＩＭｒ　　：
インドールマイシン耐性 ＳＧｒ　　：サルファグアニジン耐性 ｖＢ１□ｒ：ビタミンＢ１２耐性 これら本発明で使用される変異株は、バチルス属のトリ
プトファンアナログ耐性のＬ−トリプトファン生産能を
親株とし、これに通常の変異誘導操作、例えば紫外線照
射或はＮ−メチル−Ｎ／−二トローＮ−ニトロソグアニ
ジン、亜硝酸等の化学薬剤処理した後、親株が生育でき
ないような濃度のビタミンＢ１２を含有する寒天平板培
地で培養し、該平板培地上に生育するコロニーを分離す
ることによって得られる。

上記の親株としては、トリプトファンアナログ耐性の他
にトリットファン生産に有用な性質を有するトリプトフ
ァン生産能、例えば、Ｌ−アルギニン　Ｌ　−ＩＪジン
、Ｌ−ロイシンもしくはＬ−７エニルアラニン要求性の
トリプトファン生産能（特公昭５３−３９５１７号公報
）、更にはトリプトファンアナログ耐性でかつインドー
ルマイシン耐性のトリプトファン生産能（％開昭５６−
９２７９６号公報）等が使用される。具体例としては次
のようなトリプトファンアナログ耐性のトリットファン
生産能が使用される。

バチルス・ズブチリス　ＦＴ　１４５　ＦＥＲＭ−Ｐ　
１７８３（５−ＦＴｒ） バチルス・ズブチリスＡＪ　１２０９９　ＦＥＲＭ−Ｐ
　７２９５（５−ＦＴｒ、　ＩＭ’　ｌ　ＳＧｒ）その
他、本発明の変異株はバチルス属の野生株を親株とし、
これにビタミンＢｊ２の耐性を付与シた後、トリブトフ
ァンアナログ耐性を付与することによっても誘導できる
。

以下に本発明の使用菌株の一例、バチルス・ズブチリス
ＡＪ　１２２０１　（ＦＥＲＭ−Ｐ　８０７７　）の具
体的誘導方法とそのビタミンＢ１２に対する耐性の度合
を実験例で示す。

バチルス・ズブチリスＡＪ　１２０９９　（ＦＥＲＭ−
Ｐ　７２９５）を親株とし、これを５００μｇ／ｍｌの
ＮＧで０℃３０分間処理した。ついで第を表に示す最少
培地に親株が生育できない濃度の１００μｇ／Ｈになる
ようにビタミンＢ１□を添加して平板培地を作製し、こ
れに変異処理したＡＪ　１２０９９を箪布し、３０℃７
日間放置後、コロニーとして生育する菌株即ちビタミン
Ｂ１２耐性変異株を採取し、このうちトリプトファン生
産能のすぐれた変異株ＡＪ　１２２０１　（ＦＥＲＭ　
−Ｐ　８０７７　）を採取した。この変異株は実施例に
示すように親株よりトリプトファンを２１チ多く生成し
た。

次にＡＪ　１２２００　、　ＡＪ　１２２０１株のビタ
ミンＢ１２に対すに示した濃度になるように溶解して、
平板培地（直径８．５　ｃｍ　）を作シ、各々の培地に
、完全培地（酵母ｘ−キス１ｏｆｉ／−ｔ３、ポリイグ
トｙ　１Ｏｆｔ／−ｅ　、塩化＋　）’）’）Ａ５ｆｌ
／４、寒天２１／Ｊを含みｐＨ７，２）に生育したバチ
ルス・ズブチリスＦＴ　１４５　、ＡＪ１２２００゜Ａ
Ｊ１２０９９及びＡＪ　１２２０１をそれぞれおよそ１
０７コ接種したのち３０℃で４日間培養を行い、生成し
たコロニー数を調べた。その結果を第１表に示す。

Ｍ１表　最少培地の組成（ｐｉ（７，０）グルコース　
　　　　　　　５、ＯＩ／４３硫酸アンモニウム　　　
　　１．ｏ〃 ＫＨ２ＰＯ４８，６５＃ ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，２０／／ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０１０ｍｃｔ／１３ＭｎＳＯ４・４
Ｈ２０１０ｐ クエン酸ナトリウム　　　　　　０．５　９／ＩＩＬ−
フェニルアラニン　　　　、１００　〜／１グルタミン
酸ナトリウム　　　　１２Ｓ　　Ｉｎ？／γシスティン
　　　　　　　　　　１ｏｏ　　ｍｙ／１３ＫＯＨ２，
１８ｇ／４３ 寒天　　　　　　　　　２０　　ｐｉノ（ｐＨ７，２） 同本発明で言うビタミンＢ１２耐性とは、上記培養条件
下において、ビタミンＢ１２を１００μｇ〜含む上記培
地に微生物をおよそ１０　　コ接穐し、３０℃で４日間
培養後、５×１０コ以上のコロニーを生成する場合を言
う。

本発明で使用する培地は炭素源、窒素源、無機塩類、そ
の他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養
素を含有する通常の栄養培地が使用される。炭素源とし
てはグルコース、シュークロース、マルトース、澱粉氷
解物、糖蜜等が使用され、その他エタノール、酢酸、ク
エン酸等も単独或は上記能の炭素源と併用して用いられ
る。窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩、
尿素、ペグトン等有機或は無機の窒素源が使用される。

有機微量栄養素としてはアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、
核酸、更にこれらのものを含有するペグトン、カブミノ
酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育に
アミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合
には要求される栄養素を補添することが必要である。無
機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム
塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。

培養は通常の培養条件下で行えば良く、−を５ないし９
、温度を２０ないし４０℃に制御しつつる。培養中に−
が下がる場合には、炭素カルシウムを別殺菌して加える
か又はアンモニア水、アンモニアガス等のアルカリで中
和する。又、有機酸を炭素源とする場合は−の上昇金鉱
酸又は有機酸で中和する。

培養液からトリプトファンを採取する方法は、公知のト
リブトファン回収方法に従って行えば良く、培養液から
菌体を除去した後濃縮晶析する方法或はイオン交換クロ
マトグラフィー等によって採取される。

以下、実施例にて説明する。

実施例１ 下記第３表に示した組成のトリプトファン生産用培地２
Ｑｙｉｌを５００ａＪ容フラスコに分注し、１１０℃で
１０分間加熱した後、第４表に示す微生物をそれぞれＩ
Ａスラント量植えつけ３０℃で９６時間振盪培養した。

それぞれの培養液中のトリプトファン生成量は第４表の
如くであった。

Ｆ’Ｔ１４５にビタミンＢ１２耐性を付与したＡＪ　１
２２００のトリシトファン生成量は、親株の２．３倍に
向上した。同様に、インドールマイシン耐性株ＡＪ１２
０９９にビタミンＢ１２耐性を付与することによシ、１
．９　ｇ／４　、）リプトファン生成量が向上すること
が明らかとなった。

グルコース　　　　　　　　　　８０　９／Ｉ！。

塩化アンモニウム　　　　　　１０　１ＫＨ２ＰＯａ　
　　　　　　　　　　　ｌ　　　ｐＫＣ７２Ｎ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２０１０”９／１３ Ｆ・Ｓ０４・７Ｈ２０１０＃ カザミノ酸　　　　　　　　４　９／１ＭｇＳＯ４・７
Ｈ２０Ｑ、４　　ｔｔ ＣａＣＯｓ　　　　　　　　　　４０　　’第４表　ト
リプトファン生成量 菌　　　株　　　　　　　　　　Ｌ−）リグトファン（
辺）ＦＴ１４５（ＦＥＲＭ−Ｐ　１７８３）　　　　　
　　　１．９（５−ＦＴｒ） ＡＪ　１２２００（ＦＥＲＭ−Ｐ　８０７６）　　　　
　　　４．５（５−ＦＴ’、ＶＢ１２ｒ）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. バチルス属に属し、ビタミンＢ＿１＿２に耐性を有し、
   かつＬ−トリプトファン生産能を有する変異株を、液体
   培地中に好気的に培養してＬ−トリプトファンを培地中
   に生成・蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする
   発酵法によるＬ−トリプトファンの製造法。