JPS61233697A

JPS61233697A - ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・フオスフエ−トの製造方法

Info

Publication number: JPS61233697A
Application number: JP7259385A
Authority: JP
Inventors: Yukiharu Kobayashi; 行治小林; Kanji Koyashiki; 小屋敷　勘治; Toyofumi Miya; 豊文美矢
Original assignee: Kohjin Holdings Co Ltd; Kohjin Co
Current assignee: Kohjin Holdings Co Ltd; Kohjin Co
Priority date: 1985-04-08
Filing date: 1985-04-08
Publication date: 1986-10-17
Also published as: JPH0559711B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・フォスフ
ェート（以下ＮＡＩ）Ｐと略す）はニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチド（以下ＮＡＤと略す）と共に生
体内において酸化還元反応を司る酵素１例えば、グルコ
ース・６−リン醪脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素
、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素などの補酵素として
古くから知られている重要な物質であり、生化学用分析
試薬や臨床検査片診断薬のみならず食品中のブドウ糖や
グルコン酸の測定など食品分骨にも広く利用されている
。更に今日ではバイオリアクターによるアミノ酸などの
有用物質の生産にＮ　Ａ　１．）やＮＡＤＰの再生系と
の共役が試みられ注目を集めている有用な物質である。

（従来の技術）（１）　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐは従来より酵母からの抽出法に
より製造されてきた。

（２）近年、ＮＡＩ）キナーゼ活性を有する微生物によ
りＮＡＤとアデノシントリ・フォスフェート（以下ＡＴ
Ｐと略す）からＮＡＤＰを製造する方法（特公昭４７−
４６８５８．％開昭５０−１８．５２９０．特開昭５Ｏ
−１４２７９２）が開発された。（反応式］）（３）また、アデニレートキナーゼによるエネルギー共
役系を利用する方法（特開昭５８−１１．５８９１）も
ある。（反応式２）（４）一方、ＡＴＰを再生する系として、（反応式３）
に示すようにＡＣＰとアセテートキナーゼを利用する方
法も有効であることが報告さ扛ている。（丸尾、　ＦＦ
Ｉ宮監修「酵素ハンドブック」。

朝倉書店、　　Ｐ３６７．１９８３）更に、この反応′
（！７Ｎ　Ａ　］’）　’Ｐ生成反応に使用した例とし
てニワトリの肝臓と大腸菌からそれぞれ単離し精製した
Ｎ　Ａ、　Ｄキナーゼとアセテートキナーゼを甲いたミ
ャワキらの報告がある。（０ｓａｔｏ　Ｍ　１ｙａｉａ
ｋｉｅｔ、　ａｔ、　、　Ａｇｒｉｃ、　ｆ３ｉｏＬ　
Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、　４６＋　２７２５−２７８８
゜１．９８２　）（発明が解決しようとする問題点）（］）酵母からの抽出法では菌体内の蓄槓惜が少なく大
量に得ることは困難である□ （２）　Ｎ　Ａ　ＤとＡ’ｒＰから作る方法ではＮＡＩ
）と等モルの高価なＡＴＰを必要とする。

（３）エネルギー共役系を利用する場合でもＮＡ、Ｄ１
モルにつき０．５モルのＡＴＰが必要でありそれｉｔど
有利とは言えない。

（４）各酵素を単離して用いる方法は繁雑であり、かつ
安定性に欠は工業的に有利とはいえない・（問題を解決
するための手段及び作用）本発明者らは上記の欠点を解
決するため鋭意検討した結果、ＮＡＤキナーゼの反応に
よってＮＡＤとＡＴＰからＮＡＤＰを生化学的に合成す
るに際し、ＮＡＤキナーゼとアデニレート・キナーゼ及
びアセテート・キナーゼの酵素活性を同時に有するバク
テリアを用いれば、そ扛ぞれの酵素を分離精製すること
々＜、ＮＡＤＰ合成反応とＡＴＰ再生反応を同時に行い
得ることを見出した。すなわち菌体自身が有するアデニ
レート・キナーゼの作用によりＡＭＰからＡ　Ｉ）　Ｐ
を生成せしめ１次にアセテート・キナーゼによりＡＣＰ
とＡＤＰからＡＴＰを生成するとともにこのとのＡＴＰ
をＮＡＤＰの生成合成反応に使用し、更に生じたＡ　Ｄ
　Ｐは再度Ａ、　ＣＰとアセテート・キナーゼの作用に
よりＡ　ＴＰ　［繰返し変換できること、加えて都合の
良いことには反応開始に必ずしも高価なＡＴＰを必要と
せず、より安価なＡヤＩＰが使用できること。

しかも１０分の１モル当量り下の添加でも反応が進むこ
とを見出し１本発明を光成するに至った。

次に２本発明について詳述する。本発明に言うＮＡ、Ｄ
キナーゼ、アセテートキナーゼ、及びアデニレートキナ
ーゼの酵素活性を有するバクテＩ７７としては、バチル
ス属、プレビバクテυ五つム属。

コリネバクテリュウム属、アルカリ土類金属、アースロ
バクルー属、　エシェリヒア属、プロテウス属、シュウ
トモナス属、サルシナ稠、セラチア属などが挙げられる
。また、これらのバクテリアを二神類以上組合わせても
よい。

一例をあげれば、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネ
ス（ＡＴＣＣ１５８１２）を常法に従って培養し菌体を
取得する。該菌体を必要に応じて洗浄し、そのまま、ま
たはアクリルアミドやアルギン酸等のゲルに固定化した
固定化菌体を用いる。

このとき菌体若しくは、固定化菌体を有機浴剤や界面活
性剤を接触させて菌体の酵素活性を高めた後使用するこ
ともできる。反応液中の基質濃度はＮ　Ａ　Ｄ　０．５
〜２０　ｍＶｍｌ、　Ａ　Ｍ　Ｐ　０．００８〜１．　
ＯＴｎｇ汐、ＡＣＰＯ，１４〜５．８４匂の範囲が望捷
しく更にマグネシウムやマンガン塩等の酵素活性剤を必
要に応じて添加する。ＡＣＰとしては無水酢酸とリン酸
塩とを反応させて生成したＡＣＰを反応液の１捷添加し
てもよい。菌体濃度は５〜５０〜鷹の範囲が好ましく１
反応は適当な緩衝液９例えば、リン酸緩衝液により行う
。反応はｐＨ５，０〜９０、反応温度は１５〜５０°Ｃ
が望捷しい。反応援は、菌体を分離し、常法に従いイオ
ン交換樹脂等により分離精製する。

（実施例）以下９本発明の実施例を示すが、何ら本発明を限定する
ものではない。

実施例　ｌプレビバクテリュウム・アンモニアゲネス（ＡＴＣｏ　
１５８１２）をグルコース１％、イーストエキス１％、
ペプトン１％の培地で８０°Ｃ１２４時間培＃Ｌ、遠心
分離法により集菌し、乾燥菌体量が２０〜４ｅとなるよ
うに２０　ｍＭ塩什マンガンを含む０．２　Ｍ　１７ン
酸緩ｆ＃液（ｐＨ７，５）に懸濁する（Ｍけ７モル／ｌ
の濃度１口］Ｍは１０００の濃度を示す。）。本液に対
液４１％のトルエンを加え室温で１時間攪拌後遠心分離
法により集菌し、再び乾燥菌体量が、２０■４１となる
ように２０＋ｎＭ塩化マンガンを含む０２Ｍリンリン酸
緩衝液Ｈ７゜５）。

Ｎ　Ａ、　Ｉ）　４．０　ｍｖｌｎｌ、　Ａ、ＭＰ　０
．０３”！／ｍｅ、　Ａ　ＣＰ　１．２１ｎ７！を加え
、８７ｒで６時間反応した。反応液中に生成したＮＡＤ
Ｐは８．９１＾ｅであった。

実施例　２実施例１と同様にして得られたブレビバクテリウム・ア
ンモニアゲネス（ＡＴＣＣ１５Ｂ　１．２）（湿潤菌体
として）１７ｖを凹部の１℃食塩水に懸濁し４（１℃に
加温後、３％１（−カラギーナンを含む１％食塩水ｄ′
ｅをｌ：１の液比で混合し２て０゜３Ｍ塩化カリウム水
溶液に滴下しゲル化した。本固定化菌体を２０ｍＭ塩化
マンガンを含む（１，２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）
に懸濁し、実施例■と同様にトルエン処理して固定体菌
体６８ノを得た。

本国９（１［体ｅＮＡ　Ｄ　４．Ｏｑ／ｍｚ、　Ａ　Ｍ
Ｐ　Ｏ，０８ｎＶｒｎ１．　Ａ　ＣＰ　１．２　ｍｔ４
ｅ及び２０　ｍＭｉ−ｚ化マンガンを含む０．２　Ｍ　
ＩＩン酸緩衝液に懸濁ｌ−で３７°Ｃ，６時間反応させ
る。反応終了後生成したＮ　Ａ　ｉ）　Ｐは２、５　ｍ
ｇＡｎｅ　’１１’あツタ。

実施例　８２．５Ｍのリン酸２１カリウム溶＃′４０−に水２〇−
を加え４・規定濃度の水酸化カリウムによりｐＨ＝６．
０〜７．０に調整しつつ無氷酢酸１　］、　ｍｌを徐々
に滴下した。水冷下１時間攪拌した後、水を加え■００
−に合わせた。この反応液中にはＡ、　ＣＰが８０　ｗ
ｖｍｔ、含有されていた。

別にブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（ＡＴＣＣ
ｌ　５８１２）とエシェリヒア・コリＢｉ各々グルコー
ス１％、ペプトン１％、イーストエキス１％を含む培地
で培養しく湿潤菌体として）５ｆづつを混合し、水冷下
３０％塩化カリウム５゜４ｍ１．８３．５％アクリルア
ミド５．４ｍ１．　５％β−ジメチルアミノプロピオネ
ート１．８ｄ、６．５％過硫酸アンモニウム２．１　＋
＋＋／を加え加温し固化し、固定什菌体８０２を州だ。

本菌体をトルエン８％を含む５　ｍＭ’　）　’）スー
塩酸緩衝液（ｐＨ’７．０　）に幡濁し、２５°Ｃ２■
時間振とうし活性化した。

本固定化菌体をＮＡＩ）　４．０　ｍｇ／ｍｅ、　Ａ−
Ｍ　Ｐ　０．０８＾ｅ、上記で得たＡＣＰ合成反応液（
ＡＣＰとして８０　ｍ＠／ｍｅ）　０．０　］、　５ｑ
ｐｔＪ／ａｔｌ及び２　ＯｍＭｆｇ化マグ反応終了後生
成したＮ　Ａ　Ｄ　Ｉ）け］、、　８　’ｑ／ｍｅであ
った。

（効果）以上のように本発明においては、牟離した酵素を組合わ
せて用いないで必要な酵素活性を同時に有するバクテリ
アを用いることによりリン酸化原オー１として高価なＡ
ＴＰを用いないでもより安価なＡＭＰ及びＡ、　ＣＰに
より、珪ＡＭＰはＮ　Ａ　Ｄ　］モル当り１０分の１モ
ル以下の添加にまり安１曲に。

且＠率よ（ＮＡＩ）Ｐｉ！Ｊ造することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・キ
ナーゼとアセテートキナーゼおよびアデニレートキナー
ゼの酵素活性を共に有する一種類以上のバクテリアを用
いてニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドとアセ
チルリン酸及びアデノシン５′−モノリン酸からニコチ
ンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・フォスフェート
を製造する方法。
（２）バクテリア菌体をそのまま懸濁の状態で用いるか
、もしくは担体に固定化して用いる特許請求範囲第１項
記載のニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・フ
ォスフェートを製造する方法。
（３）アセチルリン酸として、無水酢酸とリン酸塩とを
反応させて生成したものを反応液のまま用いることを特
徴とする特許請求範囲第１項記載のニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチド・フォスフェートを製造する方
法。
（４）アデノシ５′−モノリン酸をニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチドに対して１０分の１モル当量以
下を添加することを特徴とする特許請求範囲第１項記載
のニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド・フォス
フェートを製造する方法。