JPS61268193A - 融合蛋白質をコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発現生産物に商業的用途が見出だされるその発現に利用
できる遺伝子の数がだんだんと多くなってきている。多
くの場合に、初期の発現はＥ、コリー（Ｅ、　ｃｏｌｔ
）で観察されてきている。Ｅ、コリーにおける発現は多
くの不利益をもち、その１つは特にエンテロトキシンの
存在であり、これは生産物を汚染して哺乳動物への投与
に適さないものにする。更に、バチルス・スブチリス（
Ｂａｃｉ　ｌ　Ｉｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、ストレ
プトマスセス困江翌且■組吐、又は酵母（例えばサツカ
ロマイセス （Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ））のような−その他の
微生物と比較てＥ、コリーにおける生産物の生産に関し
ての広範囲の技術が以前にはなかった。

多くの場合に、まだ解明されていない理由で、活性プロ
モーター及び高コピー数プラスミドにもかかわらず、異
種性生産物は微生物宿主中でほんの少量でのみ生産され
る。そのプロセスの経済性は、所望の生産物の発現に用
いられる栄養分の実質的な割合に依存するので、単細胞
微生物中でのこれらの生産物の生産は有望でないことは
明らかである。それ故に、宿主の生存度及び成長特性に
実質的に害を与えることなしに所望のポリペプチドの生
産を大きく増強する方法およびシステムが実質的に必要
とされている。

従米伎五二脱皿 Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ等は、Ｐｒｏｃ、　　Ｎ
ａｔｌ、　　Ａｃａｄ。

とＬ　竪虹（１９７８）　７５：３７２７〜３７３１頁
において、Ｅ。

コリーにおける発現のためのベニシリナーゼのＮ−末端
に連結されたプロインシュリンをコードする融合配列を
記載している。Ｐａｕｌ等は、７Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ
ｏｌ、　（１９８３）３１　：　　１７１〜１７４頁に
おいて、Ｅ、コリーにおける発現のためのトリプトファ
ンＥ遺伝子生産物の一部のＣ００Ｈ−末端に連結された
プロインシュリンをコードする融合配列を記載している
。Ｇｏｅｄｄｅｌ等は、同書（１９７９）７６　：　　
１０６〜１１０頁において、Ｅ、コリーにおいて融合ポ
リペプチドを提供するためにＥ、コリーβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子に融合したヒトインシュリンＡ及びＢ鎖に
ついての合成遺伝子を記載している。

５ｔｅｐｉｅｎ等は、Ｇｅｎｅ（１９８３）２４　：　
２８９〜２９７頁において、酵母における融合生産物と
してのインシュリンの発現を記載しており、その場合に
、プロインシュリン遺伝子を、酵母における発現のため
にＧＡＬＬのＮ−末端をコードする配列に融合させてい
る。

発」Ｒ戸４１ 異種性のポリペプチドを真核微生物宿主中で高収率で生
産するための方法及び造成物が提供され、それによって
完全に異種性り融合生産物が発現され、そのペプチドの
一部はそのような宿主中で他とは無関係に高収率で発現
されることが示されている生産物であり、そしてその生
産物の残りの部分は関心のあるポリペプチドであり、高
収率での融合生産物の生産がもたらされる。その２つの
ポリペプチドをコードする配列はオープンリーディング
フレームを合わせて融合され、この場合に高収率ポリペ
プチドをコードする配列は５′−末端又は３′−末端の
いずれがＫあり得る。その発現生産物中に含まれる２つ
のポリペプチドは選択的に開裂できる結合によって連結
されていてもよく、その結果としてその２つのポリペプ
チドは各々のポリペプチドを高収率で提供ために分離さ
れてもよい。他の方法としては、融合蛋白質の開裂がそ
の意図された用途にとって必要でないならば、その開裂
部位は存在しなくてもよい。特に、高収率のポリペプチ
ドがスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）場合には
酵母宿主が用いられる。

以下余白 豊亙ｐ」１１引Ｗ哩 ポリペプチドをコードする配列を用いることによって、
真核生物、特にイースト、中での異種性生産物の生産を
増強する新規な方法及び組成物が提供され、それは選択
的に開裂できる部位によって連結された２つのポリペプ
チド領域の組み合わせである。その２つの領域は、宿主
中で他とは無関係に高収率で生産されるポリペプチドで
ある第−域、及びそれ自体として注目されそして活性で
ある第二のポリペプチド、特に、宿主中ではなかなか得
られないものである。

関心のある宿主としては真核単細胞微生物、特に菌類、
例えばフイコミセテス」ユＬ遼ジ但１徂り−、アスコミ
セテス（Ａｓｃｏｍ　ｃｅｔｅｓ）　、バシジオミセテ
ス（Ｂａｓｉ止ゆジ浅ｅｔｅり一及びデューテロミセテ
スーΩμＢμ四ジ四μ胆搬−１一層特定的にはアスコミ
セテス、例えば酵母、例えばサツカロミセス旦匹並肛竺
バ閃）、スキゾサッ力ロミセス困並亘匹匹勅肛亜匹照）
、及ヒクルイベロミセスー儲よＵμＥ且■ｙ狙）等があ
る。Ｅ、コリー（旦匹虹Ｕ。

Ｂ、サブチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）等のような
原核宿主を用いてもよい。

融合において第一領域として用いられる安定なポリペプ
チドは経験的に決定できる。従って、異種性ポリペプチ
ドは種々の宿主生物中で発現されるので、全蛋白質に対
するポリペプチドの収率は容易に求められる。宿主によ
って生産される全蛋白質の５％以上の量で生産されるポ
リペプチドに関して、そのようなポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列は本発明で用いてもよい。ＤＮＡ配列は
その配列をコードする異種性遺伝子と同じでもよく、異
種性遺伝子の突然変異種でもよく、または置換された１
種以上のコドンをもっていて、この場合にそのコドンは
宿主によって好まれるコドンとして選択されてもよい。

好ましいコドンは、遺伝暗号の縮重に基づいて、宿主中
で個々の最大の豊富さで生産される蛋白質中の、そのよ
うなコドンを見出だす数学的な確率よりも実質的に大き
く見いだされるコドンである。特に、酵母においては、
解糖酵素は好ましいコドンを決定する基礎であり得る。

宿主中でポリペプチドを所望の高収率で提供する遺伝子
全体又は遺伝子のいずれかの部分を用いてもよい。従っ
て、安定なポリペプチドが関心のあるポリペプチドより
も経済的価値がかなり低い場合には、遺伝子の一部を切
り取って、遺伝子全体及びそれのポリペプチド生産物の
所望の特性をまだ保持しながら、−労金融合生産物中の
安定化ポリペプチドの割合を低下させるような断片にす
ることが望ましいかもしれない。酵母中の安定なポリペ
プチド生産物をコードする遺伝子の例としては、スーパ
ーオキシドジスムターゼ、特にヒトスーパーオキシドジ
スムターゼをコードする遺伝子がある。

２つのポリペプチド、即ち安定化ポリペプチド及び関心
のあるポリペプチド、をコードするＤＮＡ配列は種々の
方法で得ることができる。ポリペプチドをコードする配
列は天然源から誘導することができ、この場合にメツセ
ンジャーＲＮＡ又は染色体ＤＮＡは適切なプローブによ
り同定することができ、このプローブはコード配列又は
非コード配列の一部と相補的である。メツセンジャーＲ
ＮＡから、一本鎖（ｓｓ）　Ｄ　Ｎ　Ａが慣用の技術に
従うて逆転写酵素を用いて調製され得る。その５ｓＤＮ
Ａ相補鎖を次いで、ポリペプチドをコードする領域を含
む二重鎖（ｄｓ）ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを提供するための第二
鎖を調製するための鋳型として用いることができる。染
色体ＤＮＡを用いる場合には、コードする領域を含む領
域をプローブを用いて検出し、制限酵素マツピングし、
そして適切な技法を用いて非翻訳５′及び３′領域を本
質土倉まない領域を単離する。コード配列の一部のみが
得られる場合には、その残りの部分は、コード部分に連
結することができしかも特定の機能又は特徴を提供する
その他の配列に連結するのための便利な末端を提供する
アダプター合成によって提供されてもよい。

２つの遺伝子が天然源から完全に又は一部として得られ
る場合には、その２つの遺伝子を適当なリーディングフ
レーム内に連結させることが必要である。融合蛋白質の
開裂が必要ならば、それらの連結部が選択可能な開裂部
位を定義しない場合には、遺伝子は選択的に開裂できる
部位によって分離される。選択的に開裂できる部位はあ
る程度は遺伝子の性質に依存する。即ち、開裂のための
手段は一方または両方の遺伝子のアミノ配配列に依存し
て変化する。

他方、開裂が必要でない場合があり、またある場合には
望ましくない。融合蛋白質は診断薬として、アフィニテ
ィーカラムに、配列の決定のための源として、免疫源と
して融合蛋白質を用いての抗体の生産、等に用いられる
。

２つの遺伝子は普通にはイントロンを含まない。

なぜならｍＲＮＡのスプライシングは関心のある真核単
細胞微生物に広範囲には用いられていないからである。

関心のあるポリペプチドは、原核性源又は真核性源から
誘導された、天然の又は合成のいずれかの、あらゆるポ
リペプチドであり得る。普通には、ポリペプチドは少な
くとも１５個のアミノ酸（４５ｂ　ｐの遺伝子）、一層
普通には３０個のアミノ酸（９０ｂｐの遺伝子）をもち
、そして３００個以上のアミノ酸（９００ｂ　ｐ以上の
遺伝子）であってもよい、。

関心のあるポリペプチドとしては、酵素、ウィルス蛋白
質（例えば、エイズ（Ａ　Ｉ　ＤＳ）に関連したウィル
ス、例えばｐｌＢ、ｐ２５．ｐ３１．ｇｐ４１等からの
蛋白質）、哺乳動物蛍白質、例えば調節機能に関連する
もの、例えばリンフ才力イン、成長因子、ホルモン又は
ホルモン前駆体（例えば、プロインシュリン、インシュ
リン様成長因子、例えば、ＩＧＦ−１及び−■等）、等
、血液凝固因子、血餅溶解因子、免疫グロブリン等があ
る。ポリペプチドのフラグメントまたはフラクションは
、そのようなフラグメントが生理学的活性、例えば免疫
活性（例えば親蛋白質との交差反応活性）、アゴニスト
またはアンタゴニストとしての生理学的活性、等をもつ
場合に用いられる。

選択可能な開裂のための方法の１つは、米国特許第４．
３６６．２４６号に記載されている臭化シアノゲンの使
用である。この技術は、開裂部位以外に利用できるメチ
オニンがないこと、または開裂されるメチオニンとポリ
ペプチド配列内のメチオニンとを選択的に区別できるこ
と、を必要とする。他の方法としては、特定タイプのア
ミノ酸によって特定される部位を識別して開裂するプロ
テアーゼを用いてもよい。通常のプロテアーゼとしては
トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、プロメライン
、パパイン等がある。トリプシンは塩基性アミノ酸に対
して特異的でありそしてリシンまたはアルギニンのいず
れがＫついてのペプチド結合のカルボキシル基側で開裂
させる。更に、アミノ酸の特定の配列に対して特異的な
ペプチダーゼ、例えはポリペプチドからの分泌リーダー
シグナルの選択的開裂に関与するペプチダーゼ、を用い
ることができる。これらの酵素は酵素中のα−因子及び
キラートキシンで見出だされるような配列に特異的であ
り、例えば、ＫＥＸ２エンドペプチダーゼは塩基性残基
の対に対して特異的である（Ｊｕ　ｌ　ｉ　ｕｓ等、釦
旦（１９８４）３７　：　１０７５〜１０８９頁）。ま
た、アミノ酸の特定の配列で開裂させる酵素が存在する
。

ウシエンテロキナーゼ（Ｌｉｇｈｔ等、Ａｎａｌ、Ｂｔ
ｏｃｈｅｍ。

（１９８０）皿：１９９〜２０６）はアスパラギン酸、
グルタミン酸、又はカルボキシメチルシスティンの酸残
基によって先行されるリシンまたはアルギニンのカルボ
キシル基側を開裂する。多くの種牛のトリプシノゲンの
活性ペプチドの一部として天然に見出だされる配列（Ａ
ａｐ）　４Ｌｙｓは特に有用である。

特定の配列を認識し、そして開裂するその他の酵素とし
ては、コラゲナーゼ（Ｇｅｒｍｉｎｏ及びＢａｔｉａ　
。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（１９８４
）８１　：　４６９２〜４６９６頁）；因子ｘ（Ｎａｇ
ａｉ及びＴｈｙｇｅｒｓｅｎ　ＸＮａｔｕｒｅ（１９８
４）３０９　：８１０〜８１２頁）；及びポリウビクイ
チン・プロセッシング酵素（Ｏｚａｋａｙｎａｋ等、Ｎ
ａｔｕｒｅ（１９８４）３１２　　：６６３〜６６６頁
）がある。

開裂可能な部位を含むアミノ酸に加えて、その２つの融
合ポリペプチドを更に分離することが有益であり得る。

そのような“ヒンジ”は立体融通性を可能にしそれで融
合ポリペプチドはおそらく相互にあまり妨害せず、従っ
て開裂部位の誤った折りたたみ、阻止等が防止される。

“ヒンジ”アミノ酸配列は種々の長さであることができ
、アミノ酸側鎖が開裂可能な部位で破壊させるのに用い
られる作用方式を、またはいずれかの融合ポリペプチド
、において必要とされる相互作用、例えばイオン結合、
疎水性結合又は水素結合を妨害しない限りは、いかなる
アミノ酸側鎖を含んでいてもよい。好ましくは、ヒンジ
を含むアミノ酸は側鎖をもち、それは中性で且つ極性ま
たは非極性のいずれかであり、そして１個以上のプロリ
ンを含んでいてもよい。そのヒンジ域は少なくとも１つ
のアミノ酸をもち、そして２０個以上のアミノ酸をもっ
ていてもよく、普通には１５個以下のアミノ酸をもち、
特に非極性アミノ酸Ｇ、Ａ、Ｐ、■、■、し、及び中性
の極性アミノ酸Ｎ、Ｑ、Ｓ、及びＴを持つ。

例示としてヒンジ配列はＮ−３；　Ｑ−Ａ　１Ｎ−３−
Ｇ−３−Ｐ　；Ａ−Ａ−３−Ｔ−Ｐ　。

Ｎ−３−Ｃ；−Ｐ−Ｔ−Ｐ−Ｐ−３−Ｐ−Ｇ−３−Ｐ　
；　Ｓ−３−Ｐ−Ｇ−Ａ　；等であるが、これらに限定
されるものではない。そのようなヒンジ配列は融合ポリ
ペプチド間の分離を更に増加させるために繰り返し単位
として用いてもよい。

“ヒンジ”アミノ酸は、関心のある最終の開裂したポリ
ペプチドに結合されないようにするために、他とは無関
係に高収率で生産されるポリペプチドと開裂可能な部位
配列との間に“ヒンジ”を入れるように本発明を実施す
ることが望ましいが、しかし必須ではない。

１個以上のアミノ酸が開裂部位に関与する場合には、そ
のような配列をコードするコドンは、合成的に調製され
、そして全てのコドンが適切なリーディングフレーム内
にありそして選択可能な開裂部位が２つのポリペプチド
を連結している融合蛋白質を提供するように、ポリペプ
チドをコードする配列に連結されるであろう。

融合コード配列のほんの小部分を合成的に調製する代り
に、全配列を合成的に調製してもよい。

このことはコドンの選択においである種の融通性を可能
にし、それによって好ましいコドン、制限部位、を提供
することができるようになり、ＤＮＡ及びメツセンジャ
ーＲＮＡ等の特定の内部構造を避けるかまたは提供する
ことができるようになる。

はとんどの場合について、融合コード配列は単一体とし
て調製されるが、それは種々の断片として調製されても
よく、これらの断片は種々の非翻訳領域に連結されて特
定の機能を提供し、そして最終的にそのコード配列を次
の段階で結合されてもよいことを認識すべきである。し
かしながら、表現を明確にするために、解説を主として
、コードする配列が単一体として調製され、次いで発現
ベクターに移す場合に向けられている。

融合コード配列の部分を構成する種々の配列を、クロー
ニングベクターに第１の断片を導入することにより連結
することができる。次に、生ずるクローンを、コード配
列、及び失われたコドンを置き換えそして次の断片への
連結のための便利な末端を有する、導入されたアダプタ
ーの内側の部位において制限開裂することができる。末
端は使用する特定のヌクレオチドに依存して付着末端又
は平滑末端である。−緒にされた第１断片及びアダプタ
ーのクローニングの後、アダプターにより提供される制
限部位においてベクターを制限切断し、そして第２断片
の残りのコード配列をベクターに導入して連結及びクロ
ーニングを行う。生ずる融合配列は適当な制限部位を両
端に有すべきであり、これによって完全配列がクローニ
ングベクターから容易に取り出され、そして発現ベクタ
ーに移される。

発現ベクターは適切なコピー数を有するように、そして
安定な染色体外での維持をもたらすように選択される。

他の方法として、ベクターは宿主ゲノム配列に相同の配
列を含有し、これにより組込み及び増幅が可能にされる
。発現ベクターは通常、発現宿主中での選択を可能にす
るマーカーを有する。好ましくは、ある状況下で使用さ
れる殺生物剤の使用を回避するため、補完（ｃｏｍｐｌ
ｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を用い、この場合、宿主は栄養
要求性でありそしてマーカーは原栄養性をもたらす。他
の方法として、エピゾーム因子は、短時間の供給におい
て必須栄養素又は代謝産物を利用する増強された能力を
宿主に与えることにより選択における利点をもたらすで
あろう。重要な因子は、染色体外クローニングベクター
が好ましくは、融合蛋白質の生産の間にベクターを自然
に失う宿主に比べて、ベクターを含有する宿主について
選択における利点をもたらすことである。

クローニングベクターはまた、宿主の生存を深刻に妨害
しない活性な転写開始制御領域を含むであろう。特に興
味ある領域は、解糖に関する酵素；酸性ホスファターゼ
：熱シヨツク蛋白質；メタロチオネイン等の発現と関連
するであろう。解糖系に関与する酵素にはアルコールデ
ヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデ
ヒドロゲナーゼ、ピルベートデヒドロゲナーゼ、トリオ
ースホスフェートイソメラーゼ、ホスホフラクトキナー
ゼ等が含まれる。

種々の転写制御領域を用いることができ、これらの領域
はＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写開始と関連する領
域（“プロモーター領域”）（これらの２つの領域はタ
ンデムに配置される）、又は通常プロモータ領域の５′
にある転写開始側ｍ　％Ｍ域（１調節領域”）のみを含
み、ここで調節領域は通常、前記プロモーター又は野性
型宿主中の他のプロモーターと関連する。調節領域は誘
導的制御をもたらし、ここで誘導は物理的変化、例えば
温度の変化、又は化学的変化、例えば栄養又は代謝産物
、例えばグルコース又はトリプトファンの濃度の変化、
あるいはｐＨ又はイオン強度の変化の結果であろう。

特に興味あるのは、バイブリド転写開始制御領域の使用
である。好ましくは、このバイブリド転写開始領域は解
糖系酵素のプロモーター領域を使用するであろう。調節
領域は、宿主の種々の発現生成物の調節領域、例えばＡ
ＤＨ］Ｉ、ＧＡＬ４、ＰＨ０５等の調節領域に由来する
ことができる。

転写開始制御領域は野性型遺伝子の５′領域の約５０〜
１０００塩基対（ｂｐ）の範囲であることができるＲＮ
Ａポリメラーゼの結合に関与する領域に加えて、他の制
御シグナル、例えばキャッピング配列、転写開始配列、
エンハンサ−１誘導的転写のための転写制御領域等が存
在することもできる。

転写開始制御領域は一般にポリリンカーによりターミネ
ータ−領域から分離され、このポリリンカーは多数のユ
ニーク制限部位、通常２個以上、そして約１０個以下、
通常６個以下のユニーク制限部位を有する。ポリリンカ
ーは一般に約１０〜５０ｂｐであろう。ポリリンカーの
次にターミネータ−領域が続くであろう。この領域は、
２つの領域が使用される場合に効果的な転写開始及び停
止が達成される限り、プロモーター領域が得られたのと
同じ野性型遺伝子から、又は異る野性型遺伝子から得ら
れる。

発現ベクターを適当な制限酵素で消化することにより、
ポリリンカーが開裂され、そして融合ポリブペチドをコ
ードするオープンリーディングフレームが挿入される。

ポリリンカーが区別可能な末端を許容する場合、融合遺
伝子が１つの方向に挿入することができ、他方末端が同
一であれば、融合遺伝子の挿入は２つの異る方向を有す
るプラスミドをもたらし、その内の１つのみが正しい方
向を有する。ともかく、単離及び精製のために原核性複
製系を有する発現ベクターをクローン化し、そして次に
適当な真核性宿主、例えば酵母宿主に導入する。外来性
ＤＮＡの真核宿主への導入は種々の方法、例えばカルシ
ウム−ポリエチレングリコール処理スフェロプラスト、
リボゾームの使用、接合等により行うことができる。

次に、発現することができる融合遺伝子を含有するプラ
スミドを含む宿主細胞を、宿主のために適切な栄養培地
中で増殖せしめる。誘導性の転写開始制御領域を用いる
場合、宿主細胞を高濃度に増殖せしめ、そして融合ポリ
ペプチドの発現について開始をターン・オンする。プロ
モータが誘導的でない場合、目的とする融合ポリペプチ
ドの構成的生産が起こるであろう。

生成物がもはや増加しなくなるまで、又は生成物の生産
と消費される栄養との比率が所定の値より低くなるまで
、細胞を増殖せしめ、この時点で細胞を回収し、溶菌し
、そして融合蛋白質を得、そして常法に従って精製する
。これらの方法には、クロマトグラフィー、例えばＨＰ
ＬＣ、電気泳動；抽出；密度勾配遠心等が含まれる。融
合蛋白質を得た後、これを、選択的に開裂可能な連結の
種類に従って選択的に開裂せしめる。これは、種々の連
結の記載との関連においてすでに記載されている。

幾つかの場合には、分泌リーダー及びプロセシングシグ
ナルを、融合ポリペプチドの部分として含めることがで
きる。種々の分泌リーダー及びプロセシングシグナル、
例えばα−ファクター、酵母キラートキシン等が知られ
ている。これらのポリペプチドシグナルをコードするＤ
ＮＡ配列を、融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
の５′−末端（センス鎖の転写の方向において）にリー
ディングフレームを合わせて連結し、プレー融合ポリペ
プチドの転写及び翻訳をもたらすことができる。

この発明に従えば、宿主の全蛋白質に対して５重量％以
上、好ましくは６重量％以上、そしてさらに好ましくは
約１０％以上の生成物を生産することができる。同様に
して、使用される栄養は目的生成物への転換のために効
果的に利用される。

次に、例によりこの発明をさらに詳細に説明する。但し
、これによりこの発明の範囲を限定するものではない。

ＧＡＰプロモーター及びターミネータ−の制御のもとに
ヒト−プロインシュリン遺伝子のアミノ末端に融合した
ヒトＳＯＤ遺伝子を含有する酵母発現プラスミドｐＹｓ
Ｉ　１を造成した。融合蛋白質のプロセシングを可能に
するため、ＳＯＤ遺伝子及びプロインシュリン遺伝子の
間にメチオニンをコードするトリプレットを含有せしめ
た。ＳＯＤ配列は、化学合成された最初の２０コドンを
除き、ヒトー肝蔵ライブラリーから単離されたｃ　ＤＮ
Ａに対応する。プロインシュリン配列は、Ｂｅ１１等、
１９７９、Ｎａｔｕｒｅ　　２８２　：５２５〜５２７
により報告されたアミノ酸配列に従って、しかし酵母に
おいて好ましいコドンを用いて化学合成した。ＧＡＰプ
ロモーター及びターミネータ−配列は酵母ライブラリー
から単離された酵母ＧＡＰ遺伝子（Ｈｏｌｌａｎｄ及び
Ｈｏ１ｌａｎｄ　　、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、
　　、　１９７２　、　２５４　：　５４６６−５４７
４）から得た。

プラスミドｐｙｓｒ　１を次のようにして造成した。

３つの断片、すなわち、ｐｈｓＯＤ（ｐｓＱＤ　　Ｎｅ
ｏ　Ｓとも称する）から単離された４５４　ｂ　ｐ　Ｎ
ｃｏ　Ｉ　−５ａｕ３Ａ断片〔この断片は、ヒトスーパ
ーオキシドジスムターゼ（ｈｓＯＤ）の最後の３個の３
′−コドンを除く全配列を含む”）；ｈｓＯＤの最後の
３個のコドン、メチオニン、及びプロインシュリンの最
初の１４コドンをコードする５１ｂｐＳａｕ３Ａ−Ｈｉ
ｎｄＩＩ［合成アダプター；及び最初の１４アミノ酸を
除（プロインシュリンをコードする、ｐＩＮＳ５から単
離された２３１　ｂ　ｐ　Ｈｉｎｄ　ｍ　−Ｓａｌ　Ｉ
断片、を使用した。これらの断片を一緒に連結し、そし
て次に、ＮｃａＩ及び五刀」によりあらかじめ消化され
そしてアルカリ性ホスファターゼで処理されたプラスミ
ドｐＰＧＡＰに導入した。得られたプラスミドｐｓ１１
をＢａｍＨＩで消化して発現カセットを得、これをプラ
スミドｐ　Ｃ１／１にクローン化してｐＹｓＩ　１を得
た。

プラスミＦｐｈＳＯＤ（ｐ　Ｓ　ＯＤ　Ｎｃｏ　Ｓとも
称される）はｐＢＲ３２２由来細菌性発現ベクターであ
って、１９８４年５月１１日に出願された米国特許出願
６０９，４１２号明細書に記載されているように、ｈｓ
ＯＤをコードする完全なｃＤＮＡ（最初の２０コドンは
化学的に合成された）。プラスミドｐｌＮｓ　５はｐＢ
Ｒ３２２由来ベクターであり、Ｂｅ１１等、Ｎａｔｕｒ
ｅ、　１９７９．２８２　：５２５−５２７により報告
されたアミノ酸配列に従って化学的に合成されたプロイ
ンシュリンコード配列を含有する。プラスミドｐＰＧＡ
Ｐは前記の特許出願ＩＶｈ６０９．４１２号明細書中に
記載されているｐＢＲ３２２由来ベクターであって、ク
ローニングのための複数の単一制限部位をもたらすポリ
リンカーを介してＧＡＰプロモーター及びＧＡＰターミ
ネータ（Ｈｏｌｌａｎｄ及び１（ｏｌｌａｎｄ　　、Ｊ
、Ｂｔｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、　　。

１９７９　、韮、　５４６６−５４７４を含有する。プ
ラスミドｐｃｉ／１は、ｐＢＲ３２２配列、２μプラス
ミド配列及び選択マーカーとしての酵母遺伝子ＬＥＬ２
を含有する酵母発現ベクターである。ＥＰＯ８３／３０
６５０７、１を参照のこと。

且ＳＩ２坐遺双 に−Ｒ−３−Ｔ−３−Ｔ−３をコードするコドンの６ス
ペーサ”によりプロインシュリン遺伝子から分離されて
、転写の方向において５′−末端に、ｈｓＯＤコード配
列を有する融合遺伝子を調製するため、次の断片すなわ
ち、ＧＡＰプロモーター、プロインシュリン遺伝子及び
スペーサーアミノ酸を含有する６７１ｂｐ旦ａｍＨＩ−
３工１断片；両遺伝子の連結部として最後のスペーサー
アミノ酸をコードする１４ｂｐＳａｌＩ−凡匹Ｉ合成ア
ダプター；並びに、前記の特許出願書ｌＩｈ６０９，４
１２号明細書に記載されているｐｃ１／Ｉ　５ＡＰＳＯ
Ｄから単離された１、５　ｋ　ｂＮｃｏｌ　−ＢａｍＨ
Ｉ断片（ｈｓｏｏコード領域、５６ｂｐのｈｓＯＤター
ミネータ−及び９３４　ｂ　ｐのＧＡＰターミネータ−
領域を含有する）を連結した。得られるクローン化断片
を単離し、そして１３ａｍＨＩ消化されそしてアルカリ
性ホスファターゼ処理されたｐｃｉ／１中に挿入した。

プラスミドＰＫＩ　１　　びＰＫＩ　２ｐＹｓＩ　ｉ及
びｐＹｓＩ　２に類似するプラスミドを、ｈｓｏｏ遺伝
子の代わりに酵母ピルベートキナーゼ（ＰＹＫ）を用い
て造成した。ρＰＫＩＩは、酵母ＰＹＫプロモーター及
び酵母ＧＡＰターミネータ−の制御のもとに、ヒト−プ
ロインシュリン遺伝子のアミノ末端に融合したＰＹＫコ
ード配列を含有する。ｐＰＫＩ　２は、Ｋ−Ｒ−３−Ｔ
−３をコードするコドンの“スペーサー”によりプロイ
ンシュリン遺伝子から分離されて、転写の方向において
３′−末端に、ＰＹＫコード配列を含有する。

虹旦Ｕ旦盈底 この酵母発現ベクターはｐＹＳＩ　１に類似し、そして
メチオニンコドンを介してヒト−プロインシュリン遺伝
子のアミノ末端に融合したｈｓＯＤ遺伝子を含有する。

この融合遺伝子はバイブリド誘導性プロモーターＡＤＨ
２−ＧＡＰ（酵母アルコールデヒドロゲナーゼ２）及び
ＧＡＰターミネータ−の制御のもとにある。ｐＹｓｌｌ
からのＧＡＰプロモーター配列をバイブリドＡＤＨ２−
ＧＡＰプロモーター配列で置き換えることにより約３Ｋ
ｂｐＢａｍＨＩ発現カセットを造成した。

このプロモーターのＡＤＨ２部分を次のようにして造成
した。すなわち、野性型ＡＤＨ２遺伝子を含有するプラ
スミド（プラスミドｐＡＤＲ２、Ｂｅ１ｅｒ及びＹｏｕ
ｎｇ　　、　Ｎａｔｕｒｅ　、　１９８２　、３００　
　、７２４−７２８を参照のこと）を制限酵素旦ｃｏＲ
５で切断した。この制限酵素は、Ａ、ＴＣ開始コドンに
対して＋６６位、及びＡＤＨ２領域外のｐＡＤＲ２中の
他の２つの部位を切断する。ベクター断片及び２つの小
断片の混合物を１旦３１エキソヌクレアーゼで切り取っ
て約３００ｂｐを除去した。Ｂａ１３１処理されたＤＮ
Ａに合成Ｘｈｏｌリンカーベクター断片（約５ｋｂ）を
カラムクロマトグラフィーによりリンカ−から分離し、
制限酵素Ｘｈｏｌで切断し、再連結し、そしてこれを用
いてＥ、コリをアンピシリン耐性に形質転換した。Ｘｈ
ｏｌ’Ｊンカー付加の位置をＤＮＡ配列決定により決定
した。ＡＤＨ２遺伝子の５′−非転写領域（ＡＴＧから
一２３２位）内に位置するＸｈｏｌリンカ−を含有する
１つのプラスミドを制限酵素ＸｈｏＩで切断し、 ヌクレアーゼＳｌで処理し、そして次に制限酵素旦ｃｏ
ＲＩで処理してＸｈｏＩリンカ−の部位に１つ　・の平
滑末端、及び旦ｃｏＲＴ末端を有する線状ベクター分子
を形成した。

プロモーターのＧＡＰ部分を、プラスミドｐＰＧＡＰ（
前掲）を酵素旦ａｍＨＩ及び１匹Ｒ１で切断し次に０．
４ｋｂｐＤＮＡ断片を単離することにより造成した。

プラスミドｐＪｓ１０４を、人動Ｉ一旦匹ＲＩＧＡＰプ
ロモーター断片を上記の線状ベクター上に存在するＡＤ
Ｈ２断片に連結することにより造成した。

プラスミドｐＪｓ１０４を１憇Ｈ１（これは、ＡＤＨ２
領域の上流を切断する）及び五ｃａｌ（これは、ＧＡＰ
領域の下流を切断する）により消化した。

ＡＤＨ２−ＧＡＰプロモーターを含有する約１．３ｋｂ
ｐ断片をゲル精製し、そしてｐＹｓｌｌ（前記）中に存
在するＧＡＰターミネータ−及びｈＳＯＤ−プロインシ
ュリン融合ＤＮＡ配列を含有する約１、７　ｋｂｐ断片
に連結した。この３　ｋｂｐ発現カセットを、ＢａｍＨ
Ｉ消化されそしてホスファターゼ処理されたｐｃｉ／１
にクローン化してｐＹＡｓｌｌを得た。

ｐＹＡｓｌｌから一連のプラスミドを造成した。ここで
は、ＧＰＡターミネータ−をα−ファクターターミネー
タ−（Ｂｒａｋｅ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｅｔ。

皿、　１９Ｂ４　、８１　：　４６４２）により置き換
え、そしてＳＯＤとプロインシュリンとの開裂部位をト
リプシン又はエンテロキナーゼプロセシング部位をコー
ドするように変形した。Ｌｙｓ−Ａｒｇをコードする配
列を用いてｐＹＡｓｌｌ中のメチオニンコドンを置換し
てトリプシン部位を得た。別法として、開裂部位に（Ａ
ｓｐ）　ｔＬｙｓをコードする配列を用いてエンテロキ
ナーゼ部位を得た。さらに、余分のヒンジアミノ酸をコ
ードする配列をＳＯＤと開裂部位との間に挿入して他の
造成も行った。

監査１亘１重発１ 酵母２１５０−２−３株（Ｍａｔａ　、　ａｄｅＩ　、
　ｌｅｕ　２−０４　。

ｃｉｒ”　）又はＰＯ１ｒｒ株（Ｍａｔａ　、　Ｌｅｕ
　２−０４　、　　ｃｉｒ”　）を異るベクターにより
、旧ｎｎｅｎ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　ＵＳＡ　（１９７８）７５　：　１９２９
−１９３３に従って形質転換した。構成的ＧＡＰ制御ベ
クターを担持する単一形質転換体コロニーを２ｒｒｌの
１ｅｕ−選択培地に後対数増殖期又は定常期まで増殖せ
しめた。誘導性ＡＤＨ２−ＧＡＰ制御ベクターをｌｅｕ
”選択培地中で飽和まで増殖せしめ、次にＹＥＰ　（３
％エタノールを含み、２〜３．５　ｍ　Ｍ　ＣｕＳ０４
を含むか又は含まない）中に１　：　２０　（Ｖ／Ｖ）
に稀釈し、そしてこの培地中で飽和まで増殖せしめた。

ＳＤＳ及び還元剤の存在下で細胞を溶解し、そしてこの
細胞溶解物を遠心分離により透明にした。透明な細胞溶
解物をポリアクリルゲル電気泳動にかけた（Ｌａｅｍｍ
ｌｉ　、　Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２７７　：６８０
）　、クマーシーブルーにより染色した後、約２８ｋＤ
ａｌ　（キロダルトン）のバンドが観察され、そのサイ
ズは融合蛋白質であることを予想せしめた。このバンド
は、発現ベクターにより形質転換された細胞においては
観察されたが、対照（ｐｃｉ／１）プラスミドを担持す
る細胞の抽出物には存在しなかった。バンド当りの蛋白
質の量を、クマーシーブルー染色されたゲルのデンシト
メーターによる分析により決定した。ｐＹｓＩ　１　、
ｐＹｓＩ　２又はｐＹＡｓｌｌで形質転換された細胞に
おける染色ゲルから算定した場合、融合蛋白質は全細胞
蛋白質の１０％以上であり、他方ｐＹＰＫ１１又はｐＹ
ＰＫＩ２による形質転換体においては０．５％より少な
い（第１表を参照のこと）。

以下余白 ＰＹＫＣピルベートキナーゼ遺伝子 ＳＯＤ：ヒトＳＯＤ遺伝子 ＢＣＡ５　　ニブロインシュリン遺伝子Ｐ、Ｇ、Ｄ、Ｎ
、Ｍ、に、Ｒ，Ｓ、Ｔ：　１文字アミノ酸コードＧＡＰ
ｐ　：ＧＡＰプロモーター ＧＡＰｔ：ＧＡＰターミネータ− ＰＹＫｐ：ＰＹＫプロモーター ＰＹＫｔ：ＰＹＫターミネータ− （八ＤＨ２−ＧＡＰ）ｐ：ハイフ゛リドＡＤＨ２−ｃＡ
ｐプロモーター α−ファクター、：α−ファクターターミネータ−１第
１表に示す結果は、ＰＹＫ−プロインシュリン融合体の
発現レベルはプロインシュリンのみについて得られたそ
れに匹敵する（それぞれ約０．５％及び０．１％）がｈ
ｓＯＤ−プロインシュリンの発現レベルは約２０〜１０
０倍高いことを示している。

誘導性ＡＤＨ２−ＧＡＰバイブリド転写開始制’ａＳｉ
域が好ましい。なぜなら、大規模培養における構成的生
産は不安定な発現をもたらすからである。

酵母により合成されたｈｓＯＤ−プロインシュリン蛋白
質をさらにウェスタンプロットにかけた。

上記のようにして調製された透明な酵母細胞溶解物をポ
リアクリルアミドゲル上で電気泳動しくＬａｅｍｍｌｉ
、前掲）、そして次に蛋白質をニトロセルロースフィル
ター上に電的的にプロットした（Ｔｏｉｙｂｉｎ等、Ｐ
ｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　
　ｌｌ５Ａ　　、　　１９７９　　、　　ヱ旦　：　　
３４５０）　　　。

２枚の同じフィルターにプロットした。このフィルター
をＰＢＳ中１％ＢＳＡと共に１時間ブレインキュベート
し、そして次にラビット抗−ｈＳＯＤ又はモルモット抗
−インシュリン抗体により４℃にて１２時間処理した。

いずれの血清も、１０％やぎ血清中ｐ　Ｃ１／１対照細
胞溶解物により前吸着しておいたものである。フィルタ
ーを１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、そしてホースラディ
ツシュパーオキシダーゼと接合した第２ヤギ抗−ラビッ
ト抗体又は抗−モルモット抗体を加えた。最後に、フィ
ルターをホースラディツシュパーオキシダーゼ発色剤（
ビオ−ラド）と共にインキュベートし、そして洗浄した
。ウェスタン分析は、融合蛋白質が両抗体と反応したこ
とを示した。

量立ｌ皇ｌ立皿裂 ２１５０　（ｐＹＡｓｌｌ）の飽和培養物をＳＤＣ（−
ロイシン＋スレオリンおよびアデニン、２％グルコース
含有）中で増殖せしめた。これを、炭素源として３％エ
タノールを含有するＹＥＰを収容する１０１フプーメン
ターに接種した。３０℃にて４８時間の後、細胞を遠心
分離（シャープレス）により集め、秤量しく１２４ｇ）
、そして冷水で洗浄した。

１　０　　ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　　、、　ｐＨ７，０
、１ｍＭＥＤＴＡ、１Ｈｇ／ｍβペプスタチンＡ及び１
ｍＭＰＭＳＦを含有する緩衝液を用いてガラスピーズ破
砕機（ダイノミル）により細胞を溶解した。この混合物
をＪＡＩＯロータ（ベックマン）中で８．００Ｏｒｐｍ
にて２０分間遠心分離した。ペレットを１００ｍ１の緩
衝液中に再懸濁し、そして液体をビーズから離した。約
５００ｍｊ２の緩衝液が使用されるまでこれを反復して
、すべてのペレット物質をガラスピーズから十分に話し
た。再懸濁、されたベレットを遠心分離し、そしてこの
ベレットを再度洗浄した。次にベレットを１％ＳＤＳを
含有する緩衝液中で３０分間抽出した。

ＳＯ３可溶性画分を５００　ｍ　ｌの溶剤Ａ　（Ｋｏｍ
ｉｇｓｂｅｒｇ及びＨｅｎｄｅｒｓｏｎ　　、　１９８
３　、　Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚ、　９１　、２５４
−２５９頁）を用いてイオン対（ｉｏｎ−ｐａｉｒ）抽
出し、ペレットを溶剤Ａで一回及びアセトンで１回洗浄
した。

真空デシケータ−で乾燥した後、粉末を１４０ｒｒｌの
１００％蟻酸中に溶解した。６０ｍ１の水及び２０ｇの
ＣＮＢ　ｒを加えた。暗中室温にて２４時間置いた後、
さらに２０ｇのＣＮＢｒを加え、そして反応を２４時間
続けた。この時点で、この材料を４１の水に対して一夜
、２０００ＭＷカットオフチューブ（スペクトラポール
）を用いて透析した。

次に０．１％酢酸に対して第２回目の透析を行った。

凍結乾燥した後、はとんど５ＯＤ−ホモセリンとプロイ
ンシュリンとからなる粉末を１．１Ｈ得た。

この粉末を７％尿素、９％亜硫酸ナトリウム、及び８．
１％ナトリウムテトラチオネート・２Ｈ，０の溶液（ｐ
Ｈ７，５）２００　ｍ　ｌに溶解した。３７℃にて３時
間インキュベートした後、Ｓ−スルホネート生成物を１
０　ｍ　ＭＴｒｉｓ　（ｐＨ８，０）に対して２回、そ
して２０　ｍＭＴＥＡＢ　（炭素水素トリメチルアンモ
ニウム（ｐＨ７，３）に対して１回透析した。

Ｓ−スルホネートを凍結乾燥により回収し、そして２４
０ｍＮのＤＥＡＥカラム緩衝ＷＬ（１４ｅｔｚｅ１等、
Ｇｅｎｅ　、　１９８１　、１７　：　６３−７１）に
溶解し、そして６０ｍ１Ｏカラムに負荷した。２カラム
容積を用いて洗浄した後、プロインシュリン−８−スル
ホネートを、カラム緩衝液中Ｏ〜０−４　Ｍ　Ｎａ（Ｊ
！のグラジェント６００ｍ＋２により溶出した。プロイ
ンシュリンＳ−スルホネートを含有する両分をプールし
、そして１０　ｍ　ＭＴｒｉｓ　（ｐＨ７，５）に対し
て２回、そして１ｍＭＴｒｉｓに対して１回透析した。

生成物、すなわち約り０％純度のプロインシュリン−８
−スルホネートはｐ）１９でのゲル電気泳動（Ｌｉｎｅ
等、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１９８０　
、１０７　：１６５−１７６）において予想量りに泳動
することが示され、そして正しい１５Ｎ−末端残基を有
する。分析において、アミノ酸組成は予想のそれと非常
に近似しており、但し低レベルの不純物の存在のために
完全には正しくなかった。収量は１５０ｍ　ｇであった
。

次の方法により、再生（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）に
ついての予備的結果が得られた。プロインスリン−８−
スルホネートは、ｐＨ０，５にてβ−メルカプトエタノ
ールを用いて再生することができる（Ｆｒａｎｋ等、　
１９８１　、　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：　５ｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ、　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎ　
、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｅｖｅ
ｎｔｈ　ＡｍｅｒｅｃａｎＰｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙ＋ａｐ
ｑｓｉｕｍ　　、　Ｒｉｃｈ及びＧｒｏｓｓ　ｌｉ、ピ
アス・ケミカル社、ロックフォード、ＩＬ、７２９〜７
３８頁）。予備実験において、正しく構成されたプロイ
ンシュリンの収量を、トリプシン及びカルボキシペプチ
ダーゼＢによる消化によって生成するインシュリンの生
産によりモニターした。この方法により精製されたプロ
インシュリン−５−ＳＯ３は、ブタ−プロインシュリン
−３−３Ｏ３と同様に再生するようにである。この方法
は、インシュリンの予想量の７０％をもたらすことが報
告されている。この方法により製造されたインシュリン
は、アミノ酸配列決定により決定した場合、Ａ鎖および
Ｂ　１３（のそれぞれに正しいＮ−末端１５残基を有す
る。

ＡＩＤＳ関連ウィルス（八ＲＶ）　（Ｓａｎｃｈｅｚ−
Ｐｅｓｃａｄｏｒ等。

５ｃｉｅｎｃｅ（１９８５’）　２２７　：４８４）の
圧遺伝子のエンドヌクレアーゼ領域のアミノ末端に融合
したヒトＳＯＤ遺伝子を含む酵母発現プラスミドｐｃｉ
／１−ｐｓＰ３１−ＧＡＰ−ＡＤＨ２を造成した。５Ｏ
Ｄ−ｐ３１の発現は非構成性であり、ハイブリッドＡＤ
Ｈ−ＧＡＰプロモーターの調節下にある。

、ト１ｑ二１□り」２ニーｑ３１−ＧＡＰ−へＤＨ２１
秀　　　　の′告酵母内で発現すべき融合タンパク質５
ＯＤ−ｐ３１の遺伝子を造成するためにプラスミド（ｐ
Ｓ１４／３９−２）を使用した。このプラスミドは、ｐ
ＹＡＳｌと同じ態様で、ＡＤＨ−２／ＧＡＰプロモータ
ーの制御下にプロインシュリン遺伝子に融合したＳＯＤ
遺伝子を含有している。プロインシュリン遺伝子ｉ旦ｃ
ｏＲＩ制御部位を５ａｌＩ制限部位との間に位置する。

プロインシュリン遺伝子をｐ３１断片によって置き換え
ために、ホスホラミディト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄ
ｉ　ｔｅ）化学を使用して、２種のオリゴマー（各々、
ＡＲＶ−３００およびＡＲＶ−３０１と称す）を合成し
た。その配列は、２種のオリゴマーをアニーリングした
際に、分子の各側部に旦ｃｏＲＩ用およびＮｃｏＩ用の
付着端部を発生する。ＡＲＶ−３００およびＡＲＶ−３
０１は以下の配列をもつ。

ＡＲＶ−３００５’　　ＡＡＴＴＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧ
ＡＧＣＧＴＣＣＡＣＡＡＣＣＴＣＧＧＴＡＣ５’　　へ
ＲＶ−３０１旦匹Ｒ１で線状化した。）Ｓｌ、４３９−
２の２μｇを、ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼの存在
下において、リン酸化ＡＩ’１Ｖ−３００および脱リン
酸化へＲＶ−３０１の各々１００ピコモルに連結した（
最終容量３５μり。反応を１４℃で１８時間実施した。

ＤＮＡを５ａｌＩて更に消化し、断片を１％低融点アガ
ロースゲル上で分離し、前記ベクターとＳＯＤ遺伝子（
〜６．５ｋｂ）とを含む断片を前記と同様に精製し、そ
してＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、　
ｐＨ８）　　５０μβ中に再懸濁した。５μｌのこの調
製物を１４℃で１８時時間３１断片（ＡＲＶ２４８ＮＬ
　、後記参照）５μβに連結したく最終容量２０μｍ）
。コンピテントＨＢＩＯＩ細胞の形質転換には５μβを
使用した。得られたプラスミドをｐｓＢ３１と称する。

このプラスミド２０ｐｇをＢａｍＨＩで消化し、約２９
００　ｂ　ｐの断片をゲル電気泳動によって単離し、Ｔ
Ｅ中に再懸濁し、そして、予めＢａｍＨＩで切断してお
いたｐｃｉ／１に連結した。このＤＮＡを使用してＨＢ
ＩＯＩを形質転換し、旦ａｍＨＩカセットをもつ形質転
換細胞を得た。

このｐｃ１／１−ｐｓＰ３１−ＧＡＰ−ＡＤＨ２誘導対
によって酵母菌株Ｐ　Ｏ１７（Ｍａｔａ　、　ｌｅｕ　
２−０４、ｃｉｒ”　）を形質転換した。

ＡＲＶ２４８ＮＬ　　なわ　　３１コード　　の８１８
００　ｂ　ｐ　ＡＲＶ２４８ＮＬ断片は、前記５ａｎｃ
ｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ等の文献の第２図に示すよう
に、ｐａｌタンパク賞の末端に向かって、アミノ酸７３
７個をコードするものである。前記の調製は以下の手順
によって行った。

ｐｏｌ遺伝子の３′末端とｏｒｆ−１、ｅ　ｎ、ｖ、及
びｏｒｆ−２の５′末端とを含み、予め１％低融点アガ
ロース〔シー・パック（Ｓｅａ−Ｐａｃｋ）　）ゲル上
を泳動せしめそして６５℃でフェノールによって抽出し
たＡＲＶ−２（９Ｂ）のｋＩ消化体〔前記の５ａｎｃｈ
ｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ等の文献参照〕から５．２ｋｂ
ＤＮＡ断片を単離し、１００％エタノールで沈澱し、そ
してＴＥ中に再懸濁した。この材料８μ２を、３７℃で
１時間５ｓｔＩで更に消化した（最終容量１０μり。酵
素の加熱不活性化の後で、前記の消化物１．２５μβを
、予めＸ且■および５１０で切断した２０μｇのＭｌ　
３ｍｐ　１９に、ＡＴＰの存在下で連結した（最終容量
２０μｍ）。反応を室温で２時間進行させた。この混合
物５μｌを使用してコンピテント旦、ユｉＪＭ１０１の
形質転換を行った。透明なプラークが生長した。Ｍｅｓ
ｓｉｎｇおよびＶｉｅｉｒａ、釦匣（１９８２）旦：　
２６９−２７６に記載のとおりにして一本鎖ＤＮＡを調
製した。

Ｍ１３鋳型中のＤＮＡ配列を部位特異豹変′１を誘発に
よって変更して、Ｎｃｏｌによって認識される制限部位
（ＣＣＡＴＧＧ）を生成した。３８４５位置〔前記の５
ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ等の文献の第１図〕の
ＣとＡとを変えそして３８５１位置のＴ（！：Ａとを変
えたオリゴデオキシヌクレオチドを、固相ホスホラミデ
ィト法によって合成した。これらの変化は両者とも、ア
ミノ酸配列に関しては影響を与えない。第２の変化を導
入して非対応（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）分子の安定
性を低下させた。このオリゴマーをＡＩ？Ｖ−２１６と
称する。このオリゴマーは配列 ５　’　−ＴＴＡＡＡＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣ
ＴＣＴＣＣＡＡＴＴＡＣＴＧをもち、非コード鎖に相当
する。なぜなら、Ｍ１３誘導体鋳型０１１００４８４は
一本鎖であってコード鎖を含むからである。５′脱リン
酸化Ｍ１３配列決定ブライマー、５０ｍＭのＴｒｉｓ　
−ＨＣｊ！　　（ｐＨ８）、２０ｍＭのＫＣｊ２．７ｍ
ＭのＭｇＣ４２Ｋおよび０．１ｍＭのＢＤＴＡ。ＤＮＡ
二重鎖５０　ｎ　ｇ／　ＬＪ　、　ｄＮＴＰ１５０ＩＩ
Ｍ、　ＡＴＰ　１　ｍＭ、　　トリス−アセテート（ｐ
Ｈ７，８）　３３　ｍＭ、酢酸カリウム６６ｍＭ、酢酸
マグネシウム１０ｍＭ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
　　５　ｍＭ、　Ｔ　４ポリメラーゼ１２．５単位、Ｔ
４遺伝子３２プロティン１００μｇ　／　ｍ　ｌおよび
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ５単位を含む１００μ！中で重合反
応を実施した。この反応混合物を３０℃で３０分間イン
キュベートし、そしてＥＤＴＡおよびＳＤＳ　（最終濃
度で各々１０ｍＭおよび０．２％）を添加して反応を停
止した。コンピテントＪＭ１０１　Ｅ、コリ細胞を前記
重合生成物の１：１０希釈物１μｍ、２μ！および４μ
ｌで形質転換し、ＹＴプレートにブレーティングした。

プラークを吸着によってニトロセルロースフィルターに
上げ、０．２ＮのＮａＯＨおよび１．５ＭのＮａＣｊ２
中で変性し、続いて０．５　Ｍのトリス−ＨＣ１（ｐＨ
７，３）および３ＭのＮａＣ１中で中和し、そして６　
ｘＳＳＣ中で平衡化した。フィルターをブロッティング
して乾燥し、８０℃で２時間ベーキングし、そして０．
２％ＳＤＳ、１０ｘデンＡ　　）　（Ｄｅｎｈａｒｄｔ
）　　５　ｘ　ＳＳＣ中で３７℃で前アニーリングした
。１時間後うヘル付ＡＲＶ−２１６（７）　７．５　Ｘ
　１０６ｃｐｍをフィルターに加工、更に２時間３７℃
でインキュベーションした。フィルターを６　ｘＳＳＣ
中で２０分間４２℃で洗い、プロッティングで乾かし、
そして補助（ｉｎｔｅｎｓｉ−ｆｙｉｎｇ）スクリーン
を使用する−７０℃における１時間のフィルム露出に使
用した。ハイブリッド性の強いプラークが生長した。こ
れから−末鎖ＤＮＡを調製し、配列決定用の鋳型として
使用した。配列決定が示すところによれば、鋳型ｔｌ１
０２１７８５はＮｃｏＩ部位と前記の第２置換とを含ん
でいた。

第２オリゴマーを合成し、ｐｏｌ遺伝子の末端コドンの
直後に５田」部位および旦ｃｏＲ１部位を挿入した〔前
記５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ等の文献の第１図
、４６４７位置）、、：、（７）、ｔ＋Ｊゴマ−をＡＲ
Ｖ−２４８と称する。配列は以下のとおりである。

５　’　−ＧＧＴＧＴＴＴＴＡＣＴＡＡＡＧＡＡＴＴＣ
ＣＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣハイブリッド
形成後のフィルター洗浄を６５℃で実施すること以外は
前記と同様にして、鋳型０１０２０７８５を使用して部
位特異的変異誘発を実施した。前記と同様に、ハイブリ
ッド性の強いプラーク８個が生長し、−末鎖ＤＮＡを配
列決定した。

鋳型０１０３１９８５の配列が示すところによれば、そ
れは意図したとおり、ΣＣＯＩ％Ｓ旦■および１並ＲＩ
用の制限部位を含んでいる。

透明プラーク６個を各々３７℃で５時間２ｘＹＴ（酵母
抽出液０．５％、トリプトン０．８％、ＮａＣｊ２０．
５％、寒天１．５％）１．５ｍＪ中で生長させることに
より、Ｍ　１３０１０３１０９８鋳型の複製型（ＲＦ）
を調製した。Ｍａｎｉａｔｉｓ等、ル江匹且堕り工乃旦
帥ｌエエａＬａｂｏｒａｔｏｒ　　ｍａｎｕａｌ　　、
　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　、　１９８
２に記載のとおりにして二本鎖ＤＮＡを得、プールし、
最終容量１００μβ中に再懸濁した。ＲＦのアリコート
２０μｌを、消化緩衝液４０μｌ容量中で、ＮｃｏＩお
よび５ａｌＩで切断した。この断片を酵母中でのｐ３１
発現に使用した。試料を１％低融点アガロース〔シー・
パック（Ｓｅａ−Ｐａｃｋ）　）ゲル上で泳動させ、臭
化エチジウムによる蛍光によってＤＮＡを可視化した。

５ｏｏｂｐバンドを切出し、前記と同様の方法でＤＮＡ
をゲルから抽出し、そしてＴＥＩＯμβ中に再懸濁した
。この断片をＡＲＶ２４８ＮＬと称する。

ＣＩ／１−５Ｐ３１−ＧＡＰ−ＡＤ）１２の津３種類の
異なる誘導を行った。

１）ＹＥＰ／１％グリコース培地またはＩｔ　６ｕ−７
３％エタノール培地のいずれか１０ｍｊ２中で２４時間
、Ｐ０１７コロニーを誘導させた。各混合物からの酵母
ベレットを、ＡＩＤＳ患者からの血清を使用するーｅｓ
　ｔｅｒｎｓおよびポリアクリルアミドゲルの両者によ
って、ｐ３１に関して分析した。クーマシ−（Ｃｏｏｍ
ａｓｓｉｅ）染色ゲルは陰性の結果を示すが、どちらの
場合でも、Ｗｅｓ　ｔｅｒｎｓは正確な分子量のバンド
を示した。

２）ＹＥＰ／１％エタノール培地３０ｍ培地３０イＡ！
中、ＰＯ１７コロニーを誘導した。誘導の際の種々の時
点において、アリコートをＰＡＧＥによって分析した。

クーマシー染色ゲルは正しい分子量範囲（４７−５０ｋ
ｄ）にバンドを示し、これはＹＥＰ／１％エタノール中
で１４時間後に現われ、そして誘導の２４時間後に最大
強度に達する。

ＡＩＤＳ患者からの血清を使用する５ＯＤｐ３１に関す
るＷｅｓ　ｔｅｒｎの結果は、誘導の２４時間および４
８時間に強いバンドを示し、クーマシー染色ゲルと良好
に相関する。

（以下余白） からの５ＯＤ−３１の　□　び　　づけ冷凍された酵母
（細菌）細胞を室温で解凍し、そして溶菌緩衝液〔細菌
のためには、２０ｍＭのＴｒｉｓ　−Ｃ１％　ｐＨ＝　
８．０．２ｍＭのＥＩＩＴＡ、及び１ｍＭのフェニルメ
チルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）　：酵母のため
には、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃ１ｌ、ｐＨ＝８．０．２
ｍＭのＥＤＴＡ　、及び１ｍＭのＰＭＳＦ）１．５容積
中に懸濁し、そして酸で洗浄されたガラスピーズ１容積
と共に混合した。

一２０℃の冷却ユニットに連結されているＤｙｎｏｎ＋
ｔｌｌユニットのガラスチャンバーを用いて３、０００
ｒｐｍで非連続的に１５分間細胞を破壊した。

カラスビーズを氷上で２〜３分間デカントし、そして細
胞溶解物を取り出した。デカントされたガラスピーズを
４０℃で溶菌緩衝液３０ｍ！！により２度洗浄した。細
胞溶解物を３９，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。

上記の遠心分離から得られたベレットを溶菌緩衝液によ
り１度洗浄し、その後かきまぜ、そして４℃でそのベレ
ットを懸濁した（上と同じ遠心分雌を行なった）。洗浄
されたベレットを溶菌緩衝液中０．２％ＳＤＳ　（細菌
のためには）及び０．１％ＳＤＳ　（酵母のためには）
により処理し、そして４℃で１０分間揺動することによ
って攪拌した。

溶解物を３９，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。ベ
レットをサンプル緩衝液（６７，５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃ
１ｌ。

ｐＨ＝７．０．５％β−メルカプトエタノール、及び２
．３％５ＤＳ）中において１０分間煮沸し、そして３９
．０００　ｘ　ｇで１０分間遠心分離した。上清液を回
収し、そして０．４５μｍフィルターを通した。上のフ
ィルターからの上清液をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）およ
び０．１％ＳＯ３により平衡化されたゲル濾過カラム（
２，５Ｘ　９０　ｃＩｌ、　ＡＣＡ３４ＬＫＢ）上に０
、３〜０．４ｍＪ／分の流量で負荷した（最大５０■の
タンパク質）。５ＯＤ−ｐ　３１を含む両分をプールし
、そして真空透析するか、又は４０ｐｓｉでＹ　Ｍ　５
　Ａｍ１ｃｏｎ膜を用いるかいづれがＫよって濃縮した
。このタンパク質を濃厚溶液として一２０℃で貯蔵した
。

ゲル電気泳動分析は、約４６ｋｄの分子量を有する５Ｏ
Ｄ−９３１タンパク質が泳動し、そして９０％以上の純
度であることを示した。

類似する構成及び結果が、旦、ＬＬ中において細菌のｊ
ｒｐ−ｊ！　ａｃプロモーターの制御下で５ＯＤ−ｐ３
１融合体を発現することによって得られた。

この５ＯＤ−ｐ３１融合タンパク質は、体液中のＡＩＤ
Ｓに対する抗体の存在を検出するための免疫検定に使用
できる。好効果が５ｏｐ−ｐ　３１融合タンパク賞を用
いて、ＥＬＩＳＡ及びストリップ検定において得られた
。

劃３：　　５ＯＤ−ＩＧＦ−２麗治ノ詠２シ江【ｑため
の　　ベタ　−の１　　゛ ＩＧＦ２遺伝子のアミノ末端に融合したヒトＳＯＤ遺伝
子を含む酵母発現プラスミドｐＹＬＵＩＧＦ２−１４（
ＥＰＯ１２３２２８を参照のこと）を造成した。

５ＯＤ−ＩＧＦ２の発現は非構成的であり、そしてそれ
はハンプリッドＡＤＨ−ＧＡＰプロモーターの制御下に
ある。

ＹＬＵＩＧＦ２−１４　　の′告 酵母中で発現されるべき融合タンパク質５ＯＤ−ＩＧＦ
２のための遺伝子の造成のために、プラスミドｐＹ３１
Ｂを使用した。プラスミドｐＹＳ１８はＡＤＨ−ＧＡＰ
プロモーター及びα−因子ターミネータ−の制御下にプ
ロインシュリン遺伝子に融合したＳＯＤ遺伝子を含む（
第１表を参照のこと）。プラスミドｐＹ３１ＢをＢａｍ
ＨＩ及びＥｃｏＲＩにより消化した。１８３０ｂｐの断
片（ＡＤＨ−ＧＡＰプロモーター及びＳＯＤ遺伝子を含
む）をゲル電気泳動によって精製した。

第２のＢａｍＨＩ　（４６０ｂ　ｐ　）フラグメント（
ＩＧＲ−２のアミノ酸残基４１〜２０１及びα−因子タ
ーミネータ−をコードする）（ＥＰＯ１２３２２８を参
照のこと）を次のリンカー： 動態ＲＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　狂Ｉ＾ＡＴＴＣＣＡ　ＴＧ　ＧＣＴＴＡＣＡ　ＧＡＣ
ＣＡＴＣＣＧ　ＡＡ　Ａ　ＣＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧ
ＴＧ　Ａ　ＡＴＴＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＧＴＣＴＧ
ＧＴＡＧＧＣＴＴＴＧＧＡＡＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴ
ＴＡＡＣＣＡＧＣＴに連結した。このリンカ−はＥｃｏ
ＲＩオーバーハング、メチオニンのためのＡＴＧコドン
及びＩＧＦ２のコドン１〜４０並びに５ａｌｌオーバー
ハングを提供する。

ｔＧＦ−２遺伝子及びα−因子ターミネータ−を含む得
られるＥｃｏＲＩ一旦ａｍＨＩ断片（５１０ｂ　ｐ　）
を、ＡＤＨ−ＧＡＰプロモーター及びＳＯＤを含む１８
３０ｂｐの旦憇ＨＩ一旦匹ＲＩ断片に連結した（上記を
参照のこと）。この得られるＢａｍＨＩ断片（２３４０
ｂ　ｐ　）を、１短ＨＩにより消化され、そしてホスフ
ァターゼにより処理されたｐＡＢ２４（下記を参照のこ
と）にクローンし、ｐＹＬＵＩＧＦ２−１４を得た。

ｐＡＢ２４は、完全な２μ配列（Ｂｒｏａｃｈ　。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙ
ｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ（１９８１）上
：　４４５　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ出版）及びｐＢＲ３２２配列を含む酵母発現ベクター
である。これはまた、プラスミドＹＥｐ　２４に由来す
る酵母ＵＲＡ３遺伝子（Ｒｏｔ−ｓｔｅｉｎなど、　Ｇ
ｅｎｅ（１９７９）８：１７）及びプラスミドｐｃｉ／
１に由来する酵母Ｌｔ！０２’遺伝子（ＥＰＯ１１６２
０１を参照のこと）を含む。

発現カセットの挿入はｐＢＲ３２２のＢａｍＨＩ部位に
おいてであり、従って、テトラサイクリンに対する細菌
耐性めための遺伝子を中断した。

５ＯＤ−ＩＧＦ２４ 酵母ＡＢＩＩＯ（Ｍａｔα、ｕｒａ３−５２．　Ｊｅｕ
２−０４又は止２−３及び１匹２−１１２の両者、凹４
−３．旦４−５８０　　、　　ｃｉｒ”　）をｐＹＬｔ
ｌＩＧＦ２−１４により形質転換した。形質転換体をｕ
ｒａ−選択プレート上で増殖せしめた。形質転換コロニ
イーを３ｍｌの４１　ｅｕ−選択培地に移し、そして３
０℃のシェーカー内で２４時間増殖せしめた。この培養
物のＩ　Ｘ　１０−’希釈物１００μｋを」圧「プレー
ト上にプレートし、そして個々の形質転換体を約４８〜
７２時間増殖せし゛めた。個々の形質転換体を３ｍｌの
１匹〜培地に移し、そして３０℃のシェーカー内で２４
時間増殖せしめた。これらの培養物のおのおのの１ｍｌ
を２４ｍ１のＵＥＰ及び１％グルコース培地中に希釈し
、そして細胞を５ＯＤ−ＩＣ；Ｆ２の最大収得のために
１６〜２４時間増殖した。細胞を遠心分離し、そして水
により洗浄した。細胞を溶菌緩衝液〔リン酸緩衝液、ｐ
Ｈ＝　７．３　　（５０〜ｌＯＯｍＭ）　　。

０、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００　）　２溶積中に再懸濁
した。酸により洗浄されたガラスピーズ２溶積を添加し
、そしてその懸濁液を交互にかきまぜるか又は氷上にお
いた（５ｘ、１分のおのおののサイクル）。

懸濁液を遠心分離し、そして上滑液をデカントした。不
溶性ペレットを室温で３０分間１％ＳＤＳの溶菌緩衝液
中においてインキュベートした。この懸濁液を遠心分離
し、そして上清液を凍結乾燥せしめた。

２つの他の造成物：　ｐＹＬＵＩＧＦ２−１５及びｐＹ
ＵＩＧＦ２−１３を非融合ＩＧＦ２の発現のための対照
として使用した。細胞内発現のための前者のプラスミド
（ｐＹＬＵＩＧＦ２−１５）は、ＧＡＰプロモーター及
びα−因子ターミネータ−の制御下にＩＧＦ遺伝子を含
む。ＩＧＦ２の分泌のための後者のプラスミド（ｐＹＵ
ＩＧＦ２−１３）は、ＧＡＰプロモーター、α−因子リ
ーダー及びα−因子ターミネータ−の制御下にＩＧＦ２
の因子を含む。

以下余白 １、　ｐＹＬＵＩＧＦ２−１５　　　　　検出不可能　
　　　ＮＡ（ＧＡＰ、ＩＧＦ２・αｒ、） ２、　ｐＹＵＩＧＦ２−１３　　　　　わずがＫ検出可
能　１０μｇ／Ｉｔ（ＧＡＰ、αｆＬ・ＩＧＦ２・αｆ
、）＊クーマシーブルー染色によって、ＳＯＤ・ＩＧＦ
２融合タンパク質は全細胞タンパク質の１０〜１５％を
示し、すなわち１１の培養物当り約１００〜３００■に
相当する。ＩＧＦ２は融合タンパク質の約１／３を代表
し１．従ってそれは１βの培養当り約３０〜１００■に
相当する。融合タンパク賞とＣＮＢｒとの分析的な開裂
反応は、ＰＡＧＥ上に、ＩＧＦ２について予期される位
置に移動するバンドをもたらした。

＋ＲＲＡ−ＩＧ、Ｆ２レベルをｌ１ｏｒｎｅｔなど、、
二ｏｆ　Ｃ１１ｎｔｃａｌ　　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ
　　　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（１９７８）４７
し１２８７及びＭａｒｓｈａ　ｌ　ｌなど、、　Ｊ、　
ｏｆＣ！１ｎｉｃａｌ　　ｆｉｎｄｏｃｒｔｎｏｌｏ　
　　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（１９７４）３９　
：　２８３に従って、胎盤膜のラジオレセプターアッセ
イ（ＲＲＡ）によって測定した。ＲＲＡのための胎盤膜
を、Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｆ
ｆｉ　、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９７２）６９　：　３１８の方法
によって調製した。

ＳＯＤ・ＩＧＦ２のＮＢｒによる汗１のための方法 酵母細胞のカラスビーズ溶菌からの不溶性画分を７０％
蟻酸に溶解した。ＣＮＢｒ結晶（〜／ｇのＣＮ　Ｂ　ｒ
　／１００■の融合タンパク質）を添加し、そして室温
で１２〜１５時間暗中でインキュベートした。開裂が不
完全である場合、この段階を２４時間後くり返すことが
できる。

この方法を使用しなければむずかしく且つ非能率的に生
産されるポリペプチドを、融合タンパク質（ここで、こ
の融合タンパク質は、選択的に開裂可能な部位によって
他のポリペプチドに結合される比較的に短い安定したポ
リペプチド配列を含む）を用いることによって、実質的
に高められた収量をもたらすことができることが上記の
結果から明らかである。従って、高いレベルの融合タン
パク質を真核宿主、たとえば酵母中で得ることができ、
そして該宿主とは異質の目的とするポリペプチドの効率
的な製造を可能にする。

前述の発明は、明確に理解するために例示的及び測的に
いくらか詳細に記載されているけれども、特許請求の範
囲内で変更及び変性を行なうことができる。

Σ、セレビシア（盈、　ｃｅｒｅν１ｓｉａｅ）菌株２
１５０−２−３（ｐＹＡＳＩＬ＞およびＡＢＩＩＯ（ｐ
ＹＬＵＩＧＦ２４４）をそれぞれ、１９８５年２月２７
日及び１９８６年３月１９日にＡ６Ｔ、’Ｃ，Ｃ，に寄
託し、そしてそれぞれ寄託番号第２０７４５号及び２０
７９６号を得た。

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞宿主とは異種性でありそして全蛋白質のうちの
   低い割合量で発現され得るポリペプチドを細胞性宿主に
   おいて製造するための改良された方法において、 該ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレ
   ームＤＮＡ配列を、高収率で生産されそして該宿主中で
   安定である異種性のポリペプチドをコードする第二のオ
   ープンリーディングフレームＤＮＡ配列と接合させ（こ
   の場合に、その２つのポリペプチドは連結されて融合ポ
   リペプチドを形成する）； 該融合ポリペプチドをコードする配列を発現のための条
   件下に該宿主に導入し、それによって該融合ポリペプチ
   ドを発現させ；そして 該融合ポリペプチドを単離して該第二のポリペプチドを
   高収率で得る； ことを特徴とする方法。 ２、該宿主が真核宿主でありそして該２つのペプチドが
   選択的に開裂できる結合を形成するように連結されてい
   るかまたは２つのオープンリーディングフレームが、選
   択的に開裂できる結合をコードする配列によって連結さ
   れている、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、該宿主が真核性である、特許請求の範囲第２項記載
   の方法。 ４、該真核宿主が酵母である、特許請求の範囲第３項記
   載の方法。 ５、該ＤＮＡ配列が解糖酵素のためのプロモータ領域を
   含む転写開始制御領域の転写調節制御下にある、特許請
   求の範囲第４項記載の方法。 ６、該転写開始制御領域が誘導可能である、特許請求の
   範囲第５項記載の方法。 ７、該宿主が原核性である、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ８、全蛋白質のうちの低い割合の量で発現され得る哺乳
   動物ポリペプチドを酵母宿主において製造する方法にお
   いて、 該ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレ
   ームＤＮＡ配列を、異種性のスーパーオキシドジスムタ
   ーゼ（ＳＯＤ）をコードする第二のオープンリーディン
   グフレームＤＮＡ配列と連結し（この場合に、その２つ
   のポリペプチドは連結されて融合ポリペプチドを形成す
   る）； 該融合ポリペプチドをコードする配列を発現のための条
   件下に該酵母に導入し、それによって該融合ポリペプチ
   ドを発現させ；そして 該融合ポリペプチドを高収率で単離する； ことを特徴とする方法。 ９、該発現のための条件が誘導可能な転写開始制御領域
   を含む、特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、該転写開始調節域が本質的に解糖酵素プロモータ
   ー領域およびＡＤＨ２調節域からなる、特許請求の範囲
   第９項記載の方法。 １１、哺乳動物ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に
   連結された、スーパーオキシドジスムターゼをコードす
   るＤＮＡ配列であって、その２つのコード配列が、選択
   的に開裂できる部位を定義する複数のアミノ酸、又は少
   なくとも１個のアミノ酸を有する選択的に開裂できる部
   位を提供する連結をコードする塩基によって連結されて
   いるＤＮＡ配列。 １２、該結合がメチオニンをコードする、特許請求の範
   囲第１１項記載のＤＮＡ配列。 １３、該開裂できる結合がＫ−Ｒをコードする、特許請
   求の範囲第１１項記載のＤＮＡ。 １４、該結合が（Ｄ）＿４Ｋをコードする、特許請求の
   範囲第１１項記載のＤＮＡ配列。 １５、該開裂できる結合がヒンジアミノ酸を含む、特許
   請求の範囲第１１項記載のＤＮＡ配列。 １６、該連結が酵素的に除去できる連結をコードする、
   特許請求の範囲第１１項記載のＤＮＡ配列。 １７、転写の方向に、誘導できる転写開始制御領域及び
   特許請求の範囲第１１項に記載のＤＮＡ配列を含む、発
   現配列。 １８、特許請求の範囲第１１項に記載のＤＮＡ配列によ
   ってコードされたポリペプチド。 １９、該哺乳動物ポリペプチドがプロインシュリンの少
   なくとも一部をコードする、特許請求の範囲第１８項記
   載のポリペプチド。 ２０、該哺乳動物ポリペプチドがＩＧＦ−１又はＩＧＦ
   −２の少なくとも一部をコードする、特許請求の範囲第
   １９項記載のポリペプチド。