JPS61268196A - ウルソコ−ル酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明は、ウルソデオキシコール酸製造の中間原料とし
てのウルソコール酸を製造する方法に関するものである
。

［従来の技術］ ３α、７β、１２α−トリヒドロキシ−５β−フラン−
２４−酸（３α、７β、１２ａ　−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘ
ｙ　−５β−ｃｈｏｌａｎｉｃ　ａｃｉｄ）は、第４図
の［Ｉ［］の如き構造を有する胆汁酸の一種で、ウルツ
フール酸（Ｕｒｓｏｃｈｏｌ　１ｃａｃｉｄ）と呼ばれ
ている。　　また、ウルツデオキシフール酸（Ｕ　ｒｓ
ｏｃｌｅｏｘｙｃｌ＋ｏｌ　ｉｃ　　ａｃｉｄ）は、第
５図の［ＩＩｌ］に示す構造式の胆汁酸の一種であり、
日本薬局方に収載され、利胆作用、胃液分泌促進作用、
胆石溶解作用などを有している。　従来、ウルソデオキ
シコール酸の製造にはコール酸を出発原料として化学合
成法によってウルソデオキシコール酸を合成する方法（
例えば、”ＡＰＰＬＩＥＤ八ＮＤ　ＥＮへＩＲＯＮＭＥ
ＮＴＡＬ　ＭＩＣＲＯＢｌｏＬＯＣＹ”、Ｖ、ｌ、４４
、Ｎ００６．１２５０　［１９８２］　；　４Ｈ’［？
５８−１５５０９８号公報）、リトコール酸から微生物
によって直接ウルソデオキシコール酸に転換する方法（
例えば、特開昭５８−１５５０９８号公報、特開昭５９
−２７４５７号公報）などがあるが、しかし、いずれも
ウルソコール酸を出発原料あるいは中間原料として使用
するものでハナイ。　ウルソコール酸を申開原料として
ウルソデオキシコール酸を製造する方法としては、Ｊ、
プレツク・ササ−ランド（Ｊ。

Ｄｅｒｅｋ　５ｕｔｈｅｒｌａｎｄ）らの方法がある。

　（“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ″　Ｖｌ、１２、Ｎ００４．３０７−３２１　［
１９８２］）。　この方法は、コール酸（ｃｈｏｌｉｃ
　ａｃｉｄ）を出発原料とし、その７α位の水酸基を７
β位に転換し、次いで１２α位の水酸基を還元してウル
ソデオキシコール酸にするものであり、その作用機構は
、次式に示す通りである。

７α−ヒドロキシステロイド デヒドロゲナーゼ コール酸　　　　　　　　　　　　　　　ウルソコール
酸［ｎｌウルソデオキシコール酸［Ｉ］ この反応では、コール酸からウルソコール酸への異性化
には２種類の酵素、すなわち７α−ヒドロキシステロイ
ドデヒドロゲナーゼと７β−ヒドロキシステロイドデヒ
ドロゲナーゼとを使用し、助酵素としてＮＡＤＰを使用
する。

［発明が解決しようとする問題点］ コール酸からウルソコール酸を経てウルソデオキシコー
ル酸を製造することを酵素的に行う方法においては、天
然に大量に存在し水に対する溶解度が大であるコール酸
を原料とし、また有機溶媒の使用が不要であるので、製
造コストが安価となり危険性も低減できる。　　しかし
ながら、従来方法においては、コール酸からウルソコー
ル酸への転換反応において２種類の酵素（７α−ヒドロ
キシステロイドデヒドロゲナーゼ及び７β−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼ）とＮＡＤＰとを必要とし
ており、これが製造コストに大きく影響を与え、また酵
素の安定性に留意する必要があった。　すなわち使用酵
素が高価であり、また、品質的安定性を確保することが
困難であった。

［問題点を解決するための手段１ 本発明者らは、上記従来法における問題点を解消すべく
研究を重ねた結果、ある特定風の微生物がデオキシコー
ル酸をウルソコール酸に変換する能力を有するとの知見
を得、これにより本発明方法を完成することによって、
上記問題点を解消するに至ったものである。　すなわち
本発明方法は、プルロウタス（Ｐ　１ｅｕｒｏｔｕｓ）
属、コリオラス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属、グエグレオプ
シス（Ｄａｅｄａｌｅｏｐｓｉｓ）属、バナエオラス（
Ｐａｎａｅｏｌｕｓ）属、マラスミウス（Ｍａｒａｓｍ
ｉｕｓ）属、クリニヘリス（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ）
属、７オリオタ（Ｐｈｏｔ　１ｏｔａ）属、フサリウム
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する微生物のうちの１種又
はそれ以上をデオキシコール酸と接触させることにより
、該デオキシコール酸をウルツフール酸に変換せしめ、
これを採取することを特徴とするウルソコール酸の製造
法である。

本発明方法において使用するデオキシコール酸（ｃｌｅ
ｏｘｙｃｈｏｌｉｃ　　ａａｉｄ）は、コール酸に次い
で動物の胆汁中に大量に含有されており供給に問題はな
い。

また、本発明方法において使用するウルソコール酸への
変換能を有する微生物は、上記の谷風がら選択され、例
えば、プルロウタス・オストレアタス（Ｐ　１ｅｕｒｏ
ｔｕｓ　　ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）、プルロウタスープル
モナリウス（Ｐ　！ｅｕｒｏｔｕｓ　　ｐｕｂ＊ｏｎａ
ｒｉｕｓ）、プルロウタス・セイジャーカジュ（Ｐ　Ｉ
ｅｕｒｏｔｕｓ　　５ａｊｏｒ−ｃａｊｕ）、プルロウ
タス・サルモネオーストラミネウス（Ｐ　１ｅｕｒｏｔ
ｕｓ　　ｓａｌｍｏｎｅｏ−ｓｔｒａｍｉｎｅｕｓ）、
コリオラス・ベジカラー（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ　　ｖｅｓ
ｉｃｏｌｏｒ）、ダエダレオプシス０スチラシナ（Ｄａ
ｅｄａｌｅｏｐｓｉｓ　　５ｔｙｒａｃｉｎａ）、クリ
ニペリス・スチピタリア（Ｃｒｉｎｉｐｅｌ　ｌ　ｉｓ
　　５ｔｉｐｉｔａｒｉａ）、パナエオラス・スフイン
クトリヌス（Ｐａｎａｅｏｌｕｓ　　５ｐｈｉｎｃＬｒ
ｉｎｕｓ）、７ラムリア・ベルティペス（Ｆ　Ｉａｍｍ
ｕｉｉａ　　ｖｅｒｔｉｐｅｓ）、７オメス・７オメン
タリウス（Ｆｏｍｅｓ　　ｆｏｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、
マラスミウス番シ・ンカス（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ　５ｉ
ｃｃｕｓ）、７オリオタ・ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ　
　ｎａｍｅｋｏ）、フサリウム・イクィセチ（Ｆｕｓａ
ｒｉｕｍ　　ｅｑｕｉｓｅｔｉ）等を例示することがで
きる。　これら代表的微生物によって変換されたウルソ
コール酸の生成量を実施例２の第２表に示す。　第２表
に示す各菌株は、いずれも財団法人醗酵研究所のカタロ
グ（ｒＬＩｓＴ　ＯＦ　Ｃ［ＩＬＴｔｌＲＥＳＪ第７版
）に収載された公知寄託面であり、該研究所より入手で
きる。　更に、上記の属に属し、常法によって得られた
変異株も、ウルソコール酸変換能を有するものは使用で
きる。

上記の如き本発明に係る微生物とデオキシコール酸とを
接触させる方法としては、使用微生物に適する栄養培地
にデオキシコール酸を添加して培養を行う方法、使用微
生物の培養後の洗浄菌体懸濁液にデオキシコール酸を溶
解させる方法等を適用できるが、この方法だけに接触方
法が限定されるものではない。

上記本発明に係る微生物の培養方法は、液体培養でも固
体培養でも適用でき、あるいは培養後に得られた菌体の
み分離し、これを休止菌体として使用することもできる
。

培地には、炭素源としてキシロース、グルコース、〃ラ
フ）−ス、フラクトース、マンノース、マルトース、サ
ッカロース、ラフィノース、デンプン、水アメ、グリセ
ロール、ソルビトールなどの糖類、酢酸、クエン酸、コ
ハク酸、酪酸、パルミチン酸などの有機酸や脂肪酸、エ
チルアルコール、エタノール、アミルアルコールなどの
アルコール類、ヘキサン、オクテンなどの炭化水素類、
また窒素源としてはペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、
各種アミノ酸混合物、肉エキス、コーンスチープリカー
、廃糖蜜などの天然窒素源のばか硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、
尿素などの無機窒素を利用できる。　この他、必要に応
じて、各種ビタミン類、各種無機塩を微量栄養素として
添加することができる。　これらの配合割合は、利用微
生物の種類に応じて、最も生育しやすいように適宜選択
される。　培地のｐＨも、利用微生物の種類によって異
なるが通常ｐｔ１２〜１０程度で、培養温度は約１５〜
３５℃が好ましい。　培養期間は、液体培養の場合、担
子菌で２〜１４日、カビで２〜１０日、また固体培養の
場合は、担子菌で１０〜６０日、カビで５〜３０日が適
当である。

デオキシコール酸の添加方法は、培地にデオキシフール
酸を予め添加しておく方法、あるいは培地で使用微生物
が充分に生育したのち、これにデオキシコール酸を徐々
に添加する方法等を採用できるが、デオキシコール酸に
は微生物の増殖を抑制する性質があるので、後者方法が
好ましい。　前者方法の場合は、デオキシフール酸の添
加量は、約０．５〜２ｏｇ７ｐ、とすると好ましい。

また、休止菌体を使用する方法においては、本発明に係
る微生物を予め培養し、次いで菌体を集め、これを水洗
した後、水あるいは緩衝液に懸濁させる。　次いで、こ
の懸濁液にデオキシフール酸を添加し、通気又は振とう
して上記菌体とデオキシコール酸とを充分に接触せしめ
、もってデオキシコール酸をウルツフール酸に変換させ
る。　この方法は、前述の如き培地中でデオキシコール
酸と本発明に係る微生物とを接触させる方法とは異なっ
て、ウルツフール酸の変換生成する系がほとんど水や単
純な無機塩溶液であるので、生成物ウルソコール酸の精
製が容易であり、経済的である。　上述の如き方法によ
りデオキシコール酸から転換され生成したウルソコール
酸は、通常の方法によって精製する。

例えば、培養液あるいは体止菌体懸濁液を酸性とし、次
いでこれに有機溶媒（例えば、ジエチルエーテル）を加
え、振とうして生成ウルソコール酸を抽出せしめ、次い
で、この有機溶媒層を濃縮し、シリカゲルカラムでクロ
マトグラフィを行ってウルソコール酸の７ラクシシンを
分取する。　この操作を数回くり返して、結晶化し、精
製ウルソコール酸を得ることができる。

［作用］ 本発明方法は、上述の如く、プルロウタス属、フリオラ
ス属、ダエダレオブシス属、パナエオラス属、マラスミ
ウス属、クリニペリス属、７オリオタ属、フサリウム属
に属する微生物のうちの１種又はそれ以上をデオキシコ
ール酸（第４図中の［■１）と接触させることにより、
デオキシコール酸の７β位に水酸基を付加させ、ウルツ
フール酸［ＩＩ］に変換せしめるものである。　この作
用機序を示すと、第４図に示す式の通りである。

［発明の効果１ 上述の発明方法によれば、デオキシコール酸と上述の如
き本発明に係る微生物とを接触させるだけで、ウルソコ
ール酸を製造することができ、反応経路がわずか一段階
であるので、極めて処理が簡単である。　しかも、その
微生物変換反応に、従来方法の如き酵素や助酵素［ＮＡ
Ｄ（Ｐ）］を別途供給する必要がないので、より経済的
であり、また、それら酵素・助酵素の安定性に留意する
必要も全く解消される。　　また、原料物質デオキシコ
ール酸は天然に多量に存在するのでその供給に問題はな
く、したがって、安定的にしかも安価にウルソコール酸
を製造することができる。

［実施例１ 実施例１゜ ＰＳ培地（バレイショ２００ｇの浸出液にシュークロー
ス２０ｇを加え、加水して１社する：　ｒＬ［ｓＴ　Ｏ
Ｆ　ＣＵＬＴＵＲＥＳ、７　ｔｈ　ｅｄ、　Ｊ（醗酵研
究所発行）第２７９頁）にデオキシコール酸５００ｍｇ
添加し溶解させ、これを５００．Ｊ容坂ロフラスコに各
１．００＋Ｊづつ１０本に分注、１２０℃、３０分間殺
菌後、プルロウタス・オストレアタス（Ｐｌｅｕｒｏｔ
ｕｓ　ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）　Ｉ　Ｆ　ＯＮｏ、３０８
８０を予め斜面培養しておいた培地からこのＰＳ培地に
接種した。　次いで、２７℃で８日問、ロータリーシュ
イカ−（１２Ｏｒ、ｐ、＋ｎ）で振どう培養した後、こ
の培養液を集合し、これを５規定ＨＣＩでｐＨ２〜３と
し、次いで２倍容量のジエチルエーテルを加えて５分間
振どう混合して抽出を行い、次に遠心上澄液を取り、こ
れを濃縮乾固した。この乾固物をエチルアルコールに溶
解して粗ウルソコール酸液とし、続いて高速液体クロマ
トグラフィーで精製した。　高速液体クロマトグラフィ
ー装置は、（株）島原製作所製ＬＣ−５Ａを、カラムは
（株）島原製作所製ＣＬＣ−ＯＤＳ（６＋ｎｍφ刈５０
＋ｎｍ）を各々使用した。

展開液は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，９）
　ニアセトニトリル混液（７：３）を用い、流速０．６
ｍｌ／分で、１回分の試料チャージ量は１００μ吐した
。　　ウルソコール酸の標準品としては、７ランーＦ−
ホフマン（ＡｌａｎＦ、　Ｈｏｆｍａｎｎ　：　Ｄｉｖ
ｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｇａ５ｔｒ。

ｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙｔ　　　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　
　ｏｆ　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　　　５ｃｈｏｏｌ　　
ｏｆ　　Ｍｅｄｉｃｉｎｅｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　
ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　：　２２５　Ｄｉｃｋｉ
ｎｓｏｎ　５ｔｒｅｅｔ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　Ｃ
ａ１ｉｆｏｒｎｉａ９２１０３．　Ｕ、Ｓ、Ａ、）から
入手したウルソコール酸を用い、この標準品の高速クロ
マトグラフィーのピークリテンションタイムが ６．９分であることに基づき、本実施例での高速クロマ
トグラフィーでは、リテンションタイム６．２〜８．０
分の画分を分取した。

このクロマトグラフィーを３０回行った。　上述の如く
して得られた全７ラクシヨンを合わせ、塩酸酸性（ｐＨ
２〜３）とした後、２倍量のエーテルを加えて振どう抽
出し、濃縮した。　次いで、濃縮液をシリカゾルクロマ
トグラフィー（カラム：１０＋＋＋ｍφＸ　３００ｍｍ
。

担体；メルク社製キーゼルデルＡｒｔ、７７３４．７０
−２３０メツシユ、展開液；　クロロホルム：メタノー
ル：水温ｌ［７０：　２５　：　３　］）を行い、ウル
ツ−コール酸両分を集め、エタノール−水系で結晶化シ
、ウルツフール酸２０＋Ｈを得た。　この生成ウルソコ
ール酸について、以下の分析を行った。

（１）薄層クロマトグラフィー 薄層クロマトグラフィーのプレートはメルク社製キーゼ
ルデル６０（Ａｒｔ、５７２１）使用、各種溶媒で展開
した。　展開溶媒の組成及び生成ウルツフール酸のＲｆ
値を第１表に示す。

これらのＲｒ値は、上記ウルソコール酸標準品のＲｒ値
と一致した。（第１表への表示は省略した。）（２）〃
スクロマトグラフイー ガスクロマトグラフィー装置は、（株）島津製作所製Ｇ
Ｃ−９八を使用、カラム１ｍ、担体として「ガスクロム
Ｑ」、液相にシリコンＤＣ−ＱＦＩ（２％）を用いた。

　カラム温度は２２０°Ｃ、インジェクシシン温度は２
４０℃、キャリヤーガスに窒素を使用しＦＩＤで検出し
た。　測定の結果、リテンションタイム３８．８分で、
これは、標準品のリテンションタイムと一致した。

（３）融点測定 生成ウルソコール酸の融点は、１３４℃、また標準品の
融点は１３３°Ｃであった。

（４）元素分析 生成ウルツフール酸の測定値は、Ｃ：　６７．８、Ｈ：
　９．７２（理論値Ｃ：　６７．０．　Ｈ：　１０．０
）（５）分子量 生成ウルソコール酸の測定値は、４０９（理論値４０８
）。

（第１表） （６）赤外吸収 本発明方法による生成ウルツフール酸のスペクトル［Ａ
］、及び標準品のスペクトル［Ｂ］を第１図に示す。

（７）　ＮＭＲ 本発明方法による生成ウルソコール酸のスペクトルを第
２図に、標準品のスペクトルを第３図に示す。

実施例、２ 実施例１と同組成のＰＳ培地１磨を調製し、これにデオ
キシコール酸５００＋ｎｇ添加し溶解させたものを本培
養培地とした。　この培地を５００−容坂ロフラスコ１
０本に各１００ｍ１分注し、１２０°Ｃ１３０分間殺菌
後、第２表に示す微生物を予め斜面培養しておいた培地
から、この本培養培地に接種した。　次いで、実施例１
と同様の培養条件で培養し、以下、実施例１と同様方法
でウルソコール酸の変換生成反応及び精製処理を行った
。　第２表に示す各微生物について、各々上述の如き処
理を実施し、その結果得られたウルツフール酸の生成量
を各々第２表に示す。

実施例。３ 大豆粉−デンプン培地（全大豆粉２０ｇ、可溶性デンプ
ン３０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４・２Ｈ２０１ｇ、Ｍｇ５（Ｌ　
・７）１２００．５１Ｂ、　ＣａＣｌ２・２Ｈ２００，
５ｇを水１２に溶解用００Ｊを５００ｎＪ！容坂ロフラ
スコに分注し、１２０℃２０分間殺菌した。　この培地
にプルロウタス・セイジャーカジよ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕ
ｓ　５ａｊｏｒ−ｃａｊｕ）　Ｉ　Ｆ　ＯＮｏ、３０１
６７を接種し、２７℃で４日間ロータリーシェーカー（
１２Ｏｒ、ｐ、ｍ）で振どう培養し、種菌とした。　次
いで本培養培地（脱脂コーン粕１０ｇ、デキストラン２
０ｇ、Ｋ２１１Ｐ（Ｌ　１７，４ｇ、　ＨｇＳ帆・７１
１２００．５ｇ、　ＣａＣ１□・２１１２００．５ｇ、
およびデオキシコール酸０．５ｇを水１すに溶解）１０
０Ｊを５０〇−容坂ロフラスコに分注し、前記種菌培養
と同条件下で８日間培養した。

この培養液を５規定塩酸でｐＨ２〜３とした後、２倍量
のジエチルエーテルを加えて、５分間振とう抽出し、そ
の遠心上澄を取り濃縮乾固した。　得られた乾固物をエ
タノール２０．Ｊに溶解し、（第２表） 再結晶させて粗ウルソコール酸６．１ｍｇを得た。

実施例、４ 上記実施例、２と同様の各培地で、フサリウム・イクイ
セチ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　　ｅｑｕｉｓｅｔｉ）　Ｉ　
ＦＯＮｏ、３１０９５の種菌培養および本培養を行った
。　ただし、本実施例においては、本培養培地へのデオ
キシコール酸の添加量は１．　ＯＢｌ　１とした。　実
施例２と同様にして培養し、得られた培養液を、実施例
２と同様に処理して粗ウルソコール酸４６０ｍｇを得た
。　この粗ウルソコール酸を実施例１と同条件で高速液
体クロマトグラフィーおよびシリカゲルカラムクロマト
グラフィーを行い、薄層クロマトグラフィー的にほぼ単
一のウルソコール酸約２３０ｍｇを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法による生成ウルソコール酸［Ａ］
およびウルソコール酸標準品［Ｂ］の赤外線吸収スペク
トルである。　比較を容易にするため、両者上下に若干
ずらして図示した。　第２図は、本発明方法による生成
ウルソコール酸のＮＭＲスペクトルを示し、また、第３
図は、ウルソコール酸標準品のＮＭＲスペクトルを示す
。 第４図は、本発明方法における作用機序を示す式であり
、［１］はデオキシコール酸であり、［ＩＩ］はウルソ
コール酸である。　第５図は、ウルソコール酸［ｎｌか
らウルソデオキシコール酸［Ｉ］を生成する反応式を示
す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. プルロウタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）属、コリオラス（
   Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）属、ダエダレオプシス（Ｄａｅｄａ
   ｌｅｏｐｓｉｓ）属、パナエオラス（Ｐａｎａｅｏｌｕ
   ｓ）属、マラスミウス（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ）属、クリ
   ニペリス（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓ）属、フリオタ（Ｐ
   ｈｏｌｉｏｔａ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）
   属に属する微生物のうちの１種又はそれ以上をデオキシ
   コール酸と接触させることによりデオキシコール酸をウ
   ルソコール酸に変換せしめ、これを採取することを特徴
   とするウルソコール酸の製造法。