JPH0134038B2

JPH0134038B2 -

Info

Publication number: JPH0134038B2
Application number: JP11155385A
Authority: JP
Inventors: Masaki Terada; Manabu Sato; Yoshiaki Horie; Mitsumune Takatsu; Junichi Minami
Original assignee: Nissin Shokuhin KK
Current assignee: Nissin Food Products Co Ltd
Priority date: 1985-05-23
Filing date: 1985-05-23
Publication date: 1989-07-17
Also published as: JPS61268196A

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］本発明は、ウルソデオキシコール酸製造の中間
原料としてのウルソコール酸を製造する方法に関
するものである。［従来の技術］ 3α、7β、12α−トリヒドロキシ−5β−コラン−
24−酸（3α、7β、12α−trihydroxy−5β−
cholanic acid）は、第４図の［］の如き構造
を有する胆汁酸の一種で、ウルソコール酸
（Ursocholic acid）と呼ばれている。また、ウル
ソデオキシコール酸（Ursodeoxycholic acid）
は、第５図の［］に示す構造式の胆汁酸の一種
であり、日本薬局方に収載され、利胆作用、胃液
分泌促進作用、胆石溶解作用などを有している。
従来、ウルソデオキシコール酸の製造にはコール
酸を出発原料として化学合成法によつてウルソデ
オキシコール酸を合成する方法（例えば、
“APPLIED AND ENVIR ONMENTAL
MICROBIOLOGY”、Vol.44、No.６、1250
［1982］；特開昭58−155098号公報）、リトコール
酸から微生物によつて直接ウルソデオキシコール
酸に転換する方法（例えば、特開昭58−155098号
公報、特開昭59−27457号公報）などがあるが、
しかし、いずれもウルソコール酸を出発原料ある
いは中間原料として使用するものではない。ウル
ソコール酸を中間原料としてウルソデオキシコー
ル酸を製造する方法としては、J.デレツク・サザ
ーランド（J.Derek Sutherland）らの方法があ
る。（“Preparative Bioche mistry”Vol.12、No.
４、307−321［1982］）。この方法は、コール酸
（cholic acid）を出発原料とし、その7α位の水酸
基を7β位に転換し、次いで、12α位の水酸基を還
元してウルソデオキシコール酸にするものであ
り、その作用機構は、次式に示す通りである。この反応では、コール酸からウルソコール酸へ
の異性化には２種類の酵素、すなわち7α−ヒド
ロキシステロイドデヒドロゲナーゼと7β−ヒド
ロキシステロイドデヒドロゲナーゼとを使用し、
助酵素としてNADPを使用する。［発明が解決しようとする問題点］コール酸からウルソコール酸を経てウルソデオ
キシコール酸を製造することを酵素的に行う方法
においては、天然に大量に存在し水に対する溶解
度が大であるコール酸を原料とし、また有機溶媒
の使用が不要であるので、製造コストが安価とな
り危険性も低減できる。しかしながら、従来方法
においては、コール酸からウルソコール酸への転
換反応において２種類の酵素（7α−ヒドロキシ
ステロイドデヒドロゲナーゼ及び7β−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼ）とNADPとを
必要としており、これが製造コストに大きく影響
を与え、また酵素の安定性に留意する必要があつ
た。すなわち使用酵素が高価であり、また、品質
的安定性を確保することが困難であつた。［問題を解決するための手段］本発明者らは、上記従来法における問題点を解
消すべく研究を重ねた結果、ある特定属の微生物
がデオキシコール酸をウルソコール酸に変換する
能力を有するとの知見を得、これにより本発明方
法を完成することによつて、上記問題点を解消す
るに至つたものである。すなわち本発明方法は、
プルロウタス（Pleurotus）属、コリオラス
（Coriolus）属、ダエダレオプシス
（Daedaleopsis）属、パナエオラス（Panaeolus）
属、マラスミウス（Marasmius）属、クリニペ
リス（Crinipellis）属、フオリオタ（Pholiota）
属、フサリウム（Fusarium）属に属する微生物
のうちの１種又はそれ以上をデオキシコール酸と
接触させることにより、該デオキシコール酸をウ
ルソコール酸に変換せしめ、これを採取すること
を特徴とするウルソコール酸の製造法である。本発明方法において使用するデオキシコール酸
（deoxycholic acid）は、コール酸に次いで動物
の胆汁中に大量に含有されており供給に問題はな
い。また、本発明方法において使用するウルソコー
ル酸への変換能を有する微生物は、上記の各属か
ら選択され、例えば、プルロウタス・オストレア
タス（Pleurotus ostreatus）、プルロウタス・プ
ルモナリウス（Pleurotus pulmonarius）、プル
ロウタス・セイジヤーカジユ（Pleurotus sajor
−caju）、プルロウタス・サルモネオ−ストラミ
ネウス（Pleurotus salmoneo−stramineus）、コ
リオラス・ベジカラー（Coriolus vesicolor）、
ダエダレオプシス・スチラシナ（Daedaleopsis
styracina）、クリニペリス・スチピタリア
（Crinipellis stipitaria）、パナエオラス・スフイ
ンクトリヌス（Panaeolus sphinctrinus）、フラ
ムリア・ベルテイペス（Flammulia vertipes）、
フオメス・フオメンタリウス（Fomes
fomentarius）、マラスミウス・シツカス
（Marasmius siccus）、フオリタ・ナメコ
（Pholiota nameko）、フサリウム・イクイセチ
（Fusarium equiseti）等を例示することができ
る。これら代表的微生物によつて変換されたウル
ソコール酸の生成量を実施例２の第２表に示す。
第２表に示す各菌株は、いずれも財団法人醗酵研
究所のカタログ（「LIST OF CULTURES」第
７版）に収載された公知寄託菌であり、該研究所
より入手できる。更に、上記の属に属し、常法に
よつて得られた変異株も、ウルソコール酸変換能
を有するものは使用できる。上記の如き本発明に係る微生物とデオキシコー
ル酸とを接触させる方法としては、使用微生物に
適する栄養培地にデオキシコール酸を添加して培
養を行う方法、使用微生物の培養後の洗浄菌体懸
濁液にデオキシコール酸を溶解させる方法等を適
用できるが、この方法だけに接触方法が限定され
るものはでない。上記本発明に係る微生物の培養方法は、液体培
養でも固体培養でも適用でき、あるいは培養後に
得られた菌体のみ分離し、これを休止菌体として
使用することもできる。培地には、炭素源としてキシロース、グルコー
ス、ガラクトース、フラクトース、マンノース、
マルトース、サツカロース、ラフイノース、デン
プン、水アメ、グリセロール、ソルビトールなど
の糖類、酢酸、クエン酸、コハク酸、酪酸、パル
ミチン酸などの有機酸や脂肪酸、エチルアルコー
ル、エタノール、アミルアルコールなどのアルコ
ール類、ヘキサン、オクテンなどの炭化水素類、
または窒素源としてはペプトン、酵母エキス、脱
脂大豆、各種アミノ酸混合物、肉エキス、コーン
スチープリカー、廃糖蜜などの天然窒素源のほか
硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、硝酸ナトリウム、尿素などの無機窒素
を利用できる。この他、必要に応じて、各種ビタ
ミン類、各種無機塩を微量栄養素として添加する
ことができる。これらの配合割合は、利用微生物
の種類に応じて、最も生育しやすいように適宜選
択される。培地のPHも、利用微生物の種類によつ
て異なるが通常PH２〜10程度で、培養温度は約15
〜35℃が好ましい。培養期間は、液体培養の場
合、担止菌で２〜14日、カビで２〜10日、また固
体培養の場合は、担子菌で10〜60日、カビで５〜
30日が適当である。デオキシコール酸の添加方法は、培地にデオキ
シコール酸を予め添加しておく方法、あるいは培
地で使用微生物が充分に生育したのち、これにデ
オキシコール酸を徐々に添加する方法等を採用で
きるが、デオキシコール酸には微生物の増殖を抑
制する性質があるので、後者方法が好ましい。前
者方法の場合は、デオキシコール酸の添加量は、
約0.5〜20ｇ／とすると好ましい。また、休止菌体を使用する方法においては、本
発明に係る微生物を予め培養し、次いで菌体を集
め、これを水洗した後、水あるいは緩衝液に懸濁
させる。次いで、この懸濁液にデオキシコール酸
を添加し、通気又は振とうして上記菌体とデオキ
シコール酸とを充分に接触せしめ、もつてデオキ
シコール酸をウルソコール酸に変換させる。この
方法は、前述の如き培地中でデオキシコール酸と
本発明に係る微生物とを接触させる方法とは異な
つて、ウルソコール酸の変換生成する系がほとん
ど水や単純な無機塩溶液であるので、生成物ウル
ソコール酸の精製が容易であり、経済的である。
上述の如き方法によりデオキシコール酸から転換
され生成したウルソコール酸は、通常の方法によ
つて精製する。例えば、培養液あるいは休止菌体
懸濁液を酸性とし、次いでこれに有機溶媒（例え
ば、ジエチルエーテル）を加え、振とうして生成
ウルソコール酸を抽出せしめ、次いで、この有機
溶媒層を濃縮し、シリカゲルカラムでクロマトグ
ラフイを行つてウルソコール酸のフラクシヨンを
分取する。この操作を数回くり返して、結晶化
し、精製ウルソコール酸を得ることができる。［作用］本発明方法は、上述の如く、プルロウタス属、
コリオラス属、ダエダレオプシス属、パナエオラ
ス属、マラスミウス属、クリニペリス属、フオリ
オタ属、フサリウム属に属する微生物のうちの１
種又はそれ以上をデオキシコール酸（第４図中の
［］）と接触させることにより、デオキシコール
酸の7β位に水酸基を付加させ、ウルソコール酸
［］に変換せしめるものである。この作用機序
を示すと、第４図に示す式の通りである。［発明の効果］上述の発明方法によれば、デオキシコール酸と
上述の如き本発明に係る微生物とを接触させるだ
けで、ウルソコール酸を製造することができ、反
応経路がわずか一段階であるので、極めて処理が
簡単である。しかも、その微生物変換反応に、従
来方法の如き酵素や助酵素［NAD（Ｐ）］を別途
供給する必要がないので、より経済的であり、ま
た、それら酵素・助酵素の安定性に留意する必要
も全く解消される。また、原料物質デオキシコー
ル酸は天然に多量に存在するのでその供給に問題
はなく、したがつて、安定的にしかも安価にウル
ソコール酸を製造することができる。［実施例］実施例１ PS培地（バレイシヨ200ｇの浸出液にシユーク
ロース20ｇを加え、加水して１とする：「LIST
OF CULTURES、7th ed.」（醗酵研究所発行）
第279頁）にデオキシコール酸500mg添加し溶解さ
せ、これを500ml容坂口フラスコに各100mlづつ10
本に分注、120℃、30分間殺菌後、プルロウタ
ス・オストレアタス（Pleurotus ostreatus）
IFO No.30880を予め斜面培養しておいた培地か
らこのPS培地に接種した。次いで、27℃で８日
間、ロータリーシエイカー（120r.p.m）で振とう
培養した後、この培養液を集合し、これを５規定
HClでPH２〜３とし、次いで２倍容量のジエチル
エーテルを加えて５分間振とう混合して抽出を行
い、次に遠心上澄液を取り、これを濃縮乾固し
た。この乾固物をエチルアルコールに溶解して粗
ウルソコール酸液とし、続いて高速液体クロマト
グラフイーで精製した。高速液体クロマトグラフ
イー装置は、(株)島津製作所製LC−5Aを、カラム
は(株)島津製作所製CLC−ODS（６mmφ×150mm）
を各々使用した。展開液は10mMリン酸カリウム緩衝液（PH
6.9）：アセトニトリル混液（７：３）を用い、流
速0.6ml／分で、１回分の試料チヤージ量は100μ
とした。ウルソコール酸の標準品としては、ア
ラン・Ｆ・ホフマン（AlanF.Hofmann：
Division of Gastroenterology、Department of
Medicine、School of Medicine、University of
California；225Dickinson street、San Diego、
California92103、U.S.A.）から入手したウルソ
コール酸を用い、この標準品の高速クロマトグラ
フイーのピークリテンシヨンタイムが 6.9分であることに基づき、本実施例での高速
クロマトグラフイーでは、リテンシヨンタイム
6.2〜8.0分の画分を分取した。このクロマトグラ
フイーを30回行つた。上述の如くして得られた全
フラクシヨンを合わせ、塩酸酸性（PH２〜３）と
した後、２倍量のエーテルを加えて振とう抽出
し、濃縮した。次いで、濃縮液をシリカゲルクロ
マトグラフイー（カラム：10mmφ×300mm、担
体；メルク社製キーゼルゲルArt.7734、70−230
メツシユ、展開液；クロロホルム：メタノール：
水混液［70：25：３］）を行い、ウルソコール酸
画分を集め、エタノール水系で結晶化し、ウルソ
コール酸20mgを得た。この生成ウルソコール酸に
ついて、以下の分析を行つた。 (1) 薄層クロマトグラフイー薄層クロマトグラフイーのプレートはメルク
社製キーゼルゲル60（Art.5721）使用、各種溶
媒で展開した。展開溶媒の組成及び生成ウルソ
コール酸のRf値を第１表に示す。これらのRf値は、上記ウルソコール酸標準
品のRf値と一致した。（第１表への表示は省略
した。） (2) ガスクロマトグラフイーガスクロマトグラフイー装置は、(株)島津製作
所製GC−9Aを使用、カラム1m、担体として
「ガスクロムＱ」、液相にシリコンDC−QF1（２
％）を用いた。カラム温度は220℃、インジエ
クシヨン温度は240℃、キヤリヤーガスに窒素
を使用しFIDで検出した。測定の結果、リテン
シヨンタイム38.8分で、これは、標準品のリテ
ンシヨンタイムと一致した。 (3) 融点測定生成ウルソコール酸の融点は、134℃、また
標準品の融点は133℃であつた。 (4) 元素分析生成ウルソコール酸の測定値は、Ｃ：67.8、
Ｈ：9.72（理論値Ｃ：67.0、Ｈ：10.0） (5) 分子量生成ウルソコール酸の測定値は、409（理論値
408）。

【表】 (6) 赤外吸収本発明方法による生成ウルソコール酸のスペ
クトル［Ａ］、及び標準品のスペクトル［Ｂ］
を第１図に示す。 (7) NMR 本発明方法による生成ウルソコール酸のスペ
クトルを第２図に、標準品のスペクトルを第３
図に示す。実施例２実施例１と同組成のPS培地１を調製し、こ
れにデオキシコール酸500mg添加し溶解させたも
のを本培養培地とした。この培地を500ml容坂口
フラスコ10本に各100ml分注し、120℃、30分間殺
菌後、第２表に示す微生物を予め斜面培養してお
いた培地から、この本培養培地に接種した。次い
で、実施例１と同様の培養条件で培養し、以下、
実施例１と同様方法でウルソコール酸の変換生成
反応及び精製処理を行つた。第２表に示す各微生
物について、各々上述の如き処理を実施し、その
結果得られたウルソコール酸の生成量を各々第２
表に示す。実施例３大豆粉−デンプン培地（全大豆粉20ｇ、可溶性
デンプン30ｇ、KH₂PO₄・2H₂O1ｇ、MgSO₄・
7H₂O0.5ｇ、CaCl₂・2H₂O0.5ｇを水１に溶解）
100mlを500ml容坂口フラスコに分注し、120℃20
分間殺菌した。この培地にプルロウタス・セイジ
ヤーカジユ（Pleurotus sajor−caju）IFO No.
30167を接種し、27℃で４日間ロータリーシエー
カー（120r.p.m）で振とう培養し、種菌とした。
次いで文本培養培地（脱脂コーン粕10ｇ、デキス
トリン20ｇ、K₂HPO₄17.4ｇ、MgSO₄・7H₂O0.5
ｇ、CaCl₂・2H₂O0.5ｇおよびデオキシコール酸
0.5ｇを水１に溶解）100mlを500ml容坂口フラ
スコに分注し、前記種菌培養と同条件下で８日間
培養した。この培養液を５規定塩酸でPH２〜３と
した後、２倍量のジエチルエーテルを加えて、５
分間振とう抽出し、その遠心上澄を取り濃縮乾固
した。得られた乾固物をエタノール20mlに溶解
し、

【表】

【表】再結晶させて粗ウルソコール酸6.1mgを得た。実施例４上記実施例２と同様の各培地で、フサリウム・
イクイセチ（Fusarium equiseti）IFO No.31095
の種菌培養および本培養を行つた。ただし、本実
施例においては、本培養培地へのデオキシコール
酸の添加量は1.0ｇ／とした。実施例２と同様
にして培養し、得られた培養液を、実施例２と同
様に処理して粗ウルソコール酸460mgを得た。こ
の粗ウルソコール酸を実施例１と同条件で高速液
体クロマトグラフイーおよびシリカゲルカラムク
ロマトグラフイーを行い、薄層クロマトグラフイ
ー的にほぼ単一のウルソコール酸約230mgを得た。実施例５実施例１と同じ組成のPS培地を500ml容坂口フ
ラスコ３本に各100mlずつ分注し、高圧殺菌した。
次いで予め斜面培養しておいたフサリウム・イク
イセチ（Fusarium equiseti）IFO No.31095を接
種し、28℃で４日間ロータリーシエイカー
（120r.p.m.）で振とう培養を行い、これを種菌と
し、その200mlを下記組成の培地2.5を入れた培
養器（５容）で通気撹はん培養を行つた。培養
条件は28℃、通気量１／min.で撹はん数120r.
p.m.とした。培地組成シユクロース 40ｇ／ペプトン 10 〃酵母エキス１〃 K₂HPO₄ 17.4 〃 MgSO₄・7H₂O 0.5 〃 CaCl₂・2H₂O 0.5 〃デオキシコール酸 0.5 〃ミネラル（注）１ml／ (注)ミネラル FeSO₄・7H₂O １ｇ／ MnSO₄・6H₂O １〃 ZnSO₄・4H₂O １〃 CuSO₄・5H₂O １〃 NaMO₆・2H₂O １〃培養終了後、培養液をさらしでろ過し、培養中
に生じた菌糸体を胞子とろ別し、さらに遠心分離
（10000r.p.m.、15min.）し、胞子を集めた。得ら
れた胞子を無菌水で胞子数２×10¹⁰／mlの懸濁液
とし、その10mlにデオキシコール酸、リン酸緩衝
液（PH7.5）をそれぞれ0.5ｇ／、0.1Mとなるよ
うに添加して100mlとした。次いで、その100mlを
500ml容坂口フラスコに分注し、28℃で３日間ロ
ータリーシエイカー（120r.p.m.）で振とう培養
し、接種後64時間目に実施例１と同じ方法で抽出
精製し、0.25ｇ／のウルソコール酸を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法による生成ウルソコール
酸［Ａ］およびウルソコール酸標準品［Ｂ］の赤
外線吸収スペクトルである。比較を容易にするた
め、両者上下に若干ずらして図示した。第２図
は、本発明方法による生成ウルソコール酸の
NMRスペクトルを示し、また、第３図は、ウル
ソコール酸標準品のNMRスペクトルを示す。第
４図は、本発明方法における作用機序を示す式で
あり、［］はデオキシコール酸であり、［］は
ウルソコール酸である。第５図は、ウルソコール
酸［］からウルソデオキシコール酸［］を生
成する反応式を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１プルロウタス（Pleurotus）属、コリオラス
（Coriolus）属、ダエダレオプシス
（Daedaleopsis）属、パナエオラス（Panaeolus）
属、マラスミウス（Marasmius）属、クリニペ
リス（Crinipellis）属、フオリオタ（Pholiota）
属、フサリウム（Fusarium）属に属する微生物
のうちの１種又はそれ以上をデオキシコール酸と
接触させることによりデオキシコール酸をウルソ
コール酸に変換せしめ、これを採取することを特
徴とするウルソコール酸の製造法。