JPS6128363A - 甘味料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の概要と背景コ 本発明は新しい修飾天然甘味料、さらに詳しくはステビ
オサイドから生化学的に誘導されたα−１，４−グルコ
ピラノシルスゲビオサイド類を含有し、α−１′、４−
グルコピラノシルレバウディオサイド類を含有しない甘
味料に関する。

天然甘味料を食品に利用しようとする動きは、近年、と
みに活発化している。例えば、既に実用段階にある甘草
甘味料、ステビア甘味料はもちろん、甘茶から得られる
フィロズルチン、アフリカ産べり一類に含まれるミラク
リン、同じくアフリカ産果実に含まれるモネリンやンー
マチン、中国産羅漢果から得られる甘味物質等、 種々の天然甘味料が世界中で盛んに研究されている。中
でも、ステビア甘味料は、甘味質が比較的砂糖に近く、
甘味倍数も砂糖の約３００倍と高いし・熱に安定で食品
加工に適している等の理由から、それに対する一層の需
要の増大が嘱望されているものである。

ところで、ステビア（Ｓｔｅｖｉａ　Ｒｅｂａｕｄｉａ
ｎａ　Ｂｅ　−ｒｔｏｎｉ）は南米パラグアイ原産のキ
ク科に属する多年生草本であって、その葉中にはステビ
オサイド（Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）を主とするジテルペ
ン系甘味配糖体類０が含まれているから、これを抽出、
精製し、ステビア抽出物又はステビア抽出精製物として
甘味料に供する。

Ｋステビア集中の配糖体甘味物質としては、ステビオサ
イドの他、レバウディオサイド−Ａ、Ｃ，Ｄ、Ｅおよび
ズルコサイドーＡの各成分が知られている。

一般　に、ステビオサイドはステビア集中の配糖体甘味
成分のうち含量的に最も多く、ステビア抽出物、ステビ
ア抽出精製物中の甘味成分の主体をなしている成分であ
る。氷晶は前述の如く強い甘味を持ち、かつその甘味の
寅も比較的砂糖のそれに近いという利点があるが、反面
強い苦味や渋味をも有するため、これらの不快味が日中
に残るという欠点がある。

す、残味を感じさせない良質の甘味成分であるうレバウ
ディオサイド−ＣとズルコサイドーＡとは、ともにラム
ノースを有する成分であるが、甘味度は、それぞれレバ
ウディオサイド−Ａ及びステビオサイドの約Ｖ１０程度
に過ぎない。かつ、含量的にも少ｒｚ＜、甘味料の対象
とはなり難い。

レバウディオサイド−Ｄ、Ｅは、ともに甘味度、甘味質
ともステビオサイドより優れているという評価がなされ
ているが、微量成分であるためこれまた甘味料の対象と
なり難い。以下、参考までにこれまでに確認された６ｇ
のステビア甘味配糖体の化学構造を示す。

ステビア集中に含有されることが認められている上記６
種の配糖体のうち、とくにレバウディオサイド−Ａは、
甘味の強さ、質ともにステビオサイドより優れており、
含量的にもステビア抽出物・ステビア抽出精製物の甘味
に重要な役割をもつ成分である。したがって、ステビア
系配糖体甘味成分のうち、甘味料として最も注目されて
いる成分である。

このレバウディオサイド−Ａをステビア集から抽出し、
精製・単離して甘味料に供することも可能であるが、 ■　精製コストが高くなる。

■　含量的に最も高いステビオサイド画分が副産物とし
て多量に得られ、しかも苦味・渋味が分離前のものより
；基４強くなるた。

め轟せ味料として利用しにくくなる。

等のデメリットが生じるので、これを工業的に実施する
のは困難である。

そこで、本発明者は、甘味料として優れているレバウデ
ィオサイド−Ａをそのままにして勿き、ステビオサイド
の苦味・渋味や不快な残株をなくす手段について鋭意研
究の結果、ステビア甘味料に、澱粉及び／又は澱粉部分
加水分解物を基質としてステビオサイドに対し選択的に
糖転移反応を触媒する酵素、例えばバチルス・マセラン
スＩＦＯ３４９０の産生ずるサイクロデキストリン・グ
リコジルトランスフェラーゼを作用せしめることにより
ステビオサイドのみをα−１，４−グルコピラノシル誘
導体１こ変化させうることを見出した。

即ち、本発明は、ステビア甘味料の最も重要な甘味成分
であるステビオサイド及びレバウディオサイド−Ａのう
ち、甘味質の劣るステビオサイドのみを酵素化学反応の
利用によって選択的ｌコα−１．４−クルコビラノシル
ステビオサイドに変換し、ステビオサイドの欠点である
苦味・渋味をなくし、しかも不快な残株を感じさせない
良質甘味に改善することを本質とする。

本発明者は、本発明に係る酵素反応によってステビオサ
イドの実質的部分ないし殆んど大部才力α−１，４−モ
ノグルコピラノシルステビオサイド、α−１，４−ジグ
ルコピラノシルステビオサイド、α−１，４−）リグル
コピラノシルステビオサイド等に変化していることを確
認し、レバウディオサイド−Ａには本発明による反応が
進行しないことを確認した。

因みに、ステビオサイドに、α−グリコジル糖化合物を
基質としてα−グリコジル糖転手蚤酵素を作用させるこ
とにより、これをα−グリコシ′ルステビオサイドに変
換させる甘味料の製法は本願出願前公知である（特開昭
５４−５０７６号公報参照）。しかるに、本公知方法は
その明細書の記載によると、精製ステビオシトとマルト
デキストリンとをバチルス・ステアロサーモフィラスＦ
ＥＲＭ−ｐ　！２２２２の墳業物から得られた粗シクロ
デキストリングルカノトランスフェラーゼを用いて糖転
移反応を行わせた生成物中にはα−モノ、ジ及びトリグ
ルコシルステビオサイド以外に原料中のレバウディオサ
イド−Ａに由来するα−モノ及びジグルコシルレバウデ
ィオサイドーＡを夾雑している旨記載されており（同明
細書４３３〜４３４頁「実験４」参照）、この結論に反
する事実は記載されていない。即ち、本Ａとを含むステ
ビア配糖体混合物に酵素転４多反応を施すことによりス
テビオサイドとレバウディオサイド−Ａの両者をα−グ
リコジル誘導体に変換させる方法であると解される。′
しかるに、本発明の手段は原料中のステビオサイドのみ
をα−１，４−グルコピラノシル誘導体に変換する方法
であって、原料中のレバウディオサイド−人は全く変化
を受けない。従って、先ｌＩテ発明の目的物がα−１，
４−グルコピラノシル化合物であると否とを問わず、本
発明は前者とは趣を異にするのはもちろん、前者から容
易に推考し得ないものである。

本発明における酵素反応は、レバウディオサイド−Ａを
殆んど含有しない高度に精製されたステビオサイドだけ
に限るものではなく、レバウディオサイド−Ａを含有す
る混合物でありぞも、さらにその他のステビア系配糖体
甘味成分をも含有するステビア抽出物又はステビア抽出
精製物であってもよい。要は原料物質が実質的にステビ
オサイドを含有する限り、原料中のステビオサイドは酵
素の作用によって選択的にα−１，４−グルコピラノシ
ルステビオサイドに変換され、本発明による甘味料が製
造できる。

本発明に用いる澱粉もしくは澱粉部分加水分解物は、例
えばバチルス・マセランスＩ　ＦＯ−３４９０の産出す
るサイクロデキストリン・グリコジルトランスフェラー
ゼによってステビオサイドからα−１，４−グルコピラ
ノシルステビオサイドを生成するものであればよく、好
ましくは、Ｄ。

Ｅ、１以下の澱粉からり、Ｅ、約３０までの澱粉部分加
水分解物が適している。

また、本発明の実施に好適に用いられるバチルス・マセ
ランスＩＦＯ３４９０の産生ずるサイクロデキストリン
・グリコジルトランスフェラーゼは、必ずしも精製され
ている必要はなく、精製途中段階の酵素であっても、さ
らには培簀枦液であっても充分に目的を達することがで
きる。

本発明の反応は、少なくともステビオサイドと澱粉もし
くは澱粉部分加水分解物とを含有する水溶液に、例えば
バチルス・マセランスＩＦＯ３４９０の産生するサイク
ロデキストリン・グルコシルトランスフェラーゼを作用
させることにより行われるが、より好ましくは酵素の最
適反応条件又はそれに近い条件が選ばれる。即ち、温度
３０〜６５℃、ｐＨ４，５〜７．０にて反応時間２〜１
００時間とするのがよい。

また、反応に用いられるステビオサイドと澱粉もしくは
澱粉部分加水分解物との割合は、特に制限されるもので
はないが、好ましくはステビオサイドの重量に対する澱
粉もしくは澱粉部分加水分解物の重量比率を０．２５〜
１００の範囲とするのがよい。さらに、反応液中のステ
ビオサイドと澱粉もしくは澱粉部分加水分解物との固形
分濃度についても特に制限はないが、溶解性の点から好
ましくは１〜８０％とするのがよい。

本発明原料であるステビア甘味料の甘味の強さは本１発
明反応の実施前後とも殆んど同じである。しかし甘味の
質は反応の前後により著しく異なり、反応後では反応前
の原料に見られる苦味や渋味が消失し、しかも不快な残
株を呈しない爽やかでまろやかな良質甘味となる。

このように、本発明の反応によって生成されたα−１，
４−４ルコピラノシルステビオサイドを含有する反応溶
液は、そのままでも甘味料として使用できるが、必要に
応じてイオン交換樹脂を用いて脱塩し、濃縮して液状製
品とすることもできるし、さらに乾燥・粉末化して粉末
製品とし、または造粒し、顆粒製品とすることもできる
。

また、場合によっては、反応溶液から合成吸着樹脂を用
いて配糖体成分を吸着せしめ、未反応の澱粉もしくは澱
粉部分加水分解物や塩類を除去した後、メタノール、エ
タノール、アセトンもしくはこれら溶剤と水との混合溶
液にて吸着した配糖体成分を溶出せしめ、濃縮・乾燥・
粉末化し、より甘味度の高い甘味料とすることもできる
。

このようにして得られる本発明の甘味料は、ステビオサ
イドに特有な呈味の欠点が改善され、爽やかでまろやか
な良質甘味となるため、食品及び医薬品の甘味料として
特に好ましいものである。

本発明に係る甘味料は、原料として用いたステビア甘味
料中のステビオサイドのみがα−１゜４−グルコピラノ
シル誘導体に変換されたものであって、レバウディオサ
イド−Ａがそのまま残存している。故に原料の甘味の質
が飛躍的ｔこ向上した、食品及び医薬品工業上極めて有
用なものである。しかもその製造面において、原料中の
レバウディオサイド−Ａが酵素の作用を受けないため、
先行発明に比べて少７い酵素量で充分な改質効果が得ら
れるという利点がある。

以下、実験によって本発明を説明するが、本発明の技術
的範囲は、これらによって何ら限定されるものではない
。

〔本発明甘味料の製造〕

実験°１　甘味料の製造 １−１　酵素の調製 コーンステイープリカー１％、溶性澱粉１％、硫酸アン
モニウム０，５％、炭酸カルシウム０．５％からなる種
培養用液体培地１００ｒｎｌを５００ｒｎｌ容の振とう
フラスコに入れ、１２１℃、３０分間殺菌した後、バチ
ルス・マセランスＩＦＯ３４９０ヲ１　白金耳植菌し、
４０℃にて１５時時間表う培養した。

次いでこの種培養液３０−をとり、上記と同一組成から
なる本培養用液体培地３，０００ｒｎ１．を５，０００
　ｍ／容ジャーファーメンタ−に入れ、上記と同一条件
にて殺菌した培地に加えて、４０℃、４８時間通気撹拌
培養した。培養後、培養液を１３，０００　Ｘ　Ｇ、５
分間遠心分離し、４０単位／ｒｎｌのサイクロデキスト
リン・グルコシルトランスフェラーゼの活性を含む透明
な培養ｐ液２，６００−を得た。

ここに、サイクロデキストリン・グルコシルトランスフ
ェラーゼの活性１単位とは、０．００２Ｍの塩化カルシ
ウムを含む０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，
５の１９６溶性澱粉溶液０．５艷に適当に稀釈した酵素
液０．５−を加え、４０℃、１０分間正確に反応させ、
反応後、ＩＭのグリシン塩酸緩衝液、ｐＨ３，０，１−
を加えて反応を停止せしめ、さらにこの液に０．ＯＩＭ
のヨウ素−０，２５Ｍのヨウ化カリウム溶液ｌ−を加え
て発色させ、水５ｍｌを加えて稀釈した後、６６０ｎｍ
の吸光度を測定し、６６０ｎｍの吸光度を１分間に１０
％減少させる酵素社をいう。

この培養ｐ液を５℃以下に冷却し、湿熱処理澱粉５０ｙ
を加えて、１夜撹拌し、酵素を吸着せしめた。酵素の吸
着した澱粉を３，０００　Ｘ　Ｇ　２分間遠心分離して
集め、５℃以下に冷却した蒸留水２００−を用いて３回
洗浄し、同様に遠心分離して澱粉を集めた。酵素の吸着
前後の活性測定結果から、ここに得られた酵素吸着澱粉
は、９１，０００単位の酵素景を吸着していた。（酵素
１）次に、この酵素吸着澱粉を０．０５Ｍのグリシン−
水酸化す）　ＩＪウム緩衝液、ｐＨ９，０，１２０−を
用いて５０℃にて１０分間処理して酵素を溶出せしめ、
４９０単位／ｒｎｌの酵素液１３０−を得た。（酵素２
）この酵素液に硫酸アンモニウムを加え、６５％飽和と
し、冷蔵庫に１夜放置、酵素を塩析させた。塩析物を１
３，０ＯＯＸＧ　、　１０分間遠心分離して集め、蒸留
水５−に懸濁し、予め５℃以下に冷却した０、０１Ｍの
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，０，３，
０００−中で１昼夜透析し、酵素を溶解させ、不溶物を
１３，０ＯＯＸＧ　、　１０分間遠心分離して除去し、
８，４５０単位／−の酵素液７ｒｎｌを得た。

（酵素３） さらに、この酵素液を予め冷温室中で、０．０１　Ｍの
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，０、にて
平衡にしたセファデックスＧ−１５０カラム（φ２．２
　Ｘ　９４ｃ＋＋＋　）にチャージし、ゲル濾過した。

溶出液はフラクションコレクタにて１フラクション当り
７．７−ずつ分取したところ、酵素は２６〜３３フラク
シヨンの間に溶出した。活性の強イフラクションを集め
て、１，２００単位／−の酵素液３８−を得た。（酵素
４） １−２　酵素の純度検定と最適反応条件実験１−１で得
られた酵素４の吸収スペクトルを測定したところ、２８
０ｎｍに極大吸収ピークを有し、２５０ｎｍに極小吸収
を有する典型的なタンパク質の吸収スペクトルを示した
。また、０Ｄ２８０　／　０Ｄ２６０　＝　１．８９で
あり、核酸のコンタミネーションは考えられなかった。

また、電気泳動にて酵素４の純度を検定したところ、わ
ずかなコンタミネーションが見られたが、はぼ単一なタ
ンパク質にまで精製されていた。

一方、本酵素の最適反応条件を下記に示すが、最適反応
条件は酵素の精製前後で差が認められなかった。

最適温度　　　　５５〜６０℃ 最適ｐＨｐＨ５，０〜６．０ 温度安定性　　　５５〜６０℃ ｐＨ安定性　　ｐＨ８，０〜１Ｏ１０ １−３甘味料の製造 薄層クロマトグラムと高速液体クロマトグラムによって
ステビオサイド以外のステビア系配糖体甘味成分のスポ
ットやピークが検出されなくなるま１度に精製された純
ステビオサイド１０ｙとり、Ｅ；８〜１０の市販澱粉部
分加水分解物８０２とを水２２０−に加熱溶解し、冷却
後０．０２Ｍの塩化カルシウムを含、むＩＭの酢酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ５，５，１０−を加えてｐＨ５，５
に調整し、温度５５℃に調節してから、実＠１ｌ−１で
得た酵素４を８００単位（ａ、Ｇｌｍｔ　）加えて２４
時間撹拌反応させた◎反応後、反応溶液をｎｍ水中に１
０分間保って酵素を加熱失活させ、液状甘味料を得た。

（試料１） 対照量は、酵素液の代り番こ水を加えた溶液及び酵素液
を沸騰水中に１０分間保って酵素を加熱　　゛失活させ
て加えた溶液を上記同様に処理して得た。（対照量１及
び２） 実験２　高速液体クロマトグラフによる分析実験１−３
で得た試料１と対照量１及び２とを高速液体クロマトグ
ラフを用いて分析した。

高速液体クロマトグラフは、東洋ソーダ族のＨＬＣ−８
０２ＵＲを用い、カラムはＬＳ−４５０Ｎ１（２で溶媒
組成はアセトニトリル：水＝８：２、流速はｌｍｌ　７
ｍ　ｉ　ｎ　！こて分析し、検出方法は糖質の検出を防
ぎ、しかもステビオサイドを感度よく検出するため、２
００ｎｍにおける吸光度を測定する方法によった。

試料１、対照品ｌ及び２の溶液をそれぞれ１−別々に分
取し、水４−を加えて稀釈し、この稀釈溶液の１０μｌ
を高速液体クロマトグラフに注入して分析した。その結
果を第１図に示す。

第１図に示した高速液体クロマトグラムがら、対照品１
及び２ではステビオサイドのみしか検出されておらず、
しかも含有量の変化も認められなかったことがわかる。

一万、試料１の高速液体クロマトグラムでは、ステビオ
サイドのピーク（ピーク１）の他ニ複数の新規なピーク
（ステビオサイドのピークから順番にピーク２．３．４
．５とする）が検出されており、しかもステビオサイド
の含有量が非常に減少していることが認められる。

これらの分析結果から、本発明による反応によって、ス
テビオサイドから新規反応生成物が得られていることは
明白である。

実験３　反応生成物の精製 実験１−３で得た試料１の液状甘味料の半量を分取し、
合成吸着樹脂（三菱化成製　商品名ＨＰ−ｓｏ）　５ｏ
ｏ−をつめたカラムにＳ、Ｖｌで通じ、未反応のステビ
オサイド及び反応生成物を吸着せしめた後、カラムを水
で充分に洗浄して未反応の糖質と塩類を除去した。次に
、メタノール：水＝１：１の混合溶媒１０１００Ｏを用
いて吸着物を溶出させ、溶出液を濃縮・乾固して約５ｙ
の粉末状甘味料を得た。（試料２） 試料２の３２をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（
ワコーゲルＣ−２００カラム、＄１２．８　Ｘ５２　Ｃ
ｍ　ｓ展開溶媒はクロロホルム：メタノール：水＝３０
：２０：４）にて分画し、未反応のステビオサイドの他
、試料３４００＊、試料４３００岬、試料５２００ｑの
３分画を得た。この３分画以外の反応生成物も含まれて
いることは、第１図に示した高５０マドグラムから明ら
かであるがこれ以上の分離はできなかった。

、試料３．４．５をそれぞれ１．５ｙｔｙ／ｍｌ　　の
根皮になるように水に溶解して各溶液１０ｐｌを高速液
体クロマトグラフに注入し、分析した。

分析条件は、実験２で述べた高速液体クロマトグラフに
よる分析条件にて行った〇 その結果、試料３のピークは、第１図の試料１の高速液
体クロマトグラムのピーク２に一致し、このピーク以外
のピークは検出されなかった。試料４．５についても同
様に分析したところ、それぞれについておのおの１本の
ピークのみが検出され、試料４のピークはＭ１図に示し
た試料１の高速液体クロマトグラムのピーク３に一致し
、試料５のピークは同様にピーク４に一致した。

実験４　　α−１，４−グルコピラノシルステビオサイ
ドの確認。

４〜１　グルコアミラーゼによる加水分解物の高速液体
クロマトグラフによる分析 ステビオサイドおよび実験３で得た試料３．４゜５をそ
れぞれ下記に示す重量とし、水３，６ｄを加えて溶解し
た溶液をサンプル溶液として実検に供した。

ステビオサイド　：　　　４　■ 試　　料　　３　　　：　　　　４．８試　　料　　４
　　　　：　　　　５．６試　　料　　５　　　：　　
　　６．４このサンプル溶液をおのおの０．９１ｎｌず
つとり、それぞれ別々の試験管に入れ、それぞれの試験
管にＩＭの酢酸す）　ＩＪウム緩衝液、ｐＨ４，８，５
０μｌを加え、さらに市販結晶グルコアミラーゼを１０
り鷹の濃度に調整した水溶液を５０μｌ加えて、５０’
Ｃｉこて１夜反応させた。反応後、この溶液のそれぞれ
２０μｌを実験２に示した高速液体クロマトグラフの分
析条件下にて注入し、分析した。

その結果、ステビオサイド、試料３．４．５のすべての
反応溶液ともステビオサイドのみしか検出されず、しか
も検出されたステビオサイドの含有量は、はとんど同一
の量であった。

４−２　グルコアミラーゼ番こよる加水分解物中のＤ−
グルコースの定量 実験４−１で調整したサンプル溶液を、おのおのの試料
について０．９−ずつ２本の試験管に取り、それぞれの
試験管にＩＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４，８，５
０μｌを加え、さらに各々の２本の試験管のうち１本口
の試験管には、市販グルコアミラーゼを１０　ｍｙ／ｍ
ｌの濃度に調整した水溶液を５０μｌ加え（試験液）、
各々の残る１本の試験管には、上記と同濃度の市販グル
コアミラーゼ水溶液を沸騰水中に１０分間保って酵素を
失活させた溶♂Ｔｏ　／Ｉ／加え（対照液）、５０℃に
て１夜反応させた。

反応後、加水分解によって生成されたＤ−グルコースを
ＤＮＳ法にて測定した。すなわち、反応後の反応溶液に
ＤＮＳ試薬１ｄを加え、沸騰水中に５分間保った後、冷
水にて冷却し、水５ｒｎｌを加えて稀釈した溶液の５１
０ｍｍにおける吸光度を測定した。この結果を表１に示
す。

表Ｉ　　　ＤＮＳ法による分析結果 ステビオサイド　　　　０．００３　　　　　　　０．
００９　μＭ試料３　　０．４０１　　　　１．１４ノ
／４０．８１３２．３１ １／　　　５　　　　　１．２５７　　　　　　　　３
．５７をもって、あらかじめ市販特級Ｄ−グルコースを
用いて作製した検量線（Ｄ−グルコース量μＭ＝　２．
８４　Ｘ△０Ｄｓｌｏ　＆　＝　０．９９９９ただし、
０．５　ｐＭ　−８，０器Ｍの範囲）から、Ｄ−グルコ
ースの分析値をμＭで表わした。

ここで、ステビオサイドの分子量を８０５とし、試料３
はステビオサイド１モルにＤ−グルコースが１モルα−
１，４−結合したものであると仮定し分子ｆｆｉ　９６
７、同様に試料４はＤ−グルコース２モルが結合したも
のであるとして分子量１．１２９、同じく試料５はＤ−
グルコース３モルが結合したものとして分子ｆｉ１．２
９１　　の各分子量を仮定してＤＮＳ法による分析結果
を解析してみた。

その結果を表２に示す。

表２　　　ＤＮＳ法による分析結果の解析ステビオサイ
ド　　１．Ｏａｙ　　　８０５　　１．２４／ｌλ（０
，００９ｍ　　０．００７３試料３　１．２　９６７　
１．２４　　１．１４　０．９２η　　４　　１，４　
　１，１２９　　１．２４　　　２．３１　　１．８６
ｕ　　　５　　１．６　　１，２９１　　１．２４　　
　３．５７　　２．８８表２に示した結果から、試料３
の生成物は、ステビオサイド１モルにＤ−グルコースカ
０．９２モル÷１モルα−１，４−結合したものである
こ同様に試料４は２モル、試料５は３モルのＤ−グルコ
ースがα−１，４−結合したものであることが判る。

４−３　９器による分析結果 第２図、第３図、第４図に試料３．４．．５のそれぞれ
のＫＢｒ錠剤法による赤外吸収スペクトルを示す。赤外
吸収スペクトロメーターは、高滓製ＩＲ−２４Ｇ　　を
用い、スキャンスピード５分で測定した。

また、第５図１どは、試料３．４．５のそれぞれの炭素
１３−核磁気共鳴スペクトルを示す。炭素１３−核磁気
共鳴スペクトロメーターとしては、日本分光製ＪＮＭ−
ＦＸ−６０Ｑを用い、パルスＦＴ−ＮＭＲスペクトルを
測定した。試料は、ピリジンｄ５中、１５０嘴旬の濃度
で室温にて測定した。化学シフトは、ピリジンｄ５の３
組のトリプレットシグナルの中央のシグナルを各々１２
３．６　１３５．７　１４９．８ｐｐｍとしてδｐｐｍ
で示した。その結果、ステビオサイドのＣ−２０の化学
シフトは、１５．４ｐｐｍ（文献値１５．４　ｐｐｍ）
　、Ｃ−１９では１７７、ｌｐｐｍ　（文献値１７７．
０　）が得られたので化学シフトの求め方は正しいもの
であると考えられた。

この炭素−１３核磁気共鳴スペクトルから、試料３．４
．５ともに、９７．９ｐｐｍにＣ−１３−ＯＨに結合し
たβ−Ｄ−グルコースのアノマー炭ｇ、１０ａｉｐｐｍ
にβ−ソホロース部のアノマー炭素、１０２．９ｐｐｍ
に本発明による反応にて転移したα−Ｄ−グルコースの
アノマー炭素（試料３は１個分、試料４は２個分、試料
５は３個分）の各シグナルが検出されていることが判る
。

この実験４のすべての結果を総合して考えると、試料３
はステビオサイド１モルにＤ−グルコース１モルがα−
１，４−結合したものであり、同様に試料４は２モル、
試料５は３モルのＤ−グルコースがα−１，４−結合し
たものであると結論される。

即ち、試料３はα−１，４−モノグルコピラノシルステ
ビオサイド、試料４はα−１，４−ジグルコピラノシル
ステビオサイド、試料５はα−１，４−１−リグルコピ
ラノシルステビオサイドであることが判る。この他にも
、本発明の反応による反応生成物が、第１図に示した高
速液体クロマトグラムから確認されているが、上記結果
カラα−１，４−グルコピラノシルステビオサイドの一
連の化合物であると推定される。

よって、本発明による反応生成物は、ステビオサイドに
等モル以上のＤ−グルコースがα−１，４−結合した一
連の化合物、即ち、α−１，４−グルコピラノシルステ
ビオサイドであるということができる。

実験５　官能検査 ５−１　甘味度の比較 実験１−３で得た本発明品の液状甘味料（試料１）と対
照量１及び２について甘味度の比較をしてみた。

試験液としてそれぞれの溶液５２を分取し、それぞれに
水を加えてｉ、ｏ　ｏ　ｏｒｎｌとして検査に供した。

官能検査パネルは、甘味にすぐれた検査員ろ、 対照量１の甘味が強い　　　　１名 ／／　　２　　　η　　　　　　０名 両者の甘味度に差が認められない１４名となり、対照量
１と２とは甘味度が同等であると見なされた。

次に対照量１と試料ｌとについて比較検査した。その結
果は、 対照量１の甘味が強い　　　　４名 試料１３名 両者の甘味度に差が認められない　８名となり、甘味度
は対照量１と試料１とで差が認められず、同等であると
見なされた。

また、対照量をステビオサイドとし、実験３で得た粉末
状甘味料（試料２）と甘味度の比較検査を行った。試験
液は、対照量、試料２ともに０．０１５％の水溶液とし
て検査番こ供した。その結果は、 対照量の甘味が強い　　　　　１２名 試料２　　　　　　　　　　０名 両者の甘味度に差が認められない　３名となり、試料２
はステビオサイドに比し、弱い甘味度であると見なされ
た。これは、本発明の反応によってステビオサイドに等
モル以上のＤ−グルコースがα−１，４−結合し、反応
生成物の分子量がステビオサイドより大きくなったため
であると考えられた。

そこで、甘味度を捉えるため、試料２の濃度をすべてｏ
、ｏ　ｉ　ｓ％とし、対照量ステビオサイドの０．０１
％、０．０１２５％、０．０１５％の各溶液を調製し、
甘味度の比較をしてみた。その結果を表３に示す。

表３　甘味度の比較 ０．０１％　　　　　０１２３ ０．０１２５％　　　　４　　　３　　８０．０１５％
　　　　１３０２ 表３に示した結果から、試料２の０．０１５９６溶液の
甘味度は、ステビオサイドの０．０１２５％溶液の甘味
度に等しいことがわかる。

５−２　甘味質の比較 まず、試料１および対照量１．２について実験５−１で
調製した甘味度の比較試験溶液をそのまま用いて甘味質
の比較をしてみた。結果は、対照量１の甘味が最も良い
　　０名 〃　２　　　　　　　　　０名 試料１の甘味が最も良い　　１５名 となり、全員一致して試料１が最も良好な甘味質である
との結果を得た。

甘味質が良好である理由は、対照品ｌと２とはともにス
テビオサイドに特有の強い苦味を有し、かつ、渋味と相
いまって不快な残株を呈するのに対し、試料１には、こ
のような苦味・渋味が感じられず、さらに不快な残株を
も呈さない爽やかでまろやかな甘味であるとされた。

次に、対照品をステビオサイドとし、試料２との甘味の
質について比較検査してみた。試験溶液の濃度は、甘味
度をそろえるため、ステビオサイドを０．０１２５％、
試料２を０．０１５％として検査に供した。その結果は
、 対照品の甘味が最も良い　　０名 試料２　　　η　　　　　　１５名 となった。甘味質が良好である理由は、試料ｌと同様に
試料２の甘味には苦味・渋味が伴わず、不快な残株を呈
さない磯やかでまろやかな甘味であるとされた。

これらの実験結果から、本発明による甘味料は、苦味・
渋味を伴わず、しかも不快な残株を呈しないまろやかな
良質の甘味料であることが判る。これらは原料中のステ
ビオサイドがα−１，４−グルコピラノシルステビオサ
イドに修飾された結果に因るものと結論される。

〔本発明の実施例〕

次に本発明に関する１〜２の実施例について述べる。

実施例１ 高速液体クロマトグラフ分析ｌとよって第６図の■に示
したクロマトグラムのパターンが得うれる市販ステビア
抽出精製物（商品名：ステビア５Ｔ−ＡＢ　、池田糖化
工業株式会社製）３０ノと、Ｄ、Ｅ、８〜ｌＯの市販澱
粉部分加水分解物５０Ｆとを水１１０−に加熱溶解し、
冷却後、０．０２Ｍの塩化カルシウムを含むＩＭの酢酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，５，５−を加え、さらに酢
酸的０，１−を加えてｐＨ５，５に調整し、温度を５５
℃に調節してから実験１−１で述べた方法にて調製した
酵素ｌを加え（酵素の活性５００単位に相当する澱粉量
を加えた）、４０時間撹拌反応させた。

反応後の溶液１ｍｌを取り、沸騰水中に１０分間保って
酵素を加熱失活させた後、水９−を加えて稀釈した。こ
の稀釈溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過し、その
１０μｌを高速液体クロマトグラフに注入し、実験２−
１で述べた条件下に分析した。この結果を第６図の■の
クロマトグラムで示す。

第６図の■と■とを比較すると、本発明による反応後の
溶液では、ステビオサイドの含有量が非常に減少し、し
かも反応前のステビア抽出精製物には見られないα−１
，４−グルコピラノシルステビオサイドの一連のピーク
が検出されていることがわかる。

また、レバウディオサイド−Ａ、Ｃについては、本発明
による反応前後で含有量の変化が認められないことも同
時にわかる。

一方、反応の前後の溶液について官能検査してみたとこ
ろ、甘味度は反応前後で差が認められなかったが、甘味
質は、反応前に強い苦味及び渋味があり、不快な残株を
呈したのに対し、反応後ではこのような苦味・渋味及び
不快な残株が感じられず、爽やかでまろやかな甘味とな
っていた。

このことから、本発明による方法では、ステビオサイド
を含有するステビア抽出物もしくはステビア抽出物を用
いて、含有量の高いステビオサイドに選択的に本発明に
よる反応を起こさせることによって、苦味・渋味及び不
快な残株をなくシ、爽やかでまろやかな甘味に変換しう
ることがわかる。

このようなステビア抽出物もしくはステビア抽出精製物
は、高度に精製されたレバウディオサイド−Ａよりも安
価で製造できるため、本発明による反応を起こさせても
コスト的に安価で供給できる。

また、甘味質の向上も著しいので、食品や医薬品の甘味
料として特に好ましいものであり、有用に利用されるも
のであると信する。

実施例２ 実施例１で用いたステビア抽出精製物３００ｙとり、Ｅ
、８〜１０の市販澱粉部分加水分解物５００ｙとを水１
，１００ｒｎｌに加熱溶解し、冷却後、酢酸を加えてｐ
Ｈ５，５に調整し、温度５５℃に調節してから実験１−
１で述べた方法にて調製した酵素２を加え（酵素の活性
ｓ、ｏ　ｏ　ｏ単位に相当する液量を加えた）、４０時
間撹拌反応させた。反応後、反応溶液を８＃ＩＩｍ水中
に１０分間保って酵素を加熱失活させた後、スプレード
ライヤーを用いて噴霧乾燥させ、７５０ｙの粉末状甘味
料を得た。

本甘味料は、反応前のステビア抽出精製物の甘味質に見
られた苦味・渋味や不快な残株を呈しない爽やかでまろ
やかな良質甘味であった。

〔参考例〕

薄層クロマトグラムと高速液体クロマトグラムによって
、レバウディオサイド−Ａ以外のステビア系配糖体甘味
成分のスポットやピークが見られなくなるまでに高度に
精製された純レバウディオサイド−Ａｌｐと、Ｄ、Ｅ、
８〜１０の市販澱粉部分加水分解物８ｙとを水２２−に
加熱溶解し、冷却後、０．０２Ｍの塩化カルシウムを含
むＩＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，５，１−を加
えてｐＨ５，５に調整し、温度５５℃に調節してから実
験１−１で得た酵素５の８０単位（０，１５ｍ／）を加
えて２４時間撹拌反応させた。対照は、酵素の添加直後
の反応溶液から５−を分取し、沸騰水中に１０分間保っ
て酵素を加熱失活させた溶液とした。

反応後、反応溶液を沸騰水中に１０分間保って酵素を加
熱失活させた溶液の１ｒｎｌを分取し、水４ｄを加えて
稀釈した。この稀釈溶液の１０μｌを高速液体クロマト
グラフに注入し、実験２−１に述べた条件下に分析して
みた。対照についても同様に稀釈して分析に供した。そ
の結果、反応溶液、対照溶液ともにレバウディオサイド
−Ａ以外のピークは検出されず、しかも両者の溶液につ
いて含有量の差も認められなかった。

また、反応溶液と対照溶液との甘味度及び甘味の質を比
較官能検査してみたが、両者に差は認められなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は純ステビオサイドに澱粉部分加水分解物の存在
でＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ　ＩＦＯ３４９
０の酵素を作用させたもの（試料１）と同酵素を作用さ
せない対照品（１，２）の高速液体クロマトグラム、第
２図〜第４図は、それぞれ第１図ピーク２〜４の試料（
試料３〜５）の赤外部吸収スペクトル、第５図は１．そ
れぞれ第１図、ピーク２〜４の試料（試料３〜５）の核
磁気共鳴スペクトル、第６図は、レバウディオサイド−
Ａを含む市販ステビア抽出精製物に第１図と同様の酵素
反応を行った場合における反応前のものΦと反応後のも
の■の高速液体クロマトグラムである。 特許出願人　池田糖化工業株式会社 性、Ｎ；−、：、’戸 図面のａＩ書（内容に変更なし） ８　冨　Ｆ６Ｅ　　Ｒｇ　　Ｓ　　雰　８　翼　箕０昭
和６０年３月２２日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 〔１〕α−１，４−グルコピラノシルステビオサイド類
   を含有し、α−１，４−グルコピラノシルレバウディオ
   サイド類を含有しないことを特徴とする甘味料。 〔２〕ステビオサイド及びレバウディオサイド類を含有
   する特許請求の範囲第１項記載の甘味料。