JPH0399092A - 新規なステビオール配糖体及びその製造方法及びこれを用いた甘味料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、新規なステビオール配糖体及びその製造方
法及びこれを用いた甘味料に関する。

（従来の技術） 近年、人工甘味料であるサッカリン、ズルチン、チクロ
等が安全性の点から一般食品への利用が禁止、又は規制
される傾向にある． 一方では、近年砂糖の採り過ぎによる健康上のｉ９％’
Ｊが問題にされはじめたことから、それらの問題がより
少ない天然甘味料の開発が熱望されている． これに対して、南米パラグアイ原産のキク科植物である
ステビアから得られるステビオサイド及び中国南部、広
西、広東地方に野生するバラ科、キイチゴ属の潅木、甘
葉懸鈎子の葉から得られるルプソサイドは構造式（ＩＩ
）及び（■）［第１図（ｂ）、（ａ）］に示すようにス
テビオール配糖体であるが、これらは砂糖と異なり、低
カロリーの甘味料であり、しがち甘味度は約１１４〜１
４５倍と高く、砂糖に替わる甘味料として注目されてい
る． ところが、上記ステビオール配糖体であるステビ才サイ
ド、ルプソサイドの甘味質には苦味、嫌味があり，更に
は残味が長く尾を引くという欠点があるため、αまたは
β−グルコシル転移酵素でグルコシル化することにより
、これらの欠点を改善した製品が生産されているが、未
だ十分な成果を収めるには至っていない． ステビオサイドの甘味度、甘味質の改良法については、
数多くの研究報告並びに特開昭５４−５０７０号などの
数多くの特許出願がなされている。

また、ルプソサイドについては、サイクロデキストリン
を添加することにより、甘味質を改善する方法が提案さ
れている（特開昭５８−７１８６７号公報）。

更に、ルプソサイドにバシラス・メガテリウムｆＢａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）が生産するサイク
ロデキストリン　グルカノトランスフエラーゼ（以下、
Ｃ　Ｇ　Ｔａｓｅと記す）を用い、澱粉を糖供与体とし
て，グルコシル基転移を行なうことにより甘味質を改善
する方法も提案されている． 本発明者らは，これらの欠点を解決するために研究を重
ね、特願昭６３−１５０２０９号、特願平１−５６１２
９号を出願した． （発明が解決しようとする問題点） しかし、上述のルプソサイドにＣＧＴａｓｅを用いて澱
粉を糖供与体として酵素転移させる方法については、味
質の十分な改善が行なわれず、またステビオサイドにつ
いても同様である。

また、発明者らが出願した上述の出願内容も甘味質がか
なり改善され、まろやかとはなったものの完全なものに
は至っていない． これらの原因については、上述の反応においてルプソサ
イドの１３位のＯＨにエーテル結合したβ一グルコシル
基（以下、１３位のグルコシル基と記す）または１９位
のＣＯＯＨにエステル結合するβ一グルコシル基（以下
、１９位のグルコシル基と記す）にグルコースが１〜３
分子それぞれ一方に転移するもの、また両方に転移する
もの等の混合物が生成するが、このうち１３位のグルコ
シル基にグルコースが１〜３分子転移したものは、甘味
度、味質共に改良されるが、１３位のグルコシル基より
、１９位のグルコシル基に，より多くのグルコースが転
移した生成物は甘味度、味質が低下すること等がｌ９８
４年にＡｇｒｉｃ．　，　Ｂｉｏｌ．　．　Ｃｈｅｍ．
　．　４８　（１０１　２４８３〜２４８８に報告され
ている． また、ステビオサイドについても同様なことが１９８９
年のＡｇｒｉｃ．　．　Ｂｉｏｌ．　．　Ｃｈｅｍ．　
，　５３　（６１　．　１６０３　〜１６０７に報告さ
れている． 即ち、上述の反応結果得られる転移生成物は味質が改善
されたもの、逆に悪くなったものの混合物であるので、
その味質は十分に改善されるに至っていない． 発明者らが出願した特願平１−５６１２９号公報の１３
位のグルコシル基にガラクトースを選択的に転移させる
方法においても充分な結果が得られていない。

一方、本発明者らは先にアルスロバクター・エスピーＫ
−１（微工研寄託　菌寄第１０７３６号）から特殊なβ
−フラクトフラノシル転移酵素が生産されることを見出
したが、更に研究の結果ステビオール配糖体であるルプ
ソサイドまたはステビ才サイドとβ−フラクトシル糖化
合物（以下、糖供与体と記す）とを含有する水溶液また
は懸濁液にこれらの酵素を作用させることにより、各々
のｌ９位のグルコシル基にフラクトースが転移すること
を見出し、この発明を完成したものである．（問題点を
解決するための手段） この発明に係る物質は、ルプソサイド又はステビオサイ
ドの１９位のカルポキシル基にエステル結合するβ−グ
ルコシル基の６位に、β一Ｄ−・フラクトフラノースが
２位の位置で結合した構造のステビオール配糖体、即ち
β−フラクトフラノシルルプソサイドまたはβ−フラク
トフラノシルステビオサイドである。

具体的には、この発明に係る物質は構造式（ｎｌ）　　
（ＩＶ）　　［第２図（ａ）（ｂ）］で表わされる．こ
の発明に係る物質は、ルプソサイド又はステビオサイド
などのステビオール配糖体とβ−フラクトシル糖化合物
とを含有する水溶液又は懸濁液に、アルスロバクター・
エスピーＫ−１　（微工研寄託　菌寄第１０７３６号）
の生産するβ−フラクトフラノシル転移酵素を作用させ
ることによって得られる。

この反応に用いるステビオール配糖体は、精製されたル
プソサイドまたはステビオサイドに限定されることなく
、例えば甘葉懸鈎子またはステビアの抽出液、更に若干
精製を加えた中間精製物で６良い． この反応に用いる糖供与体は、蔗糖、ラフィノス、スタ
キオース等が使用される。

この反応系でのステビオール配糖体と糖供与体を含有す
る水溶液または懸濁液はルプソサイドまたはステビオサ
イドの濃度が約ｌ〜４０％（Ｗ／Ｗ）．　糖供与体の濃
度が約１〜５０％ＦＷ／Ｗ）とし、且っルプソサイドま
たはステビオサイドに対する糖供与体の比率は使用する
糖供与体によって異なるが、０．１〜５０倍の範囲とし
、好ましくはｌ〜５倍の範囲とする。

この反応に用いるβ−フラクトフラノシル転移ｉ’ｉｌ
　，｛−＝はアルスロバクター・エスピーＫ−１　（微
工研寄託　閑寄第１０７３６号）の生産するβ−フラク
トフラノシル転移酵素の他に、ルプソサイドまたはステ
ビオサイドと糖供与体を含有する水溶液または懸濁液に
作用させるとき、糖供与体を分解し、そのフラクトース
をルプソサイドまたはステビ才サイドのｌ９位のグルコ
シル基に転移させ、β一フラクトフラノシルルプソサイ
ドまたはβ−フラクトフラノシルステビオサイドを生成
する６のであれば何れも使用可能である。

反応液のｐＨと温度は、通常ｐＨ４〜８，温度は２０〜
７０゜ＣｈＳ適当である．使用酵素活性量は反応時間と
密接な関係があり、通常５〜１２０時間、好ましくは５
〜２０時間で反応が終了する酵素活性量にすれば良いが
，これらに限定されるちのではなレＸ． （発明の効果） 以上のような方法により，反応させて得られた液を吸＠
樹脂（商品名：グイヤイオンＨＰ−２０、三菱化成社製
）によるクロマト及び高速液体クロマトグラフにかけて
分画，分取した後，その画分を核ｂ１気共鳴及びメチル
化分析により構造解析を行なった結果、構造式（　ＩＩ
Ｉ、ＩＶ）に示すようなβ−フラクトフラノシルルプソ
サイドまたはβ−フラクトフラノシルステビオサイドで
あることを確認した６ また、上述のようにして得られた反応生成物の甘味度は
β−フラクトフラノシルルプソサイドの場合、原体のル
プソサイドと比較し、モル比で１．５倍となり、更に味
質ち原体と比べ、かなり苦味が減少し、まろやかなもの
に改善されることを確認した。

更に、β−フラクトフラノシルステビ才サイドの甘味度
は原体のステビオサイドと比較してモル比１６２倍とな
り、特に甘味質については苦味は殆どなくなり、甘味の
切れちよく、従来の糖転移物に比べ、はるかに改善され
、レバウディ才サイドーＡとの比較でも苦味、残味、ま
ろやかさがより上まわっていることを確認した。

したがって、このようにして得られた各転移生成物の反
応液は、そのまま甘味料として使用することができるが
、必要に応じて酵素を失活させて濾過後、その？８液を
イオン交換樹脂，例えばＩ］型強酸性カチ才ン交ＦｔＡ
Ｆ？Ａ脂及びＯ　Ｉ｛型塩基性アニオン交換樹脂を用い
て脱塩し、濃縮してシラップ状の甘味料とするか、また
はこの濃縮液を乾燥して粉末状の甘味料とすることもで
きる。

史に，脱塩した反応溶液をカラムクロマト法にて精製し
，転移精製物を分離、採取して、これを甘味料とするこ
ともできる，この際，濃縮、乾燥、粉末化は公知の方法
によれば良い。

この発明により得られたβ−フラクトフラノシルルプソ
サイド及びβ−フラクトフラノシルステビオサイドは甘
味度が高く、甘味質が非常に良好であることから、低カ
ロリーの飲食物，低カロリーの嗜好物等，いわゆる美容
食、健康食、ダイエッ１・食の甘味付けに好適である． また、うがい叉，練り歯磨等、虫歯予防用の経口用医薬
部外品への添加にも好適であり、その他医薬品も含めて
甘味の必要とする分野に自由に使用することができる。

（実施例） 以下・実施例によりこの発明を具体的に説明する。

実施例ｌ （１）酵素の調製 普通寒天斜面培地にアルスロバクター・エスビ−Ｋ−１
　（菌寄第１０７３６号）を接種し、３７℃で２日間培
養後，その１白金耳をとり、１．２％酵母エキス、０．
８％ポリベブトン、４％可溶性澱粉、０．４％［ＮＨ４
１　．ＨＰＯ．、０．１％ＭｇＳ０４・７Ｈ２０　ｆｐ
Ｈ７．　０１の組成からなる液体培地（　６０ｍｌ培地
７５００ｍｌ肩付きフラスコ）に植菌し、３７℃で２日
間振盪培養した。これを種菌とし、同組成からなる液体
培地に分注し、３７℃で２日間振盪培養した。培養終了
後、培養液を遠心分離し、上清（粗酵素液）を得た。本
液にはｍ２あたり３０単位のβ−フラクトフラノシダー
ゼを含有していた． なお、酵素の活性測定法は次の通りである．４０％キシ
ロースを含む２０％蔗糖溶液（５０ｍｉＪリン酸緩衝液
ｐＨ６．　５＋　２００μＣに適宜希釈した酵素液２０
０μ２を加え、４０℃、ＩＯ分間作用させた後、反応液
の一部を沸騰水に入れ、酵素を熱失活させた後、Ｆキッ
トで遊離するグルコース及びフラクトース量を求め、グ
ルコース量からフラクトース量を差し引き、転移したフ
ラクトース量を算出する。ｌ単位は１分間にＩＩＬｍｏ
ｌのフラクトシル基を転移させる酵素量とする。

（２）転移反応 乾燥甘葉悲鈎子の葉を粗砕し、温水を加えて抽出してか
ら濾過助剤を添加し、充分撹拌後、その液を濾過して清
澄液とした。更に、吸着樹脂（商品名：ダイヤイオンＨ
　Ｐ　−　２　０三菱化成社製）にて吸着させた後、再
結晶して純度９７％のルプソサイド（試料Ｎｏ．ｌｌ　
を調製した。上述の方法で調製したルプソサイド９ｇ．
蔗糖１９１．５ｇを５０＋ｎＭリン酸緩衝液（ｐ１１６
．５１に溶解し、２８０ｍｌとした後、（１）にて調製
したβ−フラクトフラノシダーゼを２．５００単位添加
し、５０℃にて１６時間反応させた．反応後に酵素を加
熱・失活させた溶液を吸着樹脂に吸着後，８０％メタノ
ールで溶出し、未反応ルプソサイドと転移反応生成物の
混合物（試料Ｎｏ．　２１を分取した。この転移反応生
成物を更に、分取カラムにてクロマト分画し、高純度の
転移反応生成物（試料Ｎｏ．３）を得た６ （３）構造解析 上述の方法で分画・単離した試料Ｎｏ．　３をヨウ化リ
チウム５２．６ルチジン、メタノール試薬を用いて、１
９位のエステル結合を選択的に分解する方法により、β
一・Ｄ−フラクトフラノースがｌ９位のグルコシル基に
転移していることを確認した。

次に’　Ｈ．　＋３Ｃ−ＮＭＲ解析によりβ一Ｄ−フラ
クトフラノースが２位の位置でｌ分子結合していること
を確認し、更にメチル化分析（完全メチル化一酸加水分
解→還元→アセチル化一万ス夕口マトグラフ）から、そ
のβ一Ｄ−フラクトフラノー又はグルコシル基の６位に
結合していることが確認された。

以上の結果から構造式（　ＩＩ＋　）に示すように、ル
プソサイドの１９位のＣＯＯＨにエステル結合するグル
コシル基の６位にβ−Ｄ−フラクトフラノースが２位の
位置で結合したβ−フラクトフラノシルルプソサイドと
構造決定した。

このときの”Ｃ　−　Ｎ　Ｍ　Ｒのチャートを第３図に
示す。

実施例２ （１）転移反応 純度９７％のステビオサイド（試料Ｎｏ．４−丸善化成
社製）９ｇ．蔗糖１５３．２ｇ、実施例ｌの（１）にて
調製したβ−フラクトフラノシダーゼ２．０１３単位と
する他は実施例ｌ　（２）の条件と同じく反応した６こ
の反応液を実施例ｌ　（２）の方法にて精製、分画し、
未反応ステビオサイドと転移生成物の混合物（試料Ｎｏ
．　５）及び高純度の転移生成物（試料Ｎｏ．　６）を
得た。

（２）構造解析 上述の分画、単離した試料Ｎｏ．６を実施例１（３）に
同じく構造解析した結果、構造式（ＩＶ）に示すように
ステビオサイドの１９位のＣＯＯＨにエステル結合する
グルコシル基の６位にβ一Ｄ−フラクトフラノースの２
位の位置で結合したβ−フラク１−フラノシルステビオ
サイドと構造決定した．このときの１３Ｃ　−　Ｎ　Ｍ
　Ｒのチャートを第４図に示す。

（試験例） 実施例ｌ、２にて得られた試料Ｎｏ．２．Ｎｏ．３．Ｎ
ｏ．５．Ｎｏ．６についてアスバルテーム、レバウデイ
オサイドーＡ、ルプソサイド（試料Ｎｏ．ｌｌ．ステビ
オサイド（試料Ｎｏ．４１　を標準品として官能検査を
行なった． （１）甘味度試験 ■供試品の水溶液調製 既に報告されている文献値を基準として各甘味度が概略
蔗糖換算３〜６％に入るように第ｌ表に示す水溶液を調
製した。

第１表　供試品の水溶液濃度 ■蔗糖水溶液 下記の６種の蔗糖水溶液を調製した． ３．５．　４．０．　４．５．　５．０．　５．５．　
６．０ｆ％）■試験方法 蔗糖水溶液を低濃度から順に並べ、供試品水溶液と同等
の甘味を有するものをｌＯ名のパネル員に選ばせた． 試験に基づく甘味度を第２表に示す． 第２表　供試品の甘味度 ［於（財）日本食品分析センター］ 以上のごとく、β−フラクトフラノシルルプソサイドは
標準品に比べてモル比換算で約１．５倍、β−フラクト
フラノシルステビオサイドは標準品に比ベモル比換算で
約１．２倍の甘味度となった。

（２）甘味質試験 （１）の甘味度試験の結果から、各供試品について５％
蔗糖水溶液と同等甘味水溶液を調製し、それらの甘味質
（■苦味、■残味、■まろやかさ）の検査を行なった． まず標準品（試験の都合により味質の悪いルプソサイド
は除外）３点についての苦味、■残味、■まろやかさの
３項目を２０名のパネルを用いて評点法（第３表）で株
点し、次にこの評点を参考とし、供試品（Ｎｏ．２，Ｎ
ｏ．３．Ｎｏ．５，Ｎｏ．６）　４点について１２名の
パネルを用い、同様に採点した。その結果を第４表に示
す。

第３表 ５段階評価の評点尺度 第４表 供試品の甘味質 ［於（財）日本食品分析センター］ 以上のごとく、β−フラクｌ−フラノシルルプソサイド
については味質の改善は不充分であったが、β−フラク
トフラノシルステビオサイドは苦味、残味、まろやかさ
全ての項目について、アスバルテームにやや劣るちのの
、甘味質が非常に良好といわれているレバウディ才サイ
ド−Ａよりかなり良質なものに改善された。

【図面の簡単な説明】

第ｌ図（ａ），（ｂ）は、この発明の原料物質であるル
プソサイド及びステビ才サイドの構造式、第２図（ａ）
．（ｂ）は、この発明に係る物質であるβ−フラクトフ
ラノシルルプソサイド及びβ−フラクトフラノシルステ
ビオサイドの構造式、第３図は試料Ｎｏ．　３の１３Ｃ
−ＮＭＲのチャート、測定条件は機器：　．ＪＥＯＬ　
ＪＵＮ　ＧＸ−４０Ｏｆ１００ＭＨｚｌ　．溶媒：Ｐｙ
ｒｉｄｉｎ−ｄ５．内部標準：　Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙ
ｌｓｉｌａｎ（ＴＭＳＩ　，第４図は試料Ｎｏ．６の”
Ｃ−ＮＭＲのチャート．測定条件は機器：　ＪＥＯＬ　
ＪＭＮ　ＧＸ−４０Ｏ　ｆ１００ＭＨｚｌ　，溶媒：Ｐ
ｙｒｉｄｉｎ−ｄ５，内部標準：丁ｅｔｒａｍｅｔｈｙ
ｌｓｉ　ｌａｎ　（ＴＭＳＩ，である． 第１図（ａ） 第３図 Ｆｒｕｃｔｏｓｙｌｒｕりｗｏｓｌａｅ／ＩＩＣＭ（１
） 第ｌ図（ｂ） 第４図 （ＩＩ）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ルプソサイド又はステビオサイドの１９位のカル
   ボキシル基にエステル結合するβ−グルコシル基の６位
   に、β−Ｄ−フラクトフラノースが２位の位置で結合し
   た構造のステビオール配糖体。
2. （２）ルプソサイド又はステビオサイドとβ−フラクト
   シル糖化合物とを含有する水溶液又は懸濁液に、アルス
   ロバクター・エスピーＫ−１（微工研寄託菌寄第１０７
   ３６号）の生産するβ−フラクトフラノシル転移酵素を
   作用させることを特徴とするステビオール配糖体の製造
   方法。
3. （３）ルプソサイド又はステビオサイドとβ−フラクト
   シル糖化合物とを含有する水溶液又は懸濁液にアルスロ
   バクター・エスピーＫ−１（微工研寄託菌寄第１０７３
   ６号）の生産するβ−フラクトフラノシル転移酵素を作
   用させて得られた甘味料。