JPS6128394A - 部位特定突然変異用オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組換えＤＮＡ技術の一般的分野に関する。

更に詳しくは、本発明はシスティン残基の一つないしそ
れ以上の置換／欠損によって親類像体（ｐａｒｅｎｔ　
ａｎａｌｏｇｓ）とは異なつた突然変異的に改変された
生物学的に活性のある蛋白質に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）組換
えＤＮＡ　（ｒＤＮ＾）技術よって微生物学的につくら
れる生物学的に活性な蛋白質は、システィン残基を含有
しており、それらは活性に本質°的なものではないが、
分子間または分子内の望ましくない結合を自由に形成す
る。このような一つの蛋白質は、微生物学的につくられ
るヒトのベータインターフェロン（ＩＦＮ−β）である
。ｒＤＮＡ技術によってＩＦＮ−βをつくる過程で、高
濃度のＩＦＮ−βを含有する大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１１）
抽出物中にぜ微生物学的につくられるＩＦＮ−βのダイ
マーとオリゴマーが形成されることが見い出された。こ
のマルチマー形成のため、ＩＦＮ−βの精製と分離が非
常な手間と時間のかかるものとなり、精製中に蛋白質を
還元し、次いで元のコンフォメーションに戻すためにこ
れを再酸化するというように、精製単離手順に追加の段
階が幾つか必要になり、それによって不正確なジスルフ
ィド結合形成の可能性が高まる。更に、おそらくはマル
ティマー形成又はランダムな分子内ジスルフィド架橋形
成のため、微生物学的につくられるＩＦＮ−βは一貫し
て低い比活性を示すこともわかった。従って、ＩＦＮ−
βのように微生物学的につくられ生物活性のある蛋白質
を、その活性に悪影響を及ぼさず、しかも蛋白質が望ま
しくない三次構造（例えば蛋白質の活性を低下させるよ
うなコンフォメーション）を有する結果になるような分
子間架橋や分子内結合の形成能力を減少し、又は排除す
る形で改変するのが望ま゛しいであろう。

（問題点を解決するための手段） 本発明は定方向突然変異（ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓ）により、親構造類似体（ｐａｒｅｎｔ
　ａｎａｌｏｇｓ）の活性を保持するが、分子間ジスル
フィド結合や望ましくない分子内ジスルフィド結合の形
成能力を欠いている突然変異的に改変された生物学的活
性蛋白質の製造に関する〔このような蛋白質を「ムティ
ン」（ｍｕｔｅｉｎ）という。「遺伝学・細胞遺伝学用
語辞典」（Ｇｌｏｓｓａｒｙ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉ’ｃ
ｓ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）第４版、３８
１頁、スプリンジャー・バーラグ（１９７６年）〕。

これに関し、エッチ・エム・シェパード（Ｓｈｅｐａｒ
ｄ。

Ｈ，Ｍ、）等（Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１年）２９４巻
５６３〜５６５頁〕はＩＦＮ−βについて、そのアミノ
酸配列の１４１位置のシスティンがチロシンでおき代え
られたムティンを記述している〔ヒトＩＦＮ−βに番ま
１７　、３１及び１４１位置にシスティンがある、。Ｇ
ｅｎｅ　（１９８０年）１０巻１１〜１５頁及びＮａｔ
ｕｒｅ（１９８０年）２８５巻５４２−５４７頁〕。こ
のムティンは、ＩＦＮ−β遺伝子のヌクレオチド４８５
にＧ−４へ転位をもつ部分的ＩＦＮ−βｃＤＮＡクロー
ンから構築された雑種遺伝子の細菌による発現によって
つくられた。このムティンは本来のＩＦＮ−βの生物学
的活性を失っており、著者らは置き換えられたシスティ
ンが活性に本質的であったと結論するに至った。

定方向突然変異（ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ）技法は周知であり、アール・エフ・レイザー（
Ｌａｔｈｅｒ、　Ｒ。

Ｆ、）及びジェイ・ピー・レコソク（Ｌｅｃｏｑ＋　Ｊ
、　Ｐ、）ジェネテインク・エンジニアリング（Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ　Ｅｎ−ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミツク
ブレス社（１９８３年）３１−５０頁、に検討されてい
る。オリゴヌクレオチドに指示された突然変異はエム・
スミス（Ｓｗｉｔｈ、　Ｍ、）及びニス・ギラム（Ｇｉ
ｌｌａｍ、　Ｓ、）、ジェネテインク・エンジニアリン
グ：原理と方法、ブレナムプレス社（１９８１年）３巻
１−３２頁に具体的に検討されている。

本発明の一つの面は、ジスルフィド結合を自由に形成し
、生物学的活性に非本質的であるようにな少なくとも１
個のシスティン残基をもった生物学的に活性な蛋白質の
合成ムティンであって、このムティンがシスティン残基
の少なくとも１個を欠損しているか、或いは別のアミノ
酸でおき代えられていることを特徴とするものに関する
。

本発明のもう一つの面は、上記合成ムティン類をコード
するように特に設計されたＤＮＡ配列をもつ合成構造遺
伝子（「デザイナ−遺伝子」）に関する。この面の下位
局面は、このような構造デザイナ−遺伝子を包含する発
現ベクター類、このようなベクター類で形質転換される
宿主細胞又は生物、及びこのような形質転換生物又はそ
の子孫を培養し、培養基からムティン類を回収すること
によって合成ムティンをつくる方法である。治療上有用
性をもつムティン類の場合、ムティン類の巾療有効量を
含有する治療用組成物は、本発明のもう一つの面である
。

本発明のさらにもう一つの面は、望ましくないジスルフ
ィド結合を自由に形成するような１個ないしそれ以上の
システィン残基を有する蛋白質を、このような望ましく
ないジスルフィド結合を形成することから防ぐ方法であ
って、システィン残基を欠損させるか、これらを他のア
ミノ酸でおき代えることによって蛋白質が突然変異的に
改変されることを特徴とした方法である。

本発明の更に一つの面は、以下の工程を特徴とするオリ
ゴヌクレオチドに指示された突然変異誘発によって上記
の合成構造遺伝子をつくる方法である。

Ｔａ）　　親電白質をコードした構造遺伝子の１本鎖か
らなる単鎖ＤＮＡを突然変異オリゴヌクレオチドプライ
マーとハイブリダイズさせ（このプライマ−は、欠損又
は夜替えずべきシスティン用コドン、又は場合によりこ
のコドンと対合をつくるアンチセンス・トリプレットを
包含する領域に対して相補的なものであるが、当該コド
ンの欠損又は他のアミノ酸をコードするトリプレットを
規定するコドン又はアンチセンス・トリプレットとは不
一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）である。）、 （ｂｌ　　ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長
させ、突然変異性へテロデュプレックス（ｈｅｔｅｒｏ
−ｄｕｐｌｅｘ）を形成させ、そして、 （Ｃ）　　この突然変異性へテロデュプレックスを複製
する。

本方法で用いられる突然変異株オリゴヌクレオチドプラ
イマーは本発明のもう一つの面である。

本発明は、生物学的に活性な蛋白質の生物学的活性に本
質的ではないシスティン残基が、分子間架橋又はまちが
った分子内ジスルフィド結合の形成サイトを排除するた
めに、計画的に欠損又は他のアミノ酸でおき代えられて
いるムティン類、このようなムティン類をコードする突
然変異遺伝子、及びこのようなムティン類をつくる手段
を提供する。

本発明によって突然変異的に改変できる蛋白質は、生物
学的に活性な蛋白質のシスティン含量、及びシスティン
残基が活性と三次構造に関して果たす役割について入手
可能な情報から確認できる。

文献ではこのような情報が入手できない蛋白質について
は、本明細書に記載の手順によって蛋白質のシスティン
残基の各々を系統的に変更し、生ずるムティン類の生物
学的活性及びそれらが望ましくない分子間又は分子内ジ
スルフィド結合を形成する傾向について試験°を行なう
ことによって、この情報は決定できる。従って、本発明
はＩＦＮ−β及びＩＬ−２のムティン類に関して下に特
に説明、例示されているが、望ましくないジスルフィド
結合の形成に対して蛋白質を感受性にするような、機能
的に本質的ではないシスティン残基を含有する生物学的
に活性な任意のその他の蛋白質に以下の教示が当てはま
ることが認められよう。ＩＦＮ−βとＩＬ−２以外に本
発明による突然変異性改変の候補となる蛋白質の例は、
リンフォトキシン（腫瘍壊死因子）とコロニー刺激因子
−１、それにＩＦＮ−α１である。候補蛋白質ｉよ、ふ
つうには奇数のシスティン残基をもっている。

ＩＰＮ−βの場合、グリコジル化ＩＦＮと未グリコジル
化ＩＦＮがいずれも定量的に同様な特異的活性を示すこ
と、従って、グリコジル部分はＩＦＮ−βの生物学的活
性に関与も貢献もしていないことが報告された。しかし
、細菌でつくられるグリコジル化されていないＩＦＮ−
βは、グリコジル化された天然ＩＦＮ−βより量的に低
い比活性を一貫して示す。

ＩＦＮ−βは、１７　、３１及び１４１の位置にシステ
ィン残基をもつことが知られている。システィン１４１
は、シェパードら（前掲）により、生物学的活性に本質
的であることが立証された。４個のシスティン残基を含
有するＩＦＮ−αでは、二つの分子間−５−８−結合が
あり、一つはｃｙｓ２９とｃｙｓ１３ｓの間、他はｃｙ
ｓ　１とｃｙｓ９８の間である。ＩＦＮ−βとＩＦＮ−
ｃｔとの相同性に基づいて、ＩＦＮ−βのｃｙｓｔ４１
はｃｙｓ３１と分子内−５−Ｓ−結合にしており、ｃｙ
ｓ１７は自由に分子間架橋を形成できるであろう。ｃｙ
ｓ１７を欠失させるか、これを別のアミノ酸と置換する
ことによって、ｃｙｓ１７が生物学的活性に本質的であ
るかどうか、また−８−８−結合形成におけるその役割
を決定できる。ｃｙｓ１７が蛋白質の生物学的活性に本
質的でないならば、生ずるｃｙｓ１７を欠損し又はｃｙ
ｓ１７が置換された蛋白質は、自然のＩＦＮ−βのそれ
に近い比活性を示し、またおそら（蛋白質の単離精製を
容易にもするであろう。

ＴＦＮ−β遺伝子のｃｙｓ１７用コドン（ｃｏｄｏｎ）
の領域に対して相補的であるがこのコドン中に１又は複
数の塩基変化を含有する合成オリゴヌクレオチドプライ
マーを用いるオリゴヌクレオチドで指示される突然変異
誘発手順を使用してデザイナ−遺伝子かつ（られ、こう
してｃｙｓｌＴ力、＜その他任意の選択されたアミノ酸
でおき代えられる。欠損を望む場合には、ｃｙｓ１７用
コドンを欠いたオリゴヌクレオチドプライマーを用いる
。ｃｙｓ１７をグリシン、バリン、アラニン、ロイシン
、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチ
ジン、トリプトファン、セリン、スレオニン及びメチオ
ニンのような中性アミノ酸へ変換するのが好ましい方法
である。セリン及びスレオニンは、システィンと化学的
Ｍ偏性を有するため最も好ましい代替え物である。シス
ティンを欠失させる時は、成熟ムティンは自然の親電白
質又は微生物でつくられるＩＦＮ−βよりアミノ酸１個
だけ短い。

ヒトＩＬ−２は、蛋白質の５８　、１０５及び１２５位
にシスティン残基をもつと報告されている。ＩＦＮ−β
の場合のように、Ｉ’Ｌ−２は細菌の菌体から単離され
る時は集合したオリゴマー型になっていて、細菌抽出物
から良好な収量を得るためには、還元剤で還元しなけれ
ばならない。そのうえ、精製され還元されたＩＬ−２は
不安定であり、貯蔵時にオリゴマー不活性型へ容易に再
酸化される。３個のシスティンが存在することは、天然
分子に見られるように正しい架橋は１個だけなのに、再
酸化時に蛋白質が３個の可能な分子内ジスルフィド架橋
の１個を無作為に形成しうろことを意味している。天然
ＩＬ−２蛋白質のジスルフィド構造がいかなるものか知
られていないから、ＩＬ−２遺伝子のコドン５８　、１
０５及び１２５に突然変異をつくり、どのシスティン残
基が活性にとって必要であるか、従ってまた自然のジス
ルフィド架橋形成に関与している可能性が最も大きいか
を確認するために本発明を使用できる。同様に、活性に
とって必要でないシスティン残基を修飾することによっ
てまちがった分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぎ、そ
して遊離システィン残基の除去又は置垂換えによって分
子内間ジスルフィド架橋の機会を最小限に抑えることが
できる。

オリゴヌクレオチドプ、ライマーの大きさは、突然変異
を導入すべき遺伝子領域へのプライマーの安定なハイブ
リッド形成に必要な条件により、また現在利用可能なオ
リゴヌクレオチド合成法の限界によって決まる。オリゴ
ヌクレオチドで指示される突然変異誘発に使用するオリ
ゴヌクレオチドを設計するに当たって、考慮すべき因子
（例えば全体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分
の大きさ）は、エム・スミス及び工冬・ギラム（前掲）
によって記述されている。概して、オリゴヌクレオチド
の全長は、突然変異サイトでの安定でユニークな雑種形
成を最適化するような長さであり、突然変異サイトから
５′及び３′末端までの伸長部分（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ
ｓ）は、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性
による突然変異の作用をさけるのに十分な大きさとする
。本発明に従って突然変異誘発に使用されるオリゴヌク
レオチドは、通常、約１２個ないし約２４個の塩基、好
ましくは約１４個ないし約２０個の塩基、更に好ましく
は約１４個ないし１８個の塩基を含有する。これらは通
常、変更又は欠失されるコドンの少なくとも約３個の塩
基３′を含有する。

変更されたＩＦＮ−β遺伝子をつくる方法は、大体にお
いて、コドン１７を消失させるか、又はそれが別のアミ
ノ酸をコードするように変更する合成ヌクレオチドプラ
イマーを使用して、ＩＦＮ−β遺伝子のコドン１７　（
ＴＧＴ）に部位特異的突然変異を誘発せしめるものであ
る。システィンをスレオニンに変え、プライマーをＩＦ
Ｎ−β遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリッド形成させ
る場合、好ましいヌクレオチドプライマーはＧＣＡＡＴ
ＴＴＴＣ鼾：ＴＣＡＧである（下線は変更されたコドン
を示す）、システィンを欠失させるのが望ましい時は、
好ましいプライマーはＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＧ
ＡＡＧＣＴＣＣＴＧであり、これはｃｙｓに対するＴＧ
Ｔコドンを喪失している。システィンをセリンに代える
時は、セリン用のＡＧＴコドンを含んだ１７−ヌクレオ
チドブライマーＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡＧが
選択される。ｃｙｓ１７で第一塩基Ｔ→Ａの転位により
、システィンからセリンへの変化が起る。欠失を導入す
る時には、所望の蛋白質の発現のためにＤＮＡ配列の適
正なリーディングフレームを保持しなければならない点
を認識しなければならない。

プライマーはＩＦＮ−β遺伝子の１本鎖がクローニング
されたＭ１３　、　ｆｄ　、又はφ×１７４のような１
本鎖ファージへハイブリッド形成される。ファージが遺
伝子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれでも担持でき
ることは認められよう。ファージがアンチセンス鎖を担
持する場合には、プライマーは、コドンの欠損、又は別
のアミノ酸をコードするトリブレンドを規定するこのコ
ドンとは一致しないが、突然変異させるコドンを含有す
るセンス鎖の領域と同一である。ファージがセンス鎖を
担持する場合は、欠失させるコドンと対合するトリプレ
ット中では適当に不一致であるが、突然変異させるコド
ンを含有するセンス鎖の領域に対して相補的である。ハ
イブリッド形成に使用される条件はエム・スミス及びニ
ス・ギラム（前掲）によって記述されている。温度は通
常、約θ℃ないし７０”Ｃ１もっと一般的には約１０℃
ないし５０　”Ｃの範囲にある。ハイブリッド形成後、
プライマーはＤＮＡポリメラーゼ１、Ｔ４ＯＮＡポリメ
ラーゼ、逆転写酵素又は他の適当なりＮＡポリメラーゼ
との反応によってファージＤＮＡ上で伸長される。生ず
るｄｓＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなりＡＮリ
ガーゼでの処理によって閉環状ｄｓＤＮＡへ変換される
。１本鎖領域を含有するＤＮＡ分子はＳ１エンドヌクレ
アーゼ処理によって破壊できる。

オリゴヌクレアーゼで指示される突然変異誘発は、ＩＬ
−２活性をもつがｃｙｓ１２５からセリン１２５へ変更
されたムティンをコードする突然変異ＩＬ−２遺伝子を
つくるにも同様に使用できる。ファージが遺伝子のセン
ス鎖を担持する場合に、この突然変異ＩＬ−２遺伝子を
つくるのに使われる好ましいオリゴヌクＬ／ｌチドプラ
イマーはＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＡＧＧ
ＴＡＡＴＣである。このオリゴヌクレオチドは、ＩＬ−
２遺伝子のコドン１２５と対合するトリプレットのまん
中の塩基にＣ−Ｇの変化を有する。

得られた突然変異性へテロディブレックスは、コンピテ
ント宿主生物又は細胞を形質転換するのに使用される。

宿主によるヘテロデュプレンクスの複製により、双方の
鎖かう子孫鎖ができる。複製に続いて、突然変異鎖の子
孫から突然変異遺伝子を単離し、適当なベクターへ挿入
し、このベクターを適当な宿主生物又は細胞の形質転換
に使用する。好ましいベクター類はプラスミドｐＢＲ３
２２。

ｐｃＲｌ及びそれらの変異体、合成ベクター等である。

適当な宿主生物はＥ、コリ（Ｅ、Ｃｏ１１）、シュード
モーナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、バシルス・ズ
ブチリス（Ｂａ−。

ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス・スリン
ギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓ）、種々の酵母菌株、バシルス・サーモフィルス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ハ
ッカネズミやラット、チャイニーズハムスターの卵巣（
Ｃ）１０）細胞のような動物細胞、植物細胞、動植物宿
主等である。選んだ宿主をベクターで形質転換する場合
に、ムティンが発現されるために適当なプロモータ・オ
ペレーター配列も導入されることは認識されなければな
らない。宿主は原核生物でも真核生物でも良い。（真核
細胞へＤＮＡを挿入する方法は１９８１年９月３日公表
されたＰＣＴ出順番号ＵＳ８１１００２３９及び０３８
１１００２４０に記述されている）。Ｅ、コリとＣＨＯ
細胞が好ましい宿主である。

本発明に従って得られるムティン類は、天然の親電白質
に生ずるグリコジル化およびムティン調製に使われる宿
主生物に依存してグリコジル化される場合もされない場
合もある。所望により、宿主としてＥ、コリ（Ｅ、Ｃｏ
１ｔ）及びバシルス（Ｂａｃｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）を使用す
る場合に得られる未グリコジル化ムティンを、この技術
分野で知られている科学的、酵素的及びその他の変法に
よって生体外で任意にグリコジル化してよい。

ＩＦＮ−βに関する本発明の好ましい態様においては、
第１図に示すように、ＩＦＮ−βのアミノ酸配列におい
て１７位のシスティン残基は、成熟ＩＦＮ−βをコード
するＤＮ＾配列のセンス鎖のコドン１７の第一塩基のＴ
−Ａ転位によって、セリンへ変えられる。この部位特異
的な突然変異誘発は、合成１７−ヌクレオチドプライマ
ーＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡＧを使用して誘発
され、このプライマーはコドン１７の第一塩基に一個の
塩基の不一致がある以外は、コドン１７の領域における
ＩＦＮ−βのセンス核上の１７の個ヌクレオチド配列と
同一である。この不一致はプライマーのヌクレオチド１
２にある。遺伝暗号（コドン）は縮重（ｄｅｇｅｎｅｒ
ａｔｅ）　Ｌ／ており、アミノ酸の多くは一つ以上のコ
ドンによって暗号づけられることが認識されなければな
らない。例えばセリンの塩基暗号は、ＴＣＴ、　ＴＣＧ
、　ＴＣＣ，ＴＣＡ、　ＡＧＴ。

及びＡＣＧというコドンがいずれもセリンをコードする
ように、６通りの縮重である一便宜上、好ましい態様と
してＡＧＴコドンが選ばれた。同様に、スレオニンはＡ
ＣＴ、ＡＣＡ、ＡＣＣ及びＡＣＧのコドンのどの一つに
よってもコードされる。特定アミノ酸に対して１コド／
を特定する時は、これがそのアミノ酸をコードするすべ
ての縮重コドンを包含することが意図されている。１７
−ｍａｒは、ＩＦＮ−β遺伝子のアンチセンス鎖を担持
する１本鎖Ｍ１３ファージＤＮＡにハイブリッド形成さ
れる。次に、ＤＮ＾ポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片
を使用して、オリゴヌ然変異性へテロデュプレックスの
複製によって、不一致を含有するＤＮＡ鎖からクローン
が得られる。

突然変異クローンは、特定の制限位置の存在又は不存在
、抗生物質耐性もしくは感受性、又はこの技術分野にお
いて知られたその他の方法によって確認され、スクリー
ニングされる。システィンをセリンによりおき代える場
合は、第２図に示されるＴ−Ａ転位によって、構造遺伝
子の中に新しいＨｉｎｆＩ制限部位がつくられる。突然
変異クローンは、突然変異したファージプラークのハイ
ブリッド形成スクリーニングにおけるプローブとしてオ
リゴヌクレオチドプライマーを使用して同定される。第
２図に示されるように、つ°ライマーは親とハイブリッ
ド形成される時は唯一の不一致を有するが、突然変異し
たファージＤＮＡにハイブリッド形成される時は完全な
一致を有するであろう。オリゴヌクレオチドプライマー
を親ＤＮＡよりも突然変異ＤＮＡへ優先的にハイブリッ
ド形成させるようなハイブリッド形成の条件を工夫でき
る。新しく発生した旧ｎｆ１部位も、ＩＦＮ−β遺伝子
の単一塩基の突然変異を確認する手段として役立つ。

突然変異した遺伝子を担持するＭ１３ファージＤＮＡを
単離し、プラスミドｐＴｒｐ　３のような適当な発現ベ
クター中へ組み入れ、このベクターで大腸菌ＭＭ２９４
株を形質転換させる。形質転換体とその子孫を培養する
のに適した生育培地が当業者に知られている。ＩＦＮ−
βの発現されたムティンを単離精製し、特徴づける。

以下の実施例は本発明の一層の理解を助けるため、また
例示だけの目的で提示されている。これらはいかなる形
においても本発明の範囲を限定するものと考えられては
ならない。実施例１〜９はＩＦＮ−βツムティンの調製
を記述している。実施例１０〜１５はＩＬ−２のムティ
ンの調製を記述している。

ｕ　　ＩＦＮ−β遺云　のＭ１３ベクターへのクローニ
ング １本鎖ＤＮＡ鋳型の給源としてＭ１３ファージベクター
を使用することは、ジー・エフ・テンプル（Ｇ、　Ｆ、
　Ｔｅｍｐｌｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８２年）２９
６巻５３７−５４０頁で実証された。大腸菌ｔｒｐプロ
モーターの制御下にＩＦＮ−β遺伝子を含有するプラス
ミドｐβ１ｔｒｐ　（第３図）を制限酵素旧ｎｄｌ［［
及びＸｈｏ　ＩＩで消化した。Ｍ　１３ｍｐ　８　（ジ
ェイ・メッシング（Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、　ｒ巨大分子に関する第３回クリ
ーブランド・シンポジウム：組換えＤＮ、Ａ　Ｊエイ・
ウオールトン編、エルザビアプレス社、１４３−１５３
頁（１９８１年）〕複製型（ＲＦ）　ＤＮＡ　（第４図
）を制限酵素旧ｎｄｎ［及びＢａｍＨＩで消化し、予め
旧ｎｄｌ［ｌ及びＸｈｏ　ｎで消化しておいたｐβ１　
ｔｒｐＤＮ＾と混合した。

次に混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、連結ＤＮＡ
を大腸菌−ＪＭ１０３株のコンピテント細胞中へ形質転
換させ、Ｘｇａｌインディケータ−プレート上に播いた
〔ジェイ・メッシング等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅ５（１９８１年）９巻３０９−３２１頁〕。組換
えファージを含有するプラーク　（白いプラーク）を取
り上げ、新鮮なＪＭ１０３の培養物に接種し、そして感
染細胞からＲＦ分子のミニプレツブを調整した（エッチ
・ディー・バーンボイム（ＨｏＤ、　Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
）及びジェイ・ドリイ、　（Ｊ、　Ｄｏｌｙ）、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５（１９’７９年）７巻１５
１３−１５２３頁）。ＩＦＮ−β挿入部を含有するクロ
ーンを同定するために、ＲＦ分子を種々の制限酵素で消
化した。このような１クローン（Ｎ１３−β１）の制限
地図を第５図に示す。Ｍ１３−β１クローンから１本鎖
（ｓｓ）ファージＤＮＡをつくり、合成オリゴヌクレオ
チドを使用する部位特異的突然変異誘発の鋳型として用
いた。

遺」虻例」ユ　部位　異的　然・　誘 ０．１ｍＭアデノシン三燐酸（ＡＴＰ）　、５０　ｍＭ
ヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（トリス−塩酸）
ｐＨ８，０，１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオ
スレイトール（ＤＤＴ）及びＴ４キナーゼ９単位の存在
下に、５０＃ｊｔ中で合成オリゴヌクレオチドＧＣＡＡ
ＴＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡＧ　（プライマー）４０ピコ
モルをＴ４キナーゼにより３７℃で１時間処理した。５
０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ）リス−塩Ｍ、ｐ　Ｈ
８，０，１０ｍＭ塩化マグネシウム及び１０ｍＭβ−メ
ルカプトエタノールを含有する混合物５０μβ中で、こ
のキナーゼ処理されたプライマー（１２ピコモル）を６
７℃で５分、及ヒ４２℃で２５分加熱することによって
１本１（（ｓｓ）　Ｍ２Ｓ−βＩ　ＤＮＡ５μｇにハイ
ブリット形成させた′。アニーリングした混合物を次に
氷上で冷却し、０．５ｍＭ各デオキシヌクレオチド三ｍ
Ｍ　（ｄＮＴｐ）、８０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ７，４
，８ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム
、ＤＮＡポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片９単位、０
．５　ｍＭＡＴＰ及びＴ４１）ＮＡソリガーゼ単位を含
有する反応混合物５０μβに添加し、３７℃で３時間及
び２５°Ｃで２時間インキュベートした。次にフェノー
ル抽出とエタノール沈澱によって反応を停止させた。Ｄ
ＮＡを１０ｍＭトリス−塩酸、ｐ　Ｈ８，０，１０ｍＭ
エチレン）アミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、５０％蔗糖及び
０．０５％ブロモフェニルブルー中に溶解し、臭化エチ
ジウム２μｇ　／　ｍ　Ｉｔの存在下、０．８％アガロ
ースゲル上の電気泳動にかけた。Ｍ］、３−β１のＲＦ
型に対応するＤＮＡバンドをパーコレート法〔アール・
ダブリュー・デービス（Ｒ，Ｈ，Ｄａｖｉｓ）　　３、
［高等細菌遺伝学Ｊ　（Ａｃｌｖａｎｃｅｄ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、コールド・スプリ
ング・ハーバ−研究所、Ｎ、Ｙ、　１７８〜１７９頁（
１９８０年））によってゲルスライスから溶離した。溶
離されたＤＮＡをコンピテントＪＭ１０３細胞の形質転
換に使用し、菌を一夜生育させ、培養基上澄液から５ｓ
ＩＩＮＡを単離した。この５ｓＤＮＡをプライマー伸張
の第二サイクルに鋳型として使用し、ゲル精製されたＲ
Ｆ型ＤＮＡをコンピテントＪＭ１０３細胞中へ形質転換
させ、寒天プレート上に播き、−夜培養するとファージ
プラークが得られる。

実施例３１部立特　的　１．・　読 上の実施例２の実験をくり返す。但し、合成オリゴヌク
レオチドプライマーとして、システィンをコードするも
のからスレオニンをコードするものへＩＦＮ−β遺伝子
のコドン１７を変えるのにＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＡＣ
ＴＣＡＧを使用する。

去施炭玉　亜槍豊且臨久徂 上の実施例２の実験をくり返す。但し合成オリゴヌクレ
オチドプライマーとしてはＩＦＮ−β遺伝子のコドン１
７を欠損させるのにＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＧ＾
＾ＧＣＴＣＣＴＧを使用する。

突然変異させたＭ２Ｓ−β１プラークの入ったプレート
（実施例１）並びに突然変異しないＭ２Ｓ−β１ファー
ジプラークの入った２枚のプレートを４℃に冷却し、各
プレートからのプラークを２枚のニトロセルロース円形
フィルター上へ、第一フィルターの場合には乾燥フィル
ターを寒天プレート上へ５分間重ね、第二フィルターの
場合は１５分間重ねて移した。次に０．２　ＮＮａＯＨ
、１，５Ｍ塩化ナトリウム及び０．２％トリトンＸ−１
００に浸した厚手の濾紙上へフィルター類を５分間置き
、次に０、．５’Ｍ）リス−塩酸、ｐ　Ｈ７，５、及び
１．５Ｍ塩化ナトリウムに浸した濾紙上へ更に５分間重
ねて中和した。フィルターを同様なやり方で、２ＸＳＳ
Ｃ（標準くえん酸塩）に浸したフィルター上で２回洗い
、乾燥し、真空乾燥炉内で８０℃で２時間乾燥させた。

重複フィルターをフィルター当たり１０ｍ１のＤＮＡハ
イブリッド形成緩衝液（５Ｘ　５ＳＣ）　、　ｐＨ７，
０，４Ｘデンハード液（ポリビニルピロリドン。

フィコール及び生血清アルブミン、１×＝各０．０２％
）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、　５
０ｍＭ＠酸ナトジナトリウム緩衝液　７．０及び１００
μｇ　／　ｍ　ｊ！の変性サケ精子ＤＮＡにより、５５
℃で４時間、事前ハイブリッド形成させた。オリゴヌク
レオチドプライマーを３２Ｐで標識したＡＴＰでキナー
ゼ下に処理することによって３ｔｐで標識したプローブ
をつくった。フィルター当たり５　ｍ　ｊ＋のＤＮＡバ
イブリド形成緩衝液中でフィルターを３２ｐで標識した
プライマー３．５　Ｘ　１０　’ｃｐｍ／ｍ　ｊ！に５
５℃で２４時間ハイブリッド形成させた。０．１％ＳＤ
Ｓと減少する量のＳＳＣを含有する洗浄用緩衝液中でそ
れぞれ３０分、５５℃でフィルター類を洗った。フィル
ター類を、初めに２ＸＳＳＣを含んだ緩衝液で洗い、そ
して突然変異していないＭ２Ｓ−β１プラークを含有す
る対照フィルターはガイガー計数管を用いて放射能の存
在について検査した。

ＳＳＣ濃度を段階的に低下させ、未突然変異Ｍ１３−β
１プラークをもつ対照フィルター上に検出可能な放射能
が残らなくなるまでフィルターを洗った。

ＳＳＣの使用最低濃度は０．ｌＸ５ＳＣであった。フィ
ルターを空気乾燥し、−７０℃で２〜３日オートラジオ
グラフ処理した。突然変異したＭ２Ｓ−β１のプラーク
４８０個と突然変異していない対照プラーク１００個を
キナーゼ処理したオリゴヌクレオチドプローブによって
スクリーニングした。対照プラー、りではプローブとハ
イブリッド形成したものが全く存在せず、一方突然変異
したＭ２Ｓ−β１プラーク５個がプローブとハイブリッ
ドを形成した。

５個の突然変異Ｍ１３−β１プラークの１個（Ｍ２Ｓ−
５Ｙ２５０１）を取り上げ、ＪＭ１０３培養基へ接種し
た。

上澄液から５ｓＤＮＡを調製し、そして細胞ペレットか
ら２本鎖（ｄｓ）　ＤＮＡを調製した。Ｍ１３ユニバー
サルプライマーを使用して、クローンのジデオキシ配列
決定用の鋳型として５ｓＤＮＡを使用した。配列決定分
析の結果を第６図に示す。この結果は、ＴＧＴｃｙｓコ
ドンがＡＧＴｓｅｒコドンへ変換されたことを確証して
いる。。

大施班見　　　　における７然１！ｕ−βのＭ　１３−
５Ｙ２５０１からのＲＦ　ＤＮＡを制限酵素旧ｎｄＩＩ
Ｉ及びＸｈｏ　ｎで消化し、５２ｏｂｐの挿入断片を１
％アガロースゲル上で精製した。大腸菌ｔｒｐプロモー
ターを含有するプラスミドｐＴｒｐ３　（第７図）を酵
素ＨｉｎｄＩ［［及びＢａｍＨＩで消化し、精製したＭ
ｔａ−ｓｙ２ｓｏｉ断片と混合し、Ｔ４ＤＮ＾リガーゼ
の存在下に連結した。連結ＤＮＡ　ｔ−Ｅ、コリＭＭ２
９４株へ形質転換した。

アンピシリン耐性形質転換体を薬剤テトラサイクリンに
対する感受性の点からスクリーニングした。

アンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性の５クロー
ンからのプラスミドＤＮＡを、Ｍ　１３−５Ｙ２５０１
挿入部の存在についてスクリーニングするためＨｉｎｆ
　Ｉで消化した。第８ａ図は、クローンの一つ（ｐｓＹ
２５０１）の旧ｎｆｌ制限パターンを示すが、図ではこ
れを元のＩＦＮ−βクローンすなわちｐβ１ｔｒｐのＨ
ｉｎｆ　Ｉパターンを比較している。予想のように、ｐ
ｓＹ２５０１に追加の旧ｎｆＩサイトがあり、１９７ｂ
ｐのＴＦＮ−β内部断片が１６９ｂｐの断片と２８ｂｐ
の断片に切れている（第８ｂ図）。クローンｐｓＹ２５
０１の制限地図を第９図に示す。突然変異ＩＦＮ−β遺
伝子の完全なりＮＡ配列を、予測されたアミノ酸配列と
一緒に第１０図に示す。クローンｐｓＹ２５０１　と称
するプラスミドは６０６０４イリノイ州ペオリア、ノー
ス・ユニバーシティ・ストリート１８１５番地、米国農
務省、科学教育局北部研究センター、発酵研究所のアグ
リカルチエラル・リサーチ・カルチャーコレクション（
ＮＲＲＬ）に寄託されている。指定された寄託番号はＣ
ＭＣＧ１５３３号及びＮＲＲＬＢ−１５３５６号である
。

ｐｓＹ２５０１及びｐβ１ｔｒｐ（子孫を含む）の培養
物を１．０の光学密度（ＯＤ６゜。）まで生育させた。

無細胞抽出物をつくり、ＩＦＮ−βの抗ウイルス活性量
を微量力価検定法でＧＭ２７６７細胞によって検定した
。

クローンｐｓＹ２５０１の抽出物はｐβ１．ｔｒｐより
３〜１０倍高い活性を示しく第１表）、クローンｐｓＹ
２５０１がＩＦＮ−β活性を示す蛋白質をより多量に合
成しているか、又はつくられた蛋白質がより高い比活性
をもっているかのいずれかであることが示される。

里−１−人 ？−ウィルスゞ性（卓立／＋ａｌ ｐｓＹ２５０１　　　　　　　６ｘｌ　Ｏ’ｐβ１ｔｒ
ｐ　　　　　　　　　ｌＸｌ０’ｐｔｒｐ３　（対照）
　　　　　　　　３０クローンｐｓＹ２５０１が数倍多
い活性蛋白を合成していたかどうか決定するため、両ク
ローンの抽出物を対照抽出物と共にＳＯＳポリアクリル
アミドゲル上の電気泳動にかけ、ゲルをクーマーシーブ
ルーで染色して蛋白質を発色させた。第１１図に示すよ
うに、クローンｐｓＹ２５０１とｐβ１　ｔｒｐの抽出
物中に存在するが対照のｐｔｒｐ３抽出物中にはない約
１８、０００ダルトンの蛋白質に対応する蛋白質バンド
が一つだけあった。この蛋白質は約２０，０００ダルト
ンの分子量をもつが、１８，０００ダルトンの蛋白質の
ゲル移動パターンを示しており、ｐβ１　ｔｒｐの抽出
物からこの蛋白質を精製することによってＩＦＮ−βで
あることが予めわかっていた。ｐｓＹ２５０１抽出物中
にはｐβ１ｔｒｐの抽出物中よりこの蛋白質の量が少な
いから、クローンｐｓＹ２５０１抽出物中の蛋白質の比
活性はクローンｐβ１　ｔｒｐのそれより高い。

大旅±１１ＦＭ−β５ｅｒ１７の　１ １ＦＮ−β５ｅｒ１７をつくるように形質転換されたＥ
。

コリからＩＦＮ−β５ｅｒ１７を回収した。Ｅ、コリを
次の生育培地中で、６８０ｎｍで１０〜１１の光学密度
（乾燥重量８．４ｇム０まで生育させた。

分　　　　　　　　　　−」［−−Ｊし一塩化アンモニ
ウム　　　　　　　　　　　２０ｍＭ硫酸カリウム　　
　　　　　　　　　　１６．１ｍＭ燐酸−カリウム　　
　　　　　　　　　７．８ｍＭ燐酸二ナトリウム　　　
　　　　　　１２．２ｍＭ硫酸マグネシウム・七水和物
　　　　　　３ｍＭクエン酸三ナトリウム・二水和物　
　　１．５ｍＭ硫酸マンガン・四水和物　　　　　　　
３０βＭ硫酸亜鉛・七水和物　　　　　　　　　３０β
Ｍ硫酸銅・五水和物　　　　　　　　　　　３βＭＬ−
トリプトファン　　　　　　　　７０■／β硫酸第−鉄
・七水和物　　　　　　　　７２βＭチアミン塩酸塩　
　　　　　　　　　２０■／ｌグルコース　　　　　　
　　　　　　　４０ｇ／ｊ！アンモニアでｐＨ調整 形質転換ずみＥ、コリの収穫物９．９１　（９，９ｋｇ
）を２０℃に冷却し、濾液重量が８．８　ｋｇになるま
で、収穫物を一１１Ｑｋｐ’ａの平均圧力損失と毎分２
６０ｍ　ｊ！の定常濾液流量でクロスフローフィルター
に通すことにより濃縮した。濃縮液（約１／）を容器に
流し込み、１５℃に冷却した。濃縮液を５℃、約６９、
０ＯＯｋｐａでマントン−ゴーリンホモジナイザーに通
すことによって濃縮液中の菌体を破砕した。

燐酸塩で緩衝化された食塩水、ｐ　Ｈ７，４（ＰＢＳ）
　１１でホモジナイザーを洗い、洗浄液を破砕物に加え
ると、２βの最終容量が得られた。この容量を毎分５０
ｍｊ２の流量で１２０００ｘｇの連続遠心分離にかけた
。固体を上澄液から分離し、２重量％ＳＤＳを含有する
ＰＢＳ　４βに再懸濁させた。この懸濁液を室温で１５
分かきまぜたあと、目に見える懸濁物はなかった。次に
溶液を２−ブタノールで、２−ブタノール：溶液の１：
１容量比で抽出した。

液−液相分離装置中で毎分２００＋ｗ　ｊ！の流量を用
いて抽出を行なった。次に有機相を分離し、そして蒸発
乾固させることにより蛋白質２１．３　ｇを得た。これ
を蒸留水に１７１０の容量比で再懸濁した。

回収された生成物は、ウィルスの細胞病理作用（ＣＰＥ
）に対する防護に基づく検定を用いて、ヒトＩＦＮ−β
活性について検定された。ミクロタイタープレート内で
この検定を行なった。最少基本借地５０μβを各容器に
仕込み、第一容器には資料２５μ！を入れ、つぎ容器以
降には１：３の容量の希釈を連続的に行なった。ウィル
ス（水泡性口内炎）。

細胞（ヒト線維芽細胞ＧＭ　−２７６７系統）及び標準
ＩＦＮ−β対照群を各プレートに収容せしめた。ｍβ当
たり１００単位の標準ＩＦＮ−βを使用した。次にプレ
ートに紫外線を１０分間照射した。照射後、細胞懸濁液
（ｍＡ’当たり細胞１．２Ｘ１０’）　１００μβを各
容器に加え、トレーを１８〜２４時間インキュベートし
た。細胞当たり１プラ一ク形成単位でウィルス液を細胞
対照プレートを除く各容器に加えた。

ウィルス対照が１００％のＣＰＥを示すまでトレーをイ
ンキュベートした。これは、ウィルス液を加えてから通
常１８〜２４時間で生じた。標準ＩＦＮ−β対照の５０
％ＣＰＥ容器の位置の点から検定結果を解釈した。この
点からプレート上の全試料についてのインターフェロン
の力価を測定した。回収された生成物の比活性は５ｘｉ
ｏ’　Ｕ／ｍｌと決定された。

ス」１例」ユ　　沈゛　びクロマトグラフィによる精製 実施例７の方法をくり返したが、但し、抽出。

水相と有機相の分離、及び有機相とＰＢＳとの容量比３
：１での混合の後、氷酢酸の添加によって混合物のｐＨ
を約５に下げた。生じた沈澱物を１００００〜１７００
０ｘｇ、　１５分間の遠心分離によって分離し、ペレッ
トを１０％−／Ｖ　ＳＤＳ、　１０ｍＭ　ＤＴＴ、　　
５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，５に再溶解し
、８０℃に５分間加熱した。

次に、溶液を、ベックマン勾配系を使用して、ブラウン
リーＲＰ−３００，１０βＭ、ｒアクアポア」カラムに
かけた。緩衝液Ａは水中０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）であり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中０．１％Ｔ
ＦＡとした。検出は２８０ｎｍでの紫外線吸光度によっ
た。溶媒プログラムは３時間でθ％緩衝液Ｂから１００
％緩衝液Ｂへの線形勾配とした。

最高のインターフェロン活性を含有するフラクションを
プールし、このプールされたインターフェロン調製物の
比活性は、天然のＩＦＮ−βにおける蛋白質ｍｇ当たり
約２Ｘ１０８国際単位に比べ、９．０×１０フないし３
．８　Ｘ　１０’　Ｕ／ｍＡと決定された。

゛尖施貫班　ＩＦＮ−β５ｅｒ１７の生化学的　徴付け
５、７Ｎ　Ｈ（／！、　　０．１％フェノールの２００
μβ中において試料４０μｇを１０８℃で２４〜７２時
間の加水分解にかけた後、アミノ酸組成を決定した。プ
ロリンとシスティンは、過蟻酸酸化後、同じやり方で決
定された。この場合、フェノールを加水分解から省略し
た。トリプトファンは、５．７Ｎ塩酸。

１０％メルカプト酢酸（フェノールなし）中で試料４０
０μｌを２４時間加水分解した後に分析した。

分析は、ＡＡＩＯ樹脂の単一カラムを使用するベックマ
ン１２１ＭＢアミノ酸分析装置で行なった。精製ＩＦＮ
−β５ｅｒ１７の代表的な２４−、４Ｂ−、？２一時間
の酸加水分解から計算されるアミノ酸組成は、Ｎ−末端
メチオニンが欠けているほかは、クローンＩＦＮ遺伝子
のＤＮＡ配列によって予測されるものとよく一致してい
る。精製ＩＦＮのアミノ酸末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）か
らの最初の５８残基のアミノ酸配列は、試料０．７ｍｇ
から、ベックマン８９０Ｃ配列測定装置で０．１Ｍクア
ドロール緩衝液を使って決定された。ＰＴＨアミノ酸は
、アルテックスウルトラスフェア−０ＤＳカラム（４，
６Ｘ　２５０ｍｍ）による逆相高圧液体クロマトグラフ
ィ（ＨＰＬＣ）に４５℃でかけ、４０％緩衝液Ｂで１．
３分、４０〜７０％緩衝液Ｂで８．４分溶出することに
より決定された。ここで緩衝液Ａは０．０１１５Ｍ酢酸
ナトリウム、５％テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）　。

ｐ　Ｈ５，１１であり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中１
０％Ｔｌ（Ｆであった。

決定されたＩＦＮ−β５ｅｒ１７のＮ末端アミノ酸配列
は、Ｎ−末端メチオニンの不在を除き、ＤＮＡ配列から
予測される予測配列に一致している。

上に示したように、ＩＦＮ−β５ｅｒ１．７１１製物は
天然のＩＦＮ−βの比活性レベルに非常に近いか、それ
よりすぐれた活性を示す。ＩＦＮ−β５ｅｒ１７は遊離
スルフヒドリル基をもたないが、３１及び１４１位にだ
け残っているシスティン間に１個の−８−８−結合を示
す。蛋白質は容易にオリゴマーをつくらず、実質的にモ
ノマー型にあると考えられる。本発明に従って得られる
ＩＦＮ−β５ｅｒ１７は単一生成物として又は種々の型
の混合物として不活性、無毒性。

非アレルギー性で、生理的に許容される担体媒体中にお
ける医薬として受は入れられる製剤へ処方でき、がん療
法で、又はインターフェロン療法が指示される症状にお
ける臨床用、治療用に、またウィルス感染用に使用でき
る。このような媒体は蒸留水、生理食塩水、リンゲル液
、バンク液等をを包含するが、これらに限定はされない
。デキストロース、　　ＩＳＡ　（ヒト血清アルブミン
）等のような他の無毒性の安定化・可溶化用の添加物も
最適に包含してよい。治療処方剤は、経口で、又は静脈
内、筋肉内、腹腔内及び皮下投与のような非経口で投与
できる。本発明の変形ＩＦＮ−β製剤は、局所用に通常
利用される適当な媒体中で局所適用のためにも使用でき
る。

上記のＩＦＮ−βムティンの主な利点は、’ＩＦＮ−β
の１７位の遊離スルフヒドリル基（−５Ｈ基）を排除さ
れているところにあり、これによってムティンにｃｙｓ
３１とｃｙｓ１４１の間に正しいジスルフィド結合を形
成させ、十分な生物学的活性に明白に必要なコンフォメ
ーションを取らせている。ＩＦＮ−β５ｅｒ１７の増大
した比活性のため、治療用により少ない投与量が使える
。１７位置のシステイシを欠失させ、遊離−３Ｈ基を排
除することによって、ＩＦＮ−β５ｅｒ１７蛋白質は微
生物でつくられるＩＦＮ−βはどたやすくダイマーやオ
リゴマーを形成しない。これが蛋白質の精製を容易にし
、その安定性を強める。

塞施炭土ｌ ヒトＩＬ−２をコードするｃＤＮＡクローンのヌクレオ
チド配列、ＩＬ−２ｃＤＮＡライブラリーをつくる手順
、これをＩＬ−２についてスクリーニングする手順はテ
ィー・タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、Ｔ、）、　Ｎａ
ｔｕｒｅ　（１９８３年）２４巻３０５頁以降に記述さ
れている。

有力なＩＬ−２ｃＤＮＡクローンに関して濃縮されたｃ
ＤＮＡライブラリーは、慣用手順により、誘導された末
梢血液リンパ球（ＰＢＬ）とジャーカット細胞から得ら
れる濃縮されたＩＬ−２ｍＲＮＡフラクションからつく
られた。ＩＬ−２回ｍＲＮＡの濃縮は、ｍＲＮＡを分画
し、フラクションをキセノ、ブス°ラエビス（Ｘｅｎｏ
ｐｕｓｌａｅｖｉｓ）の未成熟卵母細胞に注入し、卵母
細胞の溶解物のＩＬ−２活性をＨＴ−２細胞で検定し、
ＩＬ−２ｍＲＮＡ活性をもつフラクションを確認するこ
とによって行った〔ジェイ・ワトソンＵ、Ｗａｔｓｏｎ
）、　Ｊ、　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、ｔ　（１９７９年）１５０巻１５７０−１５１
９頁及びニス・ギリス（Ｓ、　Ｇ１１ｌｉｓ）等、Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎ、（１９７８年）１２０巻２０２７〜２０
３２頁〕。

ス１」１」ユ　ＴＬ−２ｃＤＮＡクローンのスクリーニ
ングと同定 コロニーハイブリッド形成法を用いて、ＩＬ−２ｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングした。各ミクロタイタ
ープレートを重層したニトロセルロース濾紙（Ｓ＆Ｓタ
イプＢＡ　−８５）上にレプリカ法で写取り、アンピシ
リン５０μｇ／ｍβを含有するし寒天上で３７℃、１４
〜１６時間生育させた。コロニーを溶解し、５００ｍＭ
水酸化ナトリウム、１．５Ｍ塩化ナトリウムで５分の連
続処理することによってＤＮＡをフィルターに固定し、
５×標準クエン酸塩溶液（ＳＳＣ）で５分ずつ２回洗っ
た。フィルターを空気乾燥し、８０℃で２時間炉乾燥し
た。重層フィルターをフィルター当たり１０ｍｎ、のＤ
ＮＡハイブリッド形成緩衝液（５０％ホルムアミド、５
×ＳＳＣ、ｐＨ７，０、５ｘデンハード液（ポリビニル
ピロリジン、フィコール及び牛血清アルブミン；１×−
各０．２％）、ｐＨ７，０の５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩
衝液、０．２％ＳＯ３，２０，１７８×ｍｊ２ポリＵ及
び５０℃ｇ／ｍβの変形サケ精子ＤＮＡにより、４２℃
で６〜８時間事前ハイブリッド形成させた。

タニグチ（前掲）に報告されたＩＬ−２遺伝子配列に基
づいて３ｔｐで標識された２０−ｍａｒオリゴヌクレオ
チドプローブをつくった。プローブのヌクレ、ｌ−チｌ
’　配？ｌ　＆ヨＧＴＧＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＣＡＴ
ＧＴＡテア−）　タ。

”　Ｐ　ｃＤＮＡプローブを含有するフィルター当たり
５　ｍ　１２のＤＮＡハイブリッド形成緩衝液で、試料
を４２℃で２４〜３６時間ハイブリッド形成させた。フ
ィルターを２　Ｘ５ＳＣ、０，１％ＳＤＳ、で３ｏ分間
ずつ２回５０℃で洗い、次ニＩ　Ｘ５ＳＣと０．１　％
ＳＤＳ　”？’９０分ずつ２回５０℃で洗い、空気乾燥
し、−７０℃で２〜３日間オートラジオグラフにがけた
。陽性のクローンを同定し、プローブで再度スクリーニ
ングした。十分な長さのクローンが、制限酵素地図作成
、及びタニグチら（前掲）が報告したＩＬ−２ｃＤＮＡ
クローンの配列との比較から確認された。

大施璽土ｌ　ＭＩ３ベクタ・−へのＩｔ、−２遺伝子の
クローニング 大腸菌ｔｒｐプロモーターの制御下にＩＬ−２遺伝子を
含有するプラスミドｐｌＪ１　（第１２図）を使用して
、実施例１に記載のと同様にＩＬ−２遺伝子をＭ１３ｍ
ｐ９へクローニングした。ｐＬＷ　ｌの試料は１９８３
年８月４日、２０８５２合衆国メジーランド州ロックビ
ル。

バークローン・ドライブ１２３０１番地、アメリカタイ
プ・カルチャー・フラクションに預託され、ＡＴＣＣ３
９，，４０５号と指定を受けた。ＩＬ−２挿入部を含有
する１クローン（Ｍ１３−　ＩＬ−２と称する）の制限
地図を第１３図に示す。１本鎖ファージＤＮＡをクロー
ンＭ１３−■Ｌ〜２からっ（す、オリゴヌクオチドで指
示される突然変異誘発用の鋳型として使用した。

前記のとおり、■シー２はアミノ酸位置５８．１０５及
び１２５にシスティン残基を含んでいる。ＩＬ−２遺伝
子中でこれらの３個のシスティン残基用コドンを含有す
る部分のヌクレオチド配列に基づいて、三つのオリゴヌ
クレオチドプライマーを設計し、これ　　　゛らの残基
用コドンをセリン用コドンへ突然変異せしめるために合
成した。これらのオリゴヌクレオチドは次の配列をもっ
ている。

ｃｙｓ　５Ｂを変える　ＣＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＣ
ＡＧＡＴＧＴＴＴＣ（０Ｍ２７） ｃｙｓ１０５を変える　ＣＡＴＣＡＧＣＡＴＡＣＴＣＡ
ＧＡＣＡＴＧＡＡＴＧ（０Ｍ２８） ｃｙｓ１２５を変える　ＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＴＧＡＧ
ＡＡＡＡＧＧＴＡＡＴＣ（Ｄ）１２９） ０、１　ｍ　Ｍ　ＡＴＤ　、　５０ｍ　Ｍ　）リス−塩
酸、ｐＨ８，０゜１０ｍＭ塩化マグネシウム、　　５ｍ
Ｍ　ＤＴＴ及びＴ４キナーゼ９単位の存在下に、５０μ
β中で各オリゴヌクレオチド４０ピコモルを別々に３７
℃で１時間キナーゼ処理した。キナーゼ処理されたプラ
イマー（１０ピコモル）の各々を、１００ｍＭ塩化ナト
リウム、２０ｍＭ）リス−塩酸、　ｐＨ１，９，２０ｍ
Ｍ塩化マグネシウム及び２０ｍＭβ−メルカプトエタノ
ールを含有す゛る混合物１５μイ中で、６７℃で５分及
び４２℃で２５分加熱することによって５５Ｍ１３−Ｉ
Ｌ−２ＤＮＡ　２．６μｇへハイブリッド形成した。

アニーリングされた混合物を氷上で冷却し、次に０．５
ｍＭ各ｄＮＴＰ　、　１７ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ７
，９）。

１７ｍＭ塩化マグネシウム、８３ｍＭ塩化ナトリウム。

１７ｍＭβ−メルカプトエタノール、［ｌＮＡポリメラ
ーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片５単位、　０．５　ｍＭＡＴ
Ｐ　、及びＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位を含有する反応混
合物２５μｌの最終容量まで調製し、３７℃で５時間イ
ンキエベートした。８０℃に加熱して反応を停止させ、
反応混合物をコンビテン）　ＪＭ１０３細胞の形質転換
に使用し、寒天プレート上に播いて一夜培養すると、フ
ァージプラークが得られた。

突然変異誘発されたＭ　１３−　ＩＬ−２プラークを含
んだプレートと、突然変異誘発され゛ないＭ１３−＝Ｉ
Ｌ−２ファージプラークを含んだプレート２枚とを４℃
に冷却し、各プレートからのファージプラークを２枚の
ニトロセルロース円形フィルター上へ、第一フィルター
の場合には乾燥フィルターを寒天プレート上へ５分間重
ね、第二フィルターの場合には１５分間重ねて移した。

次に０．２Ｎ水酸化ナトリウム、Ｉ５Ｍ塩化ナトリウム
及び０．２％トリトンに浸した厚手の濾紙上にフィルタ
ーを５分間置き、次に０．５　Ｍ　）リス−）ｉＣＪ　
（ｐｉ（７，５）　と１．５　ＭＮａＣＲに浸した濾紙
上へさらに５分間重ねて中和した。

フィルターを同様なやり方で、２ＸＳＳＣに浸したフィ
ルター上で２回洗い、乾燥してから真空乾燥炉内で８０
℃で２時間乾燥した。重層フィルターをフィルター当た
り１０ｍＡのＤＮＡハイブリッド形成緩衝液（５ｘＳＳ
Ｃ）、ｐＨ７，０，４ｘデンハード液（ポリビニルピロ
リジン、フィコール及び牛血清アルブミン、１×＝各０
．０２％）　、　’０．１％ＳＤＳ１５０ｍＭ燐酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ７，０）及び１００μｇ／ｍｊ！変
性サケ精子ＤＮＡにより、４２℃で４時間事前ハイブリ
ッド形成させた。標識をつけたＡＴＰでオリゴヌクレオ
チドプライマーをキナーゼ処理することによって、３１
ｐで標識をつけたプローブをつくった。フィルター当た
り５ｍｌのＤＮＡハイブリッド形成緩衝液中で４２℃で
８時間、３Ｚｐで゛　　標識したプライマー〇、Ｉ　Ｘ
　１０Ｓｃｐｔｔｒ／ｍｌｌにフィルターをハイブリッ
ド形成させた。０．１％ＳＤＳ及び２ＸＳＳＣを含有す
る洗浄緩衝液中で５０℃でそれぞれ３０分ずつ２回、次
に０．１％ＳＤＳ及び０．２ｘｓｓｃで５０℃でそれぞ
れ３０分ずつ２回フィルターを洗った。フィルターを空
気乾燥し、−７０℃で２〜３日オートラジオグラフィに
かけた。

オリゴヌクレオチドプライマー〇Ｍ２８及び０Ｍ２９は
、突然変異誘発されたクローンに新しいＤｄｅ　Ｉ制限
部位を創出するように設計されているから（第１４表）
、これらのキナーゼ処理されたプライマーとハイブリッ
ド形成された幾つかのクローンからのＲＦ　−ＤＮＡを
制限酵素Ｄｄｅ　Ｉで消化した。プライマーＤＭ２８と
ハイブリッド形成し、新しいＤｄｅＩ制限部位をもつ突
然変異誘発されたＭ　１３−　ＩＬ−２プラーク（７）
−ツ（Ｍ１３−ＩＪ４４）を取り上げ、ＪＭ１０３培養
物へ接種し、培養上澄液から５ｓＤＮＡを調製し、細胞
ペレットからｄｓＲＦ　−ＤＮＡを調製した。同じく、
プライマーＤＭ２９とハイブリッド形成させたプラーク
（Ｍ１３−ＩＪ４６）を取り上げ、これから５ｓＤＮＡ
とＲＦ−ＤＮＡを調製した。オリゴヌクレオチドプライ
マーＤＭ２７はＤｄｅ　１位置の代わりに新しいＰｓｔ
ｌ制限部位を創出するように設計されている。従って、
このプライマーにハイブリッド形成されたプラークを新
しいＰｓｔＩ部位の存在の点からスクリーニングした。

このような一つのファージプラークを同定しくＭ１３−
ＩＪ４２）　、　　５ｓＤＮ＾及びＲＦ　−ＤＮＡをこ
れから調製した。百標のシスティン用ＴＧＴコドンがセ
リン用ＴＧＴコドンへ転化されたことを°確認するため
、これらの３クロ一ン全部から得たＤＮＡの配列を決定
した。

ｍ１五　　　　における　　のため突然・Ｍ１３−ＩＪ
４２　、　Ｍ１３〜ＬＷ４４　、及びＭ１３ル桐６がら
のＩＩＰ−ＤＮＡをそれぞれ制限酵素旧ｎｄｌ［［及び
Ｂａｎ　ＩＩで消化し、挿入断片を１％アガロースゲル
から精製した。

同様に、プラスミドｐＴｒｐ３　（第７図）を旧ｎｄＩ
［［及びＢａｎ　ＩＩで消化し、ｔｒｐプロモータを含
有する大きなプラスミド断片をアガロースゲル上で精製
し、Ｍ１３−ＬＷ４２　、　Ｍ１３−ＩＪ４４及びＭ１
３−ＩＪ４６から単離された挿入断片の各々と連結した
。連結したプラスミドをコンピテント大腸菌に一１２Ｍ
Ｍ２９４株へ形質転換した。これらの形質転換体からの
プラスミドＤＮＡを制限酵素地図作成によって分析し、
プラスミドｐＬＷ４２　　、ｐＬＷ４４　　、及びｐｌ
Ｊ４６の存在を確かめた。

第１４図はｐｌＪ４６の制限地図である。ｔｒｐプロモ
ーターを誘導するために、トリプトファンの不在下にこ
れらの個々のクローンの各々を生育させ、無細胞抽出液
をＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル上で分析し、３クロ
ーンｐＬＷ４２　　、ｐＬＷ４４及びｐｌＪ４６の全部
が、１４．４Ｋｄ　ＩＬ−２蛋白質を合成することが立
証された陽性対照のｐｌＪ１２１に見られるものと同様
な１４．５Ｋｄｉ白を合成することが示された。これら
の同じ抽出液をマウスＨＴ−２細胞でＩＬ−２活性につ
いて検定すると、クローンｐｌＪ２１　（陽性対照）と
ｐＬＷ４６のみが有意義量のＩＬ−２活性を示しく下の
第２表）、ｃｙｓ５８とｃｙｓ１０５は生物学的活性に
必要なものであり、これをセリンに変えること（それぞ
れｐｌＪ４２とｐＬＷ４４）によって生物学的活性が失
われることを意味している。一方ｃｙｓ１２５は、これ
を５ｅｒ１２５　（ｐＬＷ４６）へ変えても生物学的活
性に影響しないから、活性にとって不要であるに違いな
い。

ＰＩＬ２．−７（陰性対照）　　　　　　　１ＰＬＷ２
１　　（陽性対照＞　　　　　１１３，０００ＰＬＷ４
２　　　　　　　　　　　　　　６６０Ｐ　ＬＷ　４４
　　　　　　　　　　　　１，９９０Ｐ　Ｌ　Ｗ　４６
　　　　　　　　　　　１２３，０００第１５ａ図は、
クローンｐＬＷ４６のコード鎖のヌクレオチド配列を示
す。天然のヒトＩＬ−２遺伝子のコード鎖に比べ、クロ
ーンＰＩＪｄ６はヌクレオチド３７４にＧ−＋Ｃの一つ
の塩基の変化をもつ。第１５ｂ図は、ｐｔｈａｓでコー
ドされたＩＬ−２ムテインの対応するアミノ酸配列を示
す。このムテイ゛ンをＩＬ−２ｓｅｒ１２５と称する。

天然のＩＬ−２に比べ、ムティンは１２５位にシスティ
ンの代わりにセリンをもっている。

ｐＬＷ４６で形質転換されたＥ、コリに一１２聞２９４
株の試料は、１９８３年９月２６日２合衆国ソー　２０
８５２メリーランド州ロツクビル、パークローン・ドラ
イブ１２３０１番地、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（八ｍｅｒｉｃａｍ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託され、ＡＴＣ
Ｃ３９、４５２号に指定された。

ムティンＩＬ−２ｓｅｒ１２５のように１２５位のシス
ティンが欠損した又は別のアミノ酸でおき代えられたＩ
Ｌ−２ムテイン類は、ＩＬ−２活性を保持している。従
って、これらを天然のＩＬ−２と同じように処方、使用
できる。従って、このようなムティン類は細菌。

ウィルス、寄生虫、原生動物、及びカビの感染の診断と
処置、リンフ才力イン又は免疫不全の発現に、老令のヒ
ト及び動物における通常の免疫機能の再構成に、酵素増
幅、放射能標識、放射能映像化、及び病的状態のＩＬ−
２水準をモニターするこの技術で知られたその他の方法
など、診断検定法の開発に、リンフ才力イン類の受容体
部位を遮断する治療及び診断用に生体外でのＴ細胞生育
の促進のため、またその他種々の治療１診断、研究への
応用に有用である。ヒｌ−１１，−２の種々の治療・診
断への応用については、ニス・エイ・ローゼンバーグ（
Ｓ、　Ａ、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）＋イー・エイ・グリ
ム（Ｅ、　Ａ。

Ｇｒｉｍ）　　ら、エイ・マザムダ−（Ａ、　Ｍａｚｕ
ｍｄｅｒ）　　ら、及びイー・エイ・グリムとニス・エ
イ・ローゼンバーグが研究報告している。ＩＬ−２はそ
れ自体、又は他の免疫学的に関連のあるＢ又はＴ細胞又
はその他の治療剤と組み合わせて使用できる。治療又は
診断用には、蒸留水、リンゲル液、バンク液。

生理的食塩水などの無毒性、非アレルギー性の生理学的
に許容される担体媒体中にこれらを処方できる。ヒト又
は動物へのＩＬ−２ムテイン類の投与は、医師が適当と
考えるところにより、経口、又は腹腔内又は筋肉内又は
皮下であ′す、うる。関連細胞の例はＢ又はＴ細胞、天
然のキラー細胞等であり、本発明のポリペプチド類と組
み合わせて使用できる治療用試薬の例は、種々のインタ
ーフェロン類、特にガンマインターフェロン、Ｂ細胞生
長因子。

ＩＬ−１等である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＩＦＮ−βのアミノ酸配列図である。 第２図は、オリゴヌクレアーゼ指示された突然変異誘発
による突然変異株ＩＦＮ−β遺伝子の調製を示す略図で
ある。 第３図は、ＩＦＮ−β遺伝子を含むプラスミドｐβ１ｔ
ｒｐの図である。 第４図は、クローニングベクターＭ１３ｍｐ８ファージ
の図である。 第５図は、クローンＭ１３−β１の制限地図を示す。 第６図は、コード領域で一つの塩基の変化を示す突然変
異ＩＦＮ−β５ｅｒ１７遺伝子の配列順序決定ゲルパタ
ーンを示す。 第７図は、発現プラスミドｐＴｒｐ　３の図である。 第８ａ図は、クローンｐｓＹ２５０１の旧ｎｆｌ制限パ
ターンを示し、第８ｂ図は生ずるその二つの１６９ｂｐ
及び２８１１＋）断片を示す。 第９図は、クローンｐｓＹ２５０１の制限地図である。 第１０図は、ムティンＩＦＮ−β５ｅｒ１７を暗号づけ
るＤＮＡ配列と、これに対応するアミノ酸配列を示す。 第１１図は、クローンｐｓＹ２５０１及びｐβｌ　ｔｒ
ｐの抽出液におけるＩＦＮ−β５ｅｒ１７に対応する単
一の１８．０００ダルトンの蛋白質バンドを示す。 第１２図は、Ｅ、コリｔｒｐプロモーターの制御下にヒ
トインターロイキン−２（ＩＬ−２）遺伝子を含有する
プラスミドｐｌＪ１の図である。 第１３図は、ファージクローンＭ１３−ＩＬ２の制限地
図である。 第１４図は、プラスミドｐＬＷ４６の制限地図である。 第１５２及び１５ｂ図は、クローンｐＶ４６のコード鎖
のヌクレオチド配列、及びＩＬ−２ｓｅｒ１２５と称す
るＩＬ−２ムテイの対応するアミノ酸配列をそれぞれ示
す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、生物学的活性のために本質的でない少なくとも１つ
   のシステイン残基が欠失し又は他のアミノ酸残基によっ
   て置き換えられているポリペプチドをコードする構造遺
   伝子の製造に当って部位特定突然変異を誘発せしめるた
   めのオリゴヌクレオチドであって、システインのコドン
   を含む領域のコード鎖又はアンチコード鎖に相補的であ
   るが、システインのコドン又はそのアンチコドンが欠失
   しており、あるいはシステインのコドン又はそのアンチ
   コドンが他のアミノ酸のコドン又はそのアンチコドンに
   より置き換えられていることを特徴とするオリゴヌクレ
   オチド。