JPS6128393A - 変形されたインターロイキン―２をコードするｄｎａ、このｄｎａを含有するプラスミド及びこのプラスミドにより形質転換された大腸菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組換えＤＮＡ技術の一般的分野に関する。

更に詳しくは、本発明はシスティン残基の一つないしそ
れ以上の置換／欠損によって親類似体（ｐａｒｅｎｔ　
ａｎａｌｏｇｓ）とは異なった突然変異的に改変された
生物学的に活性のある蛋白質に関する。

（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）組換
えＤＮＡ　（ｒＤＮ＾）技術よって微生物学的につくら
れる生物学的に活性な蛋白質は、システィン残基を含有
しており、それらは活性に本質的なものではないが、分
子間または分子内の望ましくない結合を自由に形成する
。このような一つの蛋白質は、微生物学的につくられる
ヒトのベータインターフェロン（１’ＦＮ−β）である
。ｒＤＮＡ技術によってＴＦＮ−βをつくる過程で、高
濃度のＪＰＮ−βを含有する大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１ｔ）
抽出物中に、微生物学的につくられるＩＦＮ−βのダイ
マーとオリゴマーが形成されることが見い出された。こ
のマルチマー形成のため、ＩＦＮ−βの精製と分離が非
常な手間と時間のかかるものとなり、精製中に蛋白質を
還元し、次いで元のコンフォメーションに戻すためにこ
れを再酸化するというように、精製単離手順に追加の段
階が幾つか必要になり、それによって不正確なジスルフ
ィド結合形成の可能性が高まる。更に、おそらくはマル
ティマー形成又はランダムな分子内ジスルフィド架橋形
成のため、微生物学的につくられるＩＦＮ−βは一貫し
て低い比活性を示すこともわかった。従って、ＩＦＮ−
βのように微生物学的にづくられ生物活性のある蛋白質
を、その活性に悪影響を及ぼさず、しかも蛋白質が望ま
しくない三次構造（例えば蛋白質の活性を低下させるよ
うなコンフォメーション）を有する結果になるような分
子間架橋や分子内結合の形成能力を減少し、又は排除す
る形で改変するのが望ましいであろう。

（問題点を解決するための手段） 本発明は定方向突然変異（ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａ
ｇｅｎｅｓｉｓ）により、組構造類似体（ｐａｒｅｎｔ
　ａｎａｌｏｇｓ）の活性を保持するが、分子間ジスル
フィド結合や望ましくない分子内ジスルフィド結合の形
成能力を欠いている突然変異的に改変された生物学的活
性蛋白質の製造に関する〔このような蛋白質を「ムティ
ン」（Ｉｗｕｔｅｉｎ）という。「遺伝学・細胞遺伝学
用語辞典」（Ｇｌｏｓｓａｒｙ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）第４版、３８
１頁、スプリンジャー・バ、−ラグ（１９７６年）〕。

これに関し、エッチ・エム・シェパード（Ｓｈｅｐａｒ
ｄ。

Ｈ，Ｍ、）等（Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１年）２９４巻
５６３〜５６５頁〕はＴＦＮ−βについて、そのアミノ
酸配列の１４１位置のシスティンがチロシンでおき代え
られたムティンを記述している〔ヒトＩＦＮ−βには１
７　、３１及び１４１位置にシスティンがある。Ｇｅｎ
ｅ　（１９８０年）１０＠１１〜１５頁及びＮａｔｕｒ
ｅ（１９８０年）２８５巻５４２−５４７頁〕。このム
ティンは、ＩＦＮ−β遺伝子のヌクレオチド４８５にＧ
−Ａ転位をもつ部分的ＩＦＮ−βｃＤＮＡクローンから
構築された雑種遺伝子の細菌による発現によってつくら
れた。このムティンは本来のＩＦＮ−βの生物学的活性
を失っており、著者らは置き換えられたシスティンが活
性に本質的であったと結論するに至った。

定方向突然変異（ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ）技法は周知であり、アール・エフ・レイザー（
Ｌａｔｈｅｒ、　Ｒ。

Ｆ、）及びジェイ・ピー・レコック（Ｌｅｃｏｑ、　Ｊ
、　Ｐ、）ジェネテインク・エンジニアリング（Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ　Ｅｎ−ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミツク
ブレス社（１９８３年）３１−５０頁、に検討されてい
る。オリゴヌクレオチドに指示された突然変異はエム・
スミス（Ｓｍｉｔｈ、　Ｐｌ、）及びニス・ギラム（Ｇ
ｉｌｌａｍ、　Ｓ、）、ジェネテインク・エンジニアリ
ング：原理と方法、プレナムプレス社（１９８１年）３
巻１−３２頁に具体的に検討されている。

本発明の一つの面は、ジスルフィド結合を自由に形成し
、生物学的活性に非本質的であるようにな少なくとも１
個のシスティン残基をもった生物学的に活性な蛋白質の
合成ムティンであって、このムティンがシスティン残基
の少なくとも１個を欠損しているか、或いは別のアミノ
酸でおき代えられていることを特徴とするものに関する
。

本発明のもう一つの面は、上記合成ムティン類をコード
するように特に設計されたＤＮＡ配列をもつ合成構造遺
伝子（「デザイナ−遺伝子」）に関する。この面の下位
局面は、このような構造デザイナ−遺伝子を包含する発
現ベクター類、このようなベクター類で形質転換される
宿主細胞又は生物、及びこのような形質転換生物又はそ
の子孫を培養し、培養基からムティン類を回収すること
によって合成ムティンをつくる方法である。治療上有用
性をもつムティン類の場合、ムティン類の治療有効量を
含有する治療用組成物は、本発明のもう一つの面である
。

本発明のさらにもう一つの面は、望ましくないジスルフ
ィド結合を自由に形成するような１個ないしそれ以上の
システィン残基を有する蛋白質を、このような望ましく
ないジスルフィド結合を形成することから防ぐ方法であ
って、システィン残基を欠損させるか、これらを他のア
ミノ酸でおき代　　　　゛えることによって蛋白質が突
然変異的に改変されることを特徴とした方法である。

本発明の更に一つの面は、以下の工程を特徴とするオリ
ゴヌクレオチドに指示された突然変異誘発によって上記
の合成構造遺伝子をつくる方法である。

（ａ）　　親蛋白質をコードした構造遺伝子の１本鎖か
らなるｊＩＬ鎖ＤＮＡを突然変異オリゴヌクレオチドプ
ライマーとハイブリダイズさせ（このプライマーは、欠
損又は代替えすべきシスティン用コドン、又は場合によ
りこのコドンと対合をつくるアンチセンス・トリプレッ
トを包含する領域に対して相補的なものであるが、当該
コドンの欠損又は他のアミノ酸をコードするトリブレン
ドを規定するコドン又はアンチセンス・トリプレットと
は不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）である。）、 （ｂ）　　ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長
させ、突然変異性へテロデュプレックス（ｈｅｔｅｒｏ
−ｄｕｐｌｅχ）を形成させ、そして、 （Ｃ）　　この突然変異性へテロデュプレックスを複製
する。

本方法で用いられる突然変異株オリゴヌクレオチドプラ
イマーは本発明のもう一つの面である。

本発明は、生物学的に活性な蛋白質の生物学的活性に本
質的ではないシスティン残基が、分子間架橋又はまちが
った分子内ジスルフィド結合の形成サイトを排除するた
めに、計画的に欠損又は他のアミノ酸でおき代えられて
いるムティン類、このようなムティン類をコードする突
然変異遺伝子、及びこのようなムティン類をつくる手段
を提供する。

本発明によって突然変異的に改変できる蛋白質は、生物
学的に活性な蛋白質のシスティン含量、及びシスティン
残基が活性と三次構造に関して果たす役割について入手
可能な情報から確認できる。

文献ではこのような情報が入手できない蛋白質について
は、本明細書に記載の手順によって蛋白質のシスティン
残基の各々を系統的に変更し、生ずるムティン類の生物
学的活性及びそれらが望ましくない分子間又は分子内ジ
スルフィド結合を形成する傾向について試験を行なうこ
とによって、この情報は決定できる。従っ一ζ、本発明
はＩＦＮ−β及びＩＬ−２のムティン類に関して下に特
に説明、例示されているが、望ましくないジスルフィド
結合の形成に対して蛋白質を感受性にするような、機能
的に本質的ではないシスティン残基を含有する生物学的
に活性な任意のその他の蛋白質に以下の教示が当てはま
ることが認められよう。ＩＦＮ−βとＩＬ−２以外に本
発明による突然変異性改変の候補となる蛋白質の例は、
リンフォトキシン（腫瘍壊死因子）とコロニー刺激因子
−１、それにＩＦＮ−α１である。候補蛋白質は、ふつ
うには奇数のシスティン残基をもっている。

ＩＦＮ−βの場合、グリコジル化ＩＦＮと未グリコジル
化ＩＦＮがいずれも定量的に同様な特異的活性を示すこ
と、従って、グリコジル部分はＩＦＮ−βの生物学的活
性に関与も貢献もしていないことが報告された。しかし
、細菌でつくられるグリコジル化されていないＩＦＮ−
βは、グリコジル化された天然ＩＦＮ−βより量的に低
い比活性を一貫して示す。

ＩＦＮ−βは、１７　、３１及び１４１の位置にシステ
ィン残基をもつことが知られている。システィン１４１
　は、シェパードら（前掲）により、生物学的活性に本
質的であることが立証された。４個のシスティン残基を
含有するＩＦＮ−αでは、二つの分子間−８−８−結合
があり、一つはｃｙｓ２９とｃｙｓ１３Ｂの間、他はｃ
ｙｓ　ｌとｃｙｓ９８の間である。ＩＦＮ−βとＩＦＮ
−αとの相同性に基づいて、ＩＦＮ−βのｃｙｓ１４１
はｃｙｓ３１　と分子内−５−Ｓ−結合にしており、ｃ
ｙｓ１７は自由に分子間架橋を形成できるであろう。ｃ
ｙｓ１７を欠失させるか、これを別のアミノ酸と置換す
ることによって、ｃｙｓ１７が生物学的活性に本質的で
あるかどうか、また−８−・Ｓ−結合形成におけるその
役割を決定できる。ｃｙｓ１７が蛋白質の生物学的活性
に本質的でないならば、生ずるｃｙｓ１７を欠損し又は
ｃｙｓ１７が置換された蛋白質は、自然のＩＦＮ−βの
それに近い比活性を示し、またおそらく蛋白質の単離精
製を容易にもするであろう。

ＩＦＮ−β遺伝子のｃｙｓｌＴ用コドン（ｃｏｄｏｌ）
の領域に対して相補的であるがこのコドン中に１又は複
数の塩基変化を含有する合成オリゴヌクレオチドプライ
マーを用いるオリゴヌクレオチドで指示される突然変異
誘発手順を使用してデザイナ−遺伝子がつくられ、こう
してｃｙｓ１７がその他任意の選択されたアミノ酸でお
き代えられる。欠損を望む場合には、ｃｙｓ１７用コド
ンを欠いたオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。ｃ
ｙｓ１７をグリシン、バリン、アラニン、ロイシン、イ
ソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン
、トリプトファン、セリン、スレオニン及びメチオニン
のような中性アミノ酸へ変換するのが好ましい方法であ
る。セリン及びスレオニンは、システィンと化学的類似
性を有するため最も好ましい代替え物である。システィ
ンを欠失させる時は、成熟ムティンは自然の粗蛋白質又
は微生物でつくられるＩＦＮ−βよりアミノ酸１個だけ
短い。

ヒトＩＬ−２は、蛋白質の５８　、１０５及び１２５位
にシスティン残基をもつと報告されている。ＩＦＮ−β
の場合のように、ＩＬ−２は細菌の菌体から単離される
時は集合したオリゴマー型になっていて、細菌抽出物か
ら良好な収量を得るためには、還元剤で還元しなければ
ならない。そのうえ、精製され還元されたＩＬ−２は不
安定であり、貯蔵時にオリゴマー不活性型へ容易に再酸
化される。３個のシスティンが存在することは、天然分
子に見られるように正しい架橋は１個だけなのに、再酸
化時に蛋白質が３個の可能な分子内ジスルフィド架橋の
１個を無作為に形成しうろことを意味している。天然Ｉ
Ｌ−２蛋白質のジスルフィド構造がいかなるものか知ら
れていないから、ＩＬ−２遺伝子のコドン５８　、１０
５及び１２５に突然変異をつくり、どのシスティン残基
が活性にとって必要であるか、従ってまた自然のジスル
フィド架橋形成に関与している可能性が最も大きいかを
確認するために本発明を使用できる。同様に、活性にと
って必要でないシスティン残基を修飾することによって
まちがった分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぎ、そし
て遊離システィン残基の除去又は置き換えによって分子
内間ジスルフィド架橋の機会を最小限に抑えることがで
きる。

オリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、突然変異を
導入すべき遺伝子領域へのプライマーの安定なハイブリ
ッド形成に必要な条件により、また現在利用可能なオリ
ゴヌクレオチド合成法の限界によって決まる。オリゴヌ
クレオチドで指示される突然変異誘発に使用するオリゴ
ヌクレオチドを設計するに当たって、考慮すべき因子（
例えば全体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の
大きさ）は、エム・スミス及びニス・ギラム（前掲）に
よって記述されている。概して、オリゴヌクレオチドの
全長は、突然変異サイトでの安定でユニークな雑種形成
を最適化するような長さであり、突然変異サイトから５
′及び３′末端までの伸長部分（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ
）は、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性に
よる突然変異の作用をさけるのに十分な大きさとする。

本発明に従って突然変異誘発に使用されるオリゴヌクレ
オチドは、通常、約１２個ないし約２４個の塩基、好ま
しくは約１４個ないし約２０個の塩基、更に好ましくは
約１４個ないし１８個の塩基を含有する。これらは通常
、変更又は欠失されるコドンの少なくとも約３個の塩基
３′を含有する。

変更されたＩＦＮ−β遺伝子をつくる方法は、大体にお
いて、コドン１７を消失させるか、又はそれが別のアミ
ノ酸をコードするように変更する合成ヌクレオチドプラ
イマーを使用して、ＪＰＮ−β遺伝子のコドン１７　（
ＴＧＴ）に部位特異的突然変異を誘発せしめるものであ
る。システィンをスレオニンに変え、プライマーをＩＦ
Ｎ−β遺伝子のアンチセンス鎖にハイブリッド形成させ
る場合、好ましいヌクレオチドプライマーはＧＣＡＡＴ
ＴＴＴＣＡＣＴＣＡＧである（下線は変更されたコドン
を示す）。システィンを欠失させるのが望ましい時は、
好ましいプライマーはＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＧ
ＡＡＧＣＴＣＣＴＧであり、これはｃｙｓに対するＴＧ
Ｔコドンを喪失している。システィンを′セリンに代え
る時は、セリン用の＾ＧＴコドンを含んだ１７−ヌクレ
オチドプライマーＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧ星ＣＡＧが選
択される。ｃｙｓ１７で第一塩基Ｔ→Ａの転位により、
システィンからセリンへの変化が起る。欠失を導入する
時には、所望の蛋白質の発現のためにＤＮＡ配列の適正
なリーディングフレームを保持しなければならない点を
認識しなければならない。

プライマーはＩＦＮ−β遺伝子の１本鎖がクローニング
されたＭ１３　、　ｆｄ　、又はφ×１７４のような１
本鎖ファージへへイブリッド形成される。ファージが遺
伝子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれでも担持でき
ることは認められよう。ファージがアンチセンス鎖を担
持する場合には、プライマーは、コドンの欠損、又は別
のアミノ酸をコードするトリプレットを規定するこのコ
ドンとは一致しないが、突然変異させるコドンを含有す
るセンス鎖の領域と同一である。ファージがセンス鎖を
担持する場合は、欠失させるコドンと対合するトリプレ
ット中では適当に不一致であるが、突然変異させるコド
ンを含有するセンス鎖の領域に対して相補的である。ハ
イブリッド形成に使用される条件はエム・スミス及びニ
ス・ギラム（前掲）によって記述されている。温度は通
常、約０℃ないし７０℃、もっと一般的には約１０°Ｃ
ないし５０℃の範囲にある。ハイブリッド形成後、プラ
イマーはＤＮＡポリメラーゼｌ５Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼ、逆転写酵素又は他の適当なりＮＡポリメラーゼとの
反応によってファージＩ）ＮＡ上で伸長される。生ずる
ｄｓＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなりＡＮリガ
ーゼでの処理によって閉環状ｄｓＤＮＡへ変換される。

１本鎖領域を含有するＤＮＡ分子はＳ１エンドヌクレア
ーゼ処理によって破壊できる。

オリゴヌクレアーゼで指示される突然変異誘発は、ＩＬ
−２活性をもつがｃｙｓ１２５からセリン１２５へ変更
されたムティンをコードする突然変異ＩＬ−２遺伝子を
つくるにも同様に使用できる。ファージが遺伝子のセン
ス鎖を担持する場合に、この突然変異ＩＬ−２遺伝子を
つくるのに使われる好ましいオリゴヌクレオチドブライ
マーはＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＡＧＧＴ
ＡＡＴＣである。このオリゴヌクレオチドは、ＩＬ−２
遺伝子のコドン１２５と対合するトリプレットのまん中
の塩基にＣ→Ｇの変化を有する。

得られた突然変異性゛ヘテロディプレックスは、コンピ
テント宿主生物又は細胞を形質転換するのに使用される
。宿主によるヘテロデュプレンクスの複製により、双方
の鎖から子孫鎖ができる。複製に続いて、突然変異鎖の
子孫から突然変異遺伝子を単離し、適当なベクターへ挿
入し、このベクターを適当な宿主生物又は細胞の形質転
換に使用する。好ましいベクター類はプラスミドｐＢＲ
３２２。

ｐｃＲｌ及びそれらの変異体、合成ベクター等である。

。 適当な宿主生物はＥ、コリ（Ｅ、Ｃｏ１１）、シュアト
モ−ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、バシルス・ズ
ブチリス（Ｂａ−ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｔｓ）、
バシルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈ
ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、種々の酵母菌株、バシルス
・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ）、ハツカネズミやラット、チャイニーズハ
ムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞のような動物細胞、植物
細胞、動植物宿主等である。選んだ宿主をベクターで形
質転換する場合に、ムティンが発現されるために適当な
プロモータ・オペレーター配列も導入されることは認識
されなければならない。宿主は原核生物でも真核生物で
も良い。（真核細胞へＤＮＡを挿入する方法は１９８１
年９月３日公表されたＰＣＴ出願番号ｔｌｓ８１１００
２３９及び１Ｉｓ８１１００２４０ニ記述されティる）
。Ｅ、コリとＣＨＯ細胞が好ましい宿主である。

本発明に従って得られるムティン類は、天然の親蛋白質
に生ずるグリコジル化およびムティン調製に使われる宿
主生物に依存してグリコジル化される場合もされない場
合もある。所望により、宿主としてＥ、コリ（Ｅ、Ｃｏ
１１）及びバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を使用する場
合に得られる未グリコジル化ムティンを、この技術分野
で知られている科学的、酵素的及びその他の変法によっ
て生体外で任意にグリコジル化してよい。

ＩＦＮ−βに関する本発明の好ましい態様においては、
第１図に示すように、ＩＦＮ−βのアミノ酸配列におい
て１７位のシスティン残基は、成熟ＩＦＮ−βをコード
するＤＮＡ配列のセンス鎖のコドン１７の第一塩基のＴ
−Ａ転位によって、セリンへ変えられる。この部位特異
的な突然変異誘発は、合成１７−ヌクレオチドプライマ
ーＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧ二ＣＡＧを使用して誘発され
、このプライマーはコドン１７の第一塩基に一個の塩基
の不一致がある以外は、コドン１７の領域におけるＩＦ
Ｎ−βのセンス核上の１７の個ヌクレオチド配列と同一
である。この不一致はプライマーのヌクレオチド１２に
ある。遺伝暗号（コドン）は縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔ
ｅ）　Ｌ／ており、アミノ酸の多くは一つ以上のコドン
によって暗号づけられることが認識されなければならな
い。例えばセリンの塩基暗号は、ＴＣＴ、　ＴＣＧ、　
ＴＣＣ，ＴＣＡ、　ＡＧＴ。

及びＡＣＧというコドンがいずれもセリンをコードする
ように、６通りの縮重である。便宜上、好ましい態様と
してＡＧＴコドンが選ばれた。同様に、スレオニンはＡ
ＣＴ、　ＡＣＡ、　ＡＣＣ及びＡＣＧのコドンのどの一
つによってもコードされる。特定アミノ酸に対してｌコ
ドンを特定する時は、これがそのアミノ酸をコードする
すべての縮重コドンを包含することが意図されているｏ
１７−ｍａｒは、ＩＦＮ−β遺伝子のアンチセンス鎖を
担持する１本鎖Ｍ１３ファー　シＤＮＡ　’にハイブリ
ッド形成される。次に、ＤＮＡポリメラーゼＩ　Ｋｌｅ
ｎｏｗ断片を使用して、オリゴヌ然変異性へテロデュプ
レックスの複製によって、不一致を含有するＤＮＡ鎖か
らクローンが得られる。

突然変異クローンは、特定の制限位置の存在又は不存在
、抗生物質耐性もしくは感受性、又はこの技術分野にお
いて知られたその他の方法によってｒｉｍされ、スクリ
ーニングされる。システィンをセリンによりおき代える
場合は、第２図に示されるＴ−Ａ転位によって、構造遺
伝子の中に新しいＨｉｎｆｒ制限部位がろくられる。突
然変異クローンは、突然変異したファージプラークのハ
イブリッド形成スクリーニングにおけるプローブとして
オリゴヌクレオチドプライマーを使用して同定される。

′第２図に示されるように、プライマーは親とハイブリ
ッド形成される時は唯一の不一致を有するが、突然変異
したファージＤＮへにハイブリッド形成される時は完全
な一致を有するであろう。オリゴヌクレオチドプライマ
ーを親ＤＮＡよりも突然変異ＤＮＡへ優先的にハイブリ
ッド形成させるようなハイブリッド形成の条件を工夫で
きる。新しく発生したＨ３ｎｆ　１部位も、ＩＦＮ〜β
遺伝子の単一塩基の突然変異を確認する手段として役立
つ。

突然変異した遺伝子を担持するＭ１３ファージＤＮＡを
単離し、プラスミドｐＴｒｐ　３のような適当な発現ベ
クター中へ組み入れ、このベクターで大腸菌ＭＭ２９４
株を形質転換させる。形質転換体とその子孫を培養する
のに適した生育培地が当業者に知られている。ＩＦＮ−
βの発現されたムティンを単離精製し、特徴づける。

以下の実施例は本発明の一層の理解を助けるため、また
例示だけの目的で提示されている。これらはいかなる形
においても本発明の範囲を限定するものと考えられては
ならない。実施例１〜９はＩＦＮ−βのムティンの調製
を記述している。実施例１０〜１５はＩＬ−２のムティ
ンの調製を記述している。

ノξｍユ　ＩＦＮ−β′　云　のＭ１３ベクターへのク
ローニング １零鎖ＤＮＡ鋳型の給源としてＭ１３ファージベクター
を使用することは、ジー・エフ・テンプル（Ｇ、　Ｆ、
　Ｔｅｍｐｌｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２年）２
９６＝ｍ　５３７−５４０頁で実証された。大腸菌ｔｒ
ｐプロモーターの制御下にＩＦＮ−β遺伝子を含有する
プラスミドｐβ１ｔｒｐ　（第３図）を制限酵素Ｈｉｎ
ｄｍ及びＸｈｏ　ＩＩで消化した。Ｍ１３ｍｐ８　（ジ
ェイ・メッシング（Ｊ。

Ｍｅｓｓｉｎｇ）　、　ｒ巨大分子に関する第３回クリ
ーブランド・シンポジウム：組換えＤＮＡ　ｊエイ・ウ
オールトン編、エルザビアプレス社、１４３−１５３　
頁（１９８１年）〕複製型（ＲＦ）　ＤＮＡ　（第４図
）を制限酵素旧ｎｄＩ［［及びＢａｍＨＩで消化し、予
めＨｉｎｄＩ［［及びＸｈｏ　ｎで消化しておいたｐβ
１　ｔｒｐＤＮ＾と混合した。

次に混合物をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、連結ＤＮＡ
を大腸菌−ＪＭ１０３株のコンピテント細胞中へ形質転
換させ、Ｘｇａｌインディケータ−プレート上に播いた
〔ジェイ・メッシング等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅ５（１９８１年）９巻３０９−３２１頁〕。組換
えファージを含有するプラーク　（白いプラーク）を取
り上げ、新鮮なＪＭ１０３の培養物に接種し、そして感
染細胞からＲＦ分子のミニブレンブを調整した（エッチ
・ディー・バーンポイム（Ｈ，Ｄ、　Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
）及びジェイ・ドリイ（Ｊ、　Ｄｏｌｙ）、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５（１９７９年）７巻１５１３−
１５２３頁）。ＩＦＮ−β挿入部を含有するクローンを
同定するために、ＲＦ分子を種々の制限酵素で消化した
。このような１クローン（Ｍ１３−β１）の制限地図を
第５図に示す。Ｍ１３−βｌクローンから１本鎖（ｓｓ
）ファージＤＮＡをつくり、合成オリゴヌクレオチドを
使用する部位特異的突　　　　　゛然変異誘発の鋳型と
して用いた。

実施例１．ノー、　　然、イ ０．１ｍＭアデノシン三燐酸（ＡＴＰｊ　、５０　ｍＭ
ヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩（トリス−塩酸）
ｐＨ８，０，１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭジチオ
スレイトーノＩ、　（ＤＤＴ）及びＴ４キナーゼ９単位
の存在下に、５０μβ中で合成オリゴヌクレ、ｔ　ｆ　
ＦＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡＧ（７”　−ｙ　
イア−）　　４０ピコモルをＴ４キナーゼにより３７℃
で１時間処理した。５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ
）リス−塩酸、ｐＨ８，０，１０ｍＭ塩化マグネシウム
及び１０ｍＭβ−メルカプトエタノールを含有する混合
物５０μβ中で、このキナーゼ処理されたプライマー（
１２ピコモル）を６７℃で５分、及ヒ４２℃で２５分加
熱することによって１本鎖（ｓｓ）　Ｍ２Ｓ−βＩ　Ｄ
ＮＡ５μｇにハイブリット形成させた。アニーリングし
た混合物を次に氷上で冷却し、０．５　ｍＭ各タデオキ
シヌクレオチド三燐酸ｄＮＴＰ）、８０ｍＭトリス−塩
酸、ｐ　Ｈ７，４，８ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、ＤＮＡポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏ
ｉｖ断片９単位、０．５　ｍＭＡＴＰ及びＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ２単位を含有する反応混合物５０μ２に添加し、
３７℃で３時間及び２５℃で２時間インキュベートした
。次にフェノール抽出とエタンール沈澱によって反応を
停止させた。ＤＮＡを１０ｍＭトリス−塩酸、ｐ　Ｈ８
，０，１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、
５０％蔗糖及び０．０５％ブロモフェニルブルー中に溶
解し、臭化エチジウム２μｇ　／　ｍ　ｊｌの存在下、
０．８％アガロースゲル上の電気泳動にかけた。Ｍ２Ｓ
−β１のＲＦ型に対応するＯＮ＾バンドをパーコレート
法（アール・タフりニー・デービス（Ｒ，Ｈ，Ｄａｖｉ
ｓ）　　３、［高等細菌遺伝学Ｊ　（ＡｄｖａｎｃＭ　
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　、コールド
・スプリング・ハーバ−研究所、Ｎ、　Ｙ、　１７８〜
１７９頁（１９８０年）〕によってゲルスライスから溶
離した。溶離されたＤＮＡをコンピテントＪＭ１０３細
胞の形質転換に使用し、菌を一夜生育させ、培養基上澄
液から５ｓＤＮＡを単離した。この５ｓＤＮＡをプライ
マー伸張の第二サイクルに鋳型として使用し、ゲル精製
されたＲＦ型ＤＮＡをコンピテントＪＭ１０３細胞中へ
形質転換させ、寒天プレート上に播き、−夜培養すると
ファージプラークが得られる。

ノｌ景側】よ。立　・　、・− 上の実施例２の実験をくり返す。但し、合成オリゴヌク
レオチドプライマーとして、システィンをコードするも
のからスレオニンを・コードするものへＩＦＮ−β遺伝
子のコドン１７を変えるのにＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＡ
ＣＴＣＡＧを使用する。

去胤桝玉　部位特異的欠損 上の実施例２の実験をくり返す。但し合成オリゴヌクレ
オチドプライマーとしてはＩＦＮ−β遺伝子のコドン１
７を欠損させるのにＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡ
ＡＧＣＴＣＣＴＧを使用する。

突然変異させたＭ２Ｓ−β１プラークの入ったプレート
（実施例１）並びに突然変異しないＭ２Ｓ−β１ファー
ジプラークの入った２枚のプレートを４℃に冷却し、各
プレートからのプラークを２枚のニトロセルロース円形
フィルター上へ、第一フィルターの場合には乾燥フィル
ターを寒天プレート上へ５分間重ね、第二フィルターの
場合は１５分間重ねて移した。次に０．２　ＮＮａ０）
１　、１．５　Ｍ塩化すＩ・リウム及び０．２％トリト
ンｘ−ｉｏｏに浸した厚手の濾紙上へフィルター類を５
分間置き、次に０、５　Ｍ　ｌ−リス−塩酸、ｐＨ７，
５、及び１．５Ｍ塩化ナトリウムに浸した濾紙上へ更に
５分間重ねて中和した。フィルターを同様なやり方で、
２ＸＳＳＣ（標準くえん酸塩）に浸したフィルター上で
２回洗い、乾燥し、真空乾燥炉内で８０℃で２時間乾燥
させた。重複フィルターをフィルター当たり１０ｍ１の
ＤＮＡハイブリッド形成緩衝液（５ｘＳＳＣ）、　ｐＨ
７，０，４Ｘデンハード液（ポリビニルピロリドン。

フィコール及び牛血清アルブミン、■×＝各０．０２％
）’、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ３）、　
５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０及び１００
μｇ　／　ｍ　ｌの変性サケ精子ＤＮＡにより、５５℃
で４時間、事前ハイブリッド形成させた。オリゴヌクレ
オチドプライマーを３ｔｐで標識したＡＴＰでキナーゼ
下に処理することによって３ｆｆｉｐで標識したプロー
フ゛をつくった。フィルレター当たり５　ｍ　ｊｌのＤ
ＮＡバイブリド形成緩衝液中でフィルターを３２ｐで標
識したプライマー３．５　Ｘ　１０　’ｃｐＩＩＩ／ｍ
　ｉｔに５５℃で２４時間ハイブリッド形成させた。０
．１％ＳＤＳと減少する量のＳＳＣを含有する洗浄用緩
衝液中でそれぞれ３０分、５５℃でフィルター類を洗っ
た。フィルター類を、初めに２ＸＳＳＣを含んだ緩衝液
で洗い、そして突然変異していないＭ２Ｓ−β１プラー
クを含有する対照フィルターはガイガー計数管を用いて
放射能の存在について検査した。

ＳＳＣ濃度を段階的に低下させ、未突然変異Ｍ１３−β
１プラークをもつ対照フィルター上に検出可能な放射能
が残らなくなるまでフィルターを洗った。

ＳＳＣの使用最低濃度はｏ、　ｉ　ｘｓｓｃであった。

フィルターを空気乾燥し、−７０℃で２〜３日オートラ
ジオグラフ処理した。突然変異したＭ２Ｓ−β１のプラ
ーク４８０個と突然変異していない対照プラーク１００
個をキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドプローブによ
ってスクリーニングした。対照プラークではプローブと
ハイブリッド形成したものが全く存在せず、一方突然変
異したＭＩ３−βＩプラーク５個がプローブとハイブリ
ッドを形成した。

５個の突然変異Ｍ１３−β１プラークの１個（Ｍ２Ｓ−
５Ｙ２５０１）を取り上げ、ＪＭ１０３培養基へ接種し
た。

上澄液から５ｓＤＮＡを調製し、そして細胞ペレットか
ら２本鎖（ｄｓ）　ＤＮＡを調製した。Ｍ１３ユニバー
サルプライマーを使用して、クローンのジデオキシ配列
決定用の鋳型として５ｓＤＮＡを使用した。配列決定分
析の結果を第６図に示す。この結果は、ＴＧＴｃｙｓコ
ドンがＡＧＴｓｅｒコドンへ変換されたことを確証して
いる。。

実施例６．　　腸閉における突然変異ＩＦＮ−βの発現
Ｍ　１３−５Ｙ２５０１からのＲＦ　ＤＮＡを制限酵素
Ｈ３ｎｄｌ１１及びＸｈｏ　ＩＩで消化し、５２０ｂｐ
の挿入断片を１％アガロースゲル上で精製した。大腸菌
ｔｒｐプロモーターを含有するプラスミドｐＴｒｐ３　
（第７図）を酵素ＦＩｉｎｄＩ［［及びＢａｍＨＩで消
化し、精製したＭ２Ｓ−５Ｙ２５０１断片と混合し、Ｔ
４１］ＮＡリガーゼの存在下に連結した。連結１１ＮＡ
をＥ、コリＭＭ２９４株へ形質転換した。

アンピシリン耐性形質転換体を薬剤テトラサイクリンに
対する感受性の点からスクリーニングした。

アンピシリン耐性でテトラサイクリン感受性の５クロー
ンからのプラスミドＤＮＡを、Ｍ　１３−５Ｙ２５０１
挿入部の存在についてスクリーニングするためＨｉｎｆ
　Ｉで消化した。第８ａ図は、クローンの一つ（ｐＳＹ
２５０１）の旧ｎｆｌ制限パターンを示すが、図ではこ
れを元のＩＦＮ−βクローンすなわちｐβｌ　ｔｒｐの
Ｈｉｎｆ　Ｉパターンを比較している。予想のように、
ｐＳＹ２５０１に追加のＨｉｎｆ　Ｉサイトがあり、１
９７ｂｐのＩＦＮ−β内部断片が１６９ｂｐの断片と２
８ｂｐの断片に切れている（第８ｂ図）。クローンｐＳ
Ｙ２５０１の制限地図を第９図に示す。突然変異ＩＦＮ
−β遺伝子の完全なりＮＡ配列を、予測されたアミノ酸
配列と一緒に第１０図に示す。クローンｐＳＹ２５０１
　と称するプラスミドは６０６０４イリノイ州ペオリア
、ノース・ユニバーシティ・ストリート１８１５番地、
米国農務省、科学教育局北部研究センター、発酵研究所
のアグリカルチエラル・リサーチ・カルチャーコレクシ
ョン（Ｎ）ｌＩ？Ｌ）に寄託されている。指定された寄
託番号はＣＭＣＣ１５３３号及びＮＲＲＬＢ−１５３５
６号である。

ｐＳＹ２５０１及びｐβ１ｔｒｐ　（子孫を含む）の培
養物を１，０の光学密度（ＯＤ６゜。）まで生育させた
。無細胞抽出物をつくり、ＩＦＮ〜βの抗ウイルス活性
量を微量力価検定法でＧＭ２７６７細胞によって検定し
た。

クローンｐＳＹ２５０１の抽出物はｐβｌ　ｔｒｐより
３〜１０倍高い活性を示しく第１表）、クローンｐＳＹ
２５０１がＩＦＮ−β活性を示す蛋白質をより多量に合
成しているか、又はつくられた蛋白質がより高い比活性
をもっているかのいずれかであることが示される。

ｐＳＹ２５０１　　　　　　　６Ｘ１０５ｐβ１ｔｒｐ
　　　　　　　　　ｌＸｌ０’ｐｔｒｐ３　（対照）３
０ クローンｐＳＹ２５０１が数倍多い活性蛋白を合成して
いたかどうか決定するため、両クローンの抽出物を対照
抽出物と共にＳＯＳポリアクリルアミドゲル上の電気泳
動にかけ、ゲルをクーマーシーブルーで染色して蛋白質
を発色させた。第１１図に示すように、クローンｐＳＹ
２５０１とｐβ１ｔｒｐの抽出物中に存在するが対照の
ｐｔｒｐ３抽出物中にはない約１８．０００ダルトンの
蛋白質に対応する蛋白質バンドが一つだけあった。この
蛋白質は約２０，０００ダルトンの分子量をもつが、１
８，０００ダルトンの蛋白質のゲル移動パターンを示し
ており、ｐβ１　ｔｒｐの抽出物からこの蛋白質を精製
することによってＩＦＮ−βであることが予めわかって
いた。ｐＳＹ２５０１抽出物中にはｐβ１ｔｒｐの抽出
物中よりこの蛋白質の量が少ないから、クローンｐＳＹ
２５０１抽出物中の蛋白質の比活性はクローンｐβ１　
ｔｒｐのそれより高い。

ス１ｊｉユＩＦＭ−β５ｅｒ１７の　＋１１ＦＮ−β５
ｅｒ１７をつくるように形質転換されたＥ。

コリからＩＦＮ−β５ｅｒ１７を回収した。Ｅ、コリを
次の生育培地中で、６８０ｎｍで１０〜１１の光学密度
（乾燥重量８．４ｇ八へまで生育させた。

ノー１り１−一一一一一１宗：−−− 塩化アンモニウム　　　　　　　　　　　２０ｍＭ硫酸
カリウム　　　　　　　　　　　　１６．１ｍＭ燐酸−
カリウム　　　　　　　　　　　　７．８ｍＭ燐酸二ナ
トリウム　　　　　　　　　　１２．２ｍＭ硫酸マグネ
シウム・七水和物　　　　　　３ｍＭクエン酸三ナトリ
ウム・二水和物　　　１．５ｍＭ硫酸マンガン・四水和
物　　　　　　　３０μＭ硫酸亜鉛・七水和物　　　　
　　　　　３０μＭ硫酸銅・五水和物　　　　　　　　
　　　３βＭＬ−トリプトファン　　　　　　　　７０
■／ｉｔ硫酸第−鉄・七水和物　　　　　　　　７２μ
Ｍチアミン塩酸塩　　　　　　　　　　２０■／ｌグル
コース　　　　　　　　　　　　４０ｇ／βアンモニア
でｐＨ調整 形質転換ずみＥ、コリの収穫物９．９２（９，９ｋｇ）
を２０℃に冷却し、濾液重量が８．８　ｋｇになるまで
、収穫物を一１１０ｋｐａの平均圧力損失と毎分２６０
ｍ　Ｉｔの定常濾液流量でクロスフローフィルターに通
すことにより濃縮した。濃縮液（約１ｊ２）を容器に流
し込み、１５°Ｃに冷却した。濃縮液を５℃、約６９、
０００ｋｐａでマントン−ゴーリンホモジナイザーに通
すことによって濃縮液中の菌体を破砕した。

燐酸塩で緩衝化された食塩水、Ｉ）　Ｈ７，４（ＰＢＳ
）　１１でホモジナイザーを洗い、洗浄液を破砕物に加
えると、２βの最終容量が得られた。この容量を毎分５
０ｍβの流量で１２０００ｘｇの連続遠心分離にかけた
。固体を上澄液から分離し、２重量％ＳＤＳを含有する
ＰＢＳ　４βに再懸濁させた。この懸濁液を室温で１５
分かきまぜたあと、目に見える懸濁物はなかった。次に
溶液を２−ブタノールで、２−ブタノール：溶液の１：
１容量比で抽出した。

液−液相分離装置中で毎分２００ｍ　Ｉｔの流量を用い
て抽出を行なった。次に有機相を分離し、そして蒸発乾
固させることにより蛋白質２１．３ｇを得た。これを蒸
留水に１：１０の容量比で再懸濁した。

回収された生成物は、ウィルスの細胞病理作用（ＣＰＥ
）に対する防護に基づく検定を用いて、ヒトＩＦＮ−β
活性について検定された。ミクロクイタープレート内で
この検定を行なった。最少基本倍・地５０μβを各容器
に仕込み、第一容器には資料２５μｉを入れ、つぎ容器
以降には１：３の容量の希釈を連続的に行なった。ウィ
ルス（水泡性口内炎）。

細胞（ヒト線維芽細胞ＧＭ　−２７６７系統）及び標準
■ＦＮ−β対照群を各プレートに収容せしめた。ｍβ当
たり１００単位の標準ＩＦＮ−βを使用した。次にプレ
アトに紫外線を１０分間照射した。照射後、細胞懸濁液
（ｍ４２当たり細胞１．２Ｘ１０’）　１００μＩＩを
各容器に加え、トレーを１８〜２４時間インキュベート
した。細胞当たり１プラ一ク形成単位でウィルス液を細
胞対照プレートを除く各容器に加えた。

ウィルス対照が１００％のＣＰＥを示すまでトレーをイ
ンキエベートした。これは、ウィルス液を加えてから通
常１８〜２４時間で生じた。標準ＩＦＮ−β対照の５０
％ＣＰＥ容器の位置の点から検定結果を解釈した。この
点からプレート上の全試料についてのインターフェロン
の力価を測定した。回収された生成物の比活性は５　Ｘ
ＩＯ’　Ｕ／ｍｌｌと決定された。

実施例８．酸ン澱　　びクロマトグラフィによる星 実施例７の方法をくり返したが、但し、抽出。

水相と有機相の分離、及び有機相とＰＢＳとの容量比３
：１での混合の後、氷酢酸の添加によって混合物のｐＨ
を約５に下げた。生じた沈澱物を１００００〜１７００
０ｘｇ、　１５分間の遠心分離によって分離し、ベレッ
トを１０％−／Ｖ　ＳＤＳ、　１０ｍＭ　ＤＴＴ、、　
　５０＋＋Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５，５に再溶
解し、８０℃に５分間加熱した。

次に、溶液を、ベックマン勾配系を使用して、ブラウン
リーＲＰ−３００，１０μＭ、ｒアクアボア」カラムに
かけた。緩衝液Ａは水中０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）であり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中０．１％Ｔ
ＦＡとした。検出は２８０ｎｍでの紫外線吸光度によっ
た。溶媒プログラムは３時間で０％緩衝液Ｂから１００
％緩衝液Ｂへの線形勾配とした。

最高のインターフェロン活性を含有するフラクションを
プールし、このプールされたインターフェロン調製物の
比活性は、天然のＩＦＮ−βにおける蛋白質ｍｇ当たり
約２×１０１′国際単位に比べ、９．０×１０７ないし
３．８Ｘ１０”Ｕ／ｎ＋ｊ！と決定された。

大廠皿炙　ＩＦＮ−β５ｅｒ１７の生化学　特　付け５
、７Ｎ　ＨＣＩ　、　　０．１％フェノールの２００ｐ
ｌｊ中において試料４０μｇを１０８℃で２４〜７２時
間の加水分解にかけた後、アミノ酸組成を決定した。プ
ロリンとシスティンは、過蟻酸酸化後、同しやり方で決
定された。この場合、フェノールを加水分解から省略し
た。トリプトファンは、５．７Ｎ塩酸。

１０％メルカプト酢酸（フェノールなし）中で試料４０
０μｋを２４時間加水分解した後に分析した。

分析は、ＡＡＩＯ樹脂の単一カラムを使用するベンクマ
ン１２１ＭＢアミノ酸分析装置で行なった。精製ＩＦＮ
−βＡｅｒ１７の代表的な２４−、４Ｂ−、７２一時間
の酸加水分解から計算されるアミノ酸組成は、Ｎ−末端
メチオニンが欠けているほかは、クローンＩＦＮ遺伝子
のＤＮＡ配列によって予測されるものとよく一致してい
る。精製ＩＦＮのアミノ酸末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）か
らの最初の５８残基のアミノ酸配列は、試料０．７ｍｇ
から、ベックマン５９ｏｃ配列測定装置で０．１Ｍクア
ドロール緩衝液を使って決定された。ＰＴＨアミノ酸は
、アルテックスウルトラスフェア−０ＤＳカラム（４、
６Ｘ　２５０ｍｍ）による逆相高圧液体クロマトグラフ
ィ（）ＩＪ’Ｌｃ）に４５℃でかけ、４０％緩衝液Ｂで
１．３分、４０〜７０％緩衝液Ｂで８．４分溶出するこ
とにより決定された。ここで緩衝液Ａは０．０１１５Ｍ
酢酸ナトリウム、５％テトラヒドロフラン（ｒＨＦ）　
。

ｐＨ５，１１であり、緩衝液Ｂはアセトニトリル中１０
％ＴＨＦであった。

決定されたＩＦＮ−β５ｅｒ１７のＮ末端アミノ酸配列
は、Ｎ−末端メチオニンの不在を除き、ＤＮＡ配列から
予測される予測配列に一致している。

上に示したように、ＩＦＮ−β５ｅｒ１７調製物は天然
のＩＦＮ−βの比活性レベルに非常に近いか、それより
すぐれた活性を示す。ＩＦＮ−β５ｅｒ１７は遊離スル
フヒドリル基をもたないが、３１及び１４１位にだけ残
っているシスティン間に１個の−５−８−結合を示す。

蛋白質は容易にオリゴマーをつくらず、実質的にモノマ
ー型にあると考えられる。本発明に従って得られるＩＦ
Ｎ−β５ｅｒ１７は単一生成物として又は種々の型の混
合物として不活性、無毒性。

非アレルギー性で、生理的に許容される担体媒体中にお
ける医薬として受は入れられる製剤へ処方でき、がん療
法で、又はインターフェロン療法が指示される症状にお
ける臨床用、治療用に、またウィルス感染用に使用でき
る。このような媒体は蒸留水、生理食塩水、リンゲル液
、ハング液等をを包含するが、これらに限定はされない
。デキストロース、　　）ＩｓＡ　（ヒト血清アルブミ
ン）等のような他の無毒性の安定化・可溶化用の添加物
も最適に包含してよい。治療処方剤は、経口で、又は静
脈内、筋肉内、腹腔内及び皮下投与のような非経口で投
与できる。本発明の変形ＩＦＮ−β製剤は、局所用に通
常利用される適当な媒体中で局所適用のためにも使用で
きる。

上記のＩＦＮ−βムティンの主な利点は、ＩＦＮ−βの
１７位の遊離スルフヒドリル基（−３Ｈ基）を排除され
ているところにあり、これによってムティンにｃｙｓ３
１とｃｙｓ１４１の間に正しいジスルフィド結合を形成
させ、十分な化物学的活性に明白に必要なコンフォメー
ションを取らせている。ＩＦＮ−β５ｅｒ１７の増大し
た比活性のため、治療用により少ない投与量が使える。

１７位置のシスティンを欠失させ、遊離−３Ｈ基を排除
することによって、ＩＦＮ−β５ｅｒｌ？蛋白質は微生
物でつくられるＩＦＮ−βはどたやすくダイマーやオリ
ゴマーを形成しない。これが蛋白質の精製を容易にし、
その安定性を強める。

ス蓬ｍよ ヒトＩＬ−２をコードするｃＤＮＡクローンのヌクレオ
チド配列、ＩＬ−２ｃＤＮＡライブラリーをつくる手順
、これをＩＬ−２についてスクリーニングする手順はテ
イー・タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、Ｔ、）＋　Ｎａ
ｔｕｒｅ　（１９８３年）２４巻３０５頁以降に記述さ
れている。

有力なＩＬ−２ｃＤＮＡクローンに関して濃縮されたｃ
ＤＮＡライブラリーは、慣用手順により、誘導された末
梢血液リンパ球（ＰＢＬ）とジャーカット細胞から得ら
れる濃縮されたＩＬ−２ｍＲＮＡフラクションからつく
られた。ＩＬ−２用ｍＲＮＡの濃縮は、ｍＲＮＡを分画
し、フラクションをキセノブス・ラエビス　（Ｘｅｎｏ
ｐｕｓｌａｅｖｉｓ）の未成熟卵母細胞に注入し、卵母
細胞の溶解物のＩＬ−２活性をＨＴ−２細胞で検定し、
ＩＬ−２ｍＲＮＡ活性をもつフラクションを確認するこ
とによって行った〔ジェイ・ワトソン（Ｊ、Ｗａｔｓｏ
ｎ）＋　Ｊ、　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、　（１９７９年）１５０巻１５７０−１５１９
頁及びニス・ギリス（Ｓ、　Ｇ１１ｌｉｓ）等、Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎ、（１９７８年）１２０巻２０２７〜２０３
２頁〕。

尖施炭上１．　　ＩＬ−２ｃＤＮＡクローンのスクリー
ニング点旦定 コロニーハイブリッド形成法を用いて、ＩＬ−２ｃＤＮ
Ａライブラリーをスクリーニングした。各ミクロタイタ
ープレートを重層したニトロセルロース濾紙（ＳＡＳタ
イプＢＡ　−８５）上にレプリカ法で写取り、アンピシ
リン５０μｇ７ｍｌを含有するし寒天上で３７℃、１４
〜１６時間生育させた。コロニーを溶解し、５００ｍＭ
水酸化ナトリウム、１．５Ｍ塩化ナトリウムで５分の連
続処理することによってＤＮ＾をフィルターに固定し、
５×標準クエン酸塩溶液（ＳＳＣ＞で５分ずつ２回洗っ
た。フィルターを空気乾燥し、８０℃で２時間炉乾燥し
た。重層フィルターをフィルター当たりｌ　Ｑｍ／！の
ＩＩＮＡハイブリッド形成緩衝液（５０％ホルムアミド
、５×ＳＳＣ、ｐＨ７，０、５Ｘデンハード液（ポリビ
ニルピロリジン、フィコール及び牛血清アルブミン；ｌ
ｘ＝各０．２％）、ｐＨ７，０の５０ｍＭ燐酸ナトリウ
ム緩衝液、０．２％ＳＯ３，２０μｇ７ｍｌｌポリＵ及
び５０μｇ／ｒｔｌｌの変形サケ精子ＤＮＡにより、４
２℃で６〜８時間事前ハイブリッド形成させた。

タニグチ（前掲）に報告されたＩＬ−２遺伝子配列に基
づいて３Ｚｐで標識された２０−ｍａｒオリゴヌクレオ
チドプローブをつくった。プローブのヌクレオチド配列
はＧＴＧＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＧＣＡＴＧＴＡであった
。

’　Ｐ　ｃＤＮＡプローブを含有するフィルター当たり
５ｍｌのＤＮＡハイブリッド形成緩衝液で、試料を４２
℃で２４〜３６時間ハイブリッド形成させた。フィルタ
ーを２　Ｘ５ＳＣ、０，１％ＳＤＳ、で３０分間ずつ２
回５０℃で洗い、次に１×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳで９
０分ずつ２回５０℃で洗い、空気乾燥し、−７０℃で２
〜３日間オートラジオグラフにかけた。陽性のクローン
を同定し、プローブで再度スクリーニングした。十分な
長さのクローンが、制限酵素地図作成、及びタニグチら
（前掲）が報告したＩＬ−２ｃＤＮＡクローンの配列と
の比較から確認された。

ノ【刈Ｅ發Ｌ」−２１Ｍ１３ベクターへのＩＬ−２゛　
　公子のクローニング 大腸菌ｔｒｐプロモーターの制御下にＩＬ−２遺伝子を
含有するプラスミドｐＬＷ１　（第１２図）を使用して
、実施例１に記載のと同様にＩＬ−２遺伝子をＭ１３ｍ
ｐ９へクローニングした。ｐｌＪ　１の試料は１９８３
年８月４日、２０８５２合衆国メソーランド州ロックビ
ル。

バークローン・ドライブ１２３０１番地、アメリカタイ
プ・カルチャー・コレクションに預託され、ＡＴＣＣ３
９，４０５号と指定を受けた。ＩＬ−２挿入部を含有す
る１クローン（Ｍ１３−　ＩＬ−２と称する）の制限地
図を第１３図に示す。１本鎖ファージＤＮＡをクローン
Ｍ１３−ＩＬ−２・からつくり、オリゴヌクオチドで指
示される突然変異誘発用の鋳型として使用した。

前記のとおり、ＩＬ−２はアミノ酸位置５８，１０５及
び１２５にシスティン残基を含んでいる。ＩＬ−２遺伝
子中でこれらの３個のシスティン残基用コドンを含有す
る部分のヌクレオチド配列に基づいて、三つのオリゴヌ
クレオチドプライマーを設計し、これらの残基用コドン
をセリン用コドンへ突然変異せしめるために合成した。

これらのオリゴヌクレオチドは次の配列をもっている。

ｃｙｓ　５８を変える　ＣＴＴＣＴＡＧＡＧＡＣＴＧＣ
ＡＧＡＴＧＴＴＴＣ（ＤＭ２７） ｃｙｓ１０５を変える　ＣＡＴＣＡＧＣＡＴＡＣＴＣＡ
ＧＡＣＡＴＧＡＡＴＧ（０Ｍ２８） ｃｙｓ１２５を変える　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　
ＣＴ　ＣＴ　Ｇ　１ｌｉｄ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　
Ａ　Ａ　Ｔ　Ｃ（０Ｍ２９） ０．１ｍＭ　ＡＴＤ　、　５０ｍＭ　）リス−塩酸、ｐ
Ｈ８，０゜１０ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭＤＴＴ及
びＴ４キナーゼ９単位の存在下に、５０μβ中で各オリ
ゴヌクレオチド４０ピコモルを別々に３７℃で１時間キ
ナーゼ処理した。キナーゼ処理されたプライマー（１０
ピコモル）の各々を、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２０
ｍＭ）リス−塩酸、ｐＨ７，９，２０ｍＭ塩化マグネシ
ウム及び２０ｍＭβ−メルカプトエタノールを含有する
混合物１５μβ中で、６７℃で５分及び４２℃で２５分
加熱することによって５５Ｍ１３−　ＩＬ−２ＤＮ八２
．６μｇへハイブリッド形成した。

アニーリングされた混合物を氷上で冷却し、次に０．５
ｍＭ各ｄＮＴＰ　、　１７ｍ　Ｍ　）リス−塩酸（ｐＨ
７，９）。

１７ｍ　Ｍ塩化マグネシウム、８３ｍＭ塩化ナトリウム
。

１７ｍＭβ−メルカプトエタノール、ＤＮΔポリメラー
ゼＩ　ｌ［ｌｅｎｏｗ断片５単位、　０．５　ｍ　ＭＡ
ＴＰ　、及びＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位を含有する反応
混合物２５μｌの最終容量まで調製し、３７℃で５時間
インキュベートした。８０°Ｃに加熱して反応を停止さ
せ、反応混合物をコンビテン）　ＪＭ１０３細胞の形質
転偉に使用し、寒天プレート上に播いて一夜培養すると
、ファージプラークが得られた。

突然変異誘発されたＭ２Ｓ−ＩＬ−２プラークを含んだ
プレートと、突然変異誘発されないＭＩ３−ＩＬ−２フ
アージプラークを含んだプレート２枚とを４℃に冷却し
、各プレートからのファージプラークを２枚のニトロセ
ルロース円形フィルター上へ、第一フィルターの場合に
は乾燥フィルターを寒天プレート上へ５分間重ね、第二
フィルターの場合には１５分間重ねて移した。次に０．
２Ｎ水酸化ナトリウム、１５Ｍ塩化ナトリウム及び０．
２％トリトンに浸した厚手の濾紙上にフィルターを５分
間置き、次に０．５　Ｍ　）リス−ＨＣＩｔ　（ｐＨ７
，５）　と１．５　ＭＮａＣｉｔに浸した濾紙上へさら
に５分間重ねて中和した。

フィルターを同様なやり方で、２ＸＳＳＣに浸したフィ
ルター上で２回洗い、乾燥してから真空乾燥炉内で８０
℃で２時間乾燥した。重層フィルターをフィルター当た
り１０ｍ　ｊ！のＤＮＡハイフ゛リッド形成緩衝液（５
ＸＳＳＣ）、ｐＨ７，０，４Ｘデンハード液（ポリビニ
ルピロリジン、フィコール及び牛血清アルブミン、１×
＝各０．０２％）、０．１％ｓｎｓ　。

５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐｆ（７，０）及びｉ
ｏ。

μｇ／ｍβ変性サケ精子ＤＮＡにより、４２℃で４時間
事前ハイブリッド形成させた。標識をつけたＡＴＰでオ
リゴヌクレオチドプライマーをキナーゼ処理することに
よって、３Ｚｐで標識をつけたプローブをつくった。フ
ィルター当たり５ｍＡのＤＮＡハイブリッド形成緩衝液
中で４２℃で８時間、３２ｐで標識したプライマー〇、
　Ｉ　Ｘ　１０　’ｃｐｍ／　ｍβにフィルターをハイ
ブリッド形成させた゛。０．１％ＳＤＳ及び２ＸＳＳＣ
を含有する洗浄緩衝液中で５０℃でそれぞれ３０分ずつ
２回、次に０．１％ＳＯ３及び０．２ｘ　ｓｓｃで５０
℃でそれぞれ３０分ずつ２回フィルターを洗った。フィ
ルターを空気乾燥し、−７０℃で２〜３日オートラジオ
グラフィにかけた。

オリゴヌクレオチドプライマーＤＭ２８及び０Ｍ２９は
、突然変異誘発されたクローンに新しいＤｄｅ　Ｉ制限
部位を創出するように設計されているから（第１４表）
、これらのキナーゼ処理されたプライマーとハイブリッ
ド形成された幾つかのクローンからのＲＦ　−ＤＮＡを
制限酵素Ｄｄｅ　Ｉで消化した。プライマー　ＤＨ２Ｂ
とハイブリッド形成し、新しいＤｄｅ　Ｔ制限部位をも
つ突然変異誘発されたＭ２Ｓ−ＩＬ−２プラークの一つ
（Ｍ２Ｓ−Ｖ４４）を取り上げ、ＪＭ１０３培養物へ接
種し、培養上澄液から５ｓＤＮＡを調製し、細胞ペレツ
トからｄｓＲＦ　−ＤＮＡを調製した。同じく、プライ
マーＤＭ２９とハイブリッド形成させたプラーク（Ｍ２
Ｓ−ＩＪ４６）を取り上げ、これから５ｓＤＮＡとＲＦ
−、ＤＮＡを調製した。オリゴヌクレオチドプライマー
ＤＭ２７はＤｄｅ　Ｉ位置の代わりに新しいＰｓｔｌ制
限部位を創出するように設計されている。従って、この
プライマーにハイブリッド形成されたプラークを新しい
Ｐｓｔ４部位の存在の点からスクリーニングした。この
ような一つのファージプラークを同定しくＭ２Ｓ−ＩＪ
４２）　、　　５ｓＤＮＡ及びＲＦ　−ＤＮＡをこれか
ら調製した。目標のシスティン用ＴＧＴコドンがセリン
用ＴＧＴコドンへ転化されたことを確認するため、これ
らの３クロ一ン全部から得たＤＮＡの配列を決定した。

Ｍ２Ｓ−Ｌ誓４２　、　Ｍ２Ｓ−ＬＷ４４　、及びＭ２
Ｓ−Ｌ葬４６からのＲＦ−ＤＮＡをそれぞれ制限酵素Ｈ
３ｎｄＩ［Ｉ及びＢａｎ　ＩＩで消化し、挿入断片を１
％アガロースゲルから精製した。

同様に、プラスミドｐＴｒｐ３　（第７図）を旧ｎｄｎ
［及びＢａｎ　Ｕで消化し、ｔｒｐプロモータを含有す
る大きなプラスミド断片をアガロースゲル上で精製し、
Ｍ２Ｓ−Ｌ見４２　、　Ｍ２Ｓ−ＬＷ４４及びＭ２Ｓ−
ＩＪ４６からｊｉｌ離された挿入断片の各々と連結した
。連結したプラスミドをコンピテント大腸菌に一１２Ｍ
Ｍ２９４株へ形質転換した。これらの形質転換体からの
プラスミドＤＮＡを制限酵素地図作成によって分析し、
プラスミドルＬ讐４２　　、ｐ’　　ＬＷ４４　　、及
びｐｌＪ４６の存在を確かめた。

第１４図はｐｌＪ４６の制限地図である。ｔｒｐプロモ
ーターを誘導するために、トリプトファンの不在下にこ
れらの個々のクローンの各々を生育させ、無細胞抽出液
をＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル上で分析し、３　り
ｏ　−７ｐＬＷ４２　　、　ｐＬＷ４４及びｐＬＷ４６
の全部が、１４．４Ｋｄ　ＩＬ−２蛋白質を合成するこ
とが立証された陽性対照のｐｌＪ２１に見られるものと
同様な１４．５Ｋｄ蛋白を合成することが示された。こ
れらの同じ抽出液をマウスＨＴ−２細胞でＩＬ−２活性
について検定すると、クローンｐｌＪ２１　（陽性対照
）とｐｌＪ４６のみが有意義量のＩＬ−２活性を示しく
下の第２表）、ｃｙｓ５Ｂとｃｙｓ１０５は生物学的活
性に必要なものであり、これをセリンに変えること（そ
れぞれｐｌＪ４２とｐｌＪ４４）によって生物学的活性
が失われることを意味している。一方ｃｙｓ１２５は、
これを５ｅｒ１２５（ｐＬＷ４６）へ変えても生物学的
活性に影響しないから、活性にとって不要であるに違い
ない。

］ＩＬ２−７　（陰性対照）　　　　　　　ＩＰＬＷ２
１　　　（陽性対照＞　　　　　　１１３，０００ＰＬ
Ｗ４２　　　　　　　　　　　　　６６０ＰＬＷ４４　
　　　　　　　　　　　１，９９０Ｐ　Ｌ　Ｗ　４６　
　　　　　　　　　　１２３，０００第１５ａ図は、ク
ローンｐｌＪ４６のコード鎖のヌクレオチド配列を示す
。天然のヒトＩＬ−２遺伝子のコード鎖に比べ、クロー
ンｐｌＪ４６はヌクレオチド３７４にＧ→Ｃの一つの塩
基の変化をもつ。第１５ｂ図は、ρ１Ｊ４６でコードさ
れたルー２ムテインの対応するアミノ酸配列を示す。こ
のムティンをＩＬ、−２ｓｅｒ１２５と称する。天然の
ＩＬ−２に比べ、ムティンは１２５位にシスティンの代
わりにセリンをもっている。

ｐｌＪ４６で形質転換されたＥ、コリに一１２ＭＭ２９
４株の試料は、１９８３年９月２６日９合衆国ソー　２
０８５２メリーランド州ロツクビル、パークローン・ド
ライブ１２３０１番地、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（八ｍｅｒｉｃａｍ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託され、ＡＴ
ＣＣ３９、４５２号に指定された。

ムティンＩＬ−２ｓｅｒ１２５のように１２５位のシス
ティンが欠損した又は別のアミノ酸でおき代えられたＩ
Ｌ−２ムテイン類は、ＩＬ−２活性を保持している。従
って、これらを天然のＩＬ−２と同じように処方、使用
できる。従って、このようなムティン類は細菌。

ウィルス、寄生虫、原生動物、及びカビの感染の診断と
処置、リンフ才力イン又は免疫不全の発現に、老令のヒ
ト及び動物における通常の免疫機能の再構成に、酵素増
幅、放射能標識、放射能映像化、及び病的状態のＩＬ−
２水準をモニターするこの技術で知られたその他の方法
など、診断検定法の開発に、リンフ才力イン類の受容体
部位を遮断する治療及び診断用に生体外でのＴ細胞生育
の促進のため、またその他種々の治療５診断、研究への
応用に有用である。ヒ）ＩＬ−２の種々の治療・診断へ
の応用については、ニス・エイ・ローゼンバーグ（Ｓ、
八、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）＋イー・エイ・グリム（Ｅ
、八。

Ｇｒｉｍ）　　ら、エイ・マザムダ−（Ａ、　Ｍａｚｕ
ｍｄｅｒ）　　ら、及びイー・エイ・グリムとニス・エ
イ・ローゼンバーグが研究報告している。ＩＬ−２はそ
れ自体、又は他の免疫学的に関連のあるＢ又はＴ細胞又
はその他の治療剤と組み合わせて使用できる。治療又は
診断用には、蒸留水、リンゲル液、バンク液。

生理的食塩水などの無毒性、非アレルギー性の生理学的
に許容される担体媒体中にこれらを処方できる。ヒト又
は動物へのＩＬ−２ムテイン類の投与は、医師が適当と
考えるところにより、経口、又は腹腔内又は筋肉内又は
皮下でありうる。関連細胞の例はＢ又はＴ細胞、天然の
キラー細胞等であり、本発明のポリペプチド類と組み合
わせて使用できる治療用試薬の例は、種々のインターフ
ェロン類、特にガンマインターフェロン、Ｂ細胞生長因
子。

ＩＬ−１等である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＩＦＮ−βのアミノ酸配列図である。 第２図は、オリゴヌクレアーゼ指示された突然変異誘発
による突然変異株ＩＦＮ−β遺伝子の調製を示す略図で
ある。 第３図は、ＩＦＮ−β遺伝子を含むプラスミドｐβｌ　
ｔｒｐの図である。 第４図は、クローニングベクターＭ１３ｍｌ）８フアー
ジの図である。 第５図は、クローンＭ１３−β１の制限地図を示す。 第６図は、コード領域で一つの塩基の変化を示す突然変
異ＩＦＮ−β５ｅｒ１７遺伝子の配列順序決定ゲルパタ
ーンを示す。 第７図は、発現プラスミドｐＴｒｐ　３の図である。 第８ａ図は、クローンｐＳＹ２５０１の旧ｎｆＩ制限パ
ターンを示し、第８ｂ図は生ずるその二つの１６９ｂｐ
及び２８ｂｐ断片を示す。 第９図は、クローンｐＳＹ２５０１の制限地図である。 第１０図は、ムティンＩＦＮ−β５ｅｒ１７を暗号づけ
るＤＮＡ配列と、これに対応するアミノ酸配列を示す。 第１１図は、クローンｐＳＹ２５０１及びｐβｌ　ｔｒ
ｐの抽出液におけるＩＦＮ−β５ｅｒ１７に対応する単
一の１８．０００ダルトンの蛋白質バンドを示す。 第１２図は、Ｅ、コリｔｒｐプロモーターの制御下にヒ
トインターロイキン−２、（ＩＬ−２）遺伝子を含有す
るプラスミドｐｌＪ１の図である。 第１３図は、ファージクローンＭ１３−ＩＬ２の制限地
図である。 第１４図は、プラスミドｐＬＷ４６の制限地図である。 第１５２及び１５ｂ図は、クローンｐｌＪ４６のコード
鎖のヌクレオチド配列、及びＩＬ−２ｓｅｒ１２５と称
するＩＬ−２ムテイの対応するアミノ酸配列をそれぞれ
示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ジスルフィド結合を自由に形成し、生物学的活性に
   とって本質的でない少なくとも１個のシステイン残基を
   もった、生物学的に活性な蛋白質の合成ムテインであっ
   て、そのムテインがシステイン残基の少なくとも１個を
   欠失しているか、又は別のアミノ酸でおき代えられてい
   るものをコードするＤＮＡ配列を遺伝子中に有する構造
   遺伝子を、ベクターが発現を許容する位置に含有するこ
   とを特徴とする発現ベクター。 ２、前記発現ベクターがプラスミドｐＳＹ２５０１であ
   る特許請求の範囲第１項記載の発現ベクター。 ３、前記発現ベクターがプラスミドｐＬＷ４６である特
   許請求の範囲第１項記載の発現ベクター。