JPS6357440B2 - - Google Patents
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- JPS6357440B2 JPS6357440B2 JP58195931A JP19593183A JPS6357440B2 JP S6357440 B2 JPS6357440 B2 JP S6357440B2 JP 58195931 A JP58195931 A JP 58195931A JP 19593183 A JP19593183 A JP 19593183A JP S6357440 B2 JPS6357440 B2 JP S6357440B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- interleukin
- ifn
- dna
- amino acid
- cysteine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は組換えDNA技術の一般的分野に関す
る。更に詳しくは、本発明はシステイン残基の一
つないしそれ以上の置換／欠損によつて親類似体
（parent analogs）とは異なつた突然変異的に改
変された生物学的に活性のある蛋白質に関する。 （従来の技術及び発明が解決しようとする問題
点） 組換えDNA（rDNA）技術よつて微生物学的に
つくられる生物学的に活性な蛋白質は、システイ
ン残基を含有しており、それらは活性に本質的な
ものではないが、分子間または分子内の望ましく
ない結合を自由に形成する。このような一つの蛋
白質は、微生物学的につくられるヒトのベータイ
ンターフエロン（IFN―β）である。rDNA技術
によつてIFN―βをつくる過程で、高濃度のIFN
―βを含有する大腸菌（E.Coli）抽出物中に、微
生物学的につくられるIFN―βのダイマーとオリ
ゴマーが形成されることが見い出された。このマ
ルチマー形成のため、IFN―βの精製と分離が非
常な手間と時間のかかるものとなり、精製中に蛋
白質を還元し、次いで元のコンフオメーシヨンに
戻すためにこれを再酸化するというように、精製
単離手順に追加の段階が幾つか必要になり、それ
によつて不正確なジスルフイド結合形成の可能性
が高まる。更に、おそらくはマルテイマー形成又
はランダムな分子内ジスルフイド架橋形成のた
め、微生物学的につくられるIFN―βは一貫して
低い比活性を示すこともわかつた。従つて、IFN
―βのように微生物学的につくられ生物活性のあ
る蛋白質を、その活性に悪影響を及ぼさず、しか
も蛋白質が望ましくない三次構造（例えば蛋白質
の活性を低下させるようなコンフオメーシヨン）
を有する結果になるような分子間架橋や分子内結
合の形成能力を減少し、又は排除する形で改変す
るのが望ましいであろう。 （問題点を解決するための手段） 本発明は定方向突然変異（directed
mutagenesis）により、親構造類似体（parent
analogs）の活性を保持するが、分子間ジスルフ
イド結合や望ましくない分子内ジスルフイド結合
の形成能力を欠いている突然変異的に改変された
生物学的活性蛋白質の製造に関する〔このような
蛋白質を「ムテイン」（mutein）という。「遺伝
学・細胞遺伝学用語辞典」（Glossary of
genetics and Cytogenetice）第４版、381頁、ス
プリンジヤー・バーラグ（1976年）〕。これに関
し、エツチ・エム・シエパード（Shepard，H.
M.）等〔Nature（1981年）294巻563頁〜565頁〕
はIFN―βについて、そのアミノ酸配列の141位
置のシステインがチロシンでおき代えられたムテ
インを記述している〔ヒトIFN―βには17，31及
び141位置にシステインがある。Gene（1980年）
10巻11〜15頁及びNature（1980年）285巻542―
547頁〕。このムテインは、IFN―β遺伝子のヌク
レオチド485にＧ→Ａ転位をもつ部分的IFN―β
cDNAクローンから構築された雑種遺伝子の細
菌による発現によつてつくられた。このムテイン
は本来のIFN―βの生物学的活性を失つており、
著者らは置き換えられたシステインが活性に本質
的であつたと結論するに至つた。 定方向突然変異（directed mutagenesis）技法
は周知であり、アール・エフ・レイサー
（Lather，R.F.）及びジエイ・ピー・レコツク
（Lecoq，J.P.）ジエネテイツク・エンジニアリン
グ（Genetic・Engineering）、アカデミツクプレ
ス社（1983年）31―50頁、に検討されている。オ
リゴヌクレオチドに指示された突然変異はエム・
スミス（Smith，M.）及びエス・ギラム
（Gillam，S.）、ジエネテイツク・エンジニアリ
ング：原理と方法、プレナムプレス社（1981年）
３巻１―32頁に具体的に検討されている。 本発明は、天然インターロイキン―２の125位
のシステイン残基が他のアミノ酸残基により置き
換えられており、且つ天然インターロイキン―２
の生物学的活性を有する変形されたインターロイ
キン―２、及びその製造方法に関する。 この変形されたインターロイキン―２は一般に
次の様にして製造することができる。 (a) 親蛋白質をコードした構造遺伝子の１本鎖か
らなる単鎖DNAを突然変異オリゴヌクレオチ
ドプライマーとハイブリダイズさせ（このプラ
イマーは、欠損又は代替えすべきシステイン用
コドン、又は場合によりこのコドンと対合をつ
くるアンチセンス・トリプレツトを包含する領
域に対して相補的なものであるが、当該コドン
の欠損又は他のアミノ酸をコードするトリプレ
ツトを規定するコドン又はアンチセンス・トリ
プレツトとは不一致（mismatch）である。）、 (b) DNAポリメラーゼによりプライマーを伸長
させ、突然変異性へテロデユプレツクス
（heteroduplex）を形成させ、そして、 (c) この突然変異性ヘテロデユプレツクスを複製
する。 本方法で用いられる突然変異株オリゴヌクレオ
チドプライマーは本発明のもう一つの面である。 本発明は、生物学的に活性な蛋白質の生物学的
活性に本質的ではないシステイン残基が、分子間
架橋又はまちがつた分子内ジスルフイド結合の形
成サイトを排除するために、計画的に欠損又は他
のアミノ酸でおき代えられているムテイン類、こ
のようなムテイン類をコードする突然変異遺伝
子、及びこのようなムテイン類をつくる手段を提
供する。 本発明によつて突然変異的に改変できる蛋白質
は、生物学的に活性な蛋白質のシステイン含量、
及びシステイン残基が活性と三次構造に関して果
たす役割について入手可能な情報から確認でき
る。文献ではこのような情報が入手できない蛋白
質については、本明細書に記載の手順によつて蛋
白質のシステイン残基の各々を系統的に変更し、
生ずるムテイン類の生物学的活性及びそれらが望
ましくない分子間又は分子内ジスルフイド結合を
形成する傾向について試験を行なうことによつ
て、この情報は決定できる。従つて、本発明は
IFN―β及びIL―２のムテイン類に関して下に特
に説明、例示されているが、望ましくないジスル
フイド結合の形成に対して蛋白質を感受性にする
ような、機能的に本質的ではないシステイン残基
を含有する生物学的に活性な任意のその他の蛋白
質に以下の教示が当てはまることが認められよ
う。IFN―βとIL―２以外に本発明による突然変
異性改変の候補となる蛋白質の例は、リンフオト
キシン（腫瘍壊死因子）とコロニー刺激因子―
１、それにIFN―α1である。候補蛋白質は、ふ
つうには奇数のシステイン残基をもつている。 IFN―βの場合、グリコシル化IFNと未グリコ
シル化IFNがいずれも定量的に同様な特異的活性
を示すこと、従つて、グリコシル部分はIFN―β
の生物学的活性に関与も貢献もしていないことが
報告された。しかし、細菌でつくられるグリコシ
ル化されていないIFN―βは、グリコシル化され
た天然IFN―βより量的に低い比活性を一貫して
示す。IFN―βは、17，31及び141の位置にシス
テイン残基をもつことが知られている。システイ
ン141は、シエパードから（前掲）により、生物
学的活性に本質的であることが立証された。４個
のシステイン残基を含有するIFN―αでは、二つ
の分子間―Ｓ―Ｓ―結合があり、一つはcys29と
cys138の間、他はcys1とcys98の間である。IFN
―βとIFN―αとの相同性に基づいて、IFN―β
のcys141はcys31と分子内―Ｓ―Ｓ結合にしてお
り、cys17は自由に分子間架橋を形成できるであ
ろう。cys17を欠失させるか、これを別のアミノ
酸と置換することによつて、cys17が生物学的活
性に本質的であるかどうか、また―Ｓ―Ｓ―結合
形成におけるその役割を決定できる。cys17が蛋
白質の生物学的活性に本質的でないならば、生ず
るcys17を欠損し又はcys17が置換された蛋白質
は、自然のIFN―βのそれに近い比活性を示し、
またおそらく蛋白質の単離精製を容易にもするで
あろう。 IFN―β遺伝子のcys17用コドン（codon）の
領域に対して相補的であるがこのコドン中に１又
は複数の塩基変化を含有する合成オリゴヌクレオ
チドプライマーを用いるオリゴヌクレオチドで指
示される突然変異誘発手順を使用してデザイナー
遺伝子がつくられ、こうしてcys17がその他任意
の選択されたアミノ酸でおき代えられる。欠損を
望む場合には、cys17用コドンを欠いたオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いる。cys17をグリシ
ン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシ
ン、チロシン、フエニルアラニン、ヒスチジン、
トリプトフアン、セリン、スレオニン及びメチオ
ニンのような中性アミノ酸へ変換するのが好まし
い方法である。セリン及びスレオニンは、システ
インと化学的類似性を有するため最も好ましい代
替え物である。システインを欠失させる時は、成
熟ムテインは自然の親蛋白質又は微生物でつくら
れるIFN―βよりアミノ酸１個だけ短い。 ヒトIL―２は、蛋白質の58，105及び125位に
システイン残基をもつと報告されている。IFN―
βの場合のように、IL―２は細菌の菌体から単
離される時は集合したオリゴマー型になつてい
て、細菌抽出物から良好な収量を得るためには、
還元剤で還元しなければならない。そのうえ、精
製され還元されたIL―２は不安定であり、貯蔵
時にオリゴマー不活性型へ容易に再酸化される。
３個のシステインが存在することは、天然分子に
見られるように正しい架橋は１個だけなのに、再
酸化時に蛋白質が３個の可能な分子内ジスルフイ
ド架橋の１個を無作為に形成しうることを意味し
ている。天然IL―２蛋白質のジスルフイド構造
がいかなるものか知られていないから、IL―２
遺伝子のコドン58，105及び125に突然変異をつく
り、どのシステイン残基が活性にとつて必要であ
るか、従つてまた自然のジスルフイド架橋形成に
関与している可能性が最も大きいかを確認するた
めに本発明を使用できる。同様に、活性にとつて
必要でないシステイン残基を修飾することによつ
てまちがつた分子内ジスルフイド架橋の形成を防
ぎ、そして遊離システイン残基の除去又は置き換
えによつて分子内間ジスルフイド架橋の機会を最
小限に抑えることができる。 オリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、突
然変異を導入すべき遺伝子領域へのプライマーの
安定なハイブリツド形成に必要な条件により、ま
た現在利用可能なオリゴヌクレオチド合成法の限
界によつて決まる。オリゴヌクレオチドで指示さ
れる突然変異誘発に使用するオリゴヌクレオチド
を設計するに当たつて、考慮すべき因子（例えば
全体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の
大きさ）は、エム・スミス及びエス・ギラム（前
掲）によつて記述されている。概して、オリゴヌ
クレオチドの全長は、突然変異サイトでの安定で
ユニークな雑種形成を最適化するような長さであ
り、突然変異サイトから5′及び3′未満までの伸長
部分（extensions）は、DNAポリメラーゼのエ
キソヌクレアーゼ活性による突然変異の作用をさ
けるのに十分な大きさとする。本発明に従つて突
然変異誘発に使用されるオリゴヌクレオチドは、
通常、約12個ないし約24個の塩基、好ましくは約
14個ないし約20個の塩基、更に好ましくは約14個
ないし18個の塩基を含有する。これらは通常、変
更又は欠失されるコドンの少なくとも約３個の塩
基3′を含有する。 変更されたIFN―β遺伝子をつくる方法は、大
体において、コドン17を消失させるか、又はそれ
が別のアミノ酸をコードするように変更する合成
ヌクレオチドプライマーを使用して、IFN―β遺
伝子のコドン17（TGT）に部位特異的突然変異を
誘発せしめるものである。システインをスレオニ
ンに変え、プライマーをIFN―β遺伝子のアンチ
センス鎖にハイブリツド形成させる場合、好まし
いヌクレオチドプライマーはGCAATTTTC
ACTCAGである（下線は変更されたコドンを示
す）。システインを欠失させるのが望ましい時は、
好ましいプライマーは
AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTGであ
り、これはcysに対するTGTコドンを喪失してい
る。システインをセリンに代える時は、セリン用
のAGTコドンを含んだ17―ヌクレオチドプライ
マーGCAATTTTCAGAGTCAGが選択される。
cys17で第一塩基Ｔ→Ａの転位により、システイ
ンからセリンへの変化が起る。欠失を導入する時
には、所望の蛋白質の発現のためにDNA配列の
適正なリーデイングフレームを保持しなければな
らない点を認識しなければならない。 プライマーはIFN―β遺伝子の１本鎖がクロー
ニングされたM13，fd，又はφ×174のような１
本鎖フアージヘハイブリツド形成される。フアー
ジが遺伝子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれ
でも担持できることは認められよう。フアージが
アンチセンス鎖を担持する場合には、プライマー
は、コドンの欠損、又は別のアミノ酸をコードす
るトリプレツトを規定するこのコドンとは一致し
ないが、突然変異させるコドンを含有するセンス
鎖の領域と同一である。フアージがセンス鎖を担
持する場合は、欠失させるコドンと対合するトリ
プレツト中では適当に不一致であるが、突然変異
させるコドンを含有するセンス鎖の領域に対して
相補的である。ハイブリツド形成に使用される条
件はエム・スミス及びエス・ギラム（前掲）によ
つて記述されている。温度は通常、約０℃ないし
70℃、もつと一般的には約10℃ないし50℃の範囲
にある。ハイブリツド形成後、プライマーは
DNAポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、
逆転写酵素又は他の適当なDNAポリメラーゼと
の反応によつてフアージDNA上で伸長される。
生ずるdsDNAは、T4DNAリガーゼのような
DANリガーゼでの処理によつて閉環式dsDNAへ
変換される。１本鎖領域を含有するDNA分子は
S1エンドヌクレアーゼ処理によつて破壊できる。 オリゴヌクレアーゼで指示される突然変異誘発
は、IL―２活性をもつがcys125からセリン125へ
変更されたムテインをコードする突然変異IL―
２遺伝子をつくるにも同様に使用できる。フアー
ジが遺伝子のセンス鎖を担持する場合に、この突
然変異IL―２遺伝子をつくるのに使われる好ま
しいオリゴヌクレオチドプライマーは
GATGATGCTTCTGAGAAAAGGTAATCで
ある。このオリゴヌクレオチドは、IL―２遺伝
子のコドン125と対合するトルプレツトのまん中
の塩基にＣ→Ｇの変化を有する。 得られた突然変異性ヘテロデイプレツクスは、
コンピテント宿主生物又は細胞を形質転換するの
に使用される。宿主によるヘテロデユプレツクス
の複製により、双方の鎖から子孫鎖ができる。複
製に続いて、突然変異鎖の子孫から突然変異遺伝
子を単離し、適当なベクターへ挿入し、このベク
ターを適当な宿主生物又は細胞の形質転換に使用
する。好ましいベクター類はプラスミド
pBR322、pCR1及びそれらの変異体、合成ベク
ター等である。適当な宿主生物はE.コリ（E.
Coli）、シユードモーナス（Pseudomonas）、パ
シルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バシ
ルス・スリンギエンシス（Bacillus
thuringiensis）、種々の酵母菌株、バシルス・サ
ーモフイルス（Bacillus thermophilus）、ハツカ
ネズミやラツト、チヤイニーズハムスターの卵巣
（CHO）細胞のような動物細胞、植物細胞、動植
物宿主等である。選んだ宿主をベクターで形質転
換する場合に、ムテインが発現されるために適当
なプロモータ・オペレーター配列も導入されるこ
とは認識されなければならない。宿主は原核生物
でも真核生物でも良い。（真核細胞へDNAを挿入
する方法は1981年９月３日公表されたPCT出願
番号US81／00239及びUS81／00240に記述されて
いる）。E.コリとCHO細胞が好ましい宿主であ
る。本発明に従つて得られるムテイン類は、天然
の親蛋白質に生ずるグリコシル化およびムテイン
調製に使われる宿主生物に依存してグリコシル化
される場合もされない場合もある。所望により、
宿主としてE.コリ（E.Coli）及びバシルス
（Bacillus）を使用する場合に得られる未グリコ
シル化ムテインを、この技術分野で知られている
科学的、酵素的及びその他の変法によつて生体外
で任意にグリコシル化してよい。 IFN―βに関する本発明の好ましい態様におい
ては、第１図に示すように、IFN―βのアミノ酸
配列において17位のシステイン残基は、成熟IFN
―βをコードするDNA配列のセンス鎖のコドン
17の第一塩基のＴ→Ａ転位によつて、セリンへ変
えられる。この部位特異的な突然変異誘発は、合
成17―ヌクレオチドプライマー
GCAATTTTCAGAGTCAGを使用して誘発さ
れ、このプライマーはコドン17の第一塩基に一個
の塩基の不一致がある以外は、コドン17の領域に
おけるIFN―βのセンス鎖上の17の個ヌクレオチ
ド配列と同一である。この不一致はプライマーの
ヌクレオチド12にある。遺伝暗号（コドン）は縮
重（degenerate）しており、アミノ酸の多くは
一つ以上のコドンによつて暗号づけられることが
認識されなければならない。例えばセリンの塩基
暗号は、TCT，TCG，TCC，TCA，AGT、及
びACGというコドンがいずれもセリンをコード
するように、６通りの縮重である。便宜上、好ま
しい態様としてAGTコドンが選ばれた。同様に、
スレオニンはACT，ACA，ACC及びACGのコ
ドンのどの一つによつてもコードされる。特定ア
ミノ酸に対して１コドンを特定する時は、これが
そのアミノ酸をコードするすべての縮重コドンを
包含することが意図されている。17―merは、
IFN―β遺伝子のアンチセンス鎖を担持する１本
鎖M13フアージDNAにハイブリツド形成される。
次に、DNAポリメラーゼ Klenow断片を使
用して、オリゴヌクレオチドをDNA上で伸長さ
せ、生ずるdsDNAをT4リガーゼで閉環状DNA
へ変換する。生ずる突然変異性ヘテロデユプレツ
クスの複製によつて、不一致を含有するDNA鎖
からクローンが得られる。突然変異クローンは、
特定の制限位置の存在又は不存在、抗生物質耐性
もしくは感受性、又はこの技術分野において知ら
れたその他の方法によつて確認され、スクリーニ
ングされる。システインをセリンによりおき代え
る場合は、第２図に示されるＴ→Ａ転位によつ
て、構造遺伝子の中に新しいHinf制限部位が
つくられる。突然変異クローンは、突然変異した
フアージプラークのハイブリツド形成スクリーニ
ングにおけるプローブとしてオリゴヌクレオチド
プライマーを使用して同定される。第２図に示さ
れるように、プライマーは親とハイブリツド形成
される時は唯一の不一致を有するが、突然変異し
たフアージDNAにハイブリツド形成される時は
完全な一致を有するであろう。オリゴヌクレオチ
ドプライマーを親DNAよりも突然変異DNAへ優
先的にハイブリツド形成させるようなハイブリツ
ド形成の条件を工夫できる。新しく発生した
Hinf部位も、IFN―β遺伝子の単一塩基の突
然変異を確認する手段として役立つ。 突然変異した遺伝子を担持するM13フアージ
DNAを単離し、プラスミドpTrp3のような適当
な発現ベクター中へ組み入れ、このベクターで大
腸菌MM294株を形質転換させる。形質転換体と
その子孫を培養するのに適した生育培地が当業者
に知られている。IFN―βの発現されたムテイン
を単離精製し、特徴づける。 以下の実施例は本発明の一層の理解を助けるた
め、また例示だけの目的で提示されている。これ
らはいかなる形においても本発明の範囲を限定す
るものと考えられてはならない。実施例１〜９は
IFN―βのムテインの調製を記述している。実施
例10〜15はIL―２のムテインの調製を記述して
いる。 実施例１ （参考例） IFN―β遺伝子のM13ベクターへのクローニン
グ １本鎖DNA鋳型の給源としてM13フアージベ
クターを使用することは、ジー・エス・テンプル
（G.F.Temple）ら、Nature（1982年）296巻537―
540頁で実証された。大腸菌trpプロモーターの制
御下にIFN―β遺伝子を含有するプラスミド
pβ1trp（第３図）を制限酵素Hind及びXhoで
消化した。M13mp8〔ジエイ・メツシング（J.
Messing）．「巨大分子に関する第３回クリーブラ
ンド・シンポジウム：組換えDNA」エイ・ウオ
ールトン編、エルザビアプレス社、143―153頁
（1981年）〕複製型（RF）DNA（第４図）を制限
酵素Hind及びBamHで消化し、予めHind
及びXhoで消化しておいたpβ1trpDNAと混合
した。次に混合物をT4DNAリガーゼで連結し、
連結DNAを大腸菌―JM103株のコンピテント細
胞中へ形質転換させ、Xgalインデイケータープ
レート上に播いた〔ジエイ・メツシング等、
Nucleic Acids Res（1981年）９巻309―321頁〕。
組換えフアージを含有するプラーク（白いプラー
ク）を取り上げ、新鮮なJM103の培養物に接種
し、そして感染細胞からRF分子のミニプレツプ
を調整した（エツチ・デイー・バーンボイム
（H.D.Birnboim）及びジエイ・ドリイ（J.
Doly）、Nucleic Acid Res（1979年）７巻1513―
1523頁）。IFN―β挿入部を含有するクローンを
同定するために、RF分子を種々の制限酵素で消
化した。このような１クローン（M13―β1）の
制限地図を第５図に示す。M13―β1クローンか
ら１本鎖（ss）フアージDNAをつくり、合成オ
リゴヌクレオチドを使用する部位特異的突然変異
誘発の鋳型として用いた。 実施例２ （参考例） 部位特異的突然変異誘発 0.1mMアデノシン三燐酸（ATP）、50mMヒド
ロキシメチルアミノメタン塩酸塩（トリス―塩
酸）PH8.0、10mM塩化マグネシウム、5mMジチ
オスレイトール（DDT）及びT4キナーゼ９単位
の存在下に、50μl中で合成オリゴヌクレオチド
GCAATTTTCAGAGTCAG（プライマー）40ピ
コモルをT4キナーゼにより37℃で１時間処理し
た。50mM塩化ナトリウム、10mMトリス―塩
酸、PH8.0、10mM塩化マグネシウム及び10mMβ
―メルカプトエタノールを含有する混合物50μl中
で、このキナーゼ処理されたプライマー（12ピコ
モル）を67℃で５分、及び42℃で25分加熱するこ
とによつて１本鎖（ss）M13―β1DNA5μgにハ
イブリツト形成させた。アニーリングした混合物
を次に氷上で冷却し、0.5mM各デオキシヌクレ
オチド三燐酸（dNTP）、80mMトリス―塩酸、
PH7.4、8mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナ
トリウム、DNAポリメラーゼ Klenow断片
９単位、0.5mMATP及びT4DNAリガーゼ２単
位を含有する反応混合物50μlに添加し、37℃で３
時間及び25℃で２時間インキユベートした。次に
フエノール抽出とエタノール沈澱によつて反応を
停止させた。DNAを10mMトリス―塩酸、PH
8.0、10mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、
50％蔗糖及び0.05％ブロモフエニルブルー中に溶
解し、臭化エチジウム2μg／mlの存在下、0.8％ア
ガロースゲル上の電気泳動にかけた。M13―β1
のRF型に対応するDNAバンドをパーコレート法
〔アール・ダブリユー・デービス（R.W.Davis）
３、「高等細菌遺伝学」（Advanced Bacterial
Genetics）、コールド・スプリング・ハーバー研
究所、N.Y.178〜179頁（1980年）〕によつてゲル
スライスから溶離した。溶離されたDNAをコン
ピテントJM103細胞の形質転換に使用し、菌を一
夜生育させ、培養基上澄液からssDNAを単離し
た。このssDNAをプライマー伸張の第二サイク
ルに鋳型として使用し、ゲル精製されたRF型
DNAをコンピテントJM103細胞中へ形質転換さ
せ、寒天プレート上に播き、一夜培養するとフア
ージプラークが得られる。 実施例３ （参考例） 部位特異的突然変異誘発 上の実施例２の実験をくり返す。但し、合成オ
リゴヌクレオチドプライマーとして、システイン
をコードするものからスレオニンをコードするも
のへIFN―β遺伝子のコドン17を変えるのに
GCAATTTTCAGACTCAGを使用する。 実施例４ （参考例） 部位特異的欠損 上の実施例２の実験をくり返す。但し合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーとしてはIFN―β遺伝
子のコドン17を欠損させるのに
AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTGを使用
する。 実施例５ （参考例） 突然変異誘発されたプラークのスクリーニング
及び同定 突然変異させたM13―βプラークの入つたプレ
ート（実施例１）並びに突然変異しないM13―
β1フアージプラークの入つた２枚のプレートを
４℃に冷却し、各プレートからのプラークを２枚
のニトロセルロース円形フイルター上へ、第一フ
イルターの場合には乾燥フイルターを寒天プレー
ト上へ５分間重ね、第二フイルターの場合は15分
間重ねて移した。次に0.2NNaOH、1.5M塩化ナ
トリウム及び0.2％トリトンＸ―100に浸した厚手
の濾紙上へフイルター類を５分間置き、次に
0.5Mトリス―塩酸、PH7.5、及び1.5M塩化ナトリ
ウムに浸した濾紙上へ更に５分間重ねて中和し
た。フイルターを同様なやり方で、２×SSC（標
準くえん酸塩）に浸したフイルター上で２回洗
い、乾燥し、真空乾燥炉内で80℃で２時間乾燥さ
せた。重複フイルターをフイルター当たり10mlの
DNAハイブリツド形成緩衝液（５×SSC）、PH
7.0、４×デンハード液（ポリビニルピロリドン、
フイコール及び牛血清アルブミン、１×＝各0.02
％）、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、
50mM燐酸ナトリウム緩衝液、PH7.0及び100μ
ｇ／mlの変性サケ精子DNAにより、55℃で４時
間、事前ハイブリツド形成させた。オリゴヌクレ
オチドプライマーを32Pで標識したATPでキナー
ゼ下に処理することによつて32Pで標識したプロ
ーブをつくつた。フイルター当たり５mlのDNA
ハイブリド形成緩衝液中でフイルターを32Pで標
識したプライマー3.5×105cpm／mlに55℃で24時
間ハイブリツド形成させた。0.1％SDSと減少す
る量のSSCを含有する洗浄用緩衝液中でそれれぞ
れ30分、55℃でフイルター類を洗つた。フイルタ
ー類を、初めに２×SSCを含んだ緩衝液で洗い、
そして突然変異していないM13―β1プラークを
含有する対照フイルターはガイガー計数管を用い
て放射能の存在について検査した。SSC濃度を段
階的に低下させ、未突然変異M13―βプラークを
もつ対照フイルター上に検出可能な放射能が残ら
なくなるまでフイルターを洗つた。SSCの使用最
低濃度は0.1×SSCであつた。フイルターを空気
乾燥し、−70℃で２〜３日オートラジオグラフ処
理した。突然変異したM13―β1のプラーク480個
と突然変異していない対照プラーク100個をキナ
ーゼ処理したオリゴヌクレオチドプローブによつ
てスクリーニングした。対照プラークではプロー
ブとハイブリツド形成したものが全く存在せず、
一方突然変異したM13―β1プラーク５個がプロ
ーブとハイブリツドを形成した。 ５個の突然変異M13―β1プラークの１個
（M13―SY2501）を取り上げ、JM103培養基へ接
種した。上澄液からssDNAを調製し、そして細
胞ペレツトから２本鎖（ds）DNAを調製した。
M13ユニバーサルプライマーを使用して、クロー
ンのジデオキシ配列決定用の鋳型としてssDNA
を使用した。配列決定分析の結果を第６図に示
す。この結果は、TGTcysコドンがAGTserコド
ンへ変換されたことを確証している。 実施例６ （考参例） 大腸菌における突然変異IFN―βの発現 M13―SY2501からのRF DNAを制限酵素
Hind及びXhoで消化し、520bpの挿入断片を
１％アガロースゲル上で精製した。大腸菌trpプ
ロモーターを含有するプラスミドpTrp3（第７図）
を酵素Hind及びBamHで消化し、精製した
M13―SY2501断片と混合し、T4DNAリガーゼ
の存在下に連結した。連結DNAをE.コリMM294
株へ形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体
を薬剤テトラサイクリンに対する感受性の点から
スクリーニングした。アンピシリン耐性でテトラ
サイクリン感受性の５クローンからのプラスミド
DNAを、M13―SY2501挿入部の存在についてス
クリーニングするためHinfで消化した。第８
ａ図は、クローンの一つ（pSY2501）のHinf
制限パターンを示すが、図ではこれを元のIFN―
βクローンすなわちpβ1trpのHinfパターンを
比較している。予想のように、pSY2501に追加の
Hinfサイトがあり、197bpのIFN―β内部断片
が169bpの断片と28bpの断片に切れている（第８
ｂ図）。クローンpSY2501の制限地図を第９図に
示す。突然変異IFN―β遺伝子の完全なDNA配
列を、予測されたアミノ酸配列と一緒に第１０図
に示す。クローンpSY2501と称するプラスミドは
60604イリノイ州ペオリア、ノース・ユニバーシ
テイ・ストリート1815番地、米国農務省、科学教
育局北部研究センター、発酵研究所のアグリカル
チユラル・リサーチ・カルチヤーコレクシヨン
（NRRL）に寄託されている。指定された寄託番
号はCMCC1533号及びNRRLB―15356号（ブダ
ペスト条約に基づく寄託）である。 pSY2501及びpβ1trp（子孫を含む）の培養物を
1.0の光学密度（0D600）まで生育させた。無細胞
抽出物をつくり、IFN―βの抗ウイルス活性量を
微量力価検定法でGM2767細胞によつて検定し
た。クローンpSY2501の抽出物はpβ1trpより３〜
10培高い活性を示し（第１表）、クローン
pSY2501がIFN―β活性を示す蛋白質をより多量
に合成しているか、又はつくられた蛋白質がより
高い比活性をもつているかのいずれかであること
が示される。 第 １ 表 抽出物 抗ウイルス活性（単位／ml） pSY2501 ６×105 pβ1trp １×105 ptrp3（対照） 30 クローンpSY2501が数倍多い活性蛋白を合成し
ていたかどうか決定するため、両クローンの抽出
物を対照抽出物と共にSDSポリアクリルアミドゲ
ル上の電気泳動にかけ、ゲルをクーマージーブル
ーで染色して蛋白質を発色させた。第１１図に示
すように、クローンpSY2501とpβ1trpの抽出物中
に存在するが対照のptrp3抽出物中にはない約
18000ダルトンの蛋白質に対応する蛋白質バンド
が一つだけであつた。この蛋白質は約20000ダル
トンの分子量をもつが、18000ダルトンの蛋白質
のゲル移動パターンを示しており、pβ1trpの抽出
物からこの蛋白質を精製することによつてIFN―
βであることが予めわかつていた。pSY2501抽出
物中にはpβ1trpの抽出物中よりこの蛋白質の量が
少ないから、クローンpSY2501抽出物中の蛋白質
の比活性はクローンpβ1trpのそれより高い。 実施例７ （考参例） IFM―βser17の精製 IFN―βser17をつくるように形質転換されたE.
コリからIFN―βser17を回収した。E.コリを次の
生育培地中で、680nmで10〜11の光学密度（乾燥
重量8.4ｇ／）まで生育させた。 成 分 濃 度 塩化アンモニウム 20mM 硫酸カリウム 16.1mM 燐酸一カリウム 7.8mM 燐酸二ナトリウム 12.2mM 硫酸マグネシウム・七水和物 3mM クエン酸三ナトリウム・二水和物 1.5mM 硫酸マンガン・四水和物 30μM 硫酸亜鉛・七水和物 30μM 硫酸銅・五水和物 3μM Ｌ―トリプトフアン 70mg／ 硫酸第一鉄・七水和物 72μM チアミン塩酸塩 20mg／ グルコース 40ｇ／ アンモニアでPH調整 形質転換ずみE.コリの収穫物9.9（9.9Kg）を
20℃に冷却し、濾液重量が8.8Kgになるまで、収
穫物を−110kpaの平均圧力損失と毎分260mlの定
常濾液流量でクロスフローフイルターに通すこと
により濃縮した。濃縮液（約１）を容器に流し
込み、15℃に冷却した。濃縮液を５℃、約
69000kpaでマントン＝ゴーリンホモジナイザー
に通すことによつて濃縮液中の菌体を破砕した。
燐酸塩で緩衝化された食塩水、PH7.4（PBS）１
でホモジナイザーを洗い、洗浄液を破砕物に加え
ると、２の最終容量が得られた。この容量を毎
分50mlの流量で12000×ｇの連続遠心分離にかけ
た。固体を上澄液から分離し、２重量％SDSを含
有するPBS ４に再懸濁させた。この懸濁液を
室温で15分かきまぜたあと、目に見える懸濁物は
なかつた。次に溶液を２―ブタノールで、２―ブ
タノール：溶液の１：１容量比で抽出した。液―
液相分離装置中で毎分200mlの流量を用いて抽出
を行なつた。次に有機相を分離し、そして蒸発乾
固させることにより蛋白質21.3ｇを得た。これを
蒸留水に１：10の容量比で再懸濁した。 回収された生成物は、ウイルスの細胞病理作用
（CPE）に対する防護に基づく検定を用いて、ヒ
トIFN―β活性について検定された。ミクロタイ
タープレート内でこの検定を行なつた。最少基本
倍地50μlを各容器に仕込み、第一容器には資料
25μlを入れ、つぎ容器以降には１：３の容量の希
釈を連続的に行なつた。ウイルス（水泡性口内
炎）、細胞（ヒト線維芽細胞GM―2767系統）及
び標準IFN―β対照群を各プレートに収容せしめ
た。ml当たり100単位の標準IFN―βを使用した。
次にプレートに紫外線を10分間照射した。照射
後、細胞懸濁液（ml当たり細胞1.2×105）100μl
を各容器に加え、トレーを18〜24時間インキユベ
ートした。細胞当たり１プラーク形成単位でウイ
ルス液を細胞対照プレートを除く各容器に加え
た。ウイルス対照が100％のCPEを示すまでトレ
ーをインキユベートした。これは、ウイルス液を
加えてから通常18〜24時間で生じた。標準IFN―
β対照の50％CPE容器の位置の点から検定結果
を解釈した。この点からプレート上の全試料につ
いてのインターフエロンの力価を測定した。回収
された生成物の比活性は５×107U／mlと決定さ
れた。 実施例８ （考参例） 酸沈澱及びクロマトグラフイによる精製 実施例７の方法をくり返したが、但し、抽出、
水相と有機相の分離、及び有機相とPBSとの容
量比３：１での混合の後、氷酢酸の添加によつて
混合物のPHを約５に下げた。生じた沈澱物を
10000〜17000xg、15分間の遠心分離によつて分
離し、ペレツトを10％Ｗ／Ｖ SDS、10mM
DTT、50mM酢酸ナトリウム緩衝液、PH5.5に再
溶解し、80℃に５分間加熱した。 次に、溶液を、ベツクマン勾配系を使用して、
ブラウンリーRP―300、10μM、「アクアポア」カ
ラムにかけた。緩衝液Ａは水中0.1％トリフルオ
ロ酢酸（TFA）であり、緩衝液Ｂはアセトニト
リル中0.1％TFAとした。検出は280nmだの紫外
線吸光度によつた。溶媒プログラムは３時間で０
％緩衝液Ｂから100％緩衝液Ｂへの線形勾配とし
た。最高のインターフエロン活性を含有するフラ
クシヨンをプールし、このプールされたインター
フエロン調製物の比活性は、天然のIFN―βにお
ける蛋白質mg当たり約２×108国際単位に比べ、
9.0×107ないし3.8×108U／mlと決定された。 実施例９ （考参例） IFN―βser17の生化学的特徴付け 5.7N HCl、0.1％フエノールの200μl中におい
て試料40μgを108℃で24〜72時間の加水分解にか
けた後、アミノ酸組成を決定した。プロリンとシ
ステインは、過蟻酸酸化後、同じやり方で決定さ
れた。この場合、フエノールを加水分解から省略
した。トリプトフアンは、5.7N塩酸、10％メル
カプト酢酸（フエノールなし）中で試料400μlを
24時間加水分解した後に分析した。分析は、
AA10樹脂の単一カラムを使用するベツクマン
121MBアミノ酸分析装置で行なつた。精製IFN
―βser17の代表的な24―、48―、72―時間の酸加
水分解から計算されるアミノ酸組成は、Ｎ―末端
メチオニンが欠けているほかは、クローンIFN遺
伝子のDNA配列によつて予測されるものとよく
一致している。精製IFNのアミノ酸末端
（terminus）からの最初の58残基のアミノ酸配列
は、試料0.7mgから、ベツクマン890C配列測定装
置で0.1Mクアドロール緩衝液を使つて決定され
た。PTHアミノ酸は、アルテツクスウルトラス
フエアー0DSカラム（4.6×250mm）による逆相高
圧液体クロマトグラフイ（HPLC）に45℃でか
け、40％緩衝液Ｂで1.3分、40〜70％緩衝液Ｂで
8.4分溶出することにより決定された。ここで緩
衝液Ａは0.0115M酢酸ナトリウム、５％テトラヒ
ドロフラン（THF）、PH5.11であり、緩衝液Ｂは
アセトニトリル中10％THFであつた。 決定されたIFN―βser17のＮ末満アミノ酸配列
は、Ｎ―末端メチオニンの不在を除き、DNA配
列から予測される予測配列に一致している。 上に示したように、IFN―βser17調製物は天然
のIFN―βの比活性レベルに非常に近いか、それ
よりすぐれた活性を示す。IFN―βser17は遊離ス
ルフヒドリル基をもたないが、31及び141位にだ
け残つているシステイン間に１個の―Ｓ―Ｓ―結
合を示す。蛋白質は容易にオリゴマーをつくら
ず、実質的にモノマー型にあると考えられる。本
発明に従つて得られるIFN―βser17は単一生成物
として又は種々の型の混合物として不活性、無毒
性、非アレルギー性で、生理的に許容される担体
媒体中における医薬として受け入れられる製剤へ
処方でき、がん療法で、又はインターフエロン療
法が指示される症状における臨床用、治療用に、
またウイルス感染用に使用できる。このような媒
体は蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、ハンク液
等をを包含するが、これらに限定はされない。デ
キストロース、HSA（ヒト血清アルブミン）等の
ような他の無毒性の安定化・可溶化用の添加物も
最適に包含してよい。治療処方剤は、経口で、又
は静脈内、筋肉内、腹腔内及び皮下投与のような
非経口で投与できる。本発明の変形IFN―β製剤
は、局所用に通常利用される適当な媒体中で局所
適用のためにも使用できる。 上記のIFN―βムテインの主な利点は、IFN―
βの17位の遊離スルフヒドリル基（―SH基）を
排除されているところにあり、これによつてムテ
インにcys31とcys141の間に正しいジスルフイド
結合を形成させ、十分な生物学的活性に明白に必
要なコンフオメーシヨンを取らせている。IFN―
βser17の増大した比活性のため、治療用により少
ない投与量が使える。17位置のシステインを欠失
させ、遊離―SH基を排除することによつて、
IFN―βser17蛋白質は微生物でつくられるIFN―
βほどたやすくダイマーやオリゴマーを形成しな
い。これが蛋白質の精製を容易にし、その安定性
を強める。 実施例 10 ヒトIL―２をコードするcDNAクローンのヌ
クレオチド配列、IL―2cDNAライブラリーをつ
くる手順、これをIL―２についてスクリーニン
グする手順はテイー・タニグチ（Taniguchi，
T.），Nature（1983年）302 24 305頁以降に記述
されている。 有力なIL―2cDNAクローンに関して濃縮され
たcDNAライブラリーは、慣用手順により、誘導
された末梢血液リンパ球（PBL）とジヤーカツ
ト細胞から得られる濃縮されたIL―2mRNAフラ
クシヨンからつくられた。IL―２用mRNAの濃
縮は、mRANを分画し、フラクシヨンをキセノ
プス・ラエビス（Xenopus laevis）の未成熟卵
母細胞に注入し、卵母細胞の溶解物のIL―２活
性をHT―２細胞で検定し、IL―2mRNA活性を
もつフラクシヨンを確認することによつて行つた
〔ジエイ・ワトソン（J.Watson），J.Exp.Med.
（1979年）150巻1570〜1519頁及びエス・ギリス
（S.Gillis）等、J.Immun.（1978年）120巻2027〜
2032頁〕。 実施例 11 IL―2cDNAクローンのスクリーニングと同定 コロニーハイブリツド形成法を用いて、IL―
2cDNAライブラリーをスクリーニングした。各
ミクロタイタープレートを重層したニトロセルロ
ース濾紙（Ｓ＆ＳタイプBA―85）上にレプリカ
法で写取り、アンピシリン50μg／mlを含有する
Ｌ寒天上で37℃、14〜16時間生育させた。コロニ
ーを溶解し、500mM水酸化ナトリウム、1.5M塩
化ナトリウムで５分の連続処理することによつて
DNAをフイルターに固定し、５×標準クエン酸
塩溶液（SSC）で５分ずつ２回洗つた。フイルタ
ーを空気乾燥し、80℃で２時間炉乾燥した。重層
フイルターをフイルター当たり10mlのDNAハイ
ブリツド形成緩衝液（50％ホルムアミド、５×
SSC、PH7.0、５×デンハード液（ポリビニルピ
ロリジン、フイコール及び牛血清アルブミン；１
×＝各0.2％）、PH7.0の50mM燐酸ナトリウム緩衝
液、0.2％SDS、20μg／mlポリＵ及び50μg／mlの
変形サケ精子DNAにより、42℃で６〜８時間事
前ハイブリツド形成させた。 タニグチ（前掲）に報告されたIL―２遺伝子
配列に基づいて32Pで標識された20―merオリゴ
ヌクレオチドプローブをつくつた。プローブのヌ
クレオチド配列は
GTGGCCTTCTTGGGCATGTAであつた。 32PcDNAプローブを含有するフイルター当た
り５mlのDNAハイブリツド形成緩衝液で、試料
を42℃で24〜36時間ハイブリツド形成させた。フ
イルターを２×SSC、0.1％SDS、で30分間ずつ
２回50℃で洗い、次に１×SSCと0.1％SDSで90
分ずつ２回50℃で洗い、空気乾燥し、−70℃で２
〜３日間オートラジオグラフにかけた。陽性のク
ローンを同定し、プローブで再度スクリーニング
した。十分な長さのクローンが、制限酵素地図作
成、及びタニグチら（前掲）が報告したIL―
2cDNAクローンの配列との比較から確認された。 実施例 12 M13ベクターへのIL―２遺伝子のクローニン
グ 大腸菌trpプロモーターの制御下にIL―２遺伝
子を含有するプラスミドpLW1（第１２図）を使
用して、実施例１に記載のと同様にIL―２遺伝
子をM13mp9へクローニングした。pLW1の試料
は1983年８月４日、20852合衆国メリーランド州
ロツクビル、パークローン・ドライブ12301番地、
アメリカタイプ・カルチヤー・コレクシヨンに預
託され、ATCC39，405号（ブタペスト条約に基
づく国際寄託）と指定を受けた。IL―２挿入部
を含有する１クローン（M13―IL―２と称する）
の制限地図を第１３図に示す。１本鎖フアージ
DNAをクローンM13―IL―２からつくり、オリ
ゴヌクレオチドで指示される突然変異誘発用の鋳
型として使用した。 実施例 13 オリゴヌクレオチドで指示された突然変異誘発 前記のとおり、IL―２はアミノ酸位置58，105
及び125にシステイン残基を含んでいる。IL―２
遺伝子中でこれらの３個のシステイン残基用コド
ンを含有する部分のヌクレオチド配列に基づい
て、三つのオリゴヌクレオチドプライマーを設計
し、これらの残基用コドンをセリン用コドンへ突
然変異せしめるために合成した。これらのオリゴ
ヌクレオチドは次の配列をもつている。 cys58を変える CTTCTAGAGACTGCAGATGTTTC
（DM27） cys105を変える CATCAGCATACTCAGACATGAATG
（DM28） cys125を変える GATGATGCTCTGAGAAAAGGTAATC
（DM29） 0.1mM ATD、50mMトリス―塩酸、PH8.0、
10mM塩化マグネシウム、5mMDTT及びT4キナ
ーゼ９単位の存在下に、50μl中で各オリゴヌクレ
オチド40ピコモルを別々に37℃で１時間キナーゼ
処理した。キナーゼ処理されたプライマー（10ピ
コモル）の各々を、100mM塩化ナトリウム、
20mMトリス―塩酸、PH7.9、20mM塩化マグネ
シウム及び20mMβ―メルカプトエタノールを含
有する混合物15μl中で、67℃で５分及び42℃で25
分加熱することによつてssM13―IL―
2DNA2.6μgへハイブリツド形成した。アニーリ
ングされた混合物を氷上で冷却し、次に0.5mM
各dNTP、17mMトリス―塩酸（PH7.9）、17mM
塩化マグネシウム、83mM塩化ナトリウム、
17mMβ―メルカプトエタノール、DNAポリメラ
ーゼ Klenow断片５単位、0.5mMATP、及
びT4DNAリガーゼ２単位を含有する反応混合物
25μlの最終容量まで調製し、37℃で５時間インキ
ユベートした。80℃に加熱して反応を停止させ、
反応混合物をコンピテントJM103細胞の形質転換
に使用し、寒天プレート上に播いて一夜培養する
と、フアージプラークが得られた。 実施例 14 突然変異誘発されたフアージプラークのスクリ
ーニングと同定 突然変異誘発されたM13―IL―２プラークを
含んだプレートと、突然変異誘発されないM13―
IL―２フアージプラークご含んだプレート２枚
とを４℃に冷却し、各プレートからのフアージプ
ラークを２枚のニトロセルロース円形フイルター
上へ、第一フイルターの場合には乾燥フイルター
を寒天プレート上へ５分間重ね、第二フイルター
の場合には15分間重ねて移した。次に0.2N水酸
化ナトリウム、15M塩化ナトリウム及び0.2％ト
リトンに浸した厚手の濾紙上にフイルターを５分
間置き、次に0.5Mトリス―HCl（PH7.5）と
1.5MNaClに浸した濾紙上へさらに５分間重ねて
中和した。フイルターを同様なやり方で、２×
SSCに浸したフイルター上で２回洗い、乾燥して
から真空乾燥炉内で80℃で２時間乾燥した。重層
フイルターをフイルター当たり10mlのDNAハイ
ブリツド形成緩衝液（５×SSC）、PH7.0、４×デ
ンハード液（ポリビニルピロリジン、フイコール
及び牛血清アルブミン、１×＝各0.02％）、0.1％
SDS、50mM燐酸ナトリウム緩衝液（PH7.0）及
び100μg／ml変性サケ精子DNAにより、42℃で
４時間事前ハイブリツド形成させた。標識をつけ
たATPでオリゴヌクレオチドプライマーをキナ
ーゼ処理することによつて、32Pで標識をつけたプ
ローブをつくつた。フイルター当たり５mlの
DNAハイブリツド形成緩衝液中で42℃で８時間、
32Pで標識したプライマー０・１×105cpm／mlに
フイルターをハイブリツド形成させた。0.1％
SDS及び２×SSCを含有する洗浄緩衝液中で50℃
でそれぞれ30分ずつ２回、次に0.1％SDS及び0.2
×SSCで50℃でそれぞれ30分ずつ２回フイルター
を洗つた。フイルターを空気乾燥し、−70℃で２
〜３日オートラジオグラフイにかけた。 オリゴヌクレオチドプライマーDM28及び
DM29は、突然変異誘発されたクローンに新しい
Dde制限部位を創出するように設計されている
から（第14表）、これらのキナーゼ処理されたプ
ライマーとハイブリツド形成された幾つかのクロ
ーンからのRF―DNAを制限酵素Ddeで消化し
た。プライマーDM28とハイブリツド形成し、新
しいDde制限部位をもつ突然変異誘発された
M13―IL―２プラークの一つ（M13―LW44）を
取り上げ、JM103培養物へ接種し、培養上澄液か
らssDNAを調製し、細胞ペレツトからdsRF―
DNAを調製した。同じく、プライマーDM29と
ハイブリツド形成させたプラーク（M13―
LW46）を取り上げ、これからssDNAとRF―
DNAを調製した。オリゴヌクレオチドプライマ
ーDM27はDde位置の代わりに新しいPst制
限部位を創出するように設計されている。従つ
て、このプライマーにハイブリツド形成されたプ
ラークを新しいPst部位の存在の点からスクリ
ーニングした。このような一つのフアージプラー
クを同定し（M13―LW42）、ssDNA及びRF―
DNAをこれから調製した。目標のシステイン用
TGTコドンがセリン用TCTコドンへ転化された
ことを確認するため、これらの３クローン全部か
ら得たDNAの配列を決定した。 実施例 15 大腸菌における発現のため突然変異誘発IL―
２遺伝子の再クローニング M13―LW42、M13―LW44、及びM13―
LW46からのRF―DNAをそれぞれ制限酵素Hind
及びBanで消化し、挿入断片を１％アガロー
スゲルから精製した。同様に、プラスミドpTrp3
（第７図）をHind及びBanで消化し、trpプ
ロモータを含有する大きなプラスミド断片をアガ
ロースゲル上で精製し、M13―LW42、M13―
LW44及びM13―LW46から単離された挿入断片
の各々と連結した。連結したプラスミドをコンピ
テント大腸菌Ｋ―12MM294株へ形質転換した。
これらの形質転換体からのプラスミドDNAを制
限酵素地図作成によつて分析し、プラスミド
pLW42、PLW44、及びpLW46の存在を確かめ
た。第１４図はpLW46の制限地図である。trpプ
ロモーターを誘導するために、トリプトフアンの
不在下にこれらの個々のクローンの各々を生育さ
せ、無細胞抽出液をSDS―ポリアクリルアミドゲ
ル上で分析し、３クローンpLW42、pLW44及び
pLW46の全部が、14.4Kd IL―２蛋白質を合成す
ることが立証された陽性対照のpLW21に見られ
るものと同様な14.5Kd蛋白を合成することが示
された。これらの同じ抽出液をマウスHT―２細
胞でIL―２活性について検定すると、クローン
pLW21（陽性対照）とpLW46のみが有意義量の
IL―２活性を示し（下の第２表）、cys58と
cys105は生物学的活性に必要なものであり、これ
をセリンに変えること（それぞれpLW42と
pLW44）によつて生物学的活性が失われること
を意味している。一方cys125は、これをser125
（pLW46）へ変えても生物学的活性に影響しない
から、活性にとつて不要であるに違いない。 第 ２ 表 クローン IL―２活性（μ／ml） PIL2―７（陰性対照） １ PLW21（陽性対照） 113000 PLW42 660 PLW44 1990 PLW46 123000 第１５ａ図は、クローンpLW46のコード鎖の
ヌクレオチド配列を示す。天然のヒトIL―２遺
伝子のコード鎖に比べ、クローンpLW46はヌク
レチド374にＧ→Ｃの一つの塩基の変化をもつ。
第１５ｂ図は、pLW46でコードされたIL―２ム
テインの対応するアミノ酸配列を示す。このムテ
インをIL―2ser125と称する。天然のIL―２に比
べ、ムテインは125位にシステインの代わりにセ
リンをもつている。 pLW46で形質転換されたE.コリＫ―12MM294
株の試料は、1983年９月26日、合衆国、20852メ
リーランド州ロツクビル、バークローン・ドライ
ブ12301番地、アメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨン（Americam Type Culture
Collection）に寄託され、ATCC39452号（ブダ
ペスト条約に基づく国際寄託）に指持された。 ムテインIL―2ser125のように125位のシステイ
ンが欠損した又は別のアミノ酸でおき代えられた
IL―２ムテイン類は、IL―２活性を保持してい
る。従つて、これらを天然のIL―２と同じよう
に処方、使用できる。従つて、このようなムテイ
ン類は細菌、ウイルス、寄生虫、原生動物、及び
カビの感染の診断と処置、リンフオカイン又は免
疫不全の発現に、老令のヒト及び動物における通
常の免疫機能の再構成に、酵素増幅、放射能標
識、放射能映像化、及び病的状態のIL―２水準
をモニターするこの技術で知られたその他の方法
など、診断検定法の開発に、リンフオカイン類の
受容体部位を遮断する治療及び診断用に生体外で
のＴ細胞生育の促進のため、またその他種々の治
療、診断、研究への応用に有用である。ヒトIL
―２の種々の治療・診断への応用については、エ
ス・エイ・ローゼンバーグ（S.A.Rosenberg）、
イー・エイ・グリム（E.A.Grim）ら、エイ・マ
ザムダー（A.Mazumder）ら、及びイー・エ
イ・グリムとエス・エイ・ローゼンバーグが研究
報告している。IL―２はそれ自体、又は他の免
疫学的に関連のあるＢ又はＴ細胞又はその他の治
療剤と組み合わせて使用できる。治療又は診断用
には、蒸留水、リンゲル液、ハンク液、生理的食
塩水などの無毒生、非アレルギー性の生理学的に
許容される担体媒体中にこれらを処方できる。ヒ
ト又は動物へのIL―２ムテイン類の投与は、医
師が適当と考えるところにより、経口、又は腹腔
内又は筋肉内又は皮下でありうる。関連細胞の例
はＢ又はＴ細胞、天然のキラー細胞等であり、本
発明のポリペプチド類と組み合わせて使用できる
治療用試薬の例は、種々のインターフエロン類、
特にガンマインターフエロン、Ｂ細胞生長因子、
IL―１等である。
る。更に詳しくは、本発明はシステイン残基の一
つないしそれ以上の置換／欠損によつて親類似体
（parent analogs）とは異なつた突然変異的に改
変された生物学的に活性のある蛋白質に関する。 （従来の技術及び発明が解決しようとする問題
点） 組換えDNA（rDNA）技術よつて微生物学的に
つくられる生物学的に活性な蛋白質は、システイ
ン残基を含有しており、それらは活性に本質的な
ものではないが、分子間または分子内の望ましく
ない結合を自由に形成する。このような一つの蛋
白質は、微生物学的につくられるヒトのベータイ
ンターフエロン（IFN―β）である。rDNA技術
によつてIFN―βをつくる過程で、高濃度のIFN
―βを含有する大腸菌（E.Coli）抽出物中に、微
生物学的につくられるIFN―βのダイマーとオリ
ゴマーが形成されることが見い出された。このマ
ルチマー形成のため、IFN―βの精製と分離が非
常な手間と時間のかかるものとなり、精製中に蛋
白質を還元し、次いで元のコンフオメーシヨンに
戻すためにこれを再酸化するというように、精製
単離手順に追加の段階が幾つか必要になり、それ
によつて不正確なジスルフイド結合形成の可能性
が高まる。更に、おそらくはマルテイマー形成又
はランダムな分子内ジスルフイド架橋形成のた
め、微生物学的につくられるIFN―βは一貫して
低い比活性を示すこともわかつた。従つて、IFN
―βのように微生物学的につくられ生物活性のあ
る蛋白質を、その活性に悪影響を及ぼさず、しか
も蛋白質が望ましくない三次構造（例えば蛋白質
の活性を低下させるようなコンフオメーシヨン）
を有する結果になるような分子間架橋や分子内結
合の形成能力を減少し、又は排除する形で改変す
るのが望ましいであろう。 （問題点を解決するための手段） 本発明は定方向突然変異（directed
mutagenesis）により、親構造類似体（parent
analogs）の活性を保持するが、分子間ジスルフ
イド結合や望ましくない分子内ジスルフイド結合
の形成能力を欠いている突然変異的に改変された
生物学的活性蛋白質の製造に関する〔このような
蛋白質を「ムテイン」（mutein）という。「遺伝
学・細胞遺伝学用語辞典」（Glossary of
genetics and Cytogenetice）第４版、381頁、ス
プリンジヤー・バーラグ（1976年）〕。これに関
し、エツチ・エム・シエパード（Shepard，H.
M.）等〔Nature（1981年）294巻563頁〜565頁〕
はIFN―βについて、そのアミノ酸配列の141位
置のシステインがチロシンでおき代えられたムテ
インを記述している〔ヒトIFN―βには17，31及
び141位置にシステインがある。Gene（1980年）
10巻11〜15頁及びNature（1980年）285巻542―
547頁〕。このムテインは、IFN―β遺伝子のヌク
レオチド485にＧ→Ａ転位をもつ部分的IFN―β
cDNAクローンから構築された雑種遺伝子の細
菌による発現によつてつくられた。このムテイン
は本来のIFN―βの生物学的活性を失つており、
著者らは置き換えられたシステインが活性に本質
的であつたと結論するに至つた。 定方向突然変異（directed mutagenesis）技法
は周知であり、アール・エフ・レイサー
（Lather，R.F.）及びジエイ・ピー・レコツク
（Lecoq，J.P.）ジエネテイツク・エンジニアリン
グ（Genetic・Engineering）、アカデミツクプレ
ス社（1983年）31―50頁、に検討されている。オ
リゴヌクレオチドに指示された突然変異はエム・
スミス（Smith，M.）及びエス・ギラム
（Gillam，S.）、ジエネテイツク・エンジニアリ
ング：原理と方法、プレナムプレス社（1981年）
３巻１―32頁に具体的に検討されている。 本発明は、天然インターロイキン―２の125位
のシステイン残基が他のアミノ酸残基により置き
換えられており、且つ天然インターロイキン―２
の生物学的活性を有する変形されたインターロイ
キン―２、及びその製造方法に関する。 この変形されたインターロイキン―２は一般に
次の様にして製造することができる。 (a) 親蛋白質をコードした構造遺伝子の１本鎖か
らなる単鎖DNAを突然変異オリゴヌクレオチ
ドプライマーとハイブリダイズさせ（このプラ
イマーは、欠損又は代替えすべきシステイン用
コドン、又は場合によりこのコドンと対合をつ
くるアンチセンス・トリプレツトを包含する領
域に対して相補的なものであるが、当該コドン
の欠損又は他のアミノ酸をコードするトリプレ
ツトを規定するコドン又はアンチセンス・トリ
プレツトとは不一致（mismatch）である。）、 (b) DNAポリメラーゼによりプライマーを伸長
させ、突然変異性へテロデユプレツクス
（heteroduplex）を形成させ、そして、 (c) この突然変異性ヘテロデユプレツクスを複製
する。 本方法で用いられる突然変異株オリゴヌクレオ
チドプライマーは本発明のもう一つの面である。 本発明は、生物学的に活性な蛋白質の生物学的
活性に本質的ではないシステイン残基が、分子間
架橋又はまちがつた分子内ジスルフイド結合の形
成サイトを排除するために、計画的に欠損又は他
のアミノ酸でおき代えられているムテイン類、こ
のようなムテイン類をコードする突然変異遺伝
子、及びこのようなムテイン類をつくる手段を提
供する。 本発明によつて突然変異的に改変できる蛋白質
は、生物学的に活性な蛋白質のシステイン含量、
及びシステイン残基が活性と三次構造に関して果
たす役割について入手可能な情報から確認でき
る。文献ではこのような情報が入手できない蛋白
質については、本明細書に記載の手順によつて蛋
白質のシステイン残基の各々を系統的に変更し、
生ずるムテイン類の生物学的活性及びそれらが望
ましくない分子間又は分子内ジスルフイド結合を
形成する傾向について試験を行なうことによつ
て、この情報は決定できる。従つて、本発明は
IFN―β及びIL―２のムテイン類に関して下に特
に説明、例示されているが、望ましくないジスル
フイド結合の形成に対して蛋白質を感受性にする
ような、機能的に本質的ではないシステイン残基
を含有する生物学的に活性な任意のその他の蛋白
質に以下の教示が当てはまることが認められよ
う。IFN―βとIL―２以外に本発明による突然変
異性改変の候補となる蛋白質の例は、リンフオト
キシン（腫瘍壊死因子）とコロニー刺激因子―
１、それにIFN―α1である。候補蛋白質は、ふ
つうには奇数のシステイン残基をもつている。 IFN―βの場合、グリコシル化IFNと未グリコ
シル化IFNがいずれも定量的に同様な特異的活性
を示すこと、従つて、グリコシル部分はIFN―β
の生物学的活性に関与も貢献もしていないことが
報告された。しかし、細菌でつくられるグリコシ
ル化されていないIFN―βは、グリコシル化され
た天然IFN―βより量的に低い比活性を一貫して
示す。IFN―βは、17，31及び141の位置にシス
テイン残基をもつことが知られている。システイ
ン141は、シエパードから（前掲）により、生物
学的活性に本質的であることが立証された。４個
のシステイン残基を含有するIFN―αでは、二つ
の分子間―Ｓ―Ｓ―結合があり、一つはcys29と
cys138の間、他はcys1とcys98の間である。IFN
―βとIFN―αとの相同性に基づいて、IFN―β
のcys141はcys31と分子内―Ｓ―Ｓ結合にしてお
り、cys17は自由に分子間架橋を形成できるであ
ろう。cys17を欠失させるか、これを別のアミノ
酸と置換することによつて、cys17が生物学的活
性に本質的であるかどうか、また―Ｓ―Ｓ―結合
形成におけるその役割を決定できる。cys17が蛋
白質の生物学的活性に本質的でないならば、生ず
るcys17を欠損し又はcys17が置換された蛋白質
は、自然のIFN―βのそれに近い比活性を示し、
またおそらく蛋白質の単離精製を容易にもするで
あろう。 IFN―β遺伝子のcys17用コドン（codon）の
領域に対して相補的であるがこのコドン中に１又
は複数の塩基変化を含有する合成オリゴヌクレオ
チドプライマーを用いるオリゴヌクレオチドで指
示される突然変異誘発手順を使用してデザイナー
遺伝子がつくられ、こうしてcys17がその他任意
の選択されたアミノ酸でおき代えられる。欠損を
望む場合には、cys17用コドンを欠いたオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いる。cys17をグリシ
ン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシ
ン、チロシン、フエニルアラニン、ヒスチジン、
トリプトフアン、セリン、スレオニン及びメチオ
ニンのような中性アミノ酸へ変換するのが好まし
い方法である。セリン及びスレオニンは、システ
インと化学的類似性を有するため最も好ましい代
替え物である。システインを欠失させる時は、成
熟ムテインは自然の親蛋白質又は微生物でつくら
れるIFN―βよりアミノ酸１個だけ短い。 ヒトIL―２は、蛋白質の58，105及び125位に
システイン残基をもつと報告されている。IFN―
βの場合のように、IL―２は細菌の菌体から単
離される時は集合したオリゴマー型になつてい
て、細菌抽出物から良好な収量を得るためには、
還元剤で還元しなければならない。そのうえ、精
製され還元されたIL―２は不安定であり、貯蔵
時にオリゴマー不活性型へ容易に再酸化される。
３個のシステインが存在することは、天然分子に
見られるように正しい架橋は１個だけなのに、再
酸化時に蛋白質が３個の可能な分子内ジスルフイ
ド架橋の１個を無作為に形成しうることを意味し
ている。天然IL―２蛋白質のジスルフイド構造
がいかなるものか知られていないから、IL―２
遺伝子のコドン58，105及び125に突然変異をつく
り、どのシステイン残基が活性にとつて必要であ
るか、従つてまた自然のジスルフイド架橋形成に
関与している可能性が最も大きいかを確認するた
めに本発明を使用できる。同様に、活性にとつて
必要でないシステイン残基を修飾することによつ
てまちがつた分子内ジスルフイド架橋の形成を防
ぎ、そして遊離システイン残基の除去又は置き換
えによつて分子内間ジスルフイド架橋の機会を最
小限に抑えることができる。 オリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、突
然変異を導入すべき遺伝子領域へのプライマーの
安定なハイブリツド形成に必要な条件により、ま
た現在利用可能なオリゴヌクレオチド合成法の限
界によつて決まる。オリゴヌクレオチドで指示さ
れる突然変異誘発に使用するオリゴヌクレオチド
を設計するに当たつて、考慮すべき因子（例えば
全体の大きさ、突然変異サイトを迂回する部分の
大きさ）は、エム・スミス及びエス・ギラム（前
掲）によつて記述されている。概して、オリゴヌ
クレオチドの全長は、突然変異サイトでの安定で
ユニークな雑種形成を最適化するような長さであ
り、突然変異サイトから5′及び3′未満までの伸長
部分（extensions）は、DNAポリメラーゼのエ
キソヌクレアーゼ活性による突然変異の作用をさ
けるのに十分な大きさとする。本発明に従つて突
然変異誘発に使用されるオリゴヌクレオチドは、
通常、約12個ないし約24個の塩基、好ましくは約
14個ないし約20個の塩基、更に好ましくは約14個
ないし18個の塩基を含有する。これらは通常、変
更又は欠失されるコドンの少なくとも約３個の塩
基3′を含有する。 変更されたIFN―β遺伝子をつくる方法は、大
体において、コドン17を消失させるか、又はそれ
が別のアミノ酸をコードするように変更する合成
ヌクレオチドプライマーを使用して、IFN―β遺
伝子のコドン17（TGT）に部位特異的突然変異を
誘発せしめるものである。システインをスレオニ
ンに変え、プライマーをIFN―β遺伝子のアンチ
センス鎖にハイブリツド形成させる場合、好まし
いヌクレオチドプライマーはGCAATTTTC
ACTCAGである（下線は変更されたコドンを示
す）。システインを欠失させるのが望ましい時は、
好ましいプライマーは
AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTGであ
り、これはcysに対するTGTコドンを喪失してい
る。システインをセリンに代える時は、セリン用
のAGTコドンを含んだ17―ヌクレオチドプライ
マーGCAATTTTCAGAGTCAGが選択される。
cys17で第一塩基Ｔ→Ａの転位により、システイ
ンからセリンへの変化が起る。欠失を導入する時
には、所望の蛋白質の発現のためにDNA配列の
適正なリーデイングフレームを保持しなければな
らない点を認識しなければならない。 プライマーはIFN―β遺伝子の１本鎖がクロー
ニングされたM13，fd，又はφ×174のような１
本鎖フアージヘハイブリツド形成される。フアー
ジが遺伝子のセンス鎖、アンチセンス鎖のいずれ
でも担持できることは認められよう。フアージが
アンチセンス鎖を担持する場合には、プライマー
は、コドンの欠損、又は別のアミノ酸をコードす
るトリプレツトを規定するこのコドンとは一致し
ないが、突然変異させるコドンを含有するセンス
鎖の領域と同一である。フアージがセンス鎖を担
持する場合は、欠失させるコドンと対合するトリ
プレツト中では適当に不一致であるが、突然変異
させるコドンを含有するセンス鎖の領域に対して
相補的である。ハイブリツド形成に使用される条
件はエム・スミス及びエス・ギラム（前掲）によ
つて記述されている。温度は通常、約０℃ないし
70℃、もつと一般的には約10℃ないし50℃の範囲
にある。ハイブリツド形成後、プライマーは
DNAポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、
逆転写酵素又は他の適当なDNAポリメラーゼと
の反応によつてフアージDNA上で伸長される。
生ずるdsDNAは、T4DNAリガーゼのような
DANリガーゼでの処理によつて閉環式dsDNAへ
変換される。１本鎖領域を含有するDNA分子は
S1エンドヌクレアーゼ処理によつて破壊できる。 オリゴヌクレアーゼで指示される突然変異誘発
は、IL―２活性をもつがcys125からセリン125へ
変更されたムテインをコードする突然変異IL―
２遺伝子をつくるにも同様に使用できる。フアー
ジが遺伝子のセンス鎖を担持する場合に、この突
然変異IL―２遺伝子をつくるのに使われる好ま
しいオリゴヌクレオチドプライマーは
GATGATGCTTCTGAGAAAAGGTAATCで
ある。このオリゴヌクレオチドは、IL―２遺伝
子のコドン125と対合するトルプレツトのまん中
の塩基にＣ→Ｇの変化を有する。 得られた突然変異性ヘテロデイプレツクスは、
コンピテント宿主生物又は細胞を形質転換するの
に使用される。宿主によるヘテロデユプレツクス
の複製により、双方の鎖から子孫鎖ができる。複
製に続いて、突然変異鎖の子孫から突然変異遺伝
子を単離し、適当なベクターへ挿入し、このベク
ターを適当な宿主生物又は細胞の形質転換に使用
する。好ましいベクター類はプラスミド
pBR322、pCR1及びそれらの変異体、合成ベク
ター等である。適当な宿主生物はE.コリ（E.
Coli）、シユードモーナス（Pseudomonas）、パ
シルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バシ
ルス・スリンギエンシス（Bacillus
thuringiensis）、種々の酵母菌株、バシルス・サ
ーモフイルス（Bacillus thermophilus）、ハツカ
ネズミやラツト、チヤイニーズハムスターの卵巣
（CHO）細胞のような動物細胞、植物細胞、動植
物宿主等である。選んだ宿主をベクターで形質転
換する場合に、ムテインが発現されるために適当
なプロモータ・オペレーター配列も導入されるこ
とは認識されなければならない。宿主は原核生物
でも真核生物でも良い。（真核細胞へDNAを挿入
する方法は1981年９月３日公表されたPCT出願
番号US81／00239及びUS81／00240に記述されて
いる）。E.コリとCHO細胞が好ましい宿主であ
る。本発明に従つて得られるムテイン類は、天然
の親蛋白質に生ずるグリコシル化およびムテイン
調製に使われる宿主生物に依存してグリコシル化
される場合もされない場合もある。所望により、
宿主としてE.コリ（E.Coli）及びバシルス
（Bacillus）を使用する場合に得られる未グリコ
シル化ムテインを、この技術分野で知られている
科学的、酵素的及びその他の変法によつて生体外
で任意にグリコシル化してよい。 IFN―βに関する本発明の好ましい態様におい
ては、第１図に示すように、IFN―βのアミノ酸
配列において17位のシステイン残基は、成熟IFN
―βをコードするDNA配列のセンス鎖のコドン
17の第一塩基のＴ→Ａ転位によつて、セリンへ変
えられる。この部位特異的な突然変異誘発は、合
成17―ヌクレオチドプライマー
GCAATTTTCAGAGTCAGを使用して誘発さ
れ、このプライマーはコドン17の第一塩基に一個
の塩基の不一致がある以外は、コドン17の領域に
おけるIFN―βのセンス鎖上の17の個ヌクレオチ
ド配列と同一である。この不一致はプライマーの
ヌクレオチド12にある。遺伝暗号（コドン）は縮
重（degenerate）しており、アミノ酸の多くは
一つ以上のコドンによつて暗号づけられることが
認識されなければならない。例えばセリンの塩基
暗号は、TCT，TCG，TCC，TCA，AGT、及
びACGというコドンがいずれもセリンをコード
するように、６通りの縮重である。便宜上、好ま
しい態様としてAGTコドンが選ばれた。同様に、
スレオニンはACT，ACA，ACC及びACGのコ
ドンのどの一つによつてもコードされる。特定ア
ミノ酸に対して１コドンを特定する時は、これが
そのアミノ酸をコードするすべての縮重コドンを
包含することが意図されている。17―merは、
IFN―β遺伝子のアンチセンス鎖を担持する１本
鎖M13フアージDNAにハイブリツド形成される。
次に、DNAポリメラーゼ Klenow断片を使
用して、オリゴヌクレオチドをDNA上で伸長さ
せ、生ずるdsDNAをT4リガーゼで閉環状DNA
へ変換する。生ずる突然変異性ヘテロデユプレツ
クスの複製によつて、不一致を含有するDNA鎖
からクローンが得られる。突然変異クローンは、
特定の制限位置の存在又は不存在、抗生物質耐性
もしくは感受性、又はこの技術分野において知ら
れたその他の方法によつて確認され、スクリーニ
ングされる。システインをセリンによりおき代え
る場合は、第２図に示されるＴ→Ａ転位によつ
て、構造遺伝子の中に新しいHinf制限部位が
つくられる。突然変異クローンは、突然変異した
フアージプラークのハイブリツド形成スクリーニ
ングにおけるプローブとしてオリゴヌクレオチド
プライマーを使用して同定される。第２図に示さ
れるように、プライマーは親とハイブリツド形成
される時は唯一の不一致を有するが、突然変異し
たフアージDNAにハイブリツド形成される時は
完全な一致を有するであろう。オリゴヌクレオチ
ドプライマーを親DNAよりも突然変異DNAへ優
先的にハイブリツド形成させるようなハイブリツ
ド形成の条件を工夫できる。新しく発生した
Hinf部位も、IFN―β遺伝子の単一塩基の突
然変異を確認する手段として役立つ。 突然変異した遺伝子を担持するM13フアージ
DNAを単離し、プラスミドpTrp3のような適当
な発現ベクター中へ組み入れ、このベクターで大
腸菌MM294株を形質転換させる。形質転換体と
その子孫を培養するのに適した生育培地が当業者
に知られている。IFN―βの発現されたムテイン
を単離精製し、特徴づける。 以下の実施例は本発明の一層の理解を助けるた
め、また例示だけの目的で提示されている。これ
らはいかなる形においても本発明の範囲を限定す
るものと考えられてはならない。実施例１〜９は
IFN―βのムテインの調製を記述している。実施
例10〜15はIL―２のムテインの調製を記述して
いる。 実施例１ （参考例） IFN―β遺伝子のM13ベクターへのクローニン
グ １本鎖DNA鋳型の給源としてM13フアージベ
クターを使用することは、ジー・エス・テンプル
（G.F.Temple）ら、Nature（1982年）296巻537―
540頁で実証された。大腸菌trpプロモーターの制
御下にIFN―β遺伝子を含有するプラスミド
pβ1trp（第３図）を制限酵素Hind及びXhoで
消化した。M13mp8〔ジエイ・メツシング（J.
Messing）．「巨大分子に関する第３回クリーブラ
ンド・シンポジウム：組換えDNA」エイ・ウオ
ールトン編、エルザビアプレス社、143―153頁
（1981年）〕複製型（RF）DNA（第４図）を制限
酵素Hind及びBamHで消化し、予めHind
及びXhoで消化しておいたpβ1trpDNAと混合
した。次に混合物をT4DNAリガーゼで連結し、
連結DNAを大腸菌―JM103株のコンピテント細
胞中へ形質転換させ、Xgalインデイケータープ
レート上に播いた〔ジエイ・メツシング等、
Nucleic Acids Res（1981年）９巻309―321頁〕。
組換えフアージを含有するプラーク（白いプラー
ク）を取り上げ、新鮮なJM103の培養物に接種
し、そして感染細胞からRF分子のミニプレツプ
を調整した（エツチ・デイー・バーンボイム
（H.D.Birnboim）及びジエイ・ドリイ（J.
Doly）、Nucleic Acid Res（1979年）７巻1513―
1523頁）。IFN―β挿入部を含有するクローンを
同定するために、RF分子を種々の制限酵素で消
化した。このような１クローン（M13―β1）の
制限地図を第５図に示す。M13―β1クローンか
ら１本鎖（ss）フアージDNAをつくり、合成オ
リゴヌクレオチドを使用する部位特異的突然変異
誘発の鋳型として用いた。 実施例２ （参考例） 部位特異的突然変異誘発 0.1mMアデノシン三燐酸（ATP）、50mMヒド
ロキシメチルアミノメタン塩酸塩（トリス―塩
酸）PH8.0、10mM塩化マグネシウム、5mMジチ
オスレイトール（DDT）及びT4キナーゼ９単位
の存在下に、50μl中で合成オリゴヌクレオチド
GCAATTTTCAGAGTCAG（プライマー）40ピ
コモルをT4キナーゼにより37℃で１時間処理し
た。50mM塩化ナトリウム、10mMトリス―塩
酸、PH8.0、10mM塩化マグネシウム及び10mMβ
―メルカプトエタノールを含有する混合物50μl中
で、このキナーゼ処理されたプライマー（12ピコ
モル）を67℃で５分、及び42℃で25分加熱するこ
とによつて１本鎖（ss）M13―β1DNA5μgにハ
イブリツト形成させた。アニーリングした混合物
を次に氷上で冷却し、0.5mM各デオキシヌクレ
オチド三燐酸（dNTP）、80mMトリス―塩酸、
PH7.4、8mM塩化マグネシウム、100mM塩化ナ
トリウム、DNAポリメラーゼ Klenow断片
９単位、0.5mMATP及びT4DNAリガーゼ２単
位を含有する反応混合物50μlに添加し、37℃で３
時間及び25℃で２時間インキユベートした。次に
フエノール抽出とエタノール沈澱によつて反応を
停止させた。DNAを10mMトリス―塩酸、PH
8.0、10mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、
50％蔗糖及び0.05％ブロモフエニルブルー中に溶
解し、臭化エチジウム2μg／mlの存在下、0.8％ア
ガロースゲル上の電気泳動にかけた。M13―β1
のRF型に対応するDNAバンドをパーコレート法
〔アール・ダブリユー・デービス（R.W.Davis）
３、「高等細菌遺伝学」（Advanced Bacterial
Genetics）、コールド・スプリング・ハーバー研
究所、N.Y.178〜179頁（1980年）〕によつてゲル
スライスから溶離した。溶離されたDNAをコン
ピテントJM103細胞の形質転換に使用し、菌を一
夜生育させ、培養基上澄液からssDNAを単離し
た。このssDNAをプライマー伸張の第二サイク
ルに鋳型として使用し、ゲル精製されたRF型
DNAをコンピテントJM103細胞中へ形質転換さ
せ、寒天プレート上に播き、一夜培養するとフア
ージプラークが得られる。 実施例３ （参考例） 部位特異的突然変異誘発 上の実施例２の実験をくり返す。但し、合成オ
リゴヌクレオチドプライマーとして、システイン
をコードするものからスレオニンをコードするも
のへIFN―β遺伝子のコドン17を変えるのに
GCAATTTTCAGACTCAGを使用する。 実施例４ （参考例） 部位特異的欠損 上の実施例２の実験をくり返す。但し合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーとしてはIFN―β遺伝
子のコドン17を欠損させるのに
AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTGを使用
する。 実施例５ （参考例） 突然変異誘発されたプラークのスクリーニング
及び同定 突然変異させたM13―βプラークの入つたプレ
ート（実施例１）並びに突然変異しないM13―
β1フアージプラークの入つた２枚のプレートを
４℃に冷却し、各プレートからのプラークを２枚
のニトロセルロース円形フイルター上へ、第一フ
イルターの場合には乾燥フイルターを寒天プレー
ト上へ５分間重ね、第二フイルターの場合は15分
間重ねて移した。次に0.2NNaOH、1.5M塩化ナ
トリウム及び0.2％トリトンＸ―100に浸した厚手
の濾紙上へフイルター類を５分間置き、次に
0.5Mトリス―塩酸、PH7.5、及び1.5M塩化ナトリ
ウムに浸した濾紙上へ更に５分間重ねて中和し
た。フイルターを同様なやり方で、２×SSC（標
準くえん酸塩）に浸したフイルター上で２回洗
い、乾燥し、真空乾燥炉内で80℃で２時間乾燥さ
せた。重複フイルターをフイルター当たり10mlの
DNAハイブリツド形成緩衝液（５×SSC）、PH
7.0、４×デンハード液（ポリビニルピロリドン、
フイコール及び牛血清アルブミン、１×＝各0.02
％）、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、
50mM燐酸ナトリウム緩衝液、PH7.0及び100μ
ｇ／mlの変性サケ精子DNAにより、55℃で４時
間、事前ハイブリツド形成させた。オリゴヌクレ
オチドプライマーを32Pで標識したATPでキナー
ゼ下に処理することによつて32Pで標識したプロ
ーブをつくつた。フイルター当たり５mlのDNA
ハイブリド形成緩衝液中でフイルターを32Pで標
識したプライマー3.5×105cpm／mlに55℃で24時
間ハイブリツド形成させた。0.1％SDSと減少す
る量のSSCを含有する洗浄用緩衝液中でそれれぞ
れ30分、55℃でフイルター類を洗つた。フイルタ
ー類を、初めに２×SSCを含んだ緩衝液で洗い、
そして突然変異していないM13―β1プラークを
含有する対照フイルターはガイガー計数管を用い
て放射能の存在について検査した。SSC濃度を段
階的に低下させ、未突然変異M13―βプラークを
もつ対照フイルター上に検出可能な放射能が残ら
なくなるまでフイルターを洗つた。SSCの使用最
低濃度は0.1×SSCであつた。フイルターを空気
乾燥し、−70℃で２〜３日オートラジオグラフ処
理した。突然変異したM13―β1のプラーク480個
と突然変異していない対照プラーク100個をキナ
ーゼ処理したオリゴヌクレオチドプローブによつ
てスクリーニングした。対照プラークではプロー
ブとハイブリツド形成したものが全く存在せず、
一方突然変異したM13―β1プラーク５個がプロ
ーブとハイブリツドを形成した。 ５個の突然変異M13―β1プラークの１個
（M13―SY2501）を取り上げ、JM103培養基へ接
種した。上澄液からssDNAを調製し、そして細
胞ペレツトから２本鎖（ds）DNAを調製した。
M13ユニバーサルプライマーを使用して、クロー
ンのジデオキシ配列決定用の鋳型としてssDNA
を使用した。配列決定分析の結果を第６図に示
す。この結果は、TGTcysコドンがAGTserコド
ンへ変換されたことを確証している。 実施例６ （考参例） 大腸菌における突然変異IFN―βの発現 M13―SY2501からのRF DNAを制限酵素
Hind及びXhoで消化し、520bpの挿入断片を
１％アガロースゲル上で精製した。大腸菌trpプ
ロモーターを含有するプラスミドpTrp3（第７図）
を酵素Hind及びBamHで消化し、精製した
M13―SY2501断片と混合し、T4DNAリガーゼ
の存在下に連結した。連結DNAをE.コリMM294
株へ形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体
を薬剤テトラサイクリンに対する感受性の点から
スクリーニングした。アンピシリン耐性でテトラ
サイクリン感受性の５クローンからのプラスミド
DNAを、M13―SY2501挿入部の存在についてス
クリーニングするためHinfで消化した。第８
ａ図は、クローンの一つ（pSY2501）のHinf
制限パターンを示すが、図ではこれを元のIFN―
βクローンすなわちpβ1trpのHinfパターンを
比較している。予想のように、pSY2501に追加の
Hinfサイトがあり、197bpのIFN―β内部断片
が169bpの断片と28bpの断片に切れている（第８
ｂ図）。クローンpSY2501の制限地図を第９図に
示す。突然変異IFN―β遺伝子の完全なDNA配
列を、予測されたアミノ酸配列と一緒に第１０図
に示す。クローンpSY2501と称するプラスミドは
60604イリノイ州ペオリア、ノース・ユニバーシ
テイ・ストリート1815番地、米国農務省、科学教
育局北部研究センター、発酵研究所のアグリカル
チユラル・リサーチ・カルチヤーコレクシヨン
（NRRL）に寄託されている。指定された寄託番
号はCMCC1533号及びNRRLB―15356号（ブダ
ペスト条約に基づく寄託）である。 pSY2501及びpβ1trp（子孫を含む）の培養物を
1.0の光学密度（0D600）まで生育させた。無細胞
抽出物をつくり、IFN―βの抗ウイルス活性量を
微量力価検定法でGM2767細胞によつて検定し
た。クローンpSY2501の抽出物はpβ1trpより３〜
10培高い活性を示し（第１表）、クローン
pSY2501がIFN―β活性を示す蛋白質をより多量
に合成しているか、又はつくられた蛋白質がより
高い比活性をもつているかのいずれかであること
が示される。 第 １ 表 抽出物 抗ウイルス活性（単位／ml） pSY2501 ６×105 pβ1trp １×105 ptrp3（対照） 30 クローンpSY2501が数倍多い活性蛋白を合成し
ていたかどうか決定するため、両クローンの抽出
物を対照抽出物と共にSDSポリアクリルアミドゲ
ル上の電気泳動にかけ、ゲルをクーマージーブル
ーで染色して蛋白質を発色させた。第１１図に示
すように、クローンpSY2501とpβ1trpの抽出物中
に存在するが対照のptrp3抽出物中にはない約
18000ダルトンの蛋白質に対応する蛋白質バンド
が一つだけであつた。この蛋白質は約20000ダル
トンの分子量をもつが、18000ダルトンの蛋白質
のゲル移動パターンを示しており、pβ1trpの抽出
物からこの蛋白質を精製することによつてIFN―
βであることが予めわかつていた。pSY2501抽出
物中にはpβ1trpの抽出物中よりこの蛋白質の量が
少ないから、クローンpSY2501抽出物中の蛋白質
の比活性はクローンpβ1trpのそれより高い。 実施例７ （考参例） IFM―βser17の精製 IFN―βser17をつくるように形質転換されたE.
コリからIFN―βser17を回収した。E.コリを次の
生育培地中で、680nmで10〜11の光学密度（乾燥
重量8.4ｇ／）まで生育させた。 成 分 濃 度 塩化アンモニウム 20mM 硫酸カリウム 16.1mM 燐酸一カリウム 7.8mM 燐酸二ナトリウム 12.2mM 硫酸マグネシウム・七水和物 3mM クエン酸三ナトリウム・二水和物 1.5mM 硫酸マンガン・四水和物 30μM 硫酸亜鉛・七水和物 30μM 硫酸銅・五水和物 3μM Ｌ―トリプトフアン 70mg／ 硫酸第一鉄・七水和物 72μM チアミン塩酸塩 20mg／ グルコース 40ｇ／ アンモニアでPH調整 形質転換ずみE.コリの収穫物9.9（9.9Kg）を
20℃に冷却し、濾液重量が8.8Kgになるまで、収
穫物を−110kpaの平均圧力損失と毎分260mlの定
常濾液流量でクロスフローフイルターに通すこと
により濃縮した。濃縮液（約１）を容器に流し
込み、15℃に冷却した。濃縮液を５℃、約
69000kpaでマントン＝ゴーリンホモジナイザー
に通すことによつて濃縮液中の菌体を破砕した。
燐酸塩で緩衝化された食塩水、PH7.4（PBS）１
でホモジナイザーを洗い、洗浄液を破砕物に加え
ると、２の最終容量が得られた。この容量を毎
分50mlの流量で12000×ｇの連続遠心分離にかけ
た。固体を上澄液から分離し、２重量％SDSを含
有するPBS ４に再懸濁させた。この懸濁液を
室温で15分かきまぜたあと、目に見える懸濁物は
なかつた。次に溶液を２―ブタノールで、２―ブ
タノール：溶液の１：１容量比で抽出した。液―
液相分離装置中で毎分200mlの流量を用いて抽出
を行なつた。次に有機相を分離し、そして蒸発乾
固させることにより蛋白質21.3ｇを得た。これを
蒸留水に１：10の容量比で再懸濁した。 回収された生成物は、ウイルスの細胞病理作用
（CPE）に対する防護に基づく検定を用いて、ヒ
トIFN―β活性について検定された。ミクロタイ
タープレート内でこの検定を行なつた。最少基本
倍地50μlを各容器に仕込み、第一容器には資料
25μlを入れ、つぎ容器以降には１：３の容量の希
釈を連続的に行なつた。ウイルス（水泡性口内
炎）、細胞（ヒト線維芽細胞GM―2767系統）及
び標準IFN―β対照群を各プレートに収容せしめ
た。ml当たり100単位の標準IFN―βを使用した。
次にプレートに紫外線を10分間照射した。照射
後、細胞懸濁液（ml当たり細胞1.2×105）100μl
を各容器に加え、トレーを18〜24時間インキユベ
ートした。細胞当たり１プラーク形成単位でウイ
ルス液を細胞対照プレートを除く各容器に加え
た。ウイルス対照が100％のCPEを示すまでトレ
ーをインキユベートした。これは、ウイルス液を
加えてから通常18〜24時間で生じた。標準IFN―
β対照の50％CPE容器の位置の点から検定結果
を解釈した。この点からプレート上の全試料につ
いてのインターフエロンの力価を測定した。回収
された生成物の比活性は５×107U／mlと決定さ
れた。 実施例８ （考参例） 酸沈澱及びクロマトグラフイによる精製 実施例７の方法をくり返したが、但し、抽出、
水相と有機相の分離、及び有機相とPBSとの容
量比３：１での混合の後、氷酢酸の添加によつて
混合物のPHを約５に下げた。生じた沈澱物を
10000〜17000xg、15分間の遠心分離によつて分
離し、ペレツトを10％Ｗ／Ｖ SDS、10mM
DTT、50mM酢酸ナトリウム緩衝液、PH5.5に再
溶解し、80℃に５分間加熱した。 次に、溶液を、ベツクマン勾配系を使用して、
ブラウンリーRP―300、10μM、「アクアポア」カ
ラムにかけた。緩衝液Ａは水中0.1％トリフルオ
ロ酢酸（TFA）であり、緩衝液Ｂはアセトニト
リル中0.1％TFAとした。検出は280nmだの紫外
線吸光度によつた。溶媒プログラムは３時間で０
％緩衝液Ｂから100％緩衝液Ｂへの線形勾配とし
た。最高のインターフエロン活性を含有するフラ
クシヨンをプールし、このプールされたインター
フエロン調製物の比活性は、天然のIFN―βにお
ける蛋白質mg当たり約２×108国際単位に比べ、
9.0×107ないし3.8×108U／mlと決定された。 実施例９ （考参例） IFN―βser17の生化学的特徴付け 5.7N HCl、0.1％フエノールの200μl中におい
て試料40μgを108℃で24〜72時間の加水分解にか
けた後、アミノ酸組成を決定した。プロリンとシ
ステインは、過蟻酸酸化後、同じやり方で決定さ
れた。この場合、フエノールを加水分解から省略
した。トリプトフアンは、5.7N塩酸、10％メル
カプト酢酸（フエノールなし）中で試料400μlを
24時間加水分解した後に分析した。分析は、
AA10樹脂の単一カラムを使用するベツクマン
121MBアミノ酸分析装置で行なつた。精製IFN
―βser17の代表的な24―、48―、72―時間の酸加
水分解から計算されるアミノ酸組成は、Ｎ―末端
メチオニンが欠けているほかは、クローンIFN遺
伝子のDNA配列によつて予測されるものとよく
一致している。精製IFNのアミノ酸末端
（terminus）からの最初の58残基のアミノ酸配列
は、試料0.7mgから、ベツクマン890C配列測定装
置で0.1Mクアドロール緩衝液を使つて決定され
た。PTHアミノ酸は、アルテツクスウルトラス
フエアー0DSカラム（4.6×250mm）による逆相高
圧液体クロマトグラフイ（HPLC）に45℃でか
け、40％緩衝液Ｂで1.3分、40〜70％緩衝液Ｂで
8.4分溶出することにより決定された。ここで緩
衝液Ａは0.0115M酢酸ナトリウム、５％テトラヒ
ドロフラン（THF）、PH5.11であり、緩衝液Ｂは
アセトニトリル中10％THFであつた。 決定されたIFN―βser17のＮ末満アミノ酸配列
は、Ｎ―末端メチオニンの不在を除き、DNA配
列から予測される予測配列に一致している。 上に示したように、IFN―βser17調製物は天然
のIFN―βの比活性レベルに非常に近いか、それ
よりすぐれた活性を示す。IFN―βser17は遊離ス
ルフヒドリル基をもたないが、31及び141位にだ
け残つているシステイン間に１個の―Ｓ―Ｓ―結
合を示す。蛋白質は容易にオリゴマーをつくら
ず、実質的にモノマー型にあると考えられる。本
発明に従つて得られるIFN―βser17は単一生成物
として又は種々の型の混合物として不活性、無毒
性、非アレルギー性で、生理的に許容される担体
媒体中における医薬として受け入れられる製剤へ
処方でき、がん療法で、又はインターフエロン療
法が指示される症状における臨床用、治療用に、
またウイルス感染用に使用できる。このような媒
体は蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、ハンク液
等をを包含するが、これらに限定はされない。デ
キストロース、HSA（ヒト血清アルブミン）等の
ような他の無毒性の安定化・可溶化用の添加物も
最適に包含してよい。治療処方剤は、経口で、又
は静脈内、筋肉内、腹腔内及び皮下投与のような
非経口で投与できる。本発明の変形IFN―β製剤
は、局所用に通常利用される適当な媒体中で局所
適用のためにも使用できる。 上記のIFN―βムテインの主な利点は、IFN―
βの17位の遊離スルフヒドリル基（―SH基）を
排除されているところにあり、これによつてムテ
インにcys31とcys141の間に正しいジスルフイド
結合を形成させ、十分な生物学的活性に明白に必
要なコンフオメーシヨンを取らせている。IFN―
βser17の増大した比活性のため、治療用により少
ない投与量が使える。17位置のシステインを欠失
させ、遊離―SH基を排除することによつて、
IFN―βser17蛋白質は微生物でつくられるIFN―
βほどたやすくダイマーやオリゴマーを形成しな
い。これが蛋白質の精製を容易にし、その安定性
を強める。 実施例 10 ヒトIL―２をコードするcDNAクローンのヌ
クレオチド配列、IL―2cDNAライブラリーをつ
くる手順、これをIL―２についてスクリーニン
グする手順はテイー・タニグチ（Taniguchi，
T.），Nature（1983年）302 24 305頁以降に記述
されている。 有力なIL―2cDNAクローンに関して濃縮され
たcDNAライブラリーは、慣用手順により、誘導
された末梢血液リンパ球（PBL）とジヤーカツ
ト細胞から得られる濃縮されたIL―2mRNAフラ
クシヨンからつくられた。IL―２用mRNAの濃
縮は、mRANを分画し、フラクシヨンをキセノ
プス・ラエビス（Xenopus laevis）の未成熟卵
母細胞に注入し、卵母細胞の溶解物のIL―２活
性をHT―２細胞で検定し、IL―2mRNA活性を
もつフラクシヨンを確認することによつて行つた
〔ジエイ・ワトソン（J.Watson），J.Exp.Med.
（1979年）150巻1570〜1519頁及びエス・ギリス
（S.Gillis）等、J.Immun.（1978年）120巻2027〜
2032頁〕。 実施例 11 IL―2cDNAクローンのスクリーニングと同定 コロニーハイブリツド形成法を用いて、IL―
2cDNAライブラリーをスクリーニングした。各
ミクロタイタープレートを重層したニトロセルロ
ース濾紙（Ｓ＆ＳタイプBA―85）上にレプリカ
法で写取り、アンピシリン50μg／mlを含有する
Ｌ寒天上で37℃、14〜16時間生育させた。コロニ
ーを溶解し、500mM水酸化ナトリウム、1.5M塩
化ナトリウムで５分の連続処理することによつて
DNAをフイルターに固定し、５×標準クエン酸
塩溶液（SSC）で５分ずつ２回洗つた。フイルタ
ーを空気乾燥し、80℃で２時間炉乾燥した。重層
フイルターをフイルター当たり10mlのDNAハイ
ブリツド形成緩衝液（50％ホルムアミド、５×
SSC、PH7.0、５×デンハード液（ポリビニルピ
ロリジン、フイコール及び牛血清アルブミン；１
×＝各0.2％）、PH7.0の50mM燐酸ナトリウム緩衝
液、0.2％SDS、20μg／mlポリＵ及び50μg／mlの
変形サケ精子DNAにより、42℃で６〜８時間事
前ハイブリツド形成させた。 タニグチ（前掲）に報告されたIL―２遺伝子
配列に基づいて32Pで標識された20―merオリゴ
ヌクレオチドプローブをつくつた。プローブのヌ
クレオチド配列は
GTGGCCTTCTTGGGCATGTAであつた。 32PcDNAプローブを含有するフイルター当た
り５mlのDNAハイブリツド形成緩衝液で、試料
を42℃で24〜36時間ハイブリツド形成させた。フ
イルターを２×SSC、0.1％SDS、で30分間ずつ
２回50℃で洗い、次に１×SSCと0.1％SDSで90
分ずつ２回50℃で洗い、空気乾燥し、−70℃で２
〜３日間オートラジオグラフにかけた。陽性のク
ローンを同定し、プローブで再度スクリーニング
した。十分な長さのクローンが、制限酵素地図作
成、及びタニグチら（前掲）が報告したIL―
2cDNAクローンの配列との比較から確認された。 実施例 12 M13ベクターへのIL―２遺伝子のクローニン
グ 大腸菌trpプロモーターの制御下にIL―２遺伝
子を含有するプラスミドpLW1（第１２図）を使
用して、実施例１に記載のと同様にIL―２遺伝
子をM13mp9へクローニングした。pLW1の試料
は1983年８月４日、20852合衆国メリーランド州
ロツクビル、パークローン・ドライブ12301番地、
アメリカタイプ・カルチヤー・コレクシヨンに預
託され、ATCC39，405号（ブタペスト条約に基
づく国際寄託）と指定を受けた。IL―２挿入部
を含有する１クローン（M13―IL―２と称する）
の制限地図を第１３図に示す。１本鎖フアージ
DNAをクローンM13―IL―２からつくり、オリ
ゴヌクレオチドで指示される突然変異誘発用の鋳
型として使用した。 実施例 13 オリゴヌクレオチドで指示された突然変異誘発 前記のとおり、IL―２はアミノ酸位置58，105
及び125にシステイン残基を含んでいる。IL―２
遺伝子中でこれらの３個のシステイン残基用コド
ンを含有する部分のヌクレオチド配列に基づい
て、三つのオリゴヌクレオチドプライマーを設計
し、これらの残基用コドンをセリン用コドンへ突
然変異せしめるために合成した。これらのオリゴ
ヌクレオチドは次の配列をもつている。 cys58を変える CTTCTAGAGACTGCAGATGTTTC
（DM27） cys105を変える CATCAGCATACTCAGACATGAATG
（DM28） cys125を変える GATGATGCTCTGAGAAAAGGTAATC
（DM29） 0.1mM ATD、50mMトリス―塩酸、PH8.0、
10mM塩化マグネシウム、5mMDTT及びT4キナ
ーゼ９単位の存在下に、50μl中で各オリゴヌクレ
オチド40ピコモルを別々に37℃で１時間キナーゼ
処理した。キナーゼ処理されたプライマー（10ピ
コモル）の各々を、100mM塩化ナトリウム、
20mMトリス―塩酸、PH7.9、20mM塩化マグネ
シウム及び20mMβ―メルカプトエタノールを含
有する混合物15μl中で、67℃で５分及び42℃で25
分加熱することによつてssM13―IL―
2DNA2.6μgへハイブリツド形成した。アニーリ
ングされた混合物を氷上で冷却し、次に0.5mM
各dNTP、17mMトリス―塩酸（PH7.9）、17mM
塩化マグネシウム、83mM塩化ナトリウム、
17mMβ―メルカプトエタノール、DNAポリメラ
ーゼ Klenow断片５単位、0.5mMATP、及
びT4DNAリガーゼ２単位を含有する反応混合物
25μlの最終容量まで調製し、37℃で５時間インキ
ユベートした。80℃に加熱して反応を停止させ、
反応混合物をコンピテントJM103細胞の形質転換
に使用し、寒天プレート上に播いて一夜培養する
と、フアージプラークが得られた。 実施例 14 突然変異誘発されたフアージプラークのスクリ
ーニングと同定 突然変異誘発されたM13―IL―２プラークを
含んだプレートと、突然変異誘発されないM13―
IL―２フアージプラークご含んだプレート２枚
とを４℃に冷却し、各プレートからのフアージプ
ラークを２枚のニトロセルロース円形フイルター
上へ、第一フイルターの場合には乾燥フイルター
を寒天プレート上へ５分間重ね、第二フイルター
の場合には15分間重ねて移した。次に0.2N水酸
化ナトリウム、15M塩化ナトリウム及び0.2％ト
リトンに浸した厚手の濾紙上にフイルターを５分
間置き、次に0.5Mトリス―HCl（PH7.5）と
1.5MNaClに浸した濾紙上へさらに５分間重ねて
中和した。フイルターを同様なやり方で、２×
SSCに浸したフイルター上で２回洗い、乾燥して
から真空乾燥炉内で80℃で２時間乾燥した。重層
フイルターをフイルター当たり10mlのDNAハイ
ブリツド形成緩衝液（５×SSC）、PH7.0、４×デ
ンハード液（ポリビニルピロリジン、フイコール
及び牛血清アルブミン、１×＝各0.02％）、0.1％
SDS、50mM燐酸ナトリウム緩衝液（PH7.0）及
び100μg／ml変性サケ精子DNAにより、42℃で
４時間事前ハイブリツド形成させた。標識をつけ
たATPでオリゴヌクレオチドプライマーをキナ
ーゼ処理することによつて、32Pで標識をつけたプ
ローブをつくつた。フイルター当たり５mlの
DNAハイブリツド形成緩衝液中で42℃で８時間、
32Pで標識したプライマー０・１×105cpm／mlに
フイルターをハイブリツド形成させた。0.1％
SDS及び２×SSCを含有する洗浄緩衝液中で50℃
でそれぞれ30分ずつ２回、次に0.1％SDS及び0.2
×SSCで50℃でそれぞれ30分ずつ２回フイルター
を洗つた。フイルターを空気乾燥し、−70℃で２
〜３日オートラジオグラフイにかけた。 オリゴヌクレオチドプライマーDM28及び
DM29は、突然変異誘発されたクローンに新しい
Dde制限部位を創出するように設計されている
から（第14表）、これらのキナーゼ処理されたプ
ライマーとハイブリツド形成された幾つかのクロ
ーンからのRF―DNAを制限酵素Ddeで消化し
た。プライマーDM28とハイブリツド形成し、新
しいDde制限部位をもつ突然変異誘発された
M13―IL―２プラークの一つ（M13―LW44）を
取り上げ、JM103培養物へ接種し、培養上澄液か
らssDNAを調製し、細胞ペレツトからdsRF―
DNAを調製した。同じく、プライマーDM29と
ハイブリツド形成させたプラーク（M13―
LW46）を取り上げ、これからssDNAとRF―
DNAを調製した。オリゴヌクレオチドプライマ
ーDM27はDde位置の代わりに新しいPst制
限部位を創出するように設計されている。従つ
て、このプライマーにハイブリツド形成されたプ
ラークを新しいPst部位の存在の点からスクリ
ーニングした。このような一つのフアージプラー
クを同定し（M13―LW42）、ssDNA及びRF―
DNAをこれから調製した。目標のシステイン用
TGTコドンがセリン用TCTコドンへ転化された
ことを確認するため、これらの３クローン全部か
ら得たDNAの配列を決定した。 実施例 15 大腸菌における発現のため突然変異誘発IL―
２遺伝子の再クローニング M13―LW42、M13―LW44、及びM13―
LW46からのRF―DNAをそれぞれ制限酵素Hind
及びBanで消化し、挿入断片を１％アガロー
スゲルから精製した。同様に、プラスミドpTrp3
（第７図）をHind及びBanで消化し、trpプ
ロモータを含有する大きなプラスミド断片をアガ
ロースゲル上で精製し、M13―LW42、M13―
LW44及びM13―LW46から単離された挿入断片
の各々と連結した。連結したプラスミドをコンピ
テント大腸菌Ｋ―12MM294株へ形質転換した。
これらの形質転換体からのプラスミドDNAを制
限酵素地図作成によつて分析し、プラスミド
pLW42、PLW44、及びpLW46の存在を確かめ
た。第１４図はpLW46の制限地図である。trpプ
ロモーターを誘導するために、トリプトフアンの
不在下にこれらの個々のクローンの各々を生育さ
せ、無細胞抽出液をSDS―ポリアクリルアミドゲ
ル上で分析し、３クローンpLW42、pLW44及び
pLW46の全部が、14.4Kd IL―２蛋白質を合成す
ることが立証された陽性対照のpLW21に見られ
るものと同様な14.5Kd蛋白を合成することが示
された。これらの同じ抽出液をマウスHT―２細
胞でIL―２活性について検定すると、クローン
pLW21（陽性対照）とpLW46のみが有意義量の
IL―２活性を示し（下の第２表）、cys58と
cys105は生物学的活性に必要なものであり、これ
をセリンに変えること（それぞれpLW42と
pLW44）によつて生物学的活性が失われること
を意味している。一方cys125は、これをser125
（pLW46）へ変えても生物学的活性に影響しない
から、活性にとつて不要であるに違いない。 第 ２ 表 クローン IL―２活性（μ／ml） PIL2―７（陰性対照） １ PLW21（陽性対照） 113000 PLW42 660 PLW44 1990 PLW46 123000 第１５ａ図は、クローンpLW46のコード鎖の
ヌクレオチド配列を示す。天然のヒトIL―２遺
伝子のコード鎖に比べ、クローンpLW46はヌク
レチド374にＧ→Ｃの一つの塩基の変化をもつ。
第１５ｂ図は、pLW46でコードされたIL―２ム
テインの対応するアミノ酸配列を示す。このムテ
インをIL―2ser125と称する。天然のIL―２に比
べ、ムテインは125位にシステインの代わりにセ
リンをもつている。 pLW46で形質転換されたE.コリＫ―12MM294
株の試料は、1983年９月26日、合衆国、20852メ
リーランド州ロツクビル、バークローン・ドライ
ブ12301番地、アメリカン・タイプ・カルチヤ
ー・コレクシヨン（Americam Type Culture
Collection）に寄託され、ATCC39452号（ブダ
ペスト条約に基づく国際寄託）に指持された。 ムテインIL―2ser125のように125位のシステイ
ンが欠損した又は別のアミノ酸でおき代えられた
IL―２ムテイン類は、IL―２活性を保持してい
る。従つて、これらを天然のIL―２と同じよう
に処方、使用できる。従つて、このようなムテイ
ン類は細菌、ウイルス、寄生虫、原生動物、及び
カビの感染の診断と処置、リンフオカイン又は免
疫不全の発現に、老令のヒト及び動物における通
常の免疫機能の再構成に、酵素増幅、放射能標
識、放射能映像化、及び病的状態のIL―２水準
をモニターするこの技術で知られたその他の方法
など、診断検定法の開発に、リンフオカイン類の
受容体部位を遮断する治療及び診断用に生体外で
のＴ細胞生育の促進のため、またその他種々の治
療、診断、研究への応用に有用である。ヒトIL
―２の種々の治療・診断への応用については、エ
ス・エイ・ローゼンバーグ（S.A.Rosenberg）、
イー・エイ・グリム（E.A.Grim）ら、エイ・マ
ザムダー（A.Mazumder）ら、及びイー・エ
イ・グリムとエス・エイ・ローゼンバーグが研究
報告している。IL―２はそれ自体、又は他の免
疫学的に関連のあるＢ又はＴ細胞又はその他の治
療剤と組み合わせて使用できる。治療又は診断用
には、蒸留水、リンゲル液、ハンク液、生理的食
塩水などの無毒生、非アレルギー性の生理学的に
許容される担体媒体中にこれらを処方できる。ヒ
ト又は動物へのIL―２ムテイン類の投与は、医
師が適当と考えるところにより、経口、又は腹腔
内又は筋肉内又は皮下でありうる。関連細胞の例
はＢ又はＴ細胞、天然のキラー細胞等であり、本
発明のポリペプチド類と組み合わせて使用できる
治療用試薬の例は、種々のインターフエロン類、
特にガンマインターフエロン、Ｂ細胞生長因子、
IL―１等である。
第１図は、IFN―βのアミノ酸配列図である。
第２図は、オリゴヌクレアーゼ指示された突然変
異誘発による突然変異株IFN―β遺伝子の調製を
示す略図である。第３図は、IFN―β遺伝子を含
むプラスミドpβ1trpの図である。第４図は、クロ
ーニングベクターM13mp8フアージの図である。
第５図は、クローンM13―β1の制限地図を示す。
第６図は、コード領域で一つの塩基の変化を示す
突然変異IFN―βser17遺伝子の配列順序決定ゲル
パターンを示す。第７図は、発現プラスミド
pTrp3の図である。第８ａ図は、クローン
pSY2501のHinf制限パターンを示し、第８ｂ
図は生ずるその二つの169bp及び28bp断片を示
す。第９図は、クローンpSY2501の制限地図であ
る。第１０図は、ムテインIFN―βser17を暗号づ
けるDNA配列と、これに対応するアミノ酸配列
を示す。第１１図は、クローンpSY2501及び
pβ1trpの抽出液におけるIFN―βser17に対応する
単一の18000ダルトンの蛋白質バンドを示す。第
１２図は、E.コリtrpプロモーターの制御下にヒ
トインターロイキン―２（IL―２）遺伝子を含有
するプラスミドpLW1の図である。第１３図は、
フアージクローンM13―IL2の制限地図である。
第１４図は、プラスミドpLW46の制限地図であ
る。第１５ａ及び１５ｂ図は、クローンpLW46
のコード鎖のヌクレオチド配列、及びIL―
2ser125と称するIL―２ムテイの対応するアミノ
酸配列をそれぞれ示す。
第２図は、オリゴヌクレアーゼ指示された突然変
異誘発による突然変異株IFN―β遺伝子の調製を
示す略図である。第３図は、IFN―β遺伝子を含
むプラスミドpβ1trpの図である。第４図は、クロ
ーニングベクターM13mp8フアージの図である。
第５図は、クローンM13―β1の制限地図を示す。
第６図は、コード領域で一つの塩基の変化を示す
突然変異IFN―βser17遺伝子の配列順序決定ゲル
パターンを示す。第７図は、発現プラスミド
pTrp3の図である。第８ａ図は、クローン
pSY2501のHinf制限パターンを示し、第８ｂ
図は生ずるその二つの169bp及び28bp断片を示
す。第９図は、クローンpSY2501の制限地図であ
る。第１０図は、ムテインIFN―βser17を暗号づ
けるDNA配列と、これに対応するアミノ酸配列
を示す。第１１図は、クローンpSY2501及び
pβ1trpの抽出液におけるIFN―βser17に対応する
単一の18000ダルトンの蛋白質バンドを示す。第
１２図は、E.コリtrpプロモーターの制御下にヒ
トインターロイキン―２（IL―２）遺伝子を含有
するプラスミドpLW1の図である。第１３図は、
フアージクローンM13―IL2の制限地図である。
第１４図は、プラスミドpLW46の制限地図であ
る。第１５ａ及び１５ｂ図は、クローンpLW46
のコード鎖のヌクレオチド配列、及びIL―
2ser125と称するIL―２ムテイの対応するアミノ
酸配列をそれぞれ示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 天然インターロイキン―２の125位のシステ
イン残基が他のアミノ酸残基により置き換えられ
ており、且つ天然インターロイキン―２の生物学
的活性を有する変形されたインターロイキン―
２。 ２ 前記システイン残基がセリン、スレオニン、
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロ
イシン、ヒスチジン、チロシン、フエニルアラニ
ン、トリプトフアン又はメチオニンで置き換えら
れていることを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載の変形されたインターロイキン―２。 ３ インターロイキン―２がグリコシル化されて
いないことを特徴とする特許請求の範囲第１項に
記載の変形されたインターロイキン―２。 ４ 前記システイン残基がセリン残基により置き
換えられており、そしてインターロイキン―２が
グリコシル化されていないことを特徴とする特許
請求の範囲第１項に記載の変形されたインターロ
イキン―２。 ５ 天然インターロイキン―２の125位のシステ
イン残基が他のアミノ酸残基により置き換えられ
ており、且つ天然インターロイキン―２の生物学
的活性を有する変形されたインターロイキン―２
の製造方法であつて、 (1) 天然インターロイキン―２をコードする
DNA断片を用意し； (2) インターロイキン―２の125位のアミノ酸を
コードするコドンがシステイン以外のアミノ酸
をコードするコドンに置き換えられているオリ
ゴヌクレオチドプライマー、又は該プライマー
に対して相補的なオリゴヌクレオチドプライマ
ーと、DNAポリメラーゼとを用いる鎖延長反
応により、前記天然インターロイキン―２をコ
ードするDNAを変異せしめることによりイン
ターロイキン―２の125位のアミノ酸をコード
するコドンがシステイン以外のアミノ酸のコド
ンであるDNA断片を得、 (3) 前記変異したDNA断片をベクターに挿入す
ることにより発現ベクターを得、これを用いて
宿主を形質転換することにより形質転換体を
得、そして (4) 前記形質転換体を培養することにより前記変
形されたインターロイキン―２を生産させ、該
変形されたインターロイキン―２を採取するこ
とを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US43515482A | 1982-10-19 | 1982-10-19 | |
| US435154 | 1982-10-19 | ||
| US486162 | 1983-04-15 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5993093A JPS5993093A (ja) | 1984-05-29 |
| JPS6357440B2 true JPS6357440B2 (ja) | 1988-11-11 |
Family
ID=23727220
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58195931A Granted JPS5993093A (ja) | 1982-10-19 | 1983-10-19 | 変形されたインターロイキン―２及びその製造方法 |
| JP18730484A Pending JPS6128394A (ja) | 1982-10-19 | 1984-09-08 | 部位特定突然変異用オリゴヌクレオチド |
| JP18730384A Granted JPS6128384A (ja) | 1982-10-19 | 1984-09-08 | 変形されたインターフェロン―βをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを含有するプラスミド及びこのプラスミドにより形質転換された大腸菌 |
| JP18730284A Granted JPS6128393A (ja) | 1982-10-19 | 1984-09-08 | 変形されたインターロイキン―２をコードするｄｎａ、このｄｎａを含有するプラスミド及びこのプラスミドにより形質転換された大腸菌 |
Family Applications After (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18730484A Pending JPS6128394A (ja) | 1982-10-19 | 1984-09-08 | 部位特定突然変異用オリゴヌクレオチド |
| JP18730384A Granted JPS6128384A (ja) | 1982-10-19 | 1984-09-08 | 変形されたインターフェロン―βをコードするＤＮＡ、このＤＮＡを含有するプラスミド及びこのプラスミドにより形質転換された大腸菌 |
| JP18730284A Granted JPS6128393A (ja) | 1982-10-19 | 1984-09-08 | 変形されたインターロイキン―２をコードするｄｎａ、このｄｎａを含有するプラスミド及びこのプラスミドにより形質転換された大腸菌 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (4) | JPS5993093A (ja) |
| IL (1) | IL90047A (ja) |
| IN (1) | IN161992B (ja) |
| ZA (1) | ZA837789B (ja) |
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| DE3581730D1 (de) * | 1984-10-15 | 1991-03-14 | Cetus Corp | Menschlicher tumornekrosisfaktor. |
| JP2675294B2 (ja) * | 1984-10-15 | 1997-11-12 | カイロン コーポレイション | ヒト腫瘍壊死因子 |
| US4572798A (en) * | 1984-12-06 | 1986-02-25 | Cetus Corporation | Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins |
| JP2583753B2 (ja) * | 1984-12-21 | 1997-02-19 | 大塚製薬株式会社 | 抗腫瘍活性物質およびその製造法 |
| JP2721854B2 (ja) * | 1984-12-21 | 1998-03-04 | 大塚製薬株式会社 | 抗腫瘍活性物質 |
| DK175380B1 (da) * | 1985-04-22 | 2004-09-20 | Genentech Inc | Mutant af human vævsplasminogenaktivator, DNA-sekvens som koder herfor, replicerbar udtrykkelsesvektor til at udtrykke denne DNA-sekvens, mikroorganisme transformeret med denne vektor, cellekulturer transformeret med denne.... |
| US4818698A (en) * | 1985-08-23 | 1989-04-04 | Toyo Jozo Co., Ltd. | Polypeptides and preparation process thereof |
| NZ226543A (en) * | 1987-10-22 | 1992-02-25 | Merck & Co Inc | Recombinant mutant acidic fibroblast growth factor |
| DE69025211T2 (de) * | 1989-02-17 | 1996-09-19 | Merck & Co Inc | Protein-Antikrebsmittel |
| NZ232900A (en) * | 1989-03-22 | 1993-08-26 | Merck & Co Inc | Pseudomonas exotoxin a, pe 40 domain derivatives |
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| AR034749A1 (es) * | 2001-07-09 | 2004-03-17 | Schering Ag | Formulaciones de interferon beta humano |
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| US20240270807A1 (en) * | 2020-04-29 | 2024-08-15 | Genopharm Inc. | Recombinant protein having fused interferon-beta mutein and antibody, and pharmaceutical composition comprising same |
-
1983
- 1983-10-14 IL IL90047A patent/IL90047A/xx not_active IP Right Cessation
- 1983-10-19 JP JP58195931A patent/JPS5993093A/ja active Granted
- 1983-10-19 ZA ZA837789A patent/ZA837789B/xx unknown
- 1983-10-19 IN IN1282/CAL/83A patent/IN161992B/en unknown
-
1984
- 1984-09-08 JP JP18730484A patent/JPS6128394A/ja active Pending
- 1984-09-08 JP JP18730384A patent/JPS6128384A/ja active Granted
- 1984-09-08 JP JP18730284A patent/JPS6128393A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| ZA837789B (en) | 1984-11-28 |
| JPS6128393A (ja) | 1986-02-08 |
| JPS6128384A (ja) | 1986-02-08 |
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| JPS5993093A (ja) | 1984-05-29 |
| IN161992B (ja) | 1988-03-12 |
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