JPS6188897A - アセチルプトレッシンの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアセチルブトレッシンオキシダーゼを７セチル
プトレンシンを含む系に作用させ、発生する過酸化水素
の量を測定することにより、アセチルブトレッシンの濃
度を定量する方法に関するものである。

ポリアミン例えばプトレッシンＩＩ、Ｎ（Ｃ１１，Ｌ）
＋１１２、スベルミノンＩ１．Ｎ（Ｃ１１１）、ＮＩＩ
（ＣＩｌ、）、Ｎｌ＋□、スペルミン１１□Ｎ（Ｃ１１
，）、Ｎ１１（Ｃ１１，）、ＮＩＩ（ＣＨ２）Ｊｌ＋２
などは、動物をはしめ、植物、細菌などあらＶ）る生命
細ＩＩ３の構成成分として生物界に広く分布し、細胞の
分裂、増Ｍｆｊ及び生化学的背景をなす核酸の代謝に関
与している物質として知られている。

ところで、近年ガン患者の尿中ポリアミン量が正常人よ
りも多いことが報告され〔［キャンサー、リサーチ（Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｒｏｓｅａｒｃｈ）Ｊ、第３１巻、第１５
５５〜１５５８ペーノ］、多くの七斤究者により尿、血
液、リンパ液などいわゆる体液中のポリアミン量とガン
疾患との関係についての研究がなされてきたが、その後
シュヨウ組織の増殖に際してもポリアミン代謝の高進化
が認められ、ポリアミン排泄呈の変動がガン患者の病状
の推移を反映することが明らかになり、臨床的にガンの
診断及びガンの治杓状態を知る上で、ポリアミンの定量
が重要となってきた。

従来、ポリアミンの定量法としては、〃入りロマトグラ
フィーによる力；去〔［クリニカルケミスト　リ（Ｃｌ
　１ｎｉｃａｌ　Ｃｂｅｍｉｓｔｒｙ）Ｊ、第１９巻、
第９０４〜９０７ペーノ〕、アミ／酸分析計による方法
〔「７エブ又・レタース’（ＦＥＤＳ　ＬｅＬＬｃｒｓ
）Ｊ、第４６巻、第３０５〜３０７ペーノ〕、ａｌ速故
体クりマトクラフイ−による方法〔「）°ヤーナル・オ
ブ・りａマドグラ７　（−（，１，ＣｈｒｏｍａＬｏ８
ｒａｕｌ＋ｙ）Ｊ、第１４５巻、第１４１〜１４６ベー
ノ〕などの化学的方法が土木となってしまたが、これら
の化学的方法は迅速性に欠ける上に、酸などによる加水
分解後、さらにポリアミン類を測定ｉｉＴ能な誘導体に
変換する前処理を必要とするため操作がはん雑になるな
ど実用上多くの不便を有していた。

池方、ｆｉ！素の特異的代用を利用して、遊離ポリアミ
ンを定量する方法（特公昭５６−３６９１８号公報）、
スベルミノンとスペルミンを定量する方法（特公昭５６
−２１３９３号公報）、スペルミ／、スペルミノン及び
プトレッシンを定量する方法（特開昭５０−９４９２号
公ｔａ）などが提案されている。これらの酵素的方法は
、化学的方法のように特に誘導体にするための前処理を
施す必要はなく、また迅速性の点でもかなり改善された
好ましい方法であるが、これらの方法はいずれも遊離ポ
リアミンとし、ての定量を目的としたものであるため、
アセチルポリアミンが混在した場合には塩酸などによる
加水分解や酵素による脱アセチル化を施し、これらを遊
離ポリアミンｔこ変換させなければならなり１ので操作
がはん雑となる上に、７セチルボリアミンを１α接に定
量することができない。

しかるに、最近の研究によれば人の尿中ポリアミンはそ
の大部分がアセチルブトレッシンであり、この増減がガ
ンの診断及［／７ｙンの冶怜状態を知る上で有効である
ことが明らかになりつつあり、アセチルブトレッシンの
定量をより簡便に行いうる方法の出現がこの分野におい
て広く要望されるようになってきた。

本発明者らは、このような事情に鑑み、アセチルブトレ
ッシンを迅速、簡便かち正確に定量しうる方法を開発す
べく鋭意研究を重ねた結果、アセチルブトレッシンを含
む系に７セチルプトレツシンオキシグーゼを作用させ、
生成する過酸化水素のｉｌ１度を測定することに上り、
その目的を達成しうろことを見出し、この知見に基づい
て本発明をなすに至った。

すなわち、本発明は、新規な酵素であるアセチルブトレ
ッシンオキシダーゼを７セチルプトレノシンを含む系に
１ヤ用させ、生成した過酸化水素の濃度を測定すること
により、アセチルブトレッシンの濃度を定量する方法を
提供するものである。

７セチルブトレノシンオキングーゼは、例えばアスベル
キ′ルス・オリゼ（八５ｐｅｒＨｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚ
ａｅ）Ｉ　Ａ　Ｍ　２６８２により生産される文献未載
の新規な酵素であり、次に述べる方法にて製造されうる
。アスペルギルス・オリゼＴ　Ａ　Ｍ　２６８２を培地
組成ＮａＮ０Ｊ、１％、に１１．Ｐｏ、０．１％、ＭＥ
Ｓｏ、０．０５％％ＫＣｌ０．０５％、グルツース３．
０からなる培地に接種し、２８゛Ｃ１・ｔ；３時間培養
し、こうして１：１られた種培Ｒ’ｔ＆をグルツース０
．１％、Ｋ１１□ＰＯ，Ｏ，１％、ト１１ＰＯ，Ｏ，１
５％、Ｍ８ＳＯ，０，０２％、アセチルプルレノシン０
．２％からなる暗地に加え、・１８時間本培養を行なっ
た。培養終Ｊ′後、ろ過１こより１責（本を集め、０．
０１八１リン酸援種ｊ波（ｎｌ１６．Ｓ）で洗浄し、同
一緩衝ン仮に懸濁後、グイ／−ミルで級壊した。この破
壊液より遠心分離７０００ｒｐｍ、２０分で上Ｃひを得
、該抽出液を直ちに０．０１き１リン酸援ｆｈ　ｉ夜（
ｐＨ１３，８）で援１ＪＩｉ化されたＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ、
セルロースに通し、アセチルブトレッシンオキシダーゼ
を吸着させ、ついで０．１λＩリン酸１衝？Ｉ！（ｐｔ
ｌ　６．８）で洗浄し、直線濃度勾配法に↓Ｉ）、８出
する。溶出された活性画分は５０％〜９０％飽和の硫安
濃度で硫安分画を行なった後、０．０１　Ｓｉミリンｔ
ｌ［ｉ液（ｐＨ６，ｏ）で透析する。ついで透析酵素液
を同一緩衝液で緩衝化したヒドロキシアパタイトカラム
に通液し、活性区分を吸着せしめ、０、ＯＩＭリン酸ｖ
ｉ、ｔ％ａ（ｐＨ６，０）　ｔ’ａ浄Ｌ、サラニ０．０
１−０．２Ｍ　’Ｊ　ン酸ｔｌ街？ａ（ｐｉｆ　６．０
）ニ、ｋ　’Ｊ直’ＩＡ　ｃｎ度勾配法で活性画分を１
８離せしめる。該、８離液を９０％飽和硫安により濃縮
後、セファデックスＧ−２００による分離を行ない精製
酵素を得た。本精製酵素は以下に示す理化学的性質を有
するものである。

（１）ｎ二　　　用；アセチルプトレッンン：こ１に用
して、その１モルより１モルの４ 一７セチルアミ／ブタナールと １モルの過酸化水素を生ｒａする。

（２）基質特異性；アセチルブトレッシンに対してはイ
ヤ用するがスペルミン、スベ ルミ）／、ブトレノンン、Ｎ−ア セチルスペルミン、贋−７セチ ルスベルミノン、Ｎａ−７セチル スベルミソ゛ン；こ大寸してはイヤ用しない。

（３）至　適　ｐＨ；８付近。

（４）ｐＨ安定性　；　ｐ１１６．０〜８．５において
、３７°Ｃで３０分間加熱処理しても８５％ 以上の残存活性を有する。

（５）至適温度　；ｐＨ７，５において５０　’Ｃ付近
。

（６）温度安定性；　１Ｊ７．０ｆ：　ｈ　イテ４０　
’Ｃ１３０９処理で９０％残存活性がある。

（７）本酵素は銅を含有ｒる。

（８）等　電　点；５．Ｏ付近。

本酵素の基質に討する１ヤ用磯序を反応式に示すと次の
ようになる。

７セチルプトレノシンオキ／グーゼにょるアセチルポリ
アミンの分解反応式 ％式％ アセチルブトレノシンオキンダーゼは、７セチルボリア
ミンの中の７セチルプトレノ／ンのみに作用し、等モル
量のアンモニアと等モル量の過酸化水素を生成するが、
池の７セナルポリアミン及び遊離ポリアミンには作用し
ない。

本発明方法は、従来の方法では全く不可能であったアセ
チルポリアミン類又はアセチルポリアミ／類と遊離ポリ
アミン類との混合系中に存在する７セチルプトレノンン
の濃度を直接定量するもので・ある。

犬に本発明の好適な実施態様を説明する。なお、ここに
示される酵素単位は、以下のようにしてよす定した１分
間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成するのに要する酵素
量をもってｌ　ｌｉ位として定めたものである。

アセチルブトレノシンオキシグーゼの測定；基質として
ｌ　（ｌ　ｍＭアセチルプトレンンン０．５　ｍｅを、
また発色液の緩衝液としてｐＨ７，５の０．１Ｍリン酸
援由液をそれぞれ用いることり外は全て参考例の場合と
同様にして酵素活性を；にめる。

本発明方法の好適な実施態様例においては、先ずアセチ
ルブトレッジンを含む試料に、アセチルブトレノンンオ
キングー七０．０５〜０．５単位を添加し、７セナルブ
トレンシンを酸化する。この反応工程で生成する過酸化
水素量を、「モルとするとその量は犬のように表わされ
る。

ｒ（モル）＝（アセチルブトレッジ／のモル数）したが
って、アセチルブトレノン／の、農度１土７セチルフト
レンシン（８Ｍ）＝Ｋ　−ｆ本発明方法において過酸化
水素量を測定するには、・ｔ−アミ／アンチピリン／７
エ／−ル／ベルオキンターゼ系又は・１−７ミ／アンチ
ピリン／ト１゜Ｎ−２エチルアニリン／ペルオキシグー
七系の試薬を用いる比色法のほか、過酸化水素の定量（
こ七１用されている行い光性、発光法などを用いること
らできる。また、過酸化水素量を測定する代りに、それ
に対応する酸素の）威少呈やアンモニア、アルデヒドの
増加量を測定することもて・きる。

本発明方法に従えば、従来のように７セチルプトレンシ
ンを測定するに当り、アセチルブトレッジンを塩酸や酵
素で加水分解する操作は不用であり、高速液本クロマト
グラフィー、アミノ酸分析計など特殊な装置を用いる化
学的方法て゛ら非常に困難とされていた、アセチルブト
レッジ／を迅速、簡便かつ正確に測定することができる
ので、本発明方法は、ゲンその池の病５（の診断やｈｐ
、　作に４１常に有用である。

次に参考例、実施例により本発明をさらに詳４１１１に
説明釘る７ 参考例 ベルオキングーゼ５貰２．７エ／−ル０．２！ρ、ｌ−
アミ／７ンチビリン］Ｑｇｙを１＋ｌＩ３．ＯのＯ，Ｉ
Ｍ　リン酸緩衝液に溶解し発色ｊ仮を調製し、基質とし
て７セチルブトレノノンを、また酵素としてアセチルブ
トレノ／／オキシグーセ杓Ｑ、５　Ｉｊｉ位を用いて揉
（１；を行った。その結果を、第１図及び第２図にグラ
フとして示す。このグラフから明りがなように、反応は
約５分以内に完了し、アセチルプトレッンン１モルより
１モルの過酸化水素が生成する。

なお、参考例及び以下の実殖例において用いた各種アセ
チルポリアミ／は「メソノズ・イン・エンザイモロノー
（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）Ｊ、
１７Ｂ、　１ＰＪ８２９〜８３３ページに記載された方
法に従って遊離ポリアミンより合成した。

実施例１ 参考゛例と同様に、ベルオキングーゼ５ｐｇ、７エ／　
−ルｏ、２ｍｌ、４−アミ／ア／チビリ＞１０ｍｇをρ
１１Ｓ、０の０．１Ｍリン酸松山液１００戸ｅに溶解し
て発色液を調製した。

このＱ色ｉ夜１．５ａ（とスペルミン、スペルミノ／、
プトレッシン、アセチルスペルミン、Ｎ’−アセチルス
ペルミン　Ｎ８−７セチルスベルミノン及びアセチルプ
トレッンンのそれぞれの２．ＯｍＭ調装水ｉＦｒ　＋（
Ｉ　２５　ｔ’　Ｉス−）　及！Ｊ７Ａ　ｆ１？水０，
５２ｉｐ　ヲ容；；；　３．ｉ９　Ｌ７）セルに入れた
。この、Ｆ；液中のポリアミ７類各成分の濃度はいずれ
も２０μ８である。

このように調製された落成を３５°Ｃの温ｌ斐で３分間
予熱後、この液に７セチルプトレ／ンンオキシグーゼを
５μｍ（約０．５ｊｉｉ位）添加し、ｌｏ　分１ｔｔｌ
　反応させたのち、５０５　ｎ　ｍの吸光度を測定した
。

この値に基づいて、本発色液の分子吸光係数６２５０を
代入した定数Ｋを用い前記第一の実施態様の各成分計算
式から、アセチルブトレッシン濃度を算出すると１９．
７μＨであった。

この値は、添加濃度値２０．０μＨと極めてよく一致し
ており、本発明の方法が高い信頼性を有することが埋角
蓼されよう。

実施例２ ペルオキシダー七（ベーリンが一社グレード■）５、　
Ｃｈｇ、４−アミ／アンチピリンｌｏ、ｏｆｆｇ、ンノ
ウムーＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒトａキン−３−スルホ
プロビルト１−トルイノ１５４．８ａｙを０．１Ｍリン
酸緩衝液（１↑ｌｌｓ、５）−０，］Ｍ炭酸ナトリウム
・塩化カリウム・ｉｔ、つ酸Ｈ’Ｊｊ液（ｐＨ８，５）
］：Ｉ　ノＨｐｆ、合液１００ａ＋ｆｆｔ’溶解して調
製した発色液１．５＃Ｎと尿０．５１１１＋と蒸留水０
．４６ｍ１を３ｓｌセルに凄人し、３５゛ｃで３分間予
熱後、アセチルブトレッシンオキシダーゼ５μｐ（約０
．５単位）を添加し１５分間反応後、５５５ｎＩｎの吸
光度を測定した（Ｇ工程）。

この反応によって得られた吸光度変１ヒ呈は次の通りで
あった。

Ｇ工程の吸光度変化量ｇ＝０．０３５ これらの値と本発色度による分子吸光係数１７２００を
用い、前記の実施態様の成分計算式に代入し計算ｒるこ
とにより反応液（２，５ａ＋Ｉ）巾の７セチルプトレノ
シンの濃度は次のように休出された。

アセチルブトレッシン＝　１．７４μＨこれらの値がら
検体される尿水の７セチルブトレノシン、濃度は夛この
Ｊ山りである。

アセチルブトレッシン−８，７μ門 実施例３ 実施例１と同し組成成分を、８解して調製した発色液１
．５ｄにスペルミン、又ベルミノ／、プトレッシン　Ｎ
１−７セチルスベルミノン、Ｎ６−７セチルスベルミノ
ン、アセチルブトレッシンの各２．０＋ａＭ水ｉ３液を
５０μｅずっ（最終的にはこれら各既知成分の濃度はい
ずれも４０μＨ）と管理用血清液０．２５．７１！（フ
ーンセーラ「二ノスイ」１ビンを蒸留水１．５万ｙて゛
溶解したもの）と蒸留水０．４５ｍ１を３ｓｌセルに入
れ、３５°Ｃで３分間予熱した。続いてアセチルブトレ
ッシンオキシダーゼ５μＩ！（約０．５単位）を、后加
し、１０分間反応させたのち５０５ｎｍ　（ｎ吸光度を
測定した吸光度変化量の測定値を代入して計算した結果
アセチルブトレッシン：３９．２μＨであった。

本発明の分別定量法により測定されたアセチルブトレノ
ノンの濃度は、調製された各成分濃度・ｔＯμＨとよく
一致し、本発明方法が１変れた天川的価値を有すること
が確認される６ 実施例・１ 参考例と同−組成の発色液を調製し、この発色Ｈ！Ｎ、
５ｘｌと、アセチルプトレッン／の各２，０ｍ１４水心
浪を１００ｕｌ＋（最終的成分濃度は８（）μＨ）と蒸
Ｍｌ水０．９０ｚｎを３ｘｉ！セルに入れ、３５℃で３
か開予熱後、アセチルブトレノノンオキングーセを５μ
／　（４！ＪＯ，５１亡１ｉ’ｊ）添加してｌｊ７１　
ｏ分間反応させ、アセチルブトレッシンの酸化によって
生した過酸化水素１こ基づく吸光度を測定した。この反
応において！！）　ｈれた各工程の５０５　ｎ　＋ｎの
吸光度変化稙は０．５２８であった。この値はアセチル
ブトレッシンＳ１，９μＨであり調製成分濃度とよく一
致している。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、各７セチルプ）レノシンをそれぞ
れの成分に７セチルブトレノシン酸化酵累を用いて酸化
反応させた場合の時間と生成過酸化水素に基づいて変化
するＵｉ先度との関係を示すクラ７である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １　アセチルブトレッシンを含む系に、アセチルブトレ
   ッシンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素量
   を測定し、これに基づいてアセチルブトレッシンの濃度
   を定量することを特徴とするアセチルブトレッシンの定
   量方法。