PL154843B1 - Method of selectively,as to location,modificating genome of pichia variety yeast - Google Patents

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	OPIS PATENTOWY	154 843
Patent dodatkowy do patentu nr--	Int. Cl.5 C12N 15/81
	Zgłoszono: 86 10 24 /P. 262030/ Pierwszeństwo: 85 10 25 Stany Zjednoczone
Crmryki	CZYTELU
URZĄD PATENTOWY	Zgłoszenie ogłoszono: 87 09 07	0 GÓLO
RP	Opis patentowy opublikowano: 1992 02 28

Twórca wynalazku: Jamss M. Cregg

Uprawniony z patentu: Phillips Petroleum Compay,

Bartleaville /Stany Zjednoczone Anmryyi/

SPOSÓB SELEKTYWNEJ CO DO MIEJSCA MODYPIKCCI GENOMU DROŻDŻY Z RODZCilU PICHIC

Praedmiotem wynalazku jest sposób selektywnej co do Pejsca mooyyikaaCi genomu drożdży z rodzaju Pichia.

Rozwój technologii rekomPbnaaCi DNC jaki nastąpił w ostatnich latach umoożiwia kontrolowaną produkcję wielu różnorodnych, użytecznych pollpeptydów przez mikroorganizmy. Mikroorganizmy wytwarzają już wiele pollpeptydów pochodKinia eukariotycznego, takich jak na przykład ludzki hormon wzrostu, interferony leukocytowe, insulina i proinsulina ludzka. Ciągłe stosowanie dostępnych już technik rekombincc^ DNC stwarza perspektywy wytwarzania wielu innych użytecznych produktów polipeptydowych przez mikroorganizmy.

Podstawowym elementem często szooowanym w techno logii t^,rkomPbnacCi DNC jest plazmid, będący poza-cłnomosomalntP, dwuniciowym DNA, wykrywanym w niektórych mikroorganizmach.

W tych mikroorganizmach, w których plazmidy znajdowane są w stanie naturalnym, występują one w wielu kopiach w jednej komórce. Poza plazmidami występującymi w stanie naturalnym wytworzono wiele nowych syntetycznych plazmidów bądź wektorów hybrydowych. Nie sewsze jednak komórka gospodarza ma zdolność utrzymania plazmidu. Plazmid ten jest gubiony w czasie reprodukcji i przenoszenia przez wiele generacji hodowli. Metody trwałego wprowadzania obcego DNś do odg.owl.edniego orgenizmu gospodarza są zatem przedmiotem dużego zainteresowania i potencjalnie mją ogromną napość.

Dotychczas prace zmierzające do zastosowania technologii rrkomPbnacCi DRC do wytwarzania różnych pollpeptydów na skalę przemysłową skupiały się na Escterichie. coli jako organizmie gospodarza. Jednak w niektórych przypadkach E. coli może okezać się gospodarzem nieodpowiednim. Przykładowo, E. coli zawiera Hele toksycznych czynników wywwłujących gorączkę, które należy usunąć z polipeptydu użytecznego jako środek farmakdogiczny. Wytajπość takiego oczyszczenia jest różna dla różnych pollpeptydów. Ponadto, aktywność enzymów proteolitycznych E. coli może poważnie ograniczyć wydajność wytwarzenego produktu. Okaaało się ponedto, że produkty heterologicznego genu są w organizmie

5. coli wytwarzane w formie nierozpuszczalnej. Te i inne ograniczenia skłoniły badaczy

154 843

154 Β43 do poszukiwań innych gospodarzy. Obiecujące jest zwłaszcza zastosowanie organizmów eukariotycznych do wytwarzania produktów polipeptydowych.

Możliwość wytwarzania produktów polipeptydowych w dostępnych układach eukariotycznych, na przykład w drożdżach, moołoby dać Enaczne korzyści w stosunku do stosowania układów proksriotycznych, takich jak B. coli, do wytwarzania polipeptydów kodowanych przez rekombinantowy DNI. Drożdże stosowane są w procesach fermentacyjnych na wielką skalę od wieków, podcEas gdy procesy fermentacyjne z użyciem B. coli prowadzone są na wielką skalę od niedawna. Na ogół hodowle drożdży można prowadzić do wyższych gęstości komórek niż w przypadku bakttrii. Można je łatwo przystosować do prooesów fermnnacji ciągłej.

W opisie patentowym StsnC Zjednoczonych .menyki 4 414 329 ujewniono sposób prowadzenia hodowli drożdży, takich jak Pichia pastoris, do ultra-wysokich gęstości kopprek, przewyższających 100 g/litr. Dodatkowe korsyści stosowania gospodarzy drożdżowyoh wynikają z faktu, że wiele krytycznych funkcji tych mikroorganizmów, np. fosforylacja oksydacyjna jest zlokalio^^anych w organeeiach, a zatem nie są one wystawione na niszczące działanie spowodowane wytwarzaniem przez te organizmy polipeptydów obcych dla komórek gospodarza dzikiego typu. Jako organimy eukariotyczne, drożdże mją zdolność glikozylacji wytwarzanych produktów polipeptydowych, co może być dużą zaletą w przypadkach, gdy zgló^I^o^^y^lc^wanie produktu polipeptydowego jest warunkiem jego aktymóci biologicznej. Jest również mooliwe, że jako organizmy eukariotyczne, drożdże będą ^^kedywi^y takie same preferencje co do kodonu jak organizmy wyższe, co będzie miało wpływ na bardziej wydajne wytwarzanie produktów ekspresji genów pochodzących od ssaków, bądź kom{^l«^i^ei^^i^:rnego DNA /cDNA/ otrzymanego na drodze odwrotnej transkrypcji inforMC.yjnego DNA pochodzącego od ssaków.

Rozwój badań nad słabo s^ere^e^on/anymi gatunkami drożdży jako układami gospodarz/ wektor jest poważnie hamowany nieznajomością warunków transformaj oraz odpowiednich mtod trwałego wprawia da nia obcego DNA do kopPrki gospodarza. Ponadto, często niedostępne są mutanty auksotroficzne, co unirmo01iwia bezpośrednie wyselekcjonowanie transformantów na drodze ^ιερ^μ^θ^Ι euksooroficznej. Jeśli technologia rrtomPbniaCi DNA ma w pełni spełniać pokładane w niej nadzieje, należy opracować nowe układy gospodarz/wektor, które ułatwiają manipulacje e DNA i umpoliwiają optymaiEację ekspresji włączonych sekwencji DNA w taki sposób, aby można było wytwarzać żądane produkty polipeptydowe w kontroOooeiych warunkach i z dużą wydeanością.

Przedmiotem wynalazku jest zatem sposób selektywnej co do miejsca modyfl^kaji genomu drożdży z rodzaju Pichia polegający na insercji DNA do genomu drożdżowego w z góry określonych miejscach tego genomu.

Sposobem według wyrnlazku wytwarza się stabilne putantt auksotroficzne drożdży, zasadniczo niezdolne do reworoji, za pomocą nowych srkweniji DNA użytecznych do tΓensOopelowenia drożdży. Wyt^rzony w ten sposób mitent gospodarza oksydaza alkoholowa minus stosuje się do zwiększonego wytwwrza nia białek 'heterologicznych przez drożdże.

Zgodnie z wynalazkiem opracowano nowy sposób kierowanej miejscem moodyftoaci genomu drożdży z rodzaju Pichia. Przez trsis^0omlowenie drożdży lnnowwym fragmentem DNA zawierającym na każdym końcu Edolne do insercji sekwencje DNA, to jest sekwencje ho]PoOogicznr z genomem gospodarza, z których każda ea długość co najmonej 200 nukleotydów, oraz pomiędzy nimi co nsjmnnej jeden dodatkowy fragment DNA, np. gen będący mrkeree selekcji, uzyskuje się dużą częstość wbudowywmia tego genu markerowego oraz zdolnych do insercji sekwencji flankujących DNA do genomu gospodarza. W wyniku transformacji takim linowNym DNA uzyskuje się modyfikowane szczepy drożdży, w których zostały przerwane i/lub wycięte sekwencje DNA n pesjscu integracji i do genomu gospodarza drożdżowego został -op:oowεdio.iy gen będący markerem selekcji oraz dowolny inny DNA, włączony jako część transi omującego linio we go f ra gme nt u DNA .

Obcy DNA włączony do genomu gospodarza drożdżowego w wyżej opisany 3poeób jest stabilnie utrzymywany przez wiele .ρθ.·μιο3ο1ϊ wzrostu gospodarze. Niniejszy wtnneazr’k ^ρϊμ^ zatem problem utraty obcego DNA wynikający z .niestabilności lleπmidl w przypadkach, gdy ten obcy DNA został w>rowadzony jako część autonomicznie replikującego się loiachromoso154 543 na 1 nago fragmentu, albo jeśli ten obcy DNA został zintegrowany z genomem jako część kolistej cząsteczki DNA. Takie inregrscje z genomem gospodarza kolistej cząsteczki DNA dają w wyniku insercję sekwencji obcego DNA flankowanych przez bezpośrednie odtworzenie sskwencci genomu gospodarza. Ponieważ takie bezpośrednio odtworzone sekwencje są substratami do dalszej rekombinnaci, to obcy DNA włączony pomiędzy te bezpośrednio odtworzone sekwencje jest niestabilny.

Kierowana miejscem modyfikacja genomu, prowadzona sposobem według wynalazku umoożiwia wytwwrzz nie mutantów, w których brak wszystkich lub wybranych części specyficznych genów. Przez wyeliminowanie znacznych części genu, w którym jest pożądana mtacls, wyklucza się zasadniczo m^oii^wość rewwrsji wtacci. Zmutowane szczepy wytworzone sposobem według wynnlazku są zatem m^antami wysoce stabilnymi.

Kierowana miejscem moOytikaejc genomu, prowadzona‘sposobem według wynalazku, łącznie ze znanymi technikami rekombbnnaci DNA in vitro umooliwia również szereg różnych precyzyjnych moOyfikaaji genomu gospodarza, np. dodanie jednego lub kilku genów heterdldgicznych w stosunku do genomu gospodarza, zmianę sekwan^i regulatorowych, kontrolujących ekspresję genu natywnego, wymianę genu natywnego na gen pochodzący z innego źródła i podobne.

Nieoczekiwanie okazało się, że indukowaną metanolem ekspresję genów heterologicznych w Pichia można znacznie zwiększyć stosując jako gospodarza, w którym zachodzi ekspresja tego genu, szczep Pichia, w którym został przerwany pierwszy gen oksydazy alkoholowej.

Okazało się ponadto, że szczepy organizmu Pichia pastoris mmją drugi gen oksydazy alkoholowej, który pozwala zachować zdolność wzrostu na meeanolu, pomimo iż pieiwszy gen oksydazy alkoholowej został przerwany, aczkolwiek w stopniu zmniejszatym w stosunku do natywnego Pichia pastoris. Opis figur ns rysunkach.

Fig. 1 przedstawia mpę restrykcyjną plazmidu pYM11.

Fig. 2 przedstawia insercję części plazmidu pYMU w locus HIS4 w chromosomie Pichia.

Fig. 3 przedstawia wpę restrykcyjną plazmidu pYJ8.

Fig. 4 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pYM13a.

Fig. 5 przedstawia insercję części plazmidu pYIŁ13a w locus HIS4 w chromosomie Pichia.

Fig. 6 przedstawia mpę restrykcyjną plazmidu pBPG1-1.

Fig. 7 przedstawia rapę restrykcyjną plazmidu pYU17.

Fig. 8 przedstawia insercję części plazmidu pYK7 w locus oksydszy alkoholowej w chromosomie Pichia.

Fig. 9 przedstawia konstrukcję plazmidu pYM39 z plazmidów pSAOH5 i pTHBS3.

Fig. 13 przedstawia konstrukcję plazmidu pY.116 z p1simidew p77139 i p?G1a2.

Fig. 11 przedstawia konstrukcję plazmidu pBSAG151 z plazmidu pYK6 i pZSAG11.

Fig. 12 przedstawia wpę restrykcyjną charakteryzującą plazmid pZ3AG151 z większą dokładnością niż na fig. 11.

Fig. 13 przedstawia insercję części plazmidu pBSAGH1 w locus oksydazy alkoholowej w chromosomie Pichia.

Fig. 14 przedstawia impę restrykcyjną plazmidu pYŁI112b.

Fig. 15 przedstawia insercję części plazmidu p’YM112a w locus drugiego genu oksydazy alkoholowej /Α0Χ2/ Pichia.

Fig. 16 przedstawia napę restrykcyjną insertów z Pichia w pochodzących z p?R322 plazmidach pPG4.0 i p?G3.3.

Insert przedstawiony na fig. l6a pochodzi z locus pierwszego genu oksydszy alkoholowej Pichia /ΑΟΧ1/, podczas gdy insert przedstawiony na fig. l6t pochodzi z locus dru-iago ger.u oksydazy alkoholowej Pichia /ΑΟΧ2/. Fig. 16c przedstawia znaną część locus genu ACX1 kodującą oksydazę alkoholową /ACN/ /w odniesieniu do fig. 1óa/.

Fig. 17 przedstawia wpę restrykcyjną plazmidu oYT22.

Fig. 18 przedstawia mpę restrykcyjną plazmidu ρΤ7δΗ3.

Skrót kbp na rysunkach oznacza kilopsry zasad.

154 343

W niniejszym opisie stosowano następujące skróty nazw enzymów restrykcyjnych.

Enzym restrykcyjny

AS

B

C

Ps

AsuII

BamHI

Bg1II

Ciał

EcoRI

EcoRV

HinniII

Pv₂

Ra

S

Hpal

KpnI

Nr ul

Pstl

PvuII

Real

Sali

Sau3Al

Sm

Sp

St

Th

Xb

Xh

Srał

Spbl

Stul

Thal

Xbal

Xhol

Na załączonych figurach, miejsca restrykcyjne stosowane io manniplaaci fragmentami

DNA, które uległy zniszczeniu podczas ligacji, pokazane są przez imiiaEczenie skrótu dla zniszczonego miejsca w nawiasach.

Zgodny z wynalazkiem sposób selektywnej co io miejsca moo^fkacci genomu drożdży z rodzaju Pichia, w z góry określonym miejscu tego genomu, polega na transfomiowaniu szczepu gospodarza z rodzaju Pichia seryjnie zbudowanym linowym fragmentem DNA zawierającym pierwszy zdolny do insercji fragment DNA, gen będący rarkerem selekcji, oraz drugi, zdolny do insercji fragment DNA. Obydwa /pierwszy i dmgg/, zdolne do insercji fragmenty DNA mmją długość co najmniej około 200 nukleotydów każdy i rają sekwencje nukleotydowe homologiczne do rozdzielanych części natywnego genomu Pichia w miejscu, w którym ma nastąpić modIfiaacja genomu. Markerem selekcji jest gen, którego produkt nadaje cechę fenotypową uimożiwiającą selekcję komórek, które przyjęły ten gen, na przykład gen oporności na antybiotyk lub gen biosyntetyczny nadający komórce zdolność wytwarzania pożywki wymagaanj do wzrostu. Gen będący rarkerem selekcji, jeśli jest obecny w DNA wektora, pozwala na wzrost tylko tych komiTek, które przyjęły DNA wekkora, w warunkach selektywnego wzrostu. Jest sprawą zasadniczą, aby ten gen rarkera selekcji był usytuowany pomiędzy pierwszym i drugim, zdolnymi do insercji fragmentami DNA i aby te zdolne do insercji fragmenty DNA były w stosunku do siebie usytuowane w tej samej orientacji, w jakiej występują w genomie kom<5rki gospodarza pod legającej ioOIyikacCi genlmowej lnniwwym fragmentem DNA.

W sposobie według wyrnlazku stosuje się zbudowany seryjnie linoowy fregment DNA zawierający pierwszy zdolny do insercji fragment DNA, gen będący rarkerem selekcji i drugi zdolny do insercji fragment DNA. Każdy z tych zdolnych do insercji fragmentów DNA ma długość co najmniej 200 nukleltyIów i posiada sekwencje iukleotyilwe hoiilogiczne z częściami geMmuego DNA z rodzaju Pichia, zorientowane w stosunku do siebie w lniOi'fyi fragmencie tak jak występują one w genomie Pichia. Gen będący raatkerem selekcji jest usytuowany pliięizy pierwszm a drugim zdolnymi, do insercji fragmentami DNA.

Pldstεwlit element stosowany do traisfoi.iowanaa gatunków z rodzaju Pichia zawiera co najmniej trzy aoiiorantt: pierwszy zdolny do insercji fragment DNA, drugi zdolny do insercji fragment DNA i gen będący markerem selekcji.

154 343

Obydwa zdolne do insercji fragmenty DNA powinny mieć długość co najmniej około 200 nukleotydćw, przy czyn zwykle stosuje się fragmenty o długości około 200-5000 nukleotydów. Korzystnie, ze względu na łatwość mnippllcC:i, stosuje się fragmenty o długości około 500-2000 nukleotydćw.

Sekwencje nukleotydowe użyteczne jako pierwszy i drugi zdolne do insercji fragmenty DNA są to sekwencje homologiczne do rozdzielenyoh części w miejscu natywnego genomu Pichia, w którym ma nastąpić mooyfikacja genomu. Tak więc, jeśli przykładowo mooyfikscja ma nastąpić w locus dla genu oksydazy alkoholowej, to jako pierwszy i drugi, zdolne do insercji fragmenty DNA stosuje się sekwencje homooogiczne do rozdziela nych części locus genu oksydazy alkoholowej. W celu mo^yika^i genomu, te dwa zdolne do insercji fragmenty DIIA muszą być zorientowane w stosunku do siebie w linowym fragmencie w takiej samej orientacji jaka występuje w genomie Pichia. Te co najmilej trzy komporenty transformującego DNA stosowane w praktycznej realizacji wynalazku są seryjnie ułożone tak, aby tworzyły linowy fragmnt, w którym gen będący mrkerem selekcji jest usytuowany pomiędzy pierwszym zdolnym do insercji fragmentem DNA a drugim zdoliym do insercji fragmentem.

Przykładami genów będących mrkerami selekcji są /lecz nie ograniczają się do nich/ gen AR44 z Pichia pastoris i Saccharomyces cerevisiae, gen HIS4 z Pichia pastoria i

S. eereviiaae, gnn lsslotΓnn3ferafy G418 z ulegajdeeoo transpozycji elomanSu Tn601 z 5. coli i podobne . DCs specjalistOw j6st ^ouami^ , ee wieee odpowiedncch eeOwlncji flankujących, to jest pierwszego i drugiego, zdolnych do insercj! fragmentów

DNA może pochodzić z genów wyizolowanych z genomu Plohia pastoris. Przykładami takich genów są /lecz nie ograniczają się do nich/ geny oksydazy alkoholowej /Α0Χ1 i ΑΟΧ2; Pichia ma dwa geny oksydazy alkoholowe/, gen sy^^azy douhhfrtO:syaoetlnowea /DAS/, gen liazy αrgininobursotfniαnu /ARG4/, gen dehydrogenazy hiitydynolu /HIS!/ i podobne.

Transform^ące Umowe fragmenty DNA mogą zawierać wiele innych sekwannc! DNA, takich jak na przykład geny heterologiczne, to jest dowolna geny lub części genów, które normlnie nie występują w t^ locus genomu, gdzie m nastąpić inercja do komórki gospodarza, a jest pożądana ekspresja tych ΗθϊιπΙι^Ιοβ^^ genów w Pichia pastoria. Na ogół, terminem ^,,hcterollgiczny określa się DNA nie pochodzący z komórki gospodarza Pichia. Taki gen heterologiczny można ewentualnie łączyć z regionem rlgulalolOTym, który będzie niezależnie kontrolował wytwarzanie produktu CetlrologicEnleo genu, bądź też można dokonać ekspresji genu heterollgicBnlgo w transfomllo·anej komórce pod wpływem ^^tywn^go regionu regulator owego genu, który uległ rozerwaniu w procesie transform^i.

Stosowany do tra Uformowania linowwy fragment DNA może ponadto zawierać bakteryjny plazmidowy DNA, taki jak na przykład sekwencje pBR322 lub pBR325. Takie sekwencje bakteryjnego DNA są użyteczne do operacji in vitro i wytwarzania tych sekwencji DNA przeE amplifikację w 5. coli. Szczególnie użyteczną formą do transformacji je3t forsa zamkniętego, kolistego plazmidu, zawierająca pierwszy zdolny do insercji fragment DNA, drugi zdolny do insercji fragment DNA, gen będący msrkerem selekcji oraz bakteryjny, plazmidowy DNA. Plazmid taki może ponadto zawierać opisane powyżej dodatkowe sekwencje DNA.

W korzystnym wariancie realizacji wynalazku, konstruuje się zamknięty, kolisty plazmid złożony z dwu części: części transformującej i części bakteryjnej. Część transoomująca zawiera ułożone kolejno: pierwszy zdolny do insercji fragment DNA, gen będący markerem selekcji oraz drugi zdolny do insercji fragment DNA, przy csym pierwszy i drugi, zdolne do insercji fragmenty DNA są zorienoowane w stosunku do siebie tak, jak występują w genomie Pichia, a gen będący markerem selekcji jest usytuowany pomiędzy pierwszym, a drugim zdolnym do insercji fragmentem DNA. Część bakteryjna jest usytuowana tak, sby łączyła pierwszy zdolny do insercji fragment DNA z. drugim zdolnym do insercji fragmentem DNA, t^oząc zamknięty, kolisty wektor. Ten zamkn.nęty, kolisty wektor przygotowany w sposób podany powyżej można użyć do wytworzenia dużych ilości plazmidu w S. coli, następnie plazmid ten izolować i trawić odpowiednimi restrykcyjnymi, oószczepiając część transformującą od części bakteryjnej. Tę linoową część transformującą drożdżow/ego DNA można z kolei stosować do trsnfoormowania szczepów/ z rodzaju Pichia w celu dokonania żądanej mo0dfSk3c;ji genomu.

154 543

Dl.a specjalistów jest zrozumiałe, że transformująca część zamkniętego, kolistego plazmidu opisanego powyżej może zawierać dodatkowe sekwencje DNA. Przykładowo, sekwencje bakteryjne ssosowsne in vitro do mnipulacji i wytwarzania BLA przez smplifikację w S. coli mogą stanowić część transformującego DNA, to jest sekwencje bakteryjne, podobnie jak sekwencje genu będącego markerem selekcji, również mogą być usytuowane pomiędzy pierwszym zdolnym do insercji fragmentem DNA a drugim zdolnym do ineercji fragmentem DNA. Jeśli zastosuje się taką konfigurację kom>°^nentów DNA, to można również wprowaadić sekwencje bakteryjne do genomu gospodarza drożdżowego poddawanego procesowi moodyf^aci genomowej według wynalazku.

Znana jest transformacja Pichia pastoris. Metody eksperymentalne stosowane do transformacci Pichia pastoris podane są bardziej szczegółowo poniżej /petrz przykład 1/. Szczepy drożdży z rodzaju Pichia transformuje się na drodze enzymlycznego trawienia ścian komórkowych z wytworzeniem sferopaastćw. Sferoplasty te miesza się następnie z transformującym DNA i inkubie w obecności jonów wapniowych i glikolu polietyeinowego, następnie regeneruje w selekywwnym środowisku wzrostu. Transformujący DNA zawiera gen będący mrkerem selekcji, pfzwaaający na wyselekcjonowanie tych komórek, które przyjęły transformujący DNA, gdyż jedynie tranfflπnowcie komórki są zdolne do życia i wzrostu w warunkach selektywnego wzrostu /dobór warunków selekyywnego wzrostu zależy od rodzaju genu będącego mrkerem selekcji, zastosowanego jako część transformującego DNA/.

Zaobserwowano, że jeśli jako gospodarza do ekspresji genów heterfaogicznyjh zastosuje się szczepy Pichia, w których został rozerwany pieiwszy gen oksydazy alkoholowej /ΑΟΧ1/ to nieoczekiwanie poziom ekspresji produktów tych genów heteroaogicBnyjh znajdujących się pod kontrolą pewnych promotorów /na przykład /0X1 lub DA// zwiększy się wielokrotnie w stosunku do poziomu ekspresji osiąganego wtedy, gdy jsko gospodarza stosowano kompetentne komórki z pełnym genem oksydazy alkoholowe;). W ^niku tej fbserwaaCi i dalszego badania tego zjawiska został opracowany ogólny sposób zwiększania poziomu ekspresji genów heterflfgicBnych w organizmach gospodarzy, polegający na tym, że urfWBCBi się hodowlę szczepu gospodarza w warunkach ograniczonego odżywiania na substracie, w stosunku do którego istnieje w komórce region silnego promotora wrażliwy na ten substrai, a gen heterologiczny znajduje się pod kontrolą tego silnego, wrażliwego na substrat promo^Ta.

Waaunki ograniczonego odży·eiciic wyłgane dla zwiększonej ek^>resj± genu wytwarza się albo przez odżywianie komórek ograniczonymi ilościami składnika odżywczego albo przez stosowanie mu.Uaitu gospodarza, który w wyniku ^^^1 mi ograniczone mofżieofci odżywiania w pewnych warunkach wzroetu. Przykładowo, jeśli jest pożądane zwiększenie poziomu ekspresji genów heterologicznych utrzymywanych pod kontrolą silnych promotorów oksydazy alkoholowej lub syntetazy dwuhyyΓo’f^y^cetfnu, przy czym obydwa te promotory są wrażliwe na otecność metanolu w pożywce, to albo stosuje się organizm gospodarza częściowo defektywny pod względem zdolności wykorzystania albo też podczas hodowŁ komputentnych komórek gospodarza z pełnym genem oksydazy alkoholowej stosuje się warunki wzrostu z ograniczeniem mtanolu w pożywce; zapewnia to warunki ograniczonego odżywania, w których można osiągniąc wzmożoną ekspresję genu.

Przyjmuje się, że opisany tu sposób zwiększania ekspresji genu hettroafgicEnego jest ogólnym sposobem mogącym mieć zastosowanie dla d^^^l.nego organizmu, dla którego istnieją promotory wrażliwe na ograniczenie odżywiania. Tak więc, umieszczając gen heterologiczny pod kontrolą tego rodzaju regionu promotora i prowadząc hodowlę organizmu gospodarza w wardukach ograniczonego odżywania pod względem składnika odżywczego pfeeOulącegf aktywację tego silnego uroiofors, powinno się uzyskać zwiększoną ekspresję genu. Korzystnym sposobem wytwoosenia warunków ograniczonego odżywiania' jest zastosowanie zmutowanego organizmu gospodarza, częściowo defektywnego pod względem móliwości ratabolizowania składnika odżywczego, który eaasprs3ję pewnych promotorów w znacznie większym stopniu niż u gospodarza iiemutowεkgo. 7 przypadku Pichia, sposób ten został baidziej szczegółowo opisany w przykładzie V.

154 343 ?rsy prowadzenia hodowli szczepu Pichia psstoris, w którym pierwszy gen oksydazy alkoholcwaj został przerwany w wyniku mooyfikaaci genomu prowadzonej sposobem według wynalazku, na metanolu jako źródle węgla, nieoczekiwanie okazało się, że te szczepy deiektywne pod względem pierwszego genu oksydazy alkoholowej mają w dalszym ciągu zdolność wzrostu na mtanolu, aczkolwiek w stopniu zmniejszonym w stosunku do komórek Pichia typu dzikiego. Obserwacja ta wskazuje na możliwą obecność drugiego genu oksydazy alkoholowej w wykorzystujących szczepach Pichia.

SkΓiiiig banku chromosomlnego DNA z Pichia doprowaddył do izolacji fragmentu o długości 3 kilopar zasad, będącego częścią drugiego genu oksydazy alkoholowej /ΑΟΧ2/. Fragment ten zawarto jeko insert w plazmidzie pBR322 /w miejscu dla BatMi/. Plazmid ten oznaczono symbolem pPG3.0 i wprowadzono do B. coli LB392 jako gospodarza. SEczep ten zdeponowano pod nr NRRL B-18022 w Northern Regional Resdarch lenner oi the United States Departament oi Agriculture w Peoria, Illinois, dla zaćmienia powszechnej dostępności po otrzymaniu patentu na przedmiot zgłoszenia.

Mapa restrykcyjna plazmidu pPG3.0 jest przedstawiona na fig. l6b i porównana z mapą restrykcyjną fragmentu genomowago pierwszego genu oksydazy alkoholowej w pPGG.O. Porównanie tych dwóch genów oksydazy alkoholowej /fig. 16/ ujawnia, że te dwa fragmenty nie są jedynie pokrywającymi się częściami tego samego locus genomu. Pomiędzy tymi dwoma fragmentami jasno widoczna jest hornologia, dowodem której jest obecność niektórych wspólnych miejso restrykcyjnych w obydwu tych fragontach. Miejsca restrykoyjit wspólne dla obydwu genów ΑΟΧ1 i A0X2 zaznaczone są na fig. 16 g^iazdkamO. Jednak obecność w jednym fragmencie Mejsc restrykcyjnych, które nie występują w drugim, wskazuje, że we fragmentach tych istnieje szereg różnic na poziomie iukleotydowyo.

Wyynlazek ilustrują poniższe przykłady.

Bufory i roztwory stoawane w przykładach rają skład podany poniżej.

M bufor Tris 121,1 g zasady Tris w 800 ml wody; doprowadza silę do żądanej warrości pi przez dodanie stężonego /35%/ wodnego roztworu iCl, pozostawia roztwór do schłodzenia do temperatury pokojowej prEed końcowym ustaleniem pi i rozcieńcza do końcowej objętości 1

Bufor TB 1,0 oM BDTA w 0,01 M buforze Tris /^i 7,4/.

Pożywka LB /Luria-Bertani/ 5 g tryptonu Bacto, 5 g ekstraktu drożdżowego Bacto, 2,5 g NaCl, w 1 litrze wo!y, doprowadza się do warrości pi 7,5 za pomocą NaOi.

Pożywka 2B 0,2« KI4PO4, 1,2% 0,01« MSO4 . 7 i2O, 0,074« leCl_2 · 2 i20, 2zug/ml biotyny, 1,ug/ol tiaminy, 100zUg/ol tryptofanu, 0,4« dekstrozy, 0,2% kwasów kazami-nowych.

Pożywka YPD 1« ekstraktu drożdżowego Bacto, 2% pentonu Bacto, 2^t« dekstrozy

Pożywka SD 6,75 g azotowej podstawy drożdżowej bez aminokwasów /D/FCO/,

2% glikozy w 1 litrze wody.

Roztwór SBD 1 M sorbitu, 25 M BDTA, 50 mM DTT.

Bufor SlB 9,1 g sorbitu, 1,47 g cytrynianu sodowego, 0,168 g BDTA, ml wody; doprowadza się do warrości pi 5,8 roztworem iCl.

Roztwór laS 1 M sorbitu, 10 ml! CaClg wyjałowiony przez sączenie.

Roztwór PB3 20« glikolu polietyeilowtgl - 3350, 10 mi.! laCl^, 10 raM Tris iC1 /ph 7,4/ wyjałowiony przeE sączenie.

SOS 1 M sorbitu, 0,3 x pożywka YPD, 10 m?4 CaCGj.

Skróty stosowane w przykładach rają następujące znaczenie:

BDTA - kwas etyenlodwuamino-czterllctowy SDA - dodecyll3iarcEai sodowy DTT - ditiltrθitll.

154 543

Przykład I. Transformacja Pichia pastoria.

A. Hodowla komórek.

1. Około 10 ml pożywki YPD zaszczepia sif kolonią Pichia psstoris GS115 /NRRL Y-15851/ i wytrząsa hodowlę w temperaturze 30°C w ciigu 12-20 godzin.

2. Po upływie 12-20 godzin rozcieńcza się zawiesinę komórek do uzyskania gęstości optycznej Οϋθ_οο około 0,01 - 0,1 i utrzymuje się komórki w logarytmicznej fazie wzrostu na pożywce YPD, w temppraturze 30°C w ciągu około 6-8 godzin.

3. Po upływie około 6-8 godzin 100 ml pożywki YPD zaszczepia się 0,5 ml hodowli posiewowej o °DgQQ około 0,1 /lub ilością i wytrząsa w tempraturze 30°C w ciągu 12-20 godzin.

4. Po osiągnięciu wartości około 0,2 - 0,3 /po upływie około 16-20 godzin/ zbiera się komórki przez wirowanie przy 1500 g w ciągu 5 minut.

B. Wytwwrrznie sferoplastów.

1. Komórki przemywa się 10 ml jałowej wody. /Wszystkie operacje wirowania w etapach

1-5 prowadzi się przy 1500 g w ciągu 5

2. ΚοπιΟ^Ο przemywa się 10 ml świeżo przygotowanego roztworu SBD.

3. ΚοιοΟΛΟ przemywa się dlukotlnie 10 ml jałowego 1 M roztworu sorbitu.

4. Kmdrki dysperguje się w 10 ml buforu SCB.

5. Dodaje się 5-10/Ul Zymolazy 60000 /4 mg/ml, Miles ΒθΙμμ^^θθ/ i inkubuje się komórki w teope:raturze 30°C w ciągu około 30-60 minut.

Ponieważ wytwarzanie sfetopla8tól jest Oiytyckąyo etapem w procesie transformaci, powinno się prowadzić m^^l^'toro^^i^:^e tworzenia się sferoplastów w sposób następujący. Przed lub zaraz po dodaniu zy^dazy oraz w różnych ok^sach czasu podczas inkubbcci dodaje się 100 /ul komórek do 900/il 5% roztworu SDA i do 900 λιΙ 1M sorbitu. Inkubację k^ozy się w momonciθ, gdy zachodzi liza komórek w SDS ale nie zachodzi w sorbicie /nykle między 30 a 60 Mnutą inkubbcji/.

6. Sferoplasty przemywa się Zwukot>lnie 10 ml jałowego 1 M roztworu sorbitu, prowadząc wirowanie przy 1000 g w ciągu 5-10 minut. Czas Θ szybkość wirowania mogą być różne; wirowanie prowadzi się tak, aby uzyskać agregację sferoplastów ale nie spowodować pękania komórek w wyniku przeciążenia.

7. ΚοιιιΟΛΙ przemywa się 10 ml jałowego roztworu CaS.

8. Κο!ι00Π dysperguje się w 0,6 ml roztworu CaS.

C. Transformc ja.

1. Do sterylnych probówek polipropylenowych o wymiarach 12 x 75 mm dodaje się próbki DNA /do objętości 20,ul/. DNA powinien być w wodzie lub w buforze TB. W oelu uzyskania rnksymlnych częstości transformacji małymi ΘloścCaoi DNA korzystne jest dodanie do każdej próbki poddanego działaniu ultradźwięków DNA z E. coli w ilości 1 /il /5 m/ml/.

2. Do każdej próbki DNA dodaje się 100,ul sferoplaslow i prowadzi inkubację w temperaturze pokojowej w ciągu około 20

3. Do każdej próbki dodaje się 1 ml roztworu PEG i prowadzi inkubację w tempraturze pokojowej w ciągu około 15 minut.

4. Próbki wiruje się przy 1000 g w ciągu 5-10 minut Θ dekantuje się roztwór PSG.

5. Próbki dysperguje się w 150/al SOS i prowadzi inkubację w ciągu 30 minut w temperaturze eokoiowlj.

b. Dodaje się B50,ul jeło^go 1M sorbitu i nanosi próbki na płytki w sposób opisany poniżej.

D. Regeneracja sfeΓoelα3tól.

1. Przygotowanie kegereracyinβj pożywki agarowej.

a. Agar-KCl /9 g agaru Bacto, 13,4 g KC1 i 240 H HgOO sterylizuje się w autoklawie.

b. Pożywkę 10 x glikoza /20 g dekstrozy, 100 ml wody/ sterylizuje się w autoklawie

c. Pożywkę 10 x SC /6,75 g podstawy azotowej drożdżowej bez am.nokw^£jów, 100 ml wody/ sterylizuje się w autoklawie /przed lub po ogrzewaniu w autoklawie dodaje się żądany aminokwas lub kwas nukleinowy do stężenia 200 jg/ml/.

154 843

0. Do 440 ml stopionego roztworu Agar-KCl dodaje się 30 ml 10 x glikozy i 30 ml 10 x SC, następnie dodaje 3-ę 0,6 ml bSttyny /0,2 m/ml/ S żądany aminokwas lub kwas nukleinowy dr stężeo.Sa 24 yg/ml. Tak przygotowany agar regeneracyjny utrzymuje aię w stanSn stoptonym w temperaturze 55-6O°C.

2. Nanorzenie próbek pr transformacji na płytki. Cr najmniej na 34 mLout przed rtroynnSem próbek transormmowanych na płytki wlewa się pr 14 ml agaru regeneracyjnego, tworząc doloą warstwę. Do probówek umiβθocoonyDh w łaźni o tewpraturze 45-5O°C dodaje sSę po 14 ml agaru regeneracyjnego, podczas gdy próbki tran8Drmowaon znajdują się w roztworze SOS.

Próbki traUformowane opisane powyżej dodaje sSę dr probówek z agarem regeneracyinym S wlewa na dolną warstwę agaru oa płytkach.

3. Oznoczenie jakości preparatu sferrplastifo. Pobiera sSę 14 /-S jednej próbki S rozcieńcza 100-krotoie przez dodanie 994 μΐ 1M sorbitu. Z tego KH-krrtoSe rozcieńczonego roztworu pobiera się 14 μΐ S ponownie rozcieńcza 100-krotoSe przez dodanie 994 μΐ 1M sorbitu. Porcje po 144 μΐ obydwu rozcieńczonych roztworów wprowedEa sSę oa płytkach agarowych zawierających pożywkę YPD dla oznaczeoSa stężenia całych pozostałych w preparacie komórek, które oie przeszły’ w postać sSerrolastów. Pon^^^r, porcje pr 144 μΐ keżdego z rozcieńczonych roztworów dodaje sSę dr 14 ml agaru regeneracyjnego wzbogaconego 44 >g/ml histydyny w celu ozoacoθnSc całkowitej SlrścS dających sSę regenerować sSm^rpla^l^i^w.

W próbie transf οπ^Ι za dobre wyniki uzoaje sSę 1-3 x 14 ' dających sSę regenerować fero^astów/ml · rlcołr 1 x 1<P ca^łyc^h kwm&rk/ml.

4. Płytki Sokubuje sSę w temperaturze 34°C w ciągu 3-5 dni.

Przykład II. Specyficzna co Od miejsca Sosercja genu ARG 4 z Sccchcrrmyces i sekwenoci pBR322 z jednoczesną delecją geou HIS4 z genomu szczepu GS194 /HRRL

FSgura 1 oronOstcwSc pla^SO pYM11, a fig. 2 przedstawia schemat postępowania, w wzⁿⁱku którego rastępuje kierowana miejscem i^osercja plazmidu Or genomu P. pastorle. Przygotowuje sSę wektor, za pomocą którego dokonuje sSę insercji geou AR44 z Saccharomyces S sekwenoci DNA z plazmidu pBR322 Or locus HIS4 w Pichia z jednoczesną delecją całego locus genu HIS4 z genomu Pichia. Dr plazmidu pYM11 można łatwr wprowadzać inne sekwenoje, takie jak odcinki /kasety/ ekspresyjne i następnie podobnie wprowadzać je Oo genomu P. pastoris.

Plazmid pYY511 złożony jest z fragmentu BcrRI - BaUI, zlokal0rowcongr in situ oa końcu 5' geou HIS4 Pichia, oraz z fragmentu BcoRI - Ciał z1rkc1iDowcongr na końcu 3* genu HIS4 Pichia. Obydwa fragmenty flankujące gen HIS4 można otrzymać z plazmidu pYJ8 /dostępnego w B. coli jekr gospodarza pod nr NRRL B-15889 z Northern Regiroal Research Center rf the United States Department rf Aggiculture, Peoria, Illinois, patrz fig. 3/. Mają one długość wkoło 444 par zasad S z plazmidem pYM11 połączone są swymi końcami BcoRI. Jakr mrker selekcji, wektor pYM11 zawiera fragment HinOOll - Sali z plazmidu pYM25 r długości

2,6 kitopar zasad /do8ioplz w E. coli Jako gospodarzu p><^0 or NRRL B-18015, patrz iigg. 17/ kodujący liazę argininobursztynCoDową z Saccharomfces /produkt genu ARG4/. W wyniku cięcia enzymem BcoRI, plazmid pYK11 przechdzi w postsć liniową ocwiercaącą oa swych końcach fragmenty flankujące gen HIS4.

Szczep Pichia pestrris arg4, 4S194 /NRRL Y-18014/ transformuje się przec^enzym enzymem BcoRI plazmidem pYMU. nadając mu piOtotrrficEność w stosunku 0r argSoiny /Arg⁺/. Regeneracyjną pożywkę agarową wzbogaca się 44/Ug/ml hSstydyny Ola uniknięcia działania selekcyjnego przeciw tranfDrraaotom wyraggi ącym histyOyoy w wyniku Oclecj· geou HIS4.

I;octipnin prowadzi się skrioiog trensfomiaot iw Arg w celu znalezienia tych, które w wyniku delecji geou HIS4 przeszły w traosfomanty His^-. Dla ODkroenia skrSoingu trsnsftrrantów His^- agar regeneracyjny ze znajdującymi sSę oa nim koloniami Arg⁺ przenosi sSę do 54 ml jałowych probówek zawierających 25 ml jsłowej wody. Agar puSter-zzuje się w hrmogeoioctoroe Brinkrao Iostiuments Polytrro przy ustawieniu mocy 5, w cićgu okołr 1 minuty. KoiUci drożdży oddziela sSę w0 agaru sącząc przez trzy warstwy’ jałowej gazy. Część zebranych komórek drożdży poddaje sSę 0oicłanSu ultradźwięków, rozcieńcza i rozprowadza oa płytkach e pożywką SD z dodatkiem 44zUg/ml histydyoy.

154 643

Operację sonifikacji prowedEi się w ten sposób, że próbki komórek rozcieńcza się do A600 = ^0,1 i poddaje działaniu ultradźwięków w ciągu 10 sekund w urządzeniu Sonnfier CU Disrupter 350 /Branson Sonic Power Co./ przy ustawieniu mocy 4. Działanie to jest wystarczające dla rozdzielania komórek, a nie zmnejsza żywoonosci komórek. Po 2-3 dniach kolonie, które wyrosły na płytkach agarowych z pożywką SD z dodatkiem histydyny nanosi się mtodą rep li k na zestaw płytek SD, z których jedna zawiera histydynę, a druga nie zawiera histydyny.

Uddiał kolonii Arg⁺ His” wynt>oi 0,7% ogólnej liczby trrn^fo3mrotów Arg⁺. Genomowy DNA z trzech szczepów Arg⁺ His” badano młodą hybrydyzacji Southerna typu biot. Wszystkie trzy szczepy nie miały całego genu HIS4, natomiast zawierały insercję linoowego plazmidu, tak jak to przedstawia fig. 2 /dół:/.

Poza tym, że szczep G3190-^ipTM11 wyimga do wzrostu'histydyny, a nie wywga argininy, nie zaobserwowano żadnych innych zmian w wynmganiach odżywczych. Nie zaobserwowano również zmian szybkości wzrostu.

Przykład III. Delecja genu HIS4 z P. pastoris NRRL Y-11430.

Figura 4 przedstawia plazmid pYMl3a, a fig. 5 przedstawia schewt postępowania, w wyniku którego następuje insercja liniowego fragmentu z plazmidu do locus HIS4 w genomie P. pastoris, szczep NRRL Y-11430. Jako rairl^eir selekcji, wektor zawiera gen oporności

O

G418 /G418 / z plazmidu pBPG1-1 /dostępnego w Northern Regional Research Cenner of the United States Department of Aggiculture, Peoria, Illinois, w E. coli jako gospodarzu pod nr NRRI> B-l^{8020, p}atrz ^fig. 6/ (len ^G418® wyodrębnia się z plainMii pBKI-1 jako fragment BamHI /miejsce pBRR22/ Bg1II /miejsce PAIR1/ o długości około 2,2 kilopar zasad i dokonuje jego insercji w Mejscu Bg1II w plazmidzie pYJ8 /NRRL &-15889, petrz fig. 3/, zastępując fragment Bg1II o długości 2,7 kilopar zasad zawierający gen HIS4 z Piohia.

Wektor pYM13a trawi się enzymem BcoRI, otrzymując fragment o długości 2,9 kilopar zasa^d, zawierają^ ^gen G41⁸® flankowan^y odcinkami DNA o <3łu^gości olcoło 45⁰ i· ²5^{0 p}ar zasad pochodzącymi z regionu ylokrlyoiwrokgo odpowiednio na końcach 5* i 3' genu H1S4. Plazmid przecięty enzymem BcoRI transformuje się do P. paatoris jako gospodarza.

Selekcji transfrrilantii dokonuje się w oparciu o ich zdolność wzrostu w obecności 300 ug/ml antybiotyku G418. W celu selekcji G418 regeneracyjną pożywkę agarową w przykładzie I /część D/ mofyyikujk się w następujący sposób.

1. Przygotowanie regeneracyjnej pożywki agarowej.

a. Aggr-sorbit /9 g agaru Bacto, 54,6 g sorbitu i 240 ml wody/ sterylizuje się w autoklawie.

b. Pożywkę 10 x /20 g dekstrozy, 100 ml wc^^^/ sterylizuje się w autoklawie.

c. Pożywkę 10 x YP /10 g ekstraktu drożdżowego, 20 g peptonu i 100 ml wody/ sterylizuje się w autoklawie.

d. Do 240 ml stopionego roztworu sgsr-sorbit dodaje się 30 ml pożywki 10 x glikoza i 30 ml pożywki 10 x YP i tak przygotowaną regeneracyjną pożywkę agarową utrzymuje się w stanie stopionym w temperatur£k 55-6O°C.

2. Nanoszenie transfrrrrιntów na płytki.

Co nsjmnej na 30 minut przed otrzymaniem próbek transfmiiroych na płytki wlewa po 10 ml regeneracyjnej pożywki agarowej z dodatkiem 600 ug/ml antybiotyku G418, tworząc dolną warstwę. Do probówek um^szczonych w łaźni o tempraturze 45-5O°C dodaje się po 10 ml regeneracyjnej pożywki agarowej /bez antybiotyku G44S/, podczas gdy próbki transformowane znajdują się w roztworze SCS. Gdy próbki transfrrmoirne są już gotowe, odpowiednie ilości tych próbek dodaje się do probówek z agarem regeneracyjnym i wlewa na dolną warstwę 10 ml agaru zawierającego antybiotyk G416 na płytkach. Następnie płytki te inkubuje się w temperaturze 30°C w ciągu 3 do 5 dni.

Po utworzeniu się kolonii na płytkach z agarem regeneracyjnym z dodatkiem. G418 prowadzi się skrining komórek na zdolność wzrostu bez histydyny. Konmrki ekstrahuje się z agaru regeneracyjnego, poddaje działaniu ultradźwięków i rozprowadza na płytkach agarowych z pożywką SD wzbogaconą 40,ug/ml histydyny, jak opisano w przykładzie II. Po 2-3 dniach

154 £43 inkubacji w teoiperaturze 30°C kolonie nanosi sie metodą replik na płytki agarowe z pożywką SB z dodatkiem histydyny i bez dodatku histydyny.

Około 3,1!? kolonii G41B było koloniami His /2 ns około 2000 poddanych skriningowi/. Próby hybrydyzaaji Southerna typu biot wykazują, że w obydwu szczepach His” nastąpiła delecja genu HIS4 i że obydwa te genomy Eawiiir ją gen G418 , jak to przedstawia fig. 5. Jeden z tych szczepów Hia”, oznaczony w laboratoruum symbolem KM31 /dostępny w Northern Regional Research Center of the United States Departrnnt of Aggiculture, Peoria, Illinois, pod nr NRRL Y-1801S/ udało się skutecznie tratsfiraoiać kilkoma plazmidami pochodzącymi z Pichia i zawierającymi gen HIS4, przykładowo plazmidem pSAOH5 /dostępny w

E. col i jeko gsspddirjU pdd nr NRRL B-1SS22/' , o o jes t aastęnnym owoddern na to , ee Ώ33 1 jest specyficnnym oigatZyyem z delecją genu HIS4.

Obeenie po raz pierwszy przeprowadzono bezpośrednią transformację P. pastoris NRRL Y-11430 typu dzikiego /to jest, bez wstępnej iE3l6(^,ji i charaktegyzecji auksotroficztej pochodne/. Przypuszczalną zaletą tych zmutowanych szczepów HIS4 jest to, że ponieważ zostały one skonstruowane młodą specyficznej co do miejsca insercji/delecji, są one woi ne od wtórnych mulaci, które prawdopodobnie występują w dUksoOΓoficznych gospodarzach Pichia wytwarzanych na przykład na drodze chemicznej mTagenezy, takich jak na przykład szczep GS115 /NRRL i GS190 /NRRL Y-18014/.

Na uwagt zasługuje fakt, że delecja genu HIS4 Pichia z genomu Pichia w wyniku insercji fragmentu EcoRI z plazmidu pYM13a nie powoduje włączenia dużych części plazmidu pBR322 /co następuje, jeśli dokonuje sit insercji plazmidu pYM11, patrz przykład II/. Ponieważ większość autonomicznych, opartych na ARS wektorów ekspresyjnych Pichia, takich jak przykładowo pSA0H5 /patrz fig. 9/ składa się głownie z sekwanj! pochodzących z p3R322 i z genu HIS4 Pichia, te autonomiczne wektory wykeaują niewielką hpmyPogit z geno· mem gospodarzy Pichia z delecją HIS4, a zatem nie powinny często podlegać integracji.

Przykład IV. Rozrywwnie pierwszego genu oksydazy alkoholowej.

Szczepy Pichia, nie zawierające genów oksydazy alkoholowej /pierwszy gen oksydazy alkoholowej jest oznaczony symbolem ΑΟΧ1, a drugi gen oksydazy alkoholowej jest oznaczony symbolem ΑΟΧ2/ są interesujące z co najmniej dwóch powodów. Po pierwsze, stanowią pomoc do badań nad regulacją ekspresji genu przez meanol. Przykładowo, taki zmutowany szczep bez genów ΑΟΧ1 i ΑΟΣ2, opisany bardziej szczegooc^^ w przykładzie VII, może dostarczyć dowodu na to, czy mtanol lub jakiś inny yeeabbtit /formaldehyd, mrówczan i tym podobnes/ jest rzeczywiście cząsteczką indukującą geny regulowane mtanolem. Po drugie, zainteresowanie ΑΟΧ-ddfeknywn;m szczepem Pichia wynika z prawdopoPyPbeńsSw8, że w takim szczepie może zachodzić ekspresja produktów heteiolpgicEπegρ genu na wy^iszych poziomach, co opisano bardziej szczegółowo w przykładach V i VI.

V celu rozerwania genu AO przygotowuje się plazmid pYN7 /fig. 7/. Plazmid ten konstruuje się przez insercję fragmentu Baimi-Sami o długości 2,9 kilopar zasad, pochodzącego z plazmidu pYK25 /NRRL B-18015, patrz fig. 17//, zawierającego gen ARG4 z Saccharodo plazmidu p?G40 ciętego uprzednio enzymem BaraNI /NRRL B-15368, patrz fig. l6s, na mapie restrykcyjnej części Pichia tego plazmidu/. Insercja ta powoduje delicję około 600 par zasad z części 5* genu ΑΟΧ1 /około jednej czwartej tego genu/. Plazmid pYL17 doprowadza się do postaci liniowej przez Srnwienίd enzymami PvuII i EcoRI i transformuje go do szczepu PPP1 /arg4 his4, NRRL Y-18017/ przez selekcję mutantów prototroficznych Arg⁺. Transformanty ekstrahuje się z agaru regeneracyjnego i poddaje działaniu ultradźwięków w sposób opisany w przykładzie II, po czym rozprowadza na płytkach agarowych z pożywką SD zawierającą O,1S glikozy /zamiast 25/ i 40 pg/ml Wstydy-ny. Utrzymane kolonie nanosi się metodą replik na zestaw płytek egartwych z pożywką SD /zawierającą histy-dynę/ z dodatkiem następujących źródeł węgla: 1/ bez źródła węgla, 2/ 3,55 mesmiu, 3/ 25 glikozy. Około 81,05 kolonii Arg⁺ nie ms zdolności norml^go wzrostu na meanolu. Annaiza SpuShdina typu biot genoyt’iego DNA z dnu z tych szczepów nie ·iykopzysΐujących mesMlu, to jest szczepu ŻC11 i Xf72, potwierddiła, że w tych szczepach uległ rozerwaniu gen ACX1 i że nastąpiła inse^ja wekkora, jak to przedstawia fig. 8 /dół/.

154 843

Defektywne pod względem oksydazy alkoholowej koMtrukoje PPP1-p1Kj17 posiadające genotyp: his4 aox1 ::SARG4 rają ogromną potencjalną wartość. Przykładowo, ponieważ jest to szczep his4. to takiego gospodarza można tranffrrmować wektorami Pichia zawierającymi gen HIS4 jako rarker selekcji, takimi jak pSSOH5 /NRRL B-15862, patrz fig. 9/, oo opisano bardziej szczegóoowo w przykładzie V.

Przykład V. Regulowana ratanolem ekspresja genu lacZ w defektw«nym pod ' względem oksydazy alkoholowej miUancie szczepu Pichia pastoris.

W niniejsym przykładzie opisane są próby ekspresji genu lacZ w Pichia KM71 jako gospodarzu /def^^lcywna pod względem oksydazy alkoholowej konstrukcja PPP1-pPM17/ otrzmanym sposobem opisanym w przykładzie IV.

W tych próbach porównawczych, gospodarzem Sox1- jest szczep KtI71 /his4 aox1 :: SSRG4/, a gospodarzem Sox+ jest szczep PPP1 /arg4 his4; NRRL P-18017/. Fragment ekspresyjny Saseta ekspresyjna/ promooor ΑΟΧ1 - gen LacZ, tranfoomoowany do obydwu szczepów znajduje się w plazmidzie pSSO5 /patrz fig. 9, NRRL B-15862/. Z obydwu szczepów izoluje się kilka stabilnych His*. Ioh genomowe DNS poddaje się analizie Southerna typu biot otrzymując skojarzony zastaw szczepów, z których każdy zawiera pSSOH5 zintegoowany w locus promotora Α0Χ1. Podobnie, odcinek fuzyjny promotor syntetazy dwuhytroksyacβtoiowej /DSS/ - gen lacZ zawarty w plazmidzie pT76H3 transfomuje się do KM71 i PPP1 /patrz fig. 18, NRRL B-18000/ przez selekcję na prototroficzność w stosunku do histydyny.

Hodowlę «szybkich czterech szczepd prowadzi się początkowo na pożywce SD, z tym, że jako jedyne źródło węgla 7 energii stosuje się 2$ gliceryny zamiast 2$ glikozy. ^^<3ą hodowlę przesuwa się, to znaczy, komórki zbiera się przez Urow^i^ie 7 przenosi na inną pożywkę, w tym przypadku na pożywkę SD z dodatkiem 0,5$ ratanolu jako jedynego źródła węgla. Próbki tych hodowli bada się na fł> -galaktozydazę. Wyyikl podano w poniższej tablicy

T a b 1 i o a

Czas /godziny/	/3-4alaktozydaza /jednostki/ yig^
Gospodarz Sox1+	Gospodarz Sox~
Promotor	S0X1	DAS	Α0Χ1	DSS
0		0	0	0	0
2		3	2	5	4
4		11	8	7	7
10		18	9	12	11
16		17		26	-
20		21	12	38	18
25		-	16	-	24
30		18	-	43	27
32		-	22	-	37
42		14	-	72	-
50		-	22	-	48
54		« i J		48

x Próba na β> -gs^ktozydazę. S. Wyyragane roztwory.

1. Bufor Z		Końcowe stężenie
N3 2KP04 . 7 H20	16.1 g	0,06 H
LaH PO.	5,5 g	0,04 K
KC1	0,75 g	0,01 KI
KgSO4 . 7 H?0	0,246 g	0,001 K
2-me rka pt oe t a no 1	2,7 ml	0,05 a
uzupełnia się do	objętości 1 litia;	pH powinno ^wywoić 7.

154 843

2. O-Nitrofenylo- /3-D-galaktozyd /ONPGG

400 mg OiPG /Sigma K-1127/ rozpuszcza się w 100 ml destylowanej wody, otrzymując roztwór ONPG o stężeniu 4 mg/ml.

B. '.'/yyoo.nnie oznaczenia.

1. Z pożywki hodowlanej pobiera się próbkę /20-50 ΟΒ^θθ komórek drożdży/, wiruje się i pastylkę komórek przemywa zimną jałową wooą.

2. Do pastylek komórek dodaje się 1zul 40$ buforu Z i Q,2_zug przemytych kwasem perełek szklanych o średnicy 0,45 - 0,50 mm. ',','ssystkie próbki utrzymuje się na lodzie. Próbki wiruje się przy najwyższym ustawieniu mocy, czterokrotnie, po minucie za każdym razem. Pomiędzy wirowaniami próbki powinny byó utrzymywane przynajmniej minutę na lodEie.

3. Lizaty przenosi się do probówek Mkrowirówki i wiruje w temperaturze 4°C w ciągu 5 minut. Ciecz znad osadu przenosi się do nowych probówek do mikrowirowania i utrzymuje te ekstrakty na lodzie.

4. Stężenie całkowitej ilości białka w ekstrakcie określa się mtodą Bio-Rad Laboratories /Bradfora/. W tym celu koncentrat odczynnika barwiącego Bio-Rad rozcieńcza się czterema objętościami wody dejonizowansj i sączy przez bibułę Wiatman 3MM. Sporządza się standardową krzywą stężenia, dodając 3, 10, 30 i 100 pg albuminy surowicy bydlęcej /BSA/ w 100 /ii buforu Z do zestawu probówek szklanych o wymiarach 13 x 100 nn, zawierających po 2,5 ml odczynnika barwiącego. Zawartość probówek miesza się i utrzymuje w temperaturze pokojowej w ciągu 5 m.nut, po czym oznacza ich gęstość optyczną przy 595 m. Próbki ekstraktów w ilości 3, 10 i 30 /ul rozcieńcza się do całkowitej objętości 100 /ii roztworem zawierającym bufor Z i oznacza zawartość białka w sposób opisany poi^^że^. Naatępnie określa się stężenie białka w każdym ekstrakcie przez interpolację przy użyciu krzywej stężenia BSA.

5. W próbie na β -galaktooydaEę, 10 /ul 10-krotnie rozcieńczonego ekstraktu dodaje się do 1 ml buforu Z i inkubuje się mieszaninę w ci^u 5 minut w temperaturze 30°C.

6. Reakcję rozpoczyna się dodając 0,2 ml ONPG /4 m/ml/ i wirując.

7. Realkję zatrzymuje się dodająo 0,5 H 1M roztworu RagCO^ w olpoi^l^dni^m czasie /zwykle Mędzy 1 a 30 minutą, przy ^a420 < ^1/*

8. OOdcytuje się absorbancję cieczy znad osadu przy 420 nm.

C. Obbiczenie jednostek aktywnnCciβ> -galaktozydazy.

Jedna jednostka /1 U/ = 1 nmol ortciitrofenclu /ONP/ powtającego w ciągu jednej minuty w temppreturze 30°C przy pH 7. Absorbanaja 1 rn^ojla ONP przy 420 nm /A^₂o^ P^ż przejściu promieni przez odcinek 1 cm wynosi 0,0045i a więc, absortancja = 1 przy 420 nm oznacza 222 ramie Offf/ml lub 378 ramoi/1,7 ml, gdyż całkowita objętość analizowanej cieczy znad osadu wynosj! 1,7 ml. Tak więc jednostki podane w tablicy oblicza się ze wzoru:

U = i—χ 378 /mlnity/

We wszystkich czterech hodowlach analizowanych w fazie wzrostu na glicerynie, aktywność ^-geakkoDzydazy była prawie niewykry^lna. Po upływie około 10-20 godzin po przeniesieniu na pożywkę z metanolem, dwie hodowle, które zawierały w gospodarzu Aox1⁺ kasety ekspresji ΑΟΧΙ-LacZ i DAA-lacZ wykazywały aktywność β -galaktozydazy na poziomie około 20 jednostek na 1 /ig białka. Jednakże kaseta A0X1-lacZ w gospodarzu Aox1~ wykazywała aktywność sięgającą około 60 jednostek β -galaktozydezy/zig. Rówwneż kaseta DAA-lacZ w gospodarzu Aox1~ wykazywała zwiększoną aktywność β-g6aokCoεydaEż. Tak więc transfommoweiż gospodarz Aox1~, KŁM1, wykazy!! ekspresję /3-g3laktozydazy na poziomie 2-3-krotnie wyAszym niż tranβ0o:ralowanż izcgenicoiy szczep Aox1⁺, PPF1.

Przykład VI. Insercja genu antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B i delecja genu Α0Χ1.

W tym przykładzie na kierowaną miejscem insercję/delecję, dokonuje się delecji całej kodującej sekrn.n<^^:i genu ΑΟΧ1 i insercji genu dla antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B /HBsAg/ pod kontrolą pozostałego w genomie promotora genu ACX1.

154 843

W celu skonstruowania odpowiedniego gospodarza P. pastoris, przygotowuje się plazmid pBSAG151 /zdeponowany w B. coli jako gospodarzu pod nr NRRL B-1B021, fig. 12, w Northern Research Ct^t^r of the United States De pert rent of Aggiculture, Peoria, Illinois, będzie powszechnie dostępny bez ograniczeń po uzyskaniu patentu na przedmiot zgłoszenia. Plazmid ten zawiera fragment o długości 1,0 kilopar zasad, pochodzący z 8ekiincCi flankujących koniec 5' genu A0x1, następnie sekwencje kodujące antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B /HBsAg/ i fragment terminatora Α0Χ1 o długości 300 par zasad, przy czym wszystkie te części są rozmieszczone tak jak to przedstawiają fig. 9, 10 i 11.

Po kasecie ekspresji następuje fragment o długości 2,7 kilopar zasad, kodująoy gen HIS4 z Pienia, a za nim fragment PvuII o długości 1,5 kilopar zasad, zawierający sekwencje 3* w stosunku do genu Α0Χ1. Jeśli ten plazmid pBSAG151 trawi się enzymem Bglll, to uwalnia się wektor liniowy o długo^<^:L 7,2 kilopar zasad, zawierający 0,85 kilopar zasad sekwencji 5' genu Α0Χ1 na jednym końcu i sekwencje 3* Α0Χ1 o długości 1,1 kilopar zasad na drugim koóou. Przecięty enzymem Bg1II plazmid pB3AG151 transformuje się do szczepu GS115 dokonując selekcji na prototrofiezcośś względem histydyny, transfoiTOanty ekstrahuje się z agaru regeneracyjnego i poddaje działaniu ultradźwięków w sposób opisany w przykładzie II, po czym nanosi się na płytki agarowe z pożywką SD zawwerająoą 0,% glikozy /zamiast 2,0%/. Otrzymane kolonie nanosi się następnie metodą replik na płytki z miid.malną pożywką agarową zawierającą następujące źródła węgla: 1/ bez źródła węgla, 2/ 0,5% meanol 1 3/ % glikoza. Średnio 32% kolonii nie miało zdolności normanego wzrostu na meanolu.

Amaiza Southerna genomowych DNA z dwu szczepów nie iykniEy^tująjych meanolu wykazała, że gen Α0Χ1 uległ delecji i że nastąpiła sekwencja wktora, jak to przedstawia fig. 13. Przy wzroście na raeanolu, szozep GS115-pBSAG151 /aox1 :: H3sAg-HI£S1·/ dawał ekspresję

HB^Ag na znacznie waszych poziomach niż podobnie tranfliormiiane komórki posiadająoe pełny gen oksydazy alkoholowej.

Przykład VII. Identyfikaoja drugiego genu oksydazy alkoholowej w P. pastoris za pomocą techniki kierowanej miejscem insercji.

Na obecność drugiego genu oksydazy alkoholowej wskazują następujące obserwacje:

1/ filtry Southerna, na których hybrydyzowano zarówno cDNA genu ΑΟΧ jak i genomowe DNA z iEG^wanymi przez restrykcję genomowymi DNA Pichia, zawsze wykazywały co najmunej dwa pasma, 2/ wyizolowano dwa fragmenty genomowe-i DNA Pichia, które wykazywały podobieństwo, lecz nie były ze sobą identyczne /patrz fig. 16/, 3/ szczepy mutantów Pichia, takie jak KM71 i GS115-pBSAG151, w których pierwszy gen ΑΟΧ /Α0Χ1/ uległ delecji lub przerwaniu, mogły w dalszym ciągu rosnąć na meesnolu i wykazywały aktywność oksydazy alkoholowej. Szybkość wEjrostu i aktywność oksydazy alkoholowej rosnących na mtanolu komórek tych szczepów Aox“ była znacznie mnnejsza niż u szczepów izo-enicE.cych Aox1 ⁺ . Okkzuje się zatem, że ekspresja drugiego genu ΑΟΧ /Α0Χ2/ zachodzi na niższym poziomie albo, że produkt ekspresji tego genu jest mnńej aktywny na pożywce weanolowwe. W przykładzie IV wykazano, że fragment DNA z Pichia zawarty w plazmidzie pPGG.0 zawiera gen Α0Χ1.

Najbarddzej przekonywującym sposobem zademointriwania, że fragment geni/mowego DNA z plazmidu pPGGo0 zawiera co najmnnej część genu Α0Χ2, jest skonstruowanie sEczepu muusntu, w którym przypuszczalny geń Α0Χ2 uległ rozerwaniu lub delecji. W tym celu skonstruowano kierowany miejscem wwktor pYM112a /fig. 14/. Plazmid ten zawiera głównie pPGG.0 /fig. I6b/, który Eawiera przypuszczalny gen A0x2 we BamHl o długości 3,0 kilopar zasad.

Z plazmidu pYJ8 /fig. 3, NRRL B-15889/ izoluje się fragment Bglll o długości 2,7 kilipar zasad, zawierający gen IIS4 z Pichia i dokonuje insercji tego fragmentu w miejsce sekννβη^ϊ Elonaliiiwlnych pomiędzy miejscem dla Bglll a na lewo, miejscem dla KpnI w plazmidzie pPCG^ /przed insercją miejsce dla Xpnl przeprowadza się w miejsce dla Bglll za pomocą sdaptorowej sekiincji oligonukleotydowej, a miejsce Banll w genie I-IIS4 niszczy się przez wipeeniecie przed insercją w pPG3.0/« Porównanie genu Α0Χ1 i przypuszczalnego genu Α0Χ2 /fig. 16/ wykrnuje, że ta konstrukcja powinna dać w wyniku delecję około 800 par zasad ze środka genu Α0Χ2. Przez trawienie plazmidu pYM12a enEymem BamKI uwlnia się liaiowy wektor o długości 4,5 kilopar zasad, zawierający fragment genu IIS4 flankowany

154 843 przeć sekwencje e przypuszczalnego locus ΑΟΧ2 o długości odpowiednio 1,1 i 0,7 kilopar zasad /patrz fig. 15//.

Tym linowwym wektorem transformuje się szczep Aoxl”, KM71 /aox1 his4 ss SARG4/ i izoluje się transfomanty prowadząc selekcję na prototrofy histydyny. Następnie wyk o nu je się skrining tranffomasntói na zdolność wykorzystywania mtanolu nanosząc je mtodą replik na zestawy płytek agarowych.

Nietr8nfformoiany szczep KM1 Aox1~ rósł tak wolno na płytkaoh z metenolem, że jeśli metanol dodawano do agaru, wyparowywł on przed tym, nim można było zaobserwować znaczący wex*o8t. Trudność tę rozwiązano przez doprowadzenie mtanolu do komórek w fazie gazowej. W tej technice, około 0,2 ml 100?? metanolu umieszczę się pod pokrywką płytki, przy czym pożywka agarowa w płytce nie zawiera źródła węgla. Płytkę taką pozostawia się w temperaturze pokojowej, a pokrywkę zmienia się oo dwa do 4 dni, umieszczając nową pokryw kę, zawierającą meanol. Po upływie 1-2 tygodni widoczna- jest wyraźna różnloa we wzroście na metanolu szczepu typu dzikiego /Aox1⁺ Aox2⁺/ i szczepów zmutowanyoh /Aox1~ Aox2+ / oraz /Aoxl“ Aox2”/.

Po wykonaniu doświadczenia metodą podawania mtanolu z fazy gazowej okazało się, że około 0,1% tranformmantw Hia⁺ ze szczepu Aox1~ nie ma zdolności wzrostu na meanolu.

DNA pochodzące z ośmiu traωfomantów Aox1~ Aox2~ His+ zanalizowano metodą hybrydyzacj Southerna na filtrach. Trzy spośród analizowanych DNA zawierało linoowy wektor pYM112a włączony w mejscu pokazanym na fig. 15. Armliza jednego z podwójnych mutantów Aox1~ Aox2~, KM 121 /NRRL Y-18019/ wykkEała, że szczep ten nie ma żadnej wzrostu na metanolu 1 że nie wykazije on żadnej wykrymwanej aktywności oksydazy alkoholowej.

Wynnki badań szczepu KM 121 jasno wizują, że fragment z Pichia w plazm-dzie pOJ4.0 zawiera sekwencje z drugiego genu ΑΟΧ i że opróoz tych dwóch genów oksydazy alkoholowej nie występuje w Pichia pastoris żadna inna aktywność utleniania meanolu.

Claims (16)

1. Zastrzeżenia patenowwe

   1. Sposób selektywnej co do miejsca iofyyiktaji genomu drożdży z rodzaju Pichia w z góry określonym miejscu genomu, prowadzący do wytwofEeniα mianta organizmu Pichia, znamienny tym, że szczep gospodarza z rodzaju Pichia trarafomuje się seryj nie zbudowanym linown^ fragmentem DNA zawierającym pierwszy, zdolny do insercji fragment DNA, gen będący mr^rem selekcji oraz drugi, zdolny do inser^i fragment DINA, przy czym ten pierwszy i drugi, zdolne do nnseΓcji fragmenty DNA mją długość po co najmniej 200 nukleotydów każdy i posiadają sekwencje ^kleotydowe hoiifogiczie do rozdzielanych części naiwnego genomu DNA Pichia w miejscu, w którym ma nastąpić mooyyikscja genomu, pn^e3wsan i drugi, zdolne do insercji fragmenty DNA są aorienfowαnt w stosunku do siebie w linowym fragmencie DNA tak jak są one afrienfowene w genomie Pichia, a gen będący mrkeram selekcji jest usytuowany między pierwszym zdolnym do insercji fragmentem DIIA a drugim, zdolnym do inser^i fragmentem DNA.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się linoowy fragmnt DNA zawierający pierwszy i drugi, zdolne do inser^i fragmenty DNA wybrane z grupy obejm^ącej fragmenty o długości około 200-5000 par zasad, odpowiednio z genón oksydazy alkoholowej, genu syntet^azy ywuhynyokgyace tonowy, genu liazy argininobursztynianowej i genu dehydrogenazy histydniflfwet.
3. 3· Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się linoowy fragmnt DNA zawerający pierwszy i drugi, zdolne do insercji fragmenty DNA scharakteyyoowane mapą restrykcyjną przedstawioną na fig. 1.
4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się linoowy fragmnt DNA zawierający pierwszy i drugi, zdolne do nnsercjn fragmenty DNA, scharakteryzowane napą restrykcyjną przedstawioną na fig. 4.
5. 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się linoowy frag-. mnt DNA zavwi.erający pierwszy i drugi, zdolne do iisercji fragmenty DNA scharakteryzowane mpą restrykcyjną przedstawioną na fig. 7.

   154 843
6. 6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się liniowy fragment DNA zawierający pierwszy i drugi, zdolne do inaercji fragmenty DNA scnarakteyyoowane mapą restrykcyjną przedstawioną na fig. 12.
7. 7. Sposób według zaatra. 1, znamienny tym, że stosuje się linóowy fragmant DNA zawierający pieiwszy i drugi, zdolne do insercji fragmenty DNA scharakteryzowane mapą restrykoyjną przedstawioną na fig. 14.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się linony fragmnt DNA zawierający ponadto gen heterologiczny, przy czym ten gen heterologiczny, tak jak i gen będący markerem selekcji, jest usytuowany pomiędzy pieawsEym zdolnym do insercji fragmentem DNA a drugim, zdolnym do insercji fragmentem DNA.
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się linony fragmnt DNA zawierająoy ponadto region regulatorowy oraź gen heterologiczny, przy czym ten gen hθteriligiczny znajduje się pod kontrolą regionu regulatorowego i ten układ konstrukcyjny region regulaoorowy - gen heterologiczny, łącznie z genem będącym markerem selekcji jest usytuowany pomiędzy pierwszym zdolnym do inseroji fragmentem DNA a drugim zdolnym do insercji fragmentem DNA.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako szczep gospodarza stosuje się Pichia pastoris /GS 115/, a transformacji dokonuje się za pomocą plazmidu pBSAGI5I, zawierającego pierwszy i drugi, zdolne do insercji fragmenty DNA oraz gen będący markerem selekcji, otrzymując zasadniczo czystą hodowlę mitanta organizmu Pichia w postaci Pichia pastoris /IS11^-pBplS^^I55^.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako szczep gospodarza stosuje się Pichia pastoris /IS 190/, a transformacji dokonuje się za pomocą plazmidu pYMI1 zawierającego pierwszy i drugi, zdolne do insercji fragmenty DNA oraz gen będąoy markerem selekojl, otrzymując zasadniczo czystą hodowlę mitanta organizmu Pichia w postaci Pichia pastoris /IS 190 - pYSMI/.
12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako szczep gospodarza stosuje się Pichia pastoris /NRRL Y—11430/, a transforanaoji dokonuje się za pomocą plazmidu pYM3a zawierającego pierwszy i drugi, zdolne do insercji fragmenty DNA oraz gen będący markerem selekcji otrzymując zasadniczo czystą hodrn^l-ę mulenia organizmu Pichia w postaci Pichia pastoris NRRL Y-18018 /NRRL Y-1143O-pYn3e; KB31/·
13. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako szczep gospodarza stosuje się Pichia pastoris /PPF1/, a transformacji dokonuje się za pomocą plazmidu pYMI7 zawierającego pierwszy i drugi, zdolne do insercji fragmenty DNA oraz gen będący markerem selekcji otrzymując zasadniczo czystą hodowlę miuanta organizmu Pichia w postaci Pichia pastoris /PPP1 - pYII7; KM 71/.
14. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako szczep gospodarza stosuje się Pichia pastoris /PPF1/, a transformicji dokonuje się za pomocą plazmidu pYJI7 - pYM12a zawierającego pierwszy i drugi, zdolne do insercji fragmenty DNA oraz gen będący markerem selekcji, otrzymując zasadniczo czystą hodowlę mulanta organimu Pichia w postaci Pichia pastoris NRRL Y-18019 /PPF1-pYMI7-pYM12a; K31111/.
15. 15. Sposób według za3trz. 2, znamienny t y m, że stosuje się fragment DNA kodujący gen Α0Σ2 z Pichia pastoris lub jego rabację, lub jego funkcjonalny równoważnik.
16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że stosuje się gen ΑΟΧ2 scharakteyyoowany mapą restrykcyjną przedstawioną na fig. l6b.

    154 843

    Chromosom

    Pichia

    Rl C Ri Β B ]_J_I_L_L |«·-H1S4—W-J

    Ri C

    P·

    I

    I Dnsercja { Pe B

    -«SSSSSSSSSS5

    1154 843

    FIG. 3

    FIG. 4

    154 843

    Rt Ba Ba Ri

    Chromosom j I_L_[___

    Pichia his 4

    IDnsercja

    Ba Rt

    ---------tul-EZZ252SSZS5Z2SZS5ZSZZSZ9-tzzJ------—

    6418

    154 843 ri-pv2 Trawienie

    PV2 ’ B Ri (P*3

    1 . KWWWWWWM o r\ & % «

    U-1

    Chromosom

    Pichia

    Pv2 S

    Pe «0X1

    Ilnsercja

    B —1.........—1~.............

    3'-A0Xl S.cere, 5'A0Xl

    Pe

    ARG 4

    154 843

    Ll — U.

    Ha Rl

    FIG. 9

    154 843

    FIG. 10

    154 843

    Sp ♦ Ρ·

    Sp ♦ Ρ·

    FIG. 11 (Pv₂/Nr)

    154 843

    I HIS 4

    IZZ7.2222/O—( ...........-IBa Ae Ba Ri B2

    Chromosom _ j_J_| p_Łchia K- αοχι -H FIG. I3

    D^^sercja

    Bz Ri(Be) .t=b (Nr-ZPv₂) Ba >4=U.

    :zzzzzzzd—c

    S'-AOXi HBsBg |

    3'-BQXl

    HIS 4

    -ηοχι

    P·

    S+ Ba s+ s

    154 843

    Β Kp 02 Ρ· Β o^jornosom___j __ι ι _____

    Pichia ηοχ2

    Ijnsercja

    Β β2(Κρ) 7 Ba Ρβ Β

    -------J I ll L5'-Α0Χ2 HIS 4 3'-Α0Χ2

    a) ΑΟΧ1 (pPG 4.0)

    Ri H3H3 PsBz H) Β B· S BzKp Xb Re St-Pv2

    I_LLJJ_YlZ ... Λ K... i LU

    b) Α0Χ2 (pPG 3.0)

    B Kp- Re· 82 St· Kp ι T λ ik f

    Po B

    Region kodujący

    c) «0X1 c=:,t—i

    S' 3'

    FIG.

    154 843

    FIG. I7

    FIG. I8

    Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 100 egz.

    Cena 3000zł