JPS62104597A - アンジオテンシンｉ変換酵素の活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 汲芋上の利用分野一 本発明は、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性測定法に
関する。

アンジオテンシンＩ変換酵素（以下、ＡＣＥと略す）は
生体内においてアンジオテンノンＩに作用し、そのＣ−
末端のジペプチド、即ち、Ｌ−ヒスチジル−し−ロイシ
ンを遊離し、血圧上昇作用のある活性型のアンジオテン
ノン■を生成する酵素である。

ＡＣＥは血液や体液内に存在し、キニン・アンジオテン
ノン系あるいはキニン・カリクレイン系と関連して生体
内で重要な役割を果たしているが、この酵素の血中ての
レベルを測定オろことによってザルコイド−シス等の疾
病の診断をすることができる。

従来技術 従って、血清や体液中のＡＣＥの酵素活性を測定するこ
とは生理的あるいは臨床的に重要であり、多数のアンジ
オテンノン１変換酵素活性測定法が報告されている。例
えば、特開昭５６−４８８９８号公報および特開昭５７
−１０５１９７号公報がある。ｔ￥ｎｒＪ昭５６−４８
８９８号公ｅυニ記載の発明は堰質ヒブリルー■７−ヒ
スヂノルーし−口イシンにＡＣＥを作用させてヒプリル
酸を得、これにヒブリカーゼを作用させて得たグリノン
を比色定量する方法を開示する。この方法は、ヒプリカ
ーセで生じたグリノンを比色窓Ｉｎずろ点で本発明と異
なる。

特開昭５７１０５１９７号公報には、基質Ａ−ヒブリル
ーＬ−ジペプチド（Ａ　：　ＯＨ，ＮＨ，、Ｎ　（ＣＨ
３）２）にＡＣＥを作用させ、得られたＡ−ヒブリル酸
にヒプリカーゼを加え、八−安息香酸を得、これを酸化
剤で酸化すると共に４−アミノアンチピリンと縮合させ
、生じたキノンイミン色素を比色法により測定すること
によりＡＧＥの活性を求める方法が示されている。ここ
には酸化剤として無機酸化剤の開示があるのみで、酵素
によるアミノ安息香酸の酸化ならびに、それによって芹
しく高い精度の定量が可能となることについては全く示
唆していない。

（株）シー・エム・シー発行、「微生物の探索・分離・
育種」（昭和５９年１月発行）第１７９〜１８０頁には
、基質３−ヒドロキンベンゾイル−グリシル−し−ヒス
チジル−し−ロイシンにＡＣＥとアシラーゼを作用さＵ
・、得られたヒドロキン安息香酸をフェノールオキシダ
ーゼと２．２−アジノージ（３−エチルベンゾチアゾリ
ン−６−スルホン酸）アンモニウム塩を用いて呈色せし
め、比色法によりヒドロキン安息香酸を定ＩＬＡＣＥ活
性を測定する方法が開示されている。しかしながらこの
方法は、基質としてヒドロキン安息香酸を用いて行うこ
と、および呈色が４−アミノアンチピリンではなく、２
．２−アジノージ（３−エヂルヘンゾチアゾリンー６−
スルポン酸）アンモニウム塩を用いる点て本質的に異な
る。またこの方法は、アシラーゼで加水分解して得られ
る生成物を直接フェノールオキシダーゼで酸化し呈色さ
せると、未反応の基質も呈色し、比色定量ができないた
め、上記生成物を適当な溶剤（例えば、酢酸エチル）で
抽出しなければならない。（特願昭５８−２３５９２４
号参照）と云う欠点がある。

発明の目的 本発明者らは、上記欠点を有しないアンジオテンシンｌ
変換酵素の測定法を提供するものであり、持に、・１−
アミノアンチピリン／フ工ノールオキノターゼ系呈色反
応において、はとんど呈色しない基質を用い、該酵素活
性をより正確に測定することを目的とする。

発明の構成 本発明は、一般式 ％式％ ５式中、Ｋｙｎはキヌレニナーゼ、ＸおよびＹはそれぞ
れ独立してアミノ酸残基を示す］て表わさこるオリゴペ
プチドを基質とし、これにアンノオテ／ノンＩ変換酵素
含ａ試料を作用仕しめ、得られるキヌレニンをギヌレニ
ナーゼで加水分解して、アントラニル酸を生成仕しめ、
４−アミノアンチピリンとフェノールオキシダーゼを用
いて呈色させ、比色法によりアントラニル酸の量を定Ｅ
ハずろことを特徴とするアンノオテン／ンＩ変換酵素の
活性測定法に関する。

本≦ツ°１゛用いる基質はキヌレニル基を何することを
特徴と４゛る。

キヌレニンの加水分解によって得られるアントラニル酸
（（２−Ｎｌ−１ｔ）ＢＺＯＨ）は後述するごとく４−
アミノアンヂピリン／フェノールオキシダーゼ呈色系で
呈色させたとき、その吸光度測定領域で未分解キヌレニ
ン等による悪影響を受けないのて精度の高い分析を行な
うことができる。

ル 本発明においてキヌレニ虐を有する基質は、一般式・ Ｋ、ｎ−Ｘ−Ｙ ［式中、Ｋｙｎ、　ＸおよびＹは前記と同意義］で表わ
されるオリゴペプチドであり、ＸとＹはそれぞれ独立し
て任なのアミノ酸であってよい。Ｘおよび）′として適
当なアミノ酸としてはそれぞれプロリン、グリシン、ヒ
スデシン、ロイシン、アラニン、グルタミン酸、アルギ
ニン、フェニルアラニン、リジン等が例示される。

Ｋｙｎ−Ｘ−Ｙの具体例としては、例えばギヌレニルー
アラニループロリン（Ｋｙｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏ
）、キヌレニルーグリンルーグリノン（Ｋｙｎ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ）、ギヌレニルーヒスチンルーロイノン（Ｋｙ
ｎ−Ｔ−１ｉｓ　−Ｌ　ｅｕ）、キヌレニルーアラニル
ーアラニン（Ｋｙｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｌａ）、キヌ
レニルーアラニルーグリシン（Ｋｙｎ　−Ａ　ｌａ　−
Ｇ　Ｉｙ）、キヌレニルーアラニルーグルタミン酸（Ｋ
ｙｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ）、キヌレニルーアラニ
ルーアルギ＝ン（Ｋｙｎ−Ａｌａ−Ａｒｇ）、キヌレニ
ルーアラニルーフェニルアラニン（Ｋｙｎ−Ａ　ｌａ−
Ｐ　ｈｅ）、キヌレニルーアラニルーリジン（Ｋ　ｙｎ
　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｙｓ）、キヌレニルーロイシルー
グリノン（Ｋｙｎ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　ｌｙ）、キヌレニ
ルーロイノルーアラニン（Ｋ　ｙｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ
　ｌａ）、キヌレニルーロインルーフェニルアラニン（
Ｋｙｎ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ）、キヌレニルーフェニル
アラニルーアルギニン（Ｋｙｎ　−Ｐ　ｈｅ　−Ａ　ｒ
ｇ）またはキヌレニルーリジルーアラニン（Ｋｙｎ　−
Ｌ　ｙｓ　−Ａ　ｌａ）等がある。

本発明の測定原理は以下の通りである。

Ｋｙｎ−Ｘ−Ｙ ↓ＡＣＥ Ｋｙｎ　　　　　　＋　　ｘ−ｙ 呈　　色 本発明に用いる化合物は全て新規化合物であり、その合
成法の一例をＫｙｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏを例にと
って説明する。

第１−ａ図中、Ｂｚｌはベンノル基、Ｓｕはスフノニル
基、Ｚはペンジルオキンカルボニル基、およびｌ３ｏｃ
はＬ−ブトキシカルボニル基をそれぞれ示す。第１−ａ
図ではＬ−プロリンをベンジルエステルとし、これとベ
ンジルオキシカルボニル−し−アラニンスクシニルイミ
ドエステル（Ｚ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＳｕ）を反応せしめ、
得られたベンジルオキシカルボニル−し−アラニル−Ｌ
−プロリンヘンノルエステルをハロゲン化水素酸塩とし
、ウッドワード試薬にの存在下に・し−ブトキシカルボ
ニル−１，−キヌレニンと上記塩を反応し、脱ハロゲン
化水素後、生成したｌ３ｏｃ−Ｋｙｎ　−Ａ　ｌａ　−
Ｐ　ｒｏ　−０Ｂｚｌを加水分解し、Ｂｏｃ　−Ｋｙｎ
　−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏ、さらに脱ブトキンカルボニ
ル化反応によりＫｙｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏを得ている。

上記基質は、ｐＨ６、５〜９．０燐酸緩衝溶液あるいは
硼酸緩衝溶液、もしくはトリス−塩酸緩衝溶液等の緩衝
溶液に５〜２０ｍＭの濃度に溶解して用いるのが好まし
い。基質溶液には他の成分、例えば、トリトンＸ−１０
０あるいは、ツイン８０といった界面活性剤、らしくは
基質化合物の溶解度を上げるためにンメチルスルホキシ
ドあるいはメタノール等の６機溶媒等を含んでもよい。

また上記溶液中にはＡＣＥの活性を保つため、ＮａＣ（
２を０〜０．７Ｍ、好ましくは０〜０５Ｍの範囲で用い
る。

ＡＣＥ含育含料試料者の血清、体液等の被検試料である
。これらの試料は通常、希釈ずろことなくそのまま供試
ザンプル溶液とするか、もしくは燐酸緩衝溶液等の緩衝
液に適宜希釈して用いるのが好ましい。ｐ　ｒ−ｉは７
３〜８３であるのか好ましい。

ｐｔ＋を調整するには、一般に緩衝溶液、例えば、燐酸
緩衝溶液、硼酸緩衝溶液あるいはトリス−塩酸緩衝溶液
などを用いるのが好ましい。

上記混合物の反応は、３７℃で、１０分〜１時間行うの
が好ましい。

ＡＣＥの活性に対応して、ＫｙＩＩ　−Ａ　Ｉａ　−Ｐ
　ｒｏ基質は加水分解し、ＫｙｎとＡｌａ−Ｐｒｏを生
成する。

系中には未分解のＫｙｎ−Ａ　ｌａ−Ｐ　ｒｏがｒＴ在
するか、これは従来の、 （Ｒ＝　ｌ（ま〕゛二は０１１　、　Ｑ　＝　１１１ｓ
−１，ｅｕ、　　Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　　ｌｙ。

Ａ　ｌ　ａ　−Ｐ　ｒｏ）と５１１￥なり、第２図に示
すごと＜３６５ｎｍ付近に極大吸収を示し、本発明の呈
色領域であろ５３８ｎｍては殆んと吸収しない。なお第
２図は、Ｋｙｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏ（Ａ）とキヌ
レニン（Ｂ）の吸赴度曲線を示す。縦軸は吸光度、横軸
は波長を示十。

一１′、成しノこキヌレニン（Ｋｙｎ）は、キヌレニナ
ーゼで加水分解し、アノトラニル酸を定量的に得る。

キヌレニナーゼとしては、バチルス・セレウス（ｒ３ａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ：　　Ｉ　ＰＯ３００１）
、ンウドモナス０マルギナリス（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　ｍａｒｇｉｎａｌｉｓＩＦＯ３９２５）、ンウド
モナス・シンシアネア（Ｐｓｅｌ、Ｉｄｏｍｏｎａｓ　
５ｙｎｃｙａｎｅａ：　　ｒ　Ｆ　Ｏ３７５７）よｊ）
得たキヌレニナーゼが好ましく、他の微生物、３うるい
は動物臓器から得１こキヌレニナーゼでも使用可能であ
る。

キヌレニナーゼの濃度は０．０１１μｍｏｌ／ｍｉｎ／
ｍＱ、好ましくは０　、０１４　μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍ
Ｑである。この範囲において１５μ！＋１０１　’１５
度のキヌレニンは１０分以内にほぼ完全に加水分解を受
ける。

上記溶液中にはキヌレニナーゼの活性を高めるためピリ
ドギザ−ルー５−リン酸を含有させるのが好ましい。

溶液のＩ）Ｈは７．０〜９０が好ましい。ｐＨを調節す
るには、一般に緩衝溶液、例えば、硼酸緩衝溶液、燐酸
緩衝溶液などを用いるのが好ましい。

キヌレニンの加水分解によって得られるアントラニル酸
（（２ＮＯ３）ＢＺＯＨ）は、４−アミノアンヂビリン
／フェノールオキシダーゼ呈色反応系で呈色させ５３８
ｎｍて吸光度を測定する。この波長領域では第２図に示
すごとくキヌレニンは殆んど吸収を示さない。第３図は
、４−アミノアンヂビリン／フェノールオキノダーセ呈
色系でのアントラニル酸（Ｃ）の高濃度（Ｉ　Ｉｌｍｏ
ｌ）での吸光度を示す。縦軸は吸光度、横軸は波長を示
す。

本発明において用いられるフェノールオキシダーゼとし
ては、ポリポラス・フエルノコラー（Ｐｏｌｙｐｏｒｕ
ｓ　ｖｅｌｓｉｃｏｌｏｒ：　　Ｉ　Ｆ　Ｏ９７９１）
から得られろラッカーゼやコリオルス・コンソールス（
Ｃｏｒｉｏｒｕｓ　ｃｏｎｓｏｒｓ：　　Ｉ　Ｆ　Ｏ８
３４８）から得られるラッカーゼが例示される。これら
を用いることにより高い比色感度が得られろ。

・１−＝アミノアンチピリンはフェノールオキンダー七
ノ）ｆ字在下に、アントラニル酸と酸化縮合物をｌＦｅ
　Ｉｉ＆し、（ｊ−色比合物を形成する。

本発明は、Ｌ記括質と４−アミノアンチピリンとフェノ
ールオキシターゼとを組合わせろことにより、溶媒抽出
操作を不要とした点か町Ｒ要である。

フゴノールオギノグーゼの濃度は０３〜２μ９７′ｍＯ
１好ましくは０．５〜１．５μＬ／ｍＱである。

二）〕範囲にｊ５いて呈色か極大に達して、測定が容男
てｌうる。

フェノールオキノターセに代えて過ヨウ素酸等；）　イ
ｊ（賎酸化剤を用いろと、１／７２〜１／４の感度しか
得られない。

■−記゛を色反応は一般に、・１０〜６０のｐ　Ｉ−ｉ
を有する溶液中で行うのが好ましい。この範囲において
カップリング反応が容易に起こる。ｐＨを調整するには
、例えば、燐酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液等を用いる。

本発明において４−アミノアンチピリンは、フェノール
オキシダーゼの作用により４−アミノアンチピリンニ４
体へ変換されろと同時に、共存するアントラニル酸と反
応し、可視部吸収を有する呈色化合物を与える、いわゆ
る、色原体（カップラー）としてイ乍用する。

溶液中の４−アミノアンチピリンの濃度は０゜０２〜０
　、２　ｙ９／　ｍＱ、好ましくは０．０３〜０．１Ｍ
９７Ｍ（ｌである。この範囲において最高の吸光度を与
える。

上記呈色反応は一般に、３７〜５０°Ｃで１０〜４０分
間行うのが好ましい。

反応後得られた呈色液のアントラニル酸の濃度を比色法
によって測定することにより、」二足ＡＣＥの活性を知
ることかできる。

本発明方法は、従来の代表的測定法でめろクソシュマン
法や過ヨウ素酸等の無機酸化剤を用いる方法に比べて、
測定感度がよく、またクツツユマン法やシー・エム・シ
ーに記載の方法とは異なり、溶剤抽出操作が不要となる
ので、多量試料の連続自動測定化か容易となる。

本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

実施例１ （＋）Ｌ−キヌレニルーし一アラニルーＬ−プロリン（
Ｋｙｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏ）の合成・Ｋｙｎ　−
Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏ合成は第１−ａ図の合成ルートに
したかって行った。

Ｌ−プロリンベンジルエステル・−塩酸塩（２゜４１９
．１０ミリモル）を酢酸エチル（５０ｆｆＣ）に懸罰し
、攪拌しなからトリエチルアミン（１，４ｍＱ）を添加
する。室温で１５分間攪拌を行ったのち、生成する不溶
物を濾別する。濾液にペンジルオキノカルホニルーし一
アラニンスクノニルイミトエステル（３，２０９，１０
モル）を、・奈加し、室温にてＪｕｔ、なから反応ひし
めろ。−夜攪拌を続けて反応計しめた後、反応混液を・
１％炭酸水素すトリウム溶液（３０ｍ０．Ｘ２）、１０
％クエン酸溶液（３０ｆｆＱＸ２）、水（３０ｍり×２
）にて順次洗浄した。この有機層を無水硫酸ナトリウム
上で乾燥した後、溶媒を留去するとオイル状の標記化合
物３３３９（収率８１％）が得られた。このものはさら
に精製することなく次の合成ステップに使用しｆ：。

Ｚ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ（３，３３ｇ、　８　１
　ミ　リモル）を２５％臭化水素酸酢酸溶液に溶解し、
室温条件下１時間反応せしめた。この反応混液にジエチ
ルエーテル２００ｚＬ２を添加し、生成するオイルをデ
カンテーションで回収し、■７−アラニル−し一プロリ
ンベンジルエステル・−臭化水素塩を得た。

（−ブトキンカルボニル−し−キヌレニン（０７７ｇ、
２６５ミリモル）とウッドワード試薬“Ｋ”（０，６３
９，２，５ミリモル）を添加し、室温条件で攪拌を行っ
た。溶液か明澄となるまで攪拌を続けて反応を行ったの
ち、この反応液にＬ−アラニル−Ｌ−プロリンベンジル
エステル（上記のＬ−７ラニルーＬ−プロリンベンジル
エステル・−臭化水素塩２５ミリモルを・５：ＩＱアセ
トニトリルに溶解し、トリエチルアミン０．３５．ｖ（
て中和して調製）を加え、室温条件下でｒｔ拌を行いな
がら反応せしめた。−昼夜反応後、反応混液を減圧濃縮
した。得られる残渣を酢酸エヂル（５０Ｍ（２）に溶解
し、４％炭酸水素ナトリウム溶液（２５ｉｄｘ２）、１
０％クエン酸（２５ｍ１２ｘ２）および水（２５ｉ（ｉ
ｘ２）にて順次洗浄した後、無水硫酸ナトリウム上で乾
燥した。溶媒を留去することによって、結晶性残渣とし
て標記化合物０．７８ｙ（収率５５％）を得ｊ′Ｓ。

Ｂ（）Ｃ−Ｋｙｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＯＥｚＩ　　（０
，７８９，１３８ミリモル）をアセトニトリル（５０ｍ
（２）に１容解し、５％パラノウム炭素約０２９を加え
水素ガスを通気して接触還元を行った。反応終了後、濾
別し、得られた濾液を減圧濃縮、溶媒を留去し、残渣を
エーテルで洗うことによって粉末状のＢｏｃ−Ｋｙｎ　
−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏを得た。このらのは精製するこ
となく次の合成ステップに供した。

上述のＢｏｃ　−Ｋｙｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏを１
規定塩化水素ノオキサン溶液（２屑のに溶解し、水冷下
に約３０分間反応せしめた。反応終了後、ジエチルエー
テル（５０πＱ）を加える。生成した沈澱を濾ｊＪ％　
Ｌ、標記化合物を回収した。この乙のは分取高性能液体
クロマトグラフィー（充填剤　リクロプレープ（Ｌ　１
ｃｈｒｏｐｒｅｐ）　ＲＰ−１８、溶離液、１７％（ｖ
／ｖ）アセトニトリル−０，０２Ｍ　Ｎａ１（ＰＯ，ｌ
−１３１）０゜（ｐＨ２、５））に付し、３６０ｎｍで
吸収を示す両分として精製した。精製標品を凍結乾燥４
−ることによって標記化合物を淡黄色を呈する粉末とし
て１すた。収量０．３９０ｇ（収率７５％）。

ＴＬＣ：　Ｒｆ　　Ｏ，４１（ンリヵヶル、溶媒系ｎ−
ブタノール／酢酸／水−４／１．／２（ｖ／ｖ））アミ
ノ酸分析・Ｌ記標品を定沸点塩酸中、１５０°Ｃ１２４
時間加水分解（封管中）し、自動アミノ酸分析機にて定
はしたと ころ、本物質１モルよりアラニン１ ０モル、プロリン０．９モルを検出し た。

ＵＶ　・　　λ　　３６５ｎｍ（ε＝３４４０）ａＸ ＮＭＲ：第４図 ＩＲ第５図 （１１）　　アンジオテンノン■変換酵素の活性測定法
。

０　、４　ｔｘ（！ＪＪ質溶液溶液下の混合液より成る
。Ｉｏ　０ｕＱ　６．２５ｍＭ　Ｋｙｎ−Ａｌａ−Ｐｒ
ｏ−ＯＨ溶液、２０ａＱ　ｌ　２．５ｍＭピリドキサー
ル−５−リン酸溶液、５０μＱキヌレニナーゼ溶液（０
２９μｍｏｌ、／ｍｉｎ／吋の酵素活性を示す酵素溶液
）、２３０μ＆　　０　、１　Ｍ　＋−１）　、１．塩
酸緩衝液（ｐＨ１１１，０）−０゜５ＭＮａＣＣを含有
。基質、補酵素およびキヌレニナーゼは同緩衝液にて調
製］を３７℃に約３分間保温したのち血清１００μａを
加えて反応を開始する。反応は３７℃で３０分行う。所
要時間反応せしめた後、３．０ｍＣ０，ＩＭリン酸緩衝
ｆＬ（ｐｔｌ　６　、０．４−アミノアンヂピリンを３
０μ９／ＩＩＩＱ含有）を添加する。これによって共役
酵素キヌレニナーゼならびにＡＣＥの活性をほぼ完全に
停止什しめることかできる。この反応混液にラッカーゼ
溶液（２０μ９／ｍ（１）　！　００μρを加え３７℃
で呈色反応を行う。１５分間反応したのち、５３８ｎｍ
の吸光度を測定する。

血清中に含有されるＡＣＥ活性は次式によって算出でき
る。

アンノオテンシン■変換酵素活性（ｎｍｏｌ／　ｍｉｎ
／　ｘ（りただし上式でＡとは、上記操作にて測定した
ときの５３８ｎｍにおける吸光度（光路長１０ｍｍ）を
示し、Ｂとはブランクの吸光度を示す。

測定を１５回行ったところ、以下の結果であった。

Ａ　ＣＥ活性（＋ｎＬＪ）＝　１７．４±０　、７５　
（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｃ） 同時分Ｆｉ−ＣＶ値＝４．３１％ 及乳鯉Ｉ ２＋ｒｔ、−キヌレニルーグリンルーグリシン（Ｋｙｎ
−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ）の合成Ｋｙｎ−Ｇ　ｌｙ　−
Ｇ　ｌｙ合成は第１−ｂ図の合成ルー）・にしたがって
行った。

［３０Ｃ−キヌレニンＩ　、＝Ｉ　０Ｙ（４，５ｍｍｏ
のとＮ−ヒトロキンスクノンイミＦ’０．５３）９（４
５ｍｍｏＱ）をジオ上４ノ゛ン２０ｍ（７に溶解させ、
該溶液中へ水冷下でジンクロヘキノル力ルホノイミト０
．９４ｙ（４５ｍｍｏＱ）を加え、４時間撹拌した。反
応混合物を濾過処理に付し、濾液を減圧蒸留に付した後
のオイル状残渣にエーテルを加えて析出させた結晶をエ
ーテルをＩｔｌいて洗どｆシシ、乾燥処理に付して標記
化合物を１６９９得た（収・キ４７５％）。

（２）　ｆ３ｏｃ−キヌレニルーク１１シルーグリンン
（Ｂｏａ　−Ｋｙｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ）の合成
ニゲリシルグリシン（市販品）０．９ｇ（６，８ｍｍｏ
夕）と炭酸水素ナトリウム０．５７ｇ（６，８ｍｍｏρ
）を水２０ｍ（ｌに溶解させ、該溶液中へ水冷下で、前
記（１）で調製したＢｏｃ−Ｋｙｎ−ＯＮＳｕ　１．６
９９（３，４ｍｌｌｌ０Ｑ）をジオキサン２０ｍＱに溶
解させた溶液を加え、撹拌を４時間行った後、室温でさ
らに３日間撹拌を続行した。撹拌終了後、ジオキサンを
減圧留去させ、残渣を濾過処理に付し、濾液に塩酸を加
えて系のＩ）Ｈを１．５に調整した後、この溶液を酢酸
エチルを用いて抽出した。抽出液を無水硫酸ナトリウム
を用いて乾燥させ、次いで酢酸エチルを留去させて標記
化合物を０．７８ｇ得た（収率７６％）。

１倉記（２）で調製゛シノニｌ３ｏｃ−Ｋｙｎ−Ｇｌｙ
−ＧｌｙＯ、７８ｇ（１、８ｍｍｏ（りを４Ｎ塩化水素
〕オキサン溶液１０ｍｆ２に加え、水冷下で１時間撹拌
後、沈澱物を濾別し、エーテルを用いて洗浄した後、高
性能液体クロマトグラフィーに付し［充填剤・Ｔ　Ｓ　
Ｋゲル０ＤＳ−＋　２０Ｔ（東洋曹達株式会社製）、溶
離液：　１９５％アセトニトリル−０，１％トリフルオ
ロ酢酸）］、３３６０ｍに吸収を示す両分を分取し精製
し、凍結乾燥処理に付すことによって標記化合物を０．
４８９得た（収率８２％）。

該化合物のＮＭＲおよびＩＲのチャートをそれぞれ第６
図および第７図に示す。

［ｎ］アンジオテンシンｌ変換酵素の活性測定法： Ｋｙｎ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　Ｉｙ　８　ｍＭ、ピリドキサー
ル−５−燐酸１ｍＭ、キヌレニナーゼ１５ｎ＋Ｕおよび
燐酸０．１Ｍを含有する試薬溶液（ｐＨ７、６）　０　
、２５　ｍＱに血清０．０５ｍ１２を加え、３７℃で３
００分間反応おこなった。次いで、４−アミノアンチピ
リン０．３８ｍＭを含有する０、１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
５゜０　）　２　、６　ｍ（！およびラッカーゼ溶液（
２０ｔｔ　ｇ／ｍｃ）０　、　ｌ　ｍ（ｌを加え、３７
℃で２００分間反応おこなった後、５３８ｎｍにおける
吸光度（Δ）を測定した。

一方、試薬溶液０．２５ｍｇを３７℃で３０分放置後、
酢酸緩衝液２　、６　ｍ（１、血ｌ？？０．０５ｍＱお
よびラッカーゼ溶液０　、　Ｉ　ｍＱ、を加え、３７℃
で２００分間反応おこなった後、５３８ｎｍにおける吸
光度（Ｂ）を測定した。

血清中に含有されるＡＣＥ活性ｍ　Ｕ　（ｎｍｏｌ／ｍ
ｆ２／ｍ１ｎ）は次式： ［式中、Ａは試料の吸光度、Ｂはブランクの吸光度、■
は試料ｍ（ｍ＆）、Ｖは血清ｍ　（ｍＱ）、′ｒは反応
時間（ｍｉｎ）、εは分子吸光係数（（ｍｏ１２／ｆ２
）　’ｃｍ−’）であり、２１１６０である］ によって算出される。

上記操作を１５回おこなった平均値は次のとおりであっ
た： ＡＣＥ活性＝１４．４±０．４９ｍＵ 同時分析ＣＶ値＝３．４％ 実施例３ ［１］　Ｌ−キヌレニルーし一ヒスチジルーし一ロイシ
ン（Ｋｙｎ　−Ｈｉｓ　−Ｌｅｕ）の合成：１（ｙｎ−
Ｈｉｓ−Ｌｅｕ合成は第１−ｃ図の合成ルートにしたが
って行った。

グリンルグリシンの代わりにヒスチジルロイシン（市販
品）１．８２９（６，８ｍｍｏのを使用し、高性能液体
クロマトグラフィーの溶ＭｔＬとして３４゜５％アセト
ニトリル−０，１％トリフルオロ酢酸を使用する以外は
実施例２と同様の手順に準拠して標記化合物を０．６６
ｇ得た。

該化合物のＮＭＲおよび［Ｒのチャートをそれぞれ第８
図および第９図に示す。

１■〕アンノオテンンンＩ変換酵素の活性測定法 Ｋｙｎ−１１ｉｓ−Ｌｅｕ　８ｍＭ１　ピリドキサール
−５−燐酸１ｍＭ、キヌレニナーゼ１５ｍＵおよび燐酸
０．１Ｍを含有する試薬溶液（ｐＨ７、６）　０　、２
５　ｍＭに血清００１ｍρを加え、３７６Ｃで１５分間
反応をおこなった。次いで、・１−アミノアンチピリン
０．３８ｎ＋Ｍを含有するＯ　、　Ｉ　Ｍ酢酸緩衝液（
ｐＨ５０）２゜６４ｍ（！およびラッカーゼ溶液（２０
μ９／ｍ１２）０　、１　ｍ（！を加え、３７°Ｃで２
００分間反応おこなった後、５３８ｎｍにおける吸光度
（Ａ）を測定した。

一方、試薬溶液０．２５ｍ１２を３７℃で１５分間放置
後、酢酸緩衝液２．６４ｍ＆、血清０．０１ｍ１２およ
びラッカーゼ溶液０．１ｍｇを加え、３７℃で２００分
間反応おこなった後、５３８ｎｍにおける吸光度（Ｂ）
を測定した。

血清中に含有されるＡＣＥ活性を実施例２に記載の式に
よって算出した。

上記操作を１５回おこなった平均値は次の通りであった
： ＡＣＥ活性＝４２７．２±１３．２ｍＵ同時分析ＣＶ値
＝３．１０％ 実施例４ Ｋｙｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏ　８　ｍＭ、ピリドキ
サール−５−リン酸１　ｍ　Ｍ　％キヌレニナーゼ１５
ｍＵおよびリン酸０．１Ｍを含有する試薬溶液（１）Ｈ
７，６）０．２５ｉＣ１，：血清０．０５Ｍ（ｉを加え
、３７℃で３００分間反応る。次いで、４−アミノアン
チピリン０゜３８ｍＭを含有する０　、　Ｉ　Ｍ酢酸緩
衝液（ｐ）［５，０）２．６肩ρおよびラッカーゼ溶液
（２０μ＠／１ｖｃ）　０　、１ｍＱを加え、３７℃で
２０分間反応した後、５３８ｎｍの吸光度を測定し、こ
の値をＡとした。

一方、試薬溶液０．２５ｍ（ｑを３７°Ｃで３０分間放
置後、酢酸緩衝液２．６虹、ｍｔ清０．０５ＲＱおよび
ラッカーゼ溶液０　、　ｌ　ｒｒｔ（ｌを加え、３７℃
で２０分間反応した。この反応液の５３８ｎｍの吸光度
をＢとする。血清水に含存されるＡＣＥ活性を実施例２
に記載の式によって算出した。

上記操作を１０回行った平均値は次の通りであった 、へＣＥ活性−１８６０±０．７０ｍＵ同時分析ＣＶ値
＝３９％ 発明の効果 本発明ＡＣＥ活性測定法を採用すると、ＡＣＥ作用工程
、キヌレニナーセ加水分解工程において精密な精製工程
を不要にし１．へ〇Ｅ活性測定を簡ｉ１ｉ％操作で正確
に行うことが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１−ａ図、第１．−ｂ図および第１−ｃ図は本発明に
用いろ活性の合成工程を示すもので、それぞれＫｙｎ　
−Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏ、　Ｋｙｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ
　ｌｙおよびＫｙｎ　−１（ｉｓ−Ｌｃｕの場合を示す
。 第２図はＫｙｎ−ΔＩａ−Ｐｒｏ（Ａ）およびキヌレニ
ン（Ｂ）の吸光度曲線を示す。 第３図はアントラニル酸（Ｃ）の４−アミノアンチピリ
ン／フェノールオキシダーゼ系での吸光度曲線を示す。 第４図および第５図はそれぞれＫｙｎ−Ａｌａ　−Ｐｒ
ｏのＮＭＲおよびＩｌｌのチャートを示す。 第６図および第７図はそれぞれＫｙｎ−Ｇｌｙ−ｃ＋ｙ
のＮＭＲおよびＩＲのチャートを示す。 第８図および第９図はそれぞれＫｙｎ−１１ｉｓ　−Ｌ
ｅｕのＮ　Ｍ　ＲおよびＩＲのチャートを示す。 纂１−ａ図 ＄１−ｂｓ ＠１−ｃ送 第２図 」 ５皮（ｉｚ　　［ｎｍｌ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式： Ｋｙｎ−Ｘ−Ｙ ［式中、Ｋｙｎはキヌレニン残基、ＸおよびＹはそれぞ
   れ独立してアミノ酸残基を示す］で表わされるオリゴペ
   プチドを基質とし、これにアンジオテンシン I 変換酵
   素含有試料を作用せしめ、得られるキヌレニンをキヌレ
   ニナーゼで加水分解して、アントラニル酸を生成せしめ
   、４−アミノアンチピリンとフェノールオキシダーゼを
   用いて呈色させ、比色法によりアントラニル酸の量を定
   量することを特徴とするアンジオテンシン I 変換酵素
   の活性測定法。