JPS62167729A - 抗体産生増強剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■１発明の背偵 ［技術分野１ 本発明は抗体産生１１η強剤に関Ｊ”るものであり、さ
らに詳しくは中性多糖体からなる抗体産生増強剤に関す
る。

生体の異物に対する防御作用の１つとして抗体産生があ
る。この抗体産生能力を補助し、上昇さＵ゛る役割をも
つものがアジュバントである。中性多糖体にはアジュバ
ント活性があるので一種の免疫間活剤として抗体産生能
の低い患者に投与される。

［先行技術およびその問題点］ 現在までのところ、抗体産生増強剤と称する薬剤は臨床
上使用されていないが、同様の作用を有しながら他の目
的に使用されているものにＢＣＧ（菌体）がある。また
死菌を用いた完全フロインドアジュバントは実験室的に
動物に特定の抗体をつくらせるときのアジュバン１へと
して用いられている。

ところが、８ＣＧは皮下性用により投与され、痛みが大
きく、注射部位に潰瘍をつくる。また完全フロインドア
ジュバントは抗原と結核死菌どを油中水型エマルジョン
どして動物に皮下、皮内または静脈内に投与されるが、
■マルジョン作成に手間と時間がかかる。そこで調製が
容易で経口投与のような簡単な投与で有効な抗体産生増
強剤の出現が望まれていた。抗体産生増強剤とは、アジ
ュバント活性を有し、抗体の産生増強作用のあるものを
いう。

本発明者等は先にメリア・アザジラクタ樹皮の熱水抽出
物を′ｆｉＪ製して１りられる多糖体ＭＡ９は強い抗腫
瘍作用やインターフェロン誘導作用を有することを見い
出した（特開昭５７−１７６９１４号、同５７−１７６
９１５号、同６０−４２３９２９号および同６０−４５
５２１号公報）。尚多糖体ＭＡ９は上記特許公開公報に
おいては多糖体Ｎ９Ｇ　Ｉと命名されているが両者は同
一物質である。

本発明者等は上記多糖体ＭＡ９の薬理作用についてさら
に研究した結果、本多糖体がｉｎ　　ｖｉｔｒ。

および堕　社靭試験において抗体産生能の増強作用を右
することを知り本発明を完成した。

■０発明の目的 本発明は、生体に投与された場合に抗体の産生能力を増
強し、かつｍ性の低い抗体産生増強剤を提供することを
目的とする。

本発明はさらに、調製が容易でかつ簡単な投与方法で有
効な抗体産生増強剤を提供することを目的とする。

かかる目的を達成するため本発明は下記のイ）および／
または口）の多糖体を含有する抗体産生増強剤よりなる
。

イ）　α−（１→４）−グルカンの主鎖にアラビノース
がα−（１→６）結合し、グルコースと７ラビノースの
構成割合が約５＝１の中性多糖体。

口）　α−（１→４）−グルカンを主鎖とし、主鎖中に
β−（１→３）フコースを含み、分校としてα−（１→
６）アラビノースを有し、グルコース、アラビノースお
よびフコースの構成割合が約５：２：１の中性多糖体。

本発明においては上記中性多糖体として多糖体ＭＡ９が
特に好適に使用される。

■１発明の詳細な説明 本発明において抗体産生増強剤として好適に使用される
多糖体ＭＡ９は、メリア・アザジラクタ樹皮の熱水抽出
物から得られる中性の多糖体である。

メリア・アザジラクタは学名をメリア・アザジラクク・
リンネ（Ｈｅｌｉａ　　ａｚａｄｉｒａｃｈｔａ　Ｌｉ
ｎｎ）またはアブジラクタ・インディカ　ジャス（Ａｚ
ａｄｉｒａｃｈｔａ　　１ｎｄｉｃａ　Ｊｕａｓ）とい
い、熱帯地域に自生する高さ１０７７１以上に達する木
本植物である。

従来メリア・アザジラクタ抽出物が種々な薬理作用を右
することは知られている。即ら、メリア・アザジラクタ
の樹皮、東部、花部、東部、枝部、根皮よたは樹脂を水
または親水性溶媒で抽出するかあるいは微粉砕して皮膚
化粧料を得る方法（１：ｉ公明５２−２８８５３、同５
２−２８８５４　Ｊ３よび向５３−１０１２５１、上記
メリア・アザジラクタ原料を親水性溶媒ａ３よび（また
は）熱水で抽出して抗菌作用、胃腸・肝臓機能改善作用
を右ブる成分を１ｑる方法（特公昭５３−　＋０１２４
）おＪ：び上記メリア・アザジラクク原ｆ）１を疎水性
溶媒で抽出して皮膚疾患おにびリュウマｙ−の治療に有
効な成分を１１１る方法（１）公明５３−１３６８９）
が報告されている。

しかしながら、メリア・アザジラクタ抽出物が抗体産生
増強作用を有することはまだ報告されていない。

本発明にｊ３ける多糖体ＭＡ９は前記特開昭６０−４５
５２１号に記載の方法によって得られる。即ち、メリア
・アザジラクタ樹皮を熱水で抽出し、抽出液を例えば次
の（＾）乃至（Ｃ）の方法で処理することによって得ら
れる。

（八）上記抽出液を限外が過し、（すられた限外濾過内
液に低級アルコールを加え、生成する沈澱を採取する。

（Ｂ）　　上記抽出液を透析膜法またはアルコール沈澱
法により精製し、１りられた精製物を水に溶解し、該水
溶液を分両分子吊約１Ｘ１０３〜１×１０５乃至１ｘ１
０３〜２Ｘ１０５の分子篩剤を用いて分子篩処１’Ｐ　
Ｌ、、３つに分れる多糖体画分のうら最初の両分から多
糖体を採取り′る。

（Ｃ）　　上記抽出液を透析膜法、アルコール沈澱法ま
たは限外清適法で精製し、１ｑられた情製油出液を分画
分子Ｅ範囲の上限が７００〜ｓ、ｏｏ。

で下限が１００以下である架橋されたデキストランゲル
と接触させ、接触水溶液から多糖体を採取する。

上記の方法において、メリア・アザジラクタ樹皮を熱水
で抽出処理する操作は常法に従って行なわれる。即ち、
細断した樹皮に熱水を加えるか、あるいは、樹皮に水を
加え、その混合物を加熱沸騰させることによって実施さ
れる。抽出を１〜３気圧の加圧下に行うと多糖体の収率
および純度が向上する。加熱は沸騰水浴中または直火で
行うことができる。抽出時間は原料の品質等に従って適
宜決定されるが通常１乃至４８時間であ、る。抽出終了
後、抽出混合物を濾過することにより熱水抽出液が得ら
れる。このような熱水抽出に先立って、該樹皮を有機溶
媒および（または）常温の水で抽出前処理することによ
り、不要部分を予め除去しておくことも望ましい。抽出
前処理に使用する溶媒としてはメタノール、エタノール
、プロパツール、とリジン、アセトンのような極性有機
溶媒、ベンピン、トルエン、キシレン、ｎ−ヘキサン、
クロロホルム、四塩化炭素、酢酸エチルのような非極性
有機溶媒があげられる。

かくして肖られた熱水抽出液は、上述した（Ａ）乃至（
Ｃ）の方法によって処理される。

上記アルコール沈澱法にＪ３いて、アルコールの添加を
ｐＨ１〜３の条件で行うと生成物の純度が一層向上する
。

上記の方法によって得られる多糖体ＭＡ９は下記の物理
化学的特性を有する。

（イ）　色と形状 凍結乾燥品は白色粉末である。

（ロ）　赤外線吸収スペクトル ＩＲｖに”　ｃｍ−’　：　３４００．２９３０．１６
３０ａＸ （ハ〉　紫外線吸収スペクトル 水溶液中の測定で吸収極大を示さず末端吸収のみを示す
。

（ニ）　溶解性 水に可溶でメタノール、エタノール、アセトン、エーテ
ル、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼンおよびヘキサ
ン等の有機溶媒に不溶である。

（ホ）　呈色反応 フェノール硫酸反応、アンスロン硫酸反応に陽性でヨウ
素の添加により青緑色を呈する。

参考までに、上で得られた多糖体ＭＡ９を分画分子量約
１ｘ１０３〜２Ｘ１０５乃至１Ｘ１０３〜８×１０５の
ゲル濾過剤を充填したカラムにかけ、蒸留水で溶離する
と多糖体が２つの両分に分画される。

最初に溶出する両分を多糖体ＭＡ９ａ　、後に溶出する
多糖体をＭＡ９ｂとする。上記ゲル濾過剤としてはデキ
ストランゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリビニル系
のポリマーゲル、多孔性ガラスピーズ等が使用される。

これらは例えばセファデックスＧ−２００、セファクリ
ル３−３００（商品名、ファルマシア社製品、スエーデ
ン）、バイオゲルＰ−３００（商品名、バイオラット社
製品、米国）、１−ヨバール１−ＩＷ−６０（商品名、
束）１曹達工業社製品、日本）等の製品名で市販されて
いる。

多糖体ＭＡＱａおよび多糖体ＭＡ９ｂの構造および物理
化学特性は下記の通りである。

１旦ｍ己口− イ）　　構　　造 α−（１→４）−グルカンの主鎖にアラビノースがα−
（１→６）結合し、グルコースとアラビノースの構成割
合が約５：１の中性多糖体。

口）　色と形状 凍結乾燥品は白色粉末である。

ハ）溶解性 水に可溶で、メタノール、エタノール、アセトン、エー
テル、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン及びヘキサ
ン笠の有機溶媒に不溶である。

二）　呈色反応 フェノール硫酸反応、アンスロン硫酸反応に陽性でヨ・
り素の添加により占緑色をすする。

ホ）分子量 セファデックスＧ−２００カラムグルりロマトグラフィ
で！１１−のビークを与え、分子量は約９４．０００で
ある。

へ）　比旋光度 （α）　：５：　＋　１３６．０°（Ｃ＝　０．５．　
Ｈ２０）ト）　赤外線吸収スペクトル Ｉ　Ｒｖ　ＫＢ’　ｃｔｓ−’　：　３４００．２９３
０．１６２０ＩＩｌａ× チ）　紫外線吸収スペクトル 水溶液中の測定で吸収極大を示さず、末端吸収のみを示
す。

す）　　Ｃ核磁気共鳴スペクトル 川水中で外部基準にＴＭＳ　（テトラメブルシラン）を
使用して測定した１００ＨＩＩｚ１３Ｃ核磁気共鳴スペ
クトルは次の通りである。

６００ｍ　：　６２．１．６２．７．６７．３．７２．
９．７４．８゜７８．１．７８．７．８２．４．８５．
５．９９．２゜１０１．１．　１０８．９ 多ｌ」１走Δ」」− イ）　　構　　造 α−（１→４）−グルカンを主鎖とし、主鎖中にβ−（
１→３）フコースを含み、分校としてα（１→６）アラ
ビノースを有し、グルコース、アラビノースおよびフコ
ースの構成割合が約５：２：１の中性多糖体。

口）　色と形状 凍結乾燥品は白色粉末である。

ハ）溶解性 水に可溶で、メタノール、エタノール、アセトン、エー
テル、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼンおよびヘキ
サン等の有機溶媒に不溶である。

二）　呈色反応 フェノール硫酸反応、アンスロン硫酸反応に陽性でヨウ
素の添加により青緑色を呈する。

ボ）分子量 セファデックスＱ　−２００カラムゲルクロマトグラフ
イで単一のピークを与え、分子量は約２１．０００であ
る。

へ）　比旋光度 （（Ｚ　）　Ｐ：　＋１４３．７°（Ｃ＝　０．５．８
２０）ト）　赤外線吸収スペクトル ＩＲνにＢｒａｎ−’　：　３４００．２９３０．１６
３０ｍａ× ｙ−）　　紫外線吸収スペクトル 水溶液中の測定で吸収極大を示さず、末端吸収のみを示
す。

す）　　　ｌ磁気共鳴スペクトル 川水中で外部基準にＴＭＳ　（テトラメヂルシラン）ヲ
使用して測定した１００ＨｔｌＺ１３ＣＰｅＷｉ気共鳴
スベク１−ルは次の通りである。

δｐｐｍ　：　１８．２．６２．３．６２．７．　ｆ３
７．４．７１．１゜γ２．０．７３．２．γ４．９．γ
８，３．γ８．９゜８２．９．８３．９．８５．６．９
９．４．　１０１．２゜１０５．０．　１０９．１ 本発明の多糖体Ｍ△９は上記多糖体ＭＡ９ａおＪ：び多
糖体ＭΔ９ｂの晶合物とみることができ、多糖体ＭＡ９
ａＪ３にびＭＡ９ｂは同様の薬理活性を示した。

本発明の多糖体ＭＡ９は後に試験例で示すように顕茗な
抗体産生増強作用を有し、毒性は極めて低いので経口ま
たは非経口投与により各種の抗原の免疫賦活剤として有
効である。

投与岱は症状、年令、体重などによって異なるが、通常
は成人に対して１日２５〜２５００ＩＩｒｇであり、１
〜４回に分けて投与することができる。

本発明の多糖体は任意所要の製剤用担体または賦形剤を
用いて経口または非経口投与用に製剤化される。

経口投与用の錠剤、散剤、カブセル剤、顆粒剤等は慣用
の賦形剤例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、と
うもろこしでＩυぶｌυ、馬鈴苫でｌυぶん、砂糖、ラ
クトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、アラビ
アゴム笠を含有していＣちよい。経口投与用液体製剤は
水性または油付懸濁液、溶液、シロップ、エリキシル剤
その他であってもよい。

注射用製剤は溶液または懸濁液の形態であり、懸濁化剤
、安定剤または分散剤のにうな処方剤を含／υでいても
よく、滅菌蒸留水、精油たとえばビーナツツ油、とうも
ろこし油あるいは非水溶媒、ポリエチレングリコール、
ポリプロピレングリコール等を含有していてもよい。

直腸内投与のためには坐剤用組成物の形で１足供され、
周知の製剤担体たとえばポリエチレングリコール、ラノ
リン、ココナツツ油等を含有していてもよい。

次に本発明の多糖体ＭＡ９の試験例および製剤例を示し
て本発明をさらに具体的に説明する。

試験例　１ 生体のもつ抗体を多糖体ＭＡ９投与によって増加させる
試験 （１）初　■独　試験 多糖体ＭＡ９を生理食塩水に溶かした溶液を８週令ＢＡ
ＬＢ／ｃマウスに腹腔内（ｉ、ｐ、）または経口的（ｐ
、ｏ、）に投与する。ｉ、ｌ）、の場合は１回投与で１
日後に、ｐ、　ｏ、の場合は１日おきに３回投与して最
後の投与の１日後に牌臓をとり出す、牌臓［１Ｉ１１を
洗浄し、これを５Ｘ１０６個／ｒＲ１となるようにＥ′
ＭＥＭ培地にＤ濁する。この細胞懸濁液０．２ｄに、ト
リニトロベンゼンスルホン酸で感作されたウマ赤血球（
ＴＮＰ−ｌ−ＩＲＢｃ）　　０．２＃！ｉ！（ｐａｃｋ
ｅｄｃｅｌｌ）とモルモット補体血ｍ　１　ｍｌおよび
Ｅ’　ＭＥＭ培地０．８ｄを混合した懸濁液０１０５−
とを加える。この混合液０．２５ｍ１！のうら、０．１
ｍｅずつを力ニンガムチャンバーに入れ、３７℃で１時
間インキュベートする。その後力ニンガムチＶンバー上
に出現する溶血理数（ＲＦＣ）を測定する。結果を第１
表に示す。

第　　１　　表 牌５ａ１ケあたりの抗ＴＮＰ−トＩＲＢＣの溶面斑数第
１表に示すように、多糖体ＭＡ９をｉ、ｐ、で１０〜１
００μｇ／マウス／日、ｐ、　ｏ、で５００〜５０００
μシ／マウス／日投与することにより明らかに溶血理数
が大きくなる。すなわち、抗体量が増加している。

（２）　ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ試験 ＢＡＬＢ／ｃマウスの牌臓をとり出し、上記（１）と同
様にして５ｘｉｏａ個／ｄの細胞懸濁液を調製リ−る。

このｌｎｆ！と、同一培地に溶かした多糖体ＭＡ９０．
１ｄを２４穴の多穴プレート各穴に入れ、３７℃で２時
間、５％Ｃ０２条件下で培′ｉ＆する。この細胞につい
て上記（１）と同様にして溶血理数を測定する。結果を
第２表に示す。

第　　２　　表 牌臓１ヶあたりの溶血理数 第２表からも多糖体ＭＡ９が抗体産生能を増強させるこ
とが明らかである。

試験例　２ 抗原と同時投与によって抗体産生の増強をみる試験（ア
ジュバント効果をみる試験）９週令のＢＡＬＢ／ｃマウ
スにヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）１Ｘ１０７個を腹腔的投
与する。多糖体ＭＡ９を、腹腔的投与では５ＲＢＣと同
時に１回投与し、４日後または８日後に牌臓をとり出す
。経口投与では５ＲＢＣ投与の２日前から連日６回投与
し、５ＲＢＣ投与後投与後転牌臓をとり出寸。とり出し
た牌臓を試験例１と同様に処理して溶血理数を測定する
。結果を第３表に示す。第３表から、多糖体ＭＡ９は明
らかに抗体（１（ＩＭ、ＩｑＧ）の産生を増強している
。特にＩ（ＩＭ抗体において顕８１１五且 本発明の多糖体ＭＡ９を体重２０±１ｇのｌＣＲ雄性マ
ウスに投与して急性毒性試験を行なった結果、ＬＤ５ｏ
値は、腹腔的投与で６００ｑ／／（９以上、経口投与で
は１０００＃　／　ＩＣ９以上であった。

製剤例　１ 多糖体Ｍ　Ａ　９　１０００ｑを無菌５％注射用ブドウ
糖溶液５００ｄｌに溶解し、この溶液を５ａｅずつバイ
アルに無菌的に分注し、凍結乾燥した。かくして、１バ
イアル中１０１１９の多糖体Ｍ八９を含む製剤を臀た。

同時、注射用Ｍ留水に溶解して使用する。

製剤例　２ 上記製剤例１と同様にしてバイアル製剤をつくった。た
だし、無菌５％注射用ブドウ糖溶液５００ｄの代りに生
理食塩水５００ｍを使用した。同時、注射用蒸留水に溶
解して使用する。

■１発明の具体的作用効果 本発明によれば、多糖体ＭＡ９からなる抗体産生増強剤
が提供される。多糖体ＭＡ９はメリア・アザジラクタ樹
皮の熱水抽出物から得られる多糖体であって毒性が極め
で低く、各種の抗原に対する免役間活剤として有用であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 下記のイ）および／またはロ）の多糖体を含有する抗体
   産生増強剤。 イ）α−（１→４）−グルカンの主鎖にアラビノースが
   α−（１→６）結合し、グルコースとアラビノースの構
   成割合が約５：１の中性多糖体。 ロ）α−（１→４）−グルカンを主鎖とし、主鎖中にβ
   −（１→３）フコースを含み、分枝としてα−（１→６
   ）アラビノースを有し、グルコース、アラビノースおよ
   びフコースの構成割合が約５：２：１の中性多糖体。