JPS6224073B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は発酵法によるＬ―リジンの製造方法に
関する。 本発明者らは、従来知られているブレビバクテ
リウム属及びコリネバクテリウム属のリジン生産
菌に、呼吸阻害剤またはADPリン酸化阻害剤耐
性を付与せしめたところ、得られたいずれの菌株
についてもＬ―リジン生産能が著しく改善される
ことを知つた。この発明はこの知見に基づいて完
成されるに至つたものである。 即ち、この発明はブレビバクテリウム属又はコ
リネバクテリウム属に属し、Ｌ―リジン生産能を
有し呼吸阻害剤又はADPリン酸化阻害剤に耐性
を有する変異株を培養して、培地中にＬ―リジン
の製造方法である。 本発明の方法において用いられる微生物は、ブ
レビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属に
属し、従来Ｌ―リジン生産能を有するために必要
であることが知られている性質即ちホモセリン要
求性、Ｓ―（２―アミノエチル）―システイン耐
性等の性質、いいかえればＬ―リジン生産能を有
しているほかに、呼吸阻害剤又はADPリン酸化
阻害剤に耐性を有する。 ここに呼吸阻害剤とは微生物の呼吸を阻害し、
従つて微生物の生育がそれによつて阻害される薬
剤を云い、例えば、マロン酸、シアン化カリ、ア
ジ化ソーダ、または亜ヒ酸ソーダ等がこれに属
し、ADPリン酸化阻害剤とはADPをリン酸化し
てATPにする反応を阻害し結果として微生物の
生育を抑制する薬剤を云い、例えば、共役反応阻
害剤である２，４―ジニトロフエノール、ヒドロ
キシアミン塩酸塩、ヒ素及びエネルギー転移反応
阻害剤であるグアニジン等がこれに属する。 本発明の変異株はこれらの呼吸阻害剤または
ADPリン酸化阻害剤の阻害作用に非感受性即ち
耐性を獲得したものである。 これらの変異株は、いずれの従来知られている
ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属
のＬ―リジン生産菌を親株としても誘導され、又
ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウム属
の野性株に先に、呼吸阻害剤又はADPリン酸化
阻害剤耐性を付与せしめ、これに前記Ｌ―リジン
生産能を有するために必要な性質を付与せしめて
もよい。 上記変異株の変異誘導方法としては、紫外線照
射、Ｘ線照射、放射線照射、変異誘起剤処理等の
通常の方法が用いられ、例えば250μg/mlのＮ―
ニトロ―N′―メチル―Ｎ―ニトロソグアニジン
により30℃で20分間処理する方法等がある。 本発明の変異株は具体的には以下のものがあ
る。 (1) ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム AJ11082（FERM―Ｐ 3840） （AEC^r、CCL^r、Ala^-）を親株とした変異株。 AJ11445（FERM―Ｐ 5162） （グアニジン耐性） AJ11446（FERM―Ｐ 5163） （ヒドロキシアミン塩酸塩耐性） AJ11447（FERM―Ｐ 5164） （亜ヒ酸ソーダ耐性） (2) ブレビバクテリウム・フラブムAJ11275 （FERM―P4549）（Hse^-、Ala^-） を親株とした変異株。 AJ11448（FERM―Ｐ 5165） （グアニジン耐性） AJ11449（FERM―Ｐ 5166） （ヒドロキシアミン塩酸塩耐性） AJ11450（FERM―Ｐ 5167） （亜ヒ酸ソーダ耐性） (3) ブレビバクテリウム・フラブムATCC21475 （AEC^r）を親株とした変異株。 AJ11451（FERM―Ｐ 5168） （グアニジン耐性） AJ11452（FERM―Ｐ 5169） （ヒドロキシアミン塩酸塩耐性） AJ11453（FERM―Ｐ 5170） （亜ヒ酸ソーダ耐性） (4) コリネバクテリウム・グルタミクム AJ11094（FERM―P3856）（AEC^r、Ala^-）を親
株とする変異株。 AJ11454（FERM―Ｐ 5171） （グアニジン耐性） AJ11455（FERM―Ｐ 5172） （ヒドロキシアミン塩酸塩耐性） AJ11456（FERM―Ｐ 5173） （亜ヒ酸ソーダ耐性） AEC^r：Ｓ―（２―アミノエチル）―システイ
ン耐性 CCL^r：α―クロロカプロラクタム耐性 Hse^-：ホモセリン要求性 Ala^-：アラニン要求性 次に先ず呼吸阻害剤である亜ヒ酸ソーダに耐性
を有する菌株の阻害剤存在下の生育度を第１表
に、ADPリン酸化阻害剤のうちの脱共役化剤で
あるヒドロキシアミン塩酸塩に耐性を有する菌株
の阻害剤存在下の生育度を第２表に、同じく
ADPリン酸化阻害剤のうちのエネルギー転移阻
害剤であるグアニジンに耐性を有する菌株の阻害
剤存在下の生育度を第３表にそれぞれ示す。 生育度の測定は次のようにして行なつた、イー
スト・エキス１g/dl、ペプトン１g/dl、食塩0.5
g/dl、寒天２g/dl（PH7.0）を含有する培地を120
℃で15分間殺菌し、寒天プレートを調製した。こ
のプレートに、ブイヨンスラントで24時間培養し
た菌株を無菌水で懸濁してプレート当り10⁵〜10⁶
の菌数を散布接種し、その上に一定濃度、容量の
薬剤を含むペーパーデイスクをおき、16〜48時間
培養した。形成される生育阻止円の存在の有無に
より生育度をみた。上記の表中〓、＋は菌の生育
が観察されたもの、−は生育が観察されなかつて
ものを示す。

【表】

【表】

【表】 次に呼吸阻害剤に耐性を有する菌株の呼吸阻害
剤存在下におけるNADH酸化能の影響を測定した
結果を第４表に示す。NADH酸化能は次の方法に
よつて測定した。 あらかじめ32℃に保持されたリン酸緩衝液（PH
7.5）500μmoles、NADH ６μmoles、一定量の
無細胞抽出液、所定量の呼吸系阻害剤からなる反
応液10mlをBeckman model 777酸素分析計セン
サーを組み込んだ容器に入れ空間が生じないよう
に密閉したのち、マグネチツクスターラーで撹拌
しながら32℃に保持し酸素分圧の減少を記録す
る。酸素濃度が直線的に減少する部分から酵素活
性を算出した。 その結果、AJ11447、AJ11450、AJ11453、
AJ11456はKCN、NaN₃、亜ヒ酸をそれぞれ添加
してもNADH酸化能の低下は親株ほど著しくない
ことがわかつた。

【表】 次にADPリン酸化阻害剤に耐性を有する菌株
のうち脱共役化剤に耐性を有する菌株の阻害剤の
存在下における呼吸活性及びADPリン酸化能の
影響を第５表に、同じくADPリン酸化阻害剤に
耐性を有する菌株のうちのエネルギー転移阻害剤
に耐性を有する菌株の阻害剤の存在下における呼
吸活性及びADPリン酸化能の影響を第６表にそ
れぞれ示す。 この場合呼吸活性、ADPリン酸化能の測定は
次の方法によつて行なつた。 呼吸活性：グルコース36mg/ml、尿素２mg/ml、
KH₂PO₄1mg/ml、MgSO₄・7aq0.4mg/ml、
FeSO₄・7aq10μg/ml、MnSO₄・4aq8μg/ml、大
豆蛋白酸加水分解物５μ/ml、サイアミン塩酸
塩100μg/、ビオチン2.5μg/を含有する培地
で20時間培養した培養液から集菌し、0.5％食塩
水で２回洗浄した菌体を１／15Mリン酸バツフア
ー（PH7.5）に懸濁し、28℃で３時間、ロータリ
ーシエーカーで飢餓培養した休止細胞懸濁液0.5
mlを、リン酸緩衝液（PH7.5）100μmoles、グル
コース100μmoles、全液量2.0mlの反応液に加
え、32℃、３時間反応後のワールブルグ検圧計の
読みから呼吸活性を測定した。 ADPリン酸化能：上記休止細胞を遠心分離に
より集菌し、室温ですみやかに風乾し、さらに五
酸化リンデシケーター内で一液減圧風乾した。こ
の菌体をADP10μmoles、グルコース200μ
moles、リン酸緩衝液250μmoles、MgCl₂・6aq5
μmolesを含む反応液２mlに50mg懸濁し、30℃
で、３時間反応させ、反応後反応液を沸謄湯浴中
に３分間浸して反応を停止し、氷冷後菌体を遠心
分離により除去し、得られた上清液を分析に供し
た。ATPの分析はATP photometer modlel2000
（SAI Technology Co.、製）によつた。

【表】

【表】 この試験の結果、ADPリン酸化阻害剤に耐性
を有する菌株AJ11446、AJ11449、AJ11452、
AJ11455（第５表）も、エネルギー転移阻害剤に
耐性を有する菌株AJ11445、AJ11448、
AJ11451、AJ11454（第６表）もいずれも阻害剤
である脱共役化剤及びエネルギー転移阻害剤の存
在下においてADPリン酸化能は親株に比べて低
下しないことが認められた。 これらの微生物をもちいて、Ｌ―リジンを生産
せしめるには、炭素源、窒素源、無機塩類および
使用する微生物が要求する栄養物質を含有する通
常の栄養培地をもちいて常法によりおこなう。も
ちいられる炭素源としては、グルコース、シユー
クローズ、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン
加水分解液などの糖類、酢酸、プロピオン酸など
の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアル
コール類などが使用できる。 窒素源としては、アンモニウム塩、アンモニア
ガス、尿素、アンモニア水その他が使用できる。
培養は好気的条件下で行うのが良く、24〜37℃、
PH5.0〜9.0で行えば最も好ましい結果が得られ
る、PHの調整には無機あるいは有機の酸あるい
は、アルカリ、更には尿素、炭酸カルシウム、ア
ンモニアガスなどを使することができる。かくし
て２〜７日間も培養を行えば、培地中には著量の
Ｌ―リジンが生成蓄積される。 発酵液からのＬ―リジンの採取は、通常、イオ
ン交換樹脂法、その他の公知の方法を組み合わせ
ることによりおこなわれ、培地の種類によつて
は、直接晶析法により行なうことも可能である。 実施例 １ 下記の組成の培地を20ml宛、500ml振とうフラ
スコに入れ、110℃にて５分間蒸気加熱殺菌し
た。 培地組成 グルコース 10g/dl 硫酸アンモニウム 4.5g/dl KH₂PO₄ 0.1g/dl MgSO₄・7H₂O 0.04g/dl FeSO₄・7H₂O 1.0mg/dl MnSO₄・4H₂O 1.0mg/dl ビチオン 50μg/ サイアミン塩酸塩 200μg/ 大豆タンパク塩酸加水分解液濃縮物
1.5ml/dl （総窒素 ７％） 炭酸カルシウム（別殺菌添加） 5.0g/dl PH 7.0 上記の培地に、あらかじめグルコース、ブイヨ
ンスラントで生育せしめた第７表に示す菌株を１
白金耳ずつ接種し、それらを31℃にて72時間振と
う培養した。72時間培養後の培地中のＬ―リジン
量を、酸性―銅ニンヒドリン反応を用いる比色法
によつて測定したところ、第７表に記載した量の
Ｌ―リジン（Ｌ―リジン塩酸塩として）が生成さ
れていた。

【表】

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ブレビバクテリウム属又はコリネバクテリウ
   ム属に属しＬ―リジン生産能を有し、呼吸阻害剤
   又はADPリン酸化阻害剤である亜ヒ酸ソーダ、
   ヒドロキシアミン塩酸塩又はグアニジンに耐性を
   有する変異株を培養して、培地中にＬ―リジンを
   生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
   る発酵法によるＬ―リジンの製造方法。