JPS61148169A - 水溶性テトラゾリウム化合物およびその化合物を用いる還元性物質の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は、新規水溶性テトラゾリウム化合物およびその
化合物を用いる還元性物質の測定方法に関し、さらに詳
しくは、２，３．５−１−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾ
リウムのフェニル基にスルファモイル基を介して１個の
スルホン酸基を有することを特徴とする水溶性のテトラ
ゾリウム化合物およびそれを用いる還元性物質の測定方
法に関する。

テトラゾリウム化合物は、脱水素酵素の活性度の測定、
それによる基質、さらにスーパーオキサイドイオンを生
成する酸化酵素の作用対象である基質の測定、すなわち
食品中の添加物の定量、あるいは生体体液成分の臨床試
薬として実用化されている。

（ロ）従来の技術 水溶性テトラゾリウム化合物は、これを還元した時に生
成するホルマザンが安定な水溶性化合物であるので、こ
のホルマザンを定量することにより水溶液中の還元性物
質を測定することに利用される。

従来テトラゾリウム化合物としては、例えば２−（４−
ヨウ化フェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−
フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）、３−（
４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニ
ル−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ＭＴＴ）、２，２°、５
．５°−テトラキス（４−ニトロフェニル）−３，３°
−（３，３’−ジメトキシ−４゜４′−ジフェニレン）
−２Ｈ，２°Ｈ−ジテトラゾリウム塩（ＮＴＢ）、２，
２°−ｐ−ジフェニレン−３゜３°、５．５°−テトラ
フェニル−２Ｈ、２°Ｈ−ジテトラゾリウム塩（Ｎｅｏ
−ＴＢ）などが代表的に利用されている。しかしながら
、これらテトラゾリウム塩及びその還元体であるホルマ
ザンはいずれも水に難溶性であり、使用にあたり多量の
界面活性剤あるいは有機溶剤の併用をやむなく行ってい
るのが現状である。特に臨床検査の分野では生成される
ホルマザンが測定機器の測光部位に色素沈着を生じ、著
しく検査結果に悪影響を与えている。

又、近年急速に進歩する検査の自動化に対し、自動分析
機の汚染による誤測定をまねいている。

以上のような理由で、テトラゾリウム塩を使用すること
が好ましい検査項目の場合でも、やむをえず他の測定原
理を使用することを強いられていた。

このような状況に対して、特公昭５６−３８１５４号、
特開昭５６−６１３６６号、特開昭５６−６１３６７号
の各特許公報、日本薬学会１０２年会講演要旨集３４１
頁４に２−４等に開示されるように、テトラゾール環に
置換するフェニル基に、直接スルホン酸基もしくはカル
ボン酸基、又は四級アンモニュウム塩を含む側鎖を導入
する試みがなされている。

しかし、可溶化の目的でフェニル基に直接導入されたこ
れら酸基のために、実際の測定で不可欠な酵素機能が発
揮される至適ｐＨ域内においては、これらのテトラゾリ
ウム化合物はホルマザンを生じないので臨床検査の分野
では応用困難である。

又、四級アンモニュウム塩導入化合物は水溶性の点で不
十分である。

又、最近では特開昭５９−１０６４７６号公報に示され
るように、フェニル基に直接結合しない水溶性基（スル
ホン酸基又は／およびカルボン酸基）２個を含有させる
方法も試みられている。

しかしながら、ここで提案されたテトラゾリウム化合物
の還元型であるホルマザンはｌ）Ｈの変化で著しく分子
吸光係数が変動する。

酵素反応を停止させるために、臨床検査では酸、又はア
ルカリに反応液の−ｐＨを移行させる方法か一般的であ
るが、ここで提案されたテトラゾリウム化合物を用いる
場合、著しく測定感度を低下せしめる欠点を有している
。

（ハ）発明が解決しようとしている問題点本発明者らは
、このような従来の欠点を解決するためには、テトラゾ
リウム化合物が水易溶性であること、還元を受けるとき
にはｌ）Ｈ依存性の小さいこと、特に臨床検査に使用さ
れろ場合には還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌクレ
オチド（以下、ＮＡＤＨと略記。）または還元型ニコチ
ン酸アミドジヌクレオチド燐酸（以下、ＮＡＤＰＨと略
記。）により特異的に作用されること、生成したホルマ
ザン化合物が水易溶性でなければならないことなどに着
目し、検討を行った結果、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の第一の目的は、還元性物質によって
、電子伝達剤の存在下に水易溶性の発色ホルマザンを生
成する新規な水溶性テトラゾリウム化合物を提供するこ
とである。

本発明の第二の目的は、新規なテトラゾリウム化合物を
用いて水性溶液中の還元性物質およびスーパーオキシド
イオンを測定する方法の提供である。

他の目的は生体体液中のＮＡＤＨやＮＡＤＰＨに特異的
に有利な測定方法であり、水性溶液のｐｉ変動による影
響が小さく、測定機器の汚染のない還元性物質の測定方
法にある。　　　　　　　　　　　　　　　　（（ニ）
問題点を解決するための手段 本発明の新規な水溶性テトラゾリウム化合物は、一般式
（１）で表される： ［式中、Ｒ１およびＲ２は水素、低級アルキル基、低級
アルコキシ基、ハロゲン、シアノ基またはニトロ基であ
り、少なくともその一つはニトロ基である。Ｒ３は水素
、低級アルキル基、低級アルコキシ基またはハロゲン、
Ｒ４は式（２）（式中、ＸはＳｏ、ＮＨまたはＳｏ、Ｎ
Ｚ（ここで、Ｚは低級アルキル基である。）、Ｒ５は水
素、低級アルキル基、低級アルコキン基またはハロゲン
、Ｒ６はスルホン酸基を示す。）で表されろ基、Ｙは水
素、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲンまた
はニトロ基を示す。］ スルホノ酸基は、テトラゾール環と分子内塩を形成して
いる。

本発明のテトラゾリウム化合物は公知の原料、方法によ
り容易に製造することができる。

例えば、ｍ−１−二口ベンゼンスルホニルクロライドと
ｍ−アミノベンゼンスルホン酸との縮合物を還元して得
られる式（３） のアミノ化合物を常法によりヒドラジン化合物とし、次
いで、例えばベンズアルデヒドと縮合すれば式（４） で示されるフェニルヒドラゾン化合物が得られる。

これに、例えばｐ−ニトロアニリンのジアゾ化合物を常
法によりカップリングさせることによって式（５） で示されるホルマザン化合物が得られる。

得られたホルマザン化合物を常法により酸化すれば、目
的とするテトラゾリウム化合物（６）を得ることができ
る。

本発明のテトラゾリウム化合物の製法は、後記実施例に
詳述されている。

本発明におけるホルマザン化合物は、アルコール等親水
性の大きい有機溶媒に溶解するため、酸化が極めて円滑
であり酸化によって得られるテトラゾリウム塩化合物は
水中分子内造塩により酸性下ではやや難溶の結晶として
高純度に分取することができ、カラム精製等繁雑な精製
によらずとも比較的高純度の品質にすることかできろ。

しかしながら、これらのテトラゾリウム化合物は水中、
弱アルカリ性とすることにより、実用上充分な水溶性を
有する。

本発明の第二の要旨は、前記一般式（１）で示される水
溶性テトラゾリウム化合物を用いろことを特徴とする水
性溶液中の還元性物質の測定方法に存する。

テトラゾリウム化合物（１）は、還元性物質、例えばＮ
ＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの水素受容体として作用し、あ
るいはスーパーオキサイドイオンによって還元される。

還元の際に定量的に生成するホルマザンの量に比例する
発色の程度を、その吸光度を測定することによって、還
元性物質であろＮＡＤＨ，ＮＡＤＰＨまたはスーパーオ
キサイドイオンの量を測定することができる。このよう
な測定方法は、酸化酵素及び脱水素酵素の活性度の測定
、それによる基質の定量、即ち、生体成分、食品中の添
加物などの定量に極めて有用である。

これらの原理を、乳酸脱水素酵素（Ｌ　Ｄ　Ｈ）の活性
度測定に例にとり示せば次の通りである：ビン酸 （ＮＡＤ：　ＮＡＤＨの酸化型） これらの反応の結果、定量的に生成するホルマザンの濃
度を、吸光度測定することによりＬＤＨの活性度を測定
することができろ。

又、脱水素酵素を使用した生体成分の測定をコレステロ
ールの測定について示せば次の通りである： チン　　　　　　メトサルフェート 同様にコレステロールの定量か可能である。

更に、生体成分中のクレアチン燐酸キナーゼ（ＣＰＫ）
について示せば次の通りである：クレアチン燐酸＋ＡＤ
Ｐ−７クレアチン＋ＡＴＰ）ＩＫ ＡＴＰ＋グルコース→ＡＤＰ＋グルコース−６−燐酸Ｍ
ｇ″“ グルコン酸 （ＮＡＤＰ：　ＮＡＤＰＨの酸化型 ＨＫ：ヘキソキーゼ ＡＤＰ：アデノシン−２−燐酸 ＡＴＰ・アデノシン−３〜燐酸 Ｇ−６−ＰＤＨニゲルコース−６−燐酸脱水素酵素） 従って、同様にＣＰＫの活性度の測定が可能である。

テトラゾリウムの応用については、その他種々の方法が
あり、それらは下記実施例により明らかにされる。

実際の測定に当たっては、トリス燐酸緩衝液などの適宜
の媒体中において、被検液に定量対象基質に特異的な酸
化酵素、脱水素酵素などの酵素類および一般式（１）で
示されろテトラゾリウム化合物を添加し、インキュベー
トして反応を進行せしめ、発色生成するホルマザンの吸
光度を測定し、被検液中の還元性物質またはスーパーオ
キサイドイオン、さらには基質を定量する。

スーパーオキサイドイオンの定量の際には、被検液中に
、測定時間、感度、定量性など実用的に測定効果をさら
に助長させるために、従来から使用されているフェノー
ル類、チオフェノール類、アミン類なとを添加しておく
こともできる。また測定時の好ましくない副反応である
自動酸化を防止するためにキレート剤を加えてもよい。

これらの添加助剤は、適宜、単独または組合わせて用い
られろ。特に添加助剤として界面活性剤を併用すること
は、ホルマザン呈色の極大吸収を長波長側にシフトする
効果があって、呈色感度をさらに増加させるので本発明
測定方法においては好ましい態様である。界面活性剤と
しては、脂肪族、芳香族アルコールのポリオキノエチレ
ン誘導体が使用され、その重合度は５〜３０程度か一般
的である。一般に市販されているノニオン系界面活性剤
が通常不便なく使用できる。

測定中の被検液のｐＨは、通常７０〜８．０の中性域が
好ましいか、本発明の測定方法では叶１６．０〜１０．
５の範囲においても呈色感度の変化は少なく、酸性域で
も変化は小さい。

（ホ）作用および効果 本発明の一般式（１）で示されるテトラゾリウム化合物
およびその還元体ホルマザンは、スルホン酸基１個を有
する置換スルファモイル基を有することによって水溶性
の過大を抑制することができ、製造、精製が容易である
。

また還元して得られたホルマザンの中性付近に　　　　
　　　　　１゜おける吸光波形が、従来のホルマザンに
比較して長波長（約５００　ｎｎ＋）であるので、体液
中の着色成分４５０ｎｍ近辺と区別が著しく、測定誤差
を生し難い。

また本発明のテトラゾリウム化合物が意元を受けろ際の
ｐＨ依存性が極めて小さいので測定結果が再現性よく、
しかも高感度に得られる。

臨床検査分野でこれらテトラゾリウム化合物を使用して
基質あるいは酵素活性度を測定する時、生体成分に共存
する種々の還元性物質もまた同時にテトラゾリウム化合
物を還元して測定結果に正の誤差を与える結果となる。

この影響を除くために、あらかじめヨウ素酸カリウムな
どの弱い酸化剤で検体（生体成分）を前処理して還元性
物質を除去した後、基質あるいは酵素活性度の測定をす
るか、本願発明のテトラゾリウム化合物はＮ　Ａ　Ｄ　
ＨやＮ　Ａ　Ｄ　Ｉ）　Ｈに特異的な作用性を何し、生
体成分に共存する種々の還元性物質や前処理剤に影響さ
れず＋Ｅ確な測定情報を得ることかできる。

（へ）実施例 以下に本発明を実施例および比較例により詳述電ろが、
本発明はこれら実施例に限定されるしのではない。

実施例１ フェニルヒドラジン−３−スルホ−３゛−スルホン酸フ
ェニルアミド３４ｇを精製水１０００１（ｊに溶解し、
ベンズアルデヒド１０．８９を加え、４０〜４５℃で２
時間かきまぜたのち、塩析してヒドラシーン化合物を得
た。収率７０％。

得られたヒドラシーン化合物２．３９を、ソーダ灰６ｇ
を含む精製水４０ｍ（ｌに添加して５〜１０６Ｃにおい
て溶解し、別に２−メトキシ−４−ニトロアニリン０．
８４ｇを常法でジアゾ化して、ｐＨ６。

０に中和し０〜５℃の温度に調製したノアゾ化合物の溶
液を加え、アルカリ性にして２時間かき混ぜた。そのあ
と得られたホルマザン化合物を塩酸で弱酸性として酸析
ろ過することによりホルマザン化合物のケーキ８ｇを得
た。

次に、湯浴中上記ホルマザン化合物ケーキ８ｇをメタノ
ール７０ｔｎ（ｌに溶解し、７０〜７５℃で７％塩酸１
０ｇを加え、次いて過硫酸アンモニウムの結晶２ｇを加
え、酸化が終了するまで７０〜７５°Ｃで約２時間かき
まぜた。活性炭を加えたのち、熱ろ過し、ろ液を水て３
００　ｌＩｃ１．＝Ｓ釈４−ると晶析した。析出した黄
白色結晶をろ過し、冷水で充分洗浄したのち乾燥して、
黄白色結晶１．４ｙを得た。

この生成物は、第１図に示すような赤外線吸収曲線及び
下記元素分析値を有する下式で示されるテトラゾリウム
塩化合物である。

元素分析値（％） ＣＨＮ　　　　Ｓ 計算値　５１，３１　３．３１　１３．８０　１０．５
３分析値　５１．２７　３．２９　１３．８１　１０．
６１実施例２ 実施例１のヒドラジン化合物の代わりに、次のようにし
て得られるフェニルヒドラジン−４−スルホ−３′−ス
ルホン酸フェニルアミドを使用する以外は同様の合成法
により、第２図に示すような赤外線吸収曲線及び下記分
析値を何する下式で示されるテトラゾリウム化合物１８
ｇ得た。

元素分析値（％） ＣＨＮ　　　Ｓ 計算値　５１，３１　３．３１　１３．８０　１０．５
３分析値　５１，３０　３．２９　１３．８５　１（１
，５５フェニルヒドラゾン−４−スルホ−３゛−スルホ
ン酸フェニルアミドの製法： １−アセチルアミノベンゼン−４−スルホニルクロライ
ド２５ｇを、ｍ−アミノベンゼンスルホン酸１８９を精
製水１５０ｍ（７にソーダ灰ｔｓｇの共存下で溶かした
溶液中に２０〜２５℃で徐々に加え、５〜６時間かきま
ぜたのち、塩酸酸性とし、析出物をろ過した。得られた
ケーキを５％苛性ソーダ１５０ｍ（ｊ中、９０〜９５℃
で２時間処理したのち、塩酸で酸析し、ろ過することに
より１−アミノベンゼン−４−スルホ−３°−スルホン
酸フェニルアミドを収率的５０％で得た。

以下、常法により、得られたｌ−アミノベンゼン−４−
スルホ−３°−スルホン酸フェニルアミドをヒドラジン
化合物とした。

実施例３ ２−クロロ−４−ニトロアニリン１．７９を常法により
ノアゾ化し、フェニルヒドラジン−４−スルポー３°−
スルホン酸フェニルアミドとヘンズアルデヒトの縮合に
より得られるヒドラゾン化合物４．５ｇとを水中弱アル
カリ性において反応させてホルマザン化合物のケーキ２
０ｙを得た。ホルマザン化合物ケーキをメタノール７０
ｍＱに溶解し、湯浴中７０〜７５℃で７％塩酸１５ｉｏ
、および過硫酸アンモニウム６ｇを加え、液が略無色に
なるまでかきまぜた。活性炭を加えて熱ろ過し、ろ液を
精製水で２５０ｚ９に希釈し、析出した黄白色結晶をろ
過、水洗、乾燥して、下記式を何するテトラゾリウム化
合物２，５ｇを得た。この生成物は第３図に示すような
赤外線吸収曲線を示す。

元素分析値（％） ＨＮＳ 計算値　４８．９４　２．７９　１３．７０　１０．４
６分析値　４９．０３　２．８０　１３．６８　１０．
５１＼ｌ 実施例４ ２−メトキシ−４−ニトロアニリン０．８４をノアゾ化
し、常法により得た下記式ヒドラゾ化合物、 （この化合物は によりアミン化合物とし、ヒドラノン化したのら。

られる。）５ｇとカップリングさせろことにより得られ
たホルマザン化合物を実施例３の方法によりテトラゾリ
ウム化合物とした。

第４図に示すような赤外線吸収曲線および下記元素分析
値を有する下式で示されろテトラゾリウム化合物■、２
ｇが得られた。

元素分析値（％） ＣＨＮ　　　Ｓ 計算値　４８，５７　３．１７　１４，６９　９．６０
分析値　４８．３１　３．１６　１４，７３　９．７Ｏ
Ｏ２ 実施例５〜８ 実施例１〜４で得られたテトラゾリウム化合吻合０　、
２　ｍＭ／ρ、トリトンＸ−４０５，０４％、Ｎ　Ａ　
Ｄ　２　ｍＭ／１２．ジアホラーゼ２Ｕ／ｆｆ＆を含有
する０、１Ｍトリス燐酸緩衝液（ｐＨ７，５）２．５ｚ
ＣにＮＡＤＨの２．５ｍＭ／＆水溶液５０μＱを加え、
３５〜４０℃で５分間加温のあと吸光度を測定した。

（水溶性と発色性） 本発明のテトラゾリウム化合物は実用上充分な水溶性を
有するととらに、ＮＡＤＨ−ジアホラーゼ系のような低
還元電位系においてら良好な発色を示している。

実施例９およびＩＯ 実施例２および３で得られたテトラゾリウム化合吻合０
．２ｍＭ／（２，トリトンＸ−４０５，０，４％、ＮＡ
Ｄ２ｍＭ／Ｑ１ジアホラーゼ２Ｕ／ＩＩＩＱを含有する
０、１Ｍ）リス燐酸緩衝液（叶（７，５）２．５ｍＱを
とる。一方、各側においてトリトンＸ−４０５を加えな
い同様の組成の緩衝液２　、５　ｍ（ｌをとる。

それぞれの溶液にＮＡＤＨの２．５ｍＭ／ｆ２水溶液を
各５０μρ加え、３７℃で５分間加温した後、その吸光
度を測定した。それぞれの結果を第５図および第６図に
示す。

第５図および第６図に示す通り、界面活性剤を併用する
場合、実施例２の化合物では極大波長４９０ｎｍから５
０５ｎｍにシフトしその吸光度は１゜５倍以上に増大し
、又実施例３の化合物では極大波長、５２０ｎｍから５
２５ｎｍにソフトし、その吸光度は１．４倍以上に増大
し、呈色感度が増加４−る。

次に、本発明化合物による呈色のｐ）（依存の様子をＮ
ＡＤＨの測定を例にとって示す。

実施例ｔｉ トリトンＸ−４０５，０，４％を含有する０、１Ｍトリ
ス燐酸緩衝液において、ｐ）ｌを５．８．６゜５．７．
０．７．４．８，０．８．４．９．０．９．４．９．８
、ｌ０５５に調製した溶液を争備し、各々実施例。２の
テトラゾリウム化合物０　、２　ｍＭ／ρ及びジアホラ
ーゼ２Ｕ／ｒｔｒＱになるよう添加し、その溶液２．５
ｘ１２に２．５ｍＭ／ＱのＮ　Ａ　Ｄ　Ｈの水溶液５０
μＣを加え、３７℃で５分間加温して波長５０５ｎｍの
吸光度を測定し、その結果をプロシトし第７図の結果を
得た。

即ち、呈色の感度は少なくとらｐＨ６，０〜１０゜５域
で呈色感度の変化は少なく、酸性域てら変化は著しく少
なかった。このことは目的とする測定結果が再現性よく
高感度に得られろことを０味するものである。

実施例１２および比較例１ トリトンＸ−４０５，０，４％を含有する０１Ｍトリス
燐酸緩衝液において、ｐＨを５．８．７５．８．４．９
０．９．８に調製した溶液群二組を亭備し、−組には実
施例２のテトラゾリウム化合物（実施例１２）を、他の
組にはＮＴＢ（比較例１）を各々０．２ｍＭ／Ｃとなる
ように添加し、さらにそれぞれにジアホラーゼ２Ｕ／ｍ
Ｑになるよう加え調製する。これら溶液各２　、５　ｒ
ｔｔＱに５０ｉｙ／ｄ＆アスコルビン酸水溶液５０μＣ
をそれぞれ加えて３７℃で５分間加温後、５０５ｎｍて
吸光を測定し、第８図に示す結果を得た。

即ち、テトラゾリウム化合物はアスコルビン酸の通元力
で還元され発色するか、従来使用されているＮＴＢに比
較し、各ｐＨにおいて吸光度が低０゜このことはアスコ
ルビン酸に対し還元され難く、従来のＮＴＢに比較して
Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈに対し特異的に作用することの一面を示
すものである。

実施例１３ 実施例２の化合物１ｍＭ／Ｌ乳酸リチウム塩２５ｍＭ／
（！、ＮＡＤ２ｍＭ／Ｃ、ジアホラーゼ３Ｕ／ｍＱ、Ｅ
ＤＴＡ−２Ｎａ、１ｍＭ／ｆ！、　　トリトンＸ−４０
５，０，４％を含む０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８２
）を発色試液とする。

ヒト血清２０μＣをとり、発色試薬３ｍＱを加え、その
反応過程を３７℃の恒温下で連続的に５０５ｎｍの吸光
度を測定して追跡した。結果を第９図に示す。

又、血清量を２０．３０．４０μＱと増加させ、同様に
連続的に吸光度を測定した後、１分間当たりの吸光度の
変化量をプロットした。結果を第１θ図に示す。

これらの結果から、本発明の測定方法は、体液成分の測
定に何効で定量的な反応であることかわかる。

次にスーパーオキサイドの定量についてコレステロール
の定量を例にとり示す。

実施例１４ 実施例３の化合物０．２ｍＭ／σ、コレステロールオキ
シダーゼ０．２Ｕ／ＩＩｆ２、ペルオキシダーゼ１０　
ＬＪ／＋！（、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキソ−３
−スル〕十プロピル）−ｍ−）ルイジンＩｍＭ／Ｌぶ元
型グルタチオン０．５ｍＭ／ｆ２を、トリトンＸ−Ｉ　
０Ｏ１０，２％を含む０．１Ｍ１−リス塩酸緩衝液に溶
解し、発色試薬とする。

コレステロールをイソプロパツールに溶解し、３００Ｍ
９／ｄＱの濃度に調製して試料とする。

試料１Ｏ１２０，３０，４０，５０μＱを各々取り、発
色試薬５肩σを加え、３７℃恒ｌ詰下で５分間インキュ
ベート後、試料ブランクを対照として５２５ｎｍの吸光
度を測定し、第１１図に示す結果を得た。

このことは、コレステロールオキシダーゼの作用により
生成されたスーパーオキサイドイオンを定量的に測定で
きろことを示すしのである。

【図面の簡単な説明】

第１〜４図は、実施例１〜４て得たテトラゾリウム化合
物の赤外吸収スペクトル、 第５〜７図、実施例９〜ＩＩで得られｆこ吸光度を示す
図、 第８図は、実施例１２および比較例１で得られた吸光度
を示す図、 第９図および第１０図は、実施例１３で得られた吸光度
を示す図、および 第１１図は、実施例１４て得られた吸光度を示す図であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式（１） ▲数式、化学式、表等があります▼（１） ［式中、Ｒ＿１およびＲ＿２は水素、低級アルキル基、
   低級アルコキシ基、ハロゲン、シアノ基またはニトロ基
   であり、少なくともその一つはニトロ基である。Ｒ＿３
   は水素、低級アルキル基、低級アルコキシ基またはハロ
   ゲン、Ｒ＿４は式（２） ▲数式、化学式、表等があります▼（２） （式中、ＸはＳＯ＿２ＮＨまたはＳＯ＿２ＮＺ（ここで
   、Ｚは低級アルキル基である。）、Ｒ＿５は水素、低級
   アルキル基、低級アルコキシ基またはハロゲン、Ｒ＿６
   はスルホン酸基を示す。）で表される基、Ｙは水素、低
   級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲンまたはニト
   ロ基を示す。］ で表される新規水溶性テトラゾリウム化合物。 ２、一般式（１） ▲数式、化学式、表等があります▼（１） ［式中、Ｒ＿１およびＲ＿２は水素、低級アルキル基、
   低級アルコキシ基、ハロゲン、シアノ基またはニトロ基
   であり、少なくともその一つはニトロ基である。Ｒ＿３
   は水素、低級アルキル基、低級アルコキシ基またはハロ
   ゲン、Ｒ＿４は式（２） ▲数式、化学式、表等があります▼（２） （式中、ＸはＳＯ＿２ＮＨまたはＳＯ＿２ＮＺ（ここで
   、Ｚは低級アルキル基である。）、Ｒ＿５は水素、低級
   アルキル基、低級アルコキシ基またはハロゲン、Ｒ＿６
   はスルホン酸基を示す。）で表される基、Ｙは水素、低
   級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲンまたはニト
   ロ基を示す。］ で表される水溶性テトラゾリウム化合物を用いることを
   特徴とする水性溶液中の還元性物質の測定方法。 ３、還元性物質が還元型ニコチン酸アミドアデニンジヌ
   クレオチド又は還元型ニコチン酸アミドジヌクレオチド
   燐酸である特許請求の範囲第２項に記載の測定方法。 ４、還元性物質がスーパーオキサイドイオンである特許
   請求の範囲第２項に記載の測定方法。 ５、テトラゾリウム化合物を界面活性剤と併用する特許
   請求の範囲第２〜４項のいずれかに記載の測定方法。 ６、水性溶液中の還元性物質を測定することによって水
   性溶液中の成分を定量する特許請求の範囲第２〜５項の
   いずれかに記載の測定方法。 ７、水性溶液中の成分が生体体液中の成分である特許請
   求の範囲第６項に記載の測定方法。