JPS62300A - 僅かに１〜３個のヌクレオチドで異なつている２種の相補的なヌクレオチド配列の間を識別する方法、オリゴヌクレオチド信号発生複合体及び僅かに１個のヌクレオチドで異なつている２種の相補的なヌクレオチド配列の間を識別するための診断キツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 、本発明は、僅かに１個の単一ヌクレオチドで異なって
いてよい２種の相補的なヌクレオチド配列の間を識別す
るｔめに好適な方法、そのための核酸交雑試料（ｎｕｃ
ｌｅｉｅ　ａｃｉｄｈｙｂｒｉｄｌｇａｔｉａｎ　ｐｒ
ｏｂｅａ　）及びこのような方法で使用する九めのキッ
トに関する。

従来の技術 標識され次ポリヌクレオチド試料の使用は、例えばレウ
イン（Ｌｅｗｉｎ　）によるサイエンス（５ｃ１ｅｎｃ
＊　）　２２１．１１６７（１９８３）及びタラウスナ
ー（Ｋｌａｕｓｎ＠ｒ　）等によるビオ／チクノロシイ
（Ｂｉｏ　／　Ｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ　）　１．４７１
（１９８３）に記載のように広範囲の用途で公知である
。標識され次オリゴヌクレオチド９試料は、特に、臨床
又は研究の用途の診断材料として重要である。

慣用のラジオ標識された試料は、有効かつ敏感であるが
、例えば臨床実験室でのスクリーニングのための日常の
使用にとっては妨げとなるいくつかの問題と結びついて
いる。このようにラジオ標識された試料は、潜在的に危
険であル、廃棄の問題】と生じる。更に、ラジオ標識さ
れた試料は、屡々、不安定で、ラベルとして用いられる
放射性物質殊に５２Ｐの比較的短かい半減時間の結果と
して、限られた貯蔵性（５ｈｅｌｆ　−１１ｆｅ）ｉ有
する。更にオートラジオグラフィ検査は、時間がかかシ
、ラジオ標識された試料の取扱いは適切な安全訓練を受
は次人材を必要とする。

従って、非放射性の試料標識付は法全使用することが所
望されておシ、このようなある種の方法は、文献例えば
、ワード（ＤＥＣ＠　Ｗａｒｄ　）によるコロラド州、
キーストン（Ｋ＠ｙｓｔｏｎ・。

Ｃｏ１ｏｒａｄｏ　）で１９８１年６月１５〜２０日に
開催され７ｔ１９８１１α−ＵＣＬＡシンポジウムで発
表され九デベロッグメンタル・パイオロジイ・ニーシン
グーに’ウリ７アイド拳グンズ（Ｄｅｖｓｌｏｐｅｍ＠
ｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｕｓｌｎｇ　Ｐｕｒ１ｆｉ
ｅｄＧ＠ｎ＠ｓ　：　Ａｃａｄ＠ｍ１＊　Ｐｒ＠ｓｓ　
＃　Ｄｏｎａｌｄ　Ｄ＠　Ｂｒｏｗｎ発行）１９８１．
双臥１９８１６４．７〜６５８頁及びマｂコルム（ＡＩ
ＩＤＩＩＢ＠　Ｍａｌａｏｌｍ　）等によるアブストラ
クツ・オプ・ザ・６０４　ｔｈバイオケンカル−ソサエ
ティ・ミーティング、ケンブリッジ、インク２ンド（Ａ
ｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　５Ｑ４−ｔｈ　Ｂｉ
ｏｃｈ＠ｍ１ｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｍｅ・ｔｉｎｇ
　、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ。

Ｅｎｇｌａｎｄ　１９８３年７月１日開催）に記載され
ている。

ビオチンで標識された試料も広く文献に記載されている
。

発明が解決しようとする問題点 しかしながら、本発明は、特に、比較的少ないヌクレオ
チドで異なっている２種の相補的なヌクレオチド配列の
間を識別することを必要としている交雑分析（ｈｙｂｒ
ｉｄｉｓａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｇ　）で使用する
九めの非放射性標識された試料の使用に関する。相補的
な核酸配列を有するオリゴヌクレオチドのハイブリッド
の安定性は、ハイブリッド中の誤対合塩基対に対して敏
感であることは報告されている〔例えば、Ｊ、Ｗ、スジ
ストーク（５ｚｏｓｔｏｋ　）等による、メソッズΦイ
ン・エンツィモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ　ｅＡｅａｄｅｍｌ＠Ｐｒｅｓｓ　）　
６８巻、４１９〜４２８頁参照〕。これらの著者は、塩
基対中に１個の誤対合金有する大抵のオリゴヌクレオチ
ドハイブリッドは、正しい塩基対を有する同じオリゴヌ
クレオチドのハイブリッドよりも温度に対する安定性が
低いことを示してｈる。このように、オリゴ９ヌクレオ
チド配列相補性の微妙な差異は、実際に、正対合及び誤
対合゛のオリゴヌクレオチドハイブリッドを水溶液中で
特定の温度でインキユベートすることによフ検出するこ
とのできるハイブリッド不安定化に微妙な差異を生じさ
せることができる。従って、本発明は、相補的配列と僅
かに１〜３個の非相補的なヌクレオチドを有する配列と
の間を識別するのに充分な選択性を有する非放射性標識
された試料に関することが認められる。オリゴヌクレオ
チド上の塩基対の誤対合の比較的小さい不安定化作用に
基づき、低分子量ラベルでのオリゴヌクレオチド試料の
標識付けは、試料の交雑特性を、試料の所望交雑選択性
が、２ペルの存在の結果として消失されるように変わる
ことが予期されていたはずである。最近、コレット（Ａ
、　Ｃｈｏｌｌ＠ｔ　）及びカワシマ（ＥｍＨａ　Ｋａ
ｗａｓｈｉｍａ　）は、ヌクレイックーアシズ・リサー
チ（Ｎｕｃｌｅｌｃ　ＡｅｉｄｓＲ＠５ｅａｒｃｈ　）
　１３巻Ｉ６５．１９８５で１．ビオチンで処理された
試料が単−Ａ／Ｃ誤対合を検出する九めに使用でき、低
分子ｔＳでも、ビオチンは、オリゴヌクレオチド試料の
交雑特性を変えることができることを示している。

低分子量ラベルをオリゴヌクレオチド試料に付けても、
相補的及び誤対合の配列を区別する能力に逆に作用しう
ると信じることは、この検出系が交雑の後にのみこの試
料に結合できるという実際的な欠点を包含する。従って
、この試料の観察者は、交雑の後に、時間を浪費し、経
費がかかシ、作業員のミスの管理全必要とする引続く反
応工程の管理に直面する。

問題点を解決するための手段 本発明は、高分子量種が、交雑の前に、試料の交雑選択
性をあまり変えることなしにオリゴヌクレオチド試料に
結合できることの意想外の発見に基づく。従って、例え
ば、高分子量検出系を、交雑の前にオリゴヌクレオチド
試料に結合させることができ、こうして、交雑後の一連
の反応工程の必要性を排除している。

従って、本発明の１実施態様によれば、１〜３個の僅か
なヌクレオチドで異なっている２種の相補的なヌクレオ
チド配列の間ｔｍ別するための方法が得られ、これは、
次の工程よりなる＝６）２種の相補的なオリゴヌクレオ
チド鎖の交雑を促進するか又は助成する条件下で、同定
すべき又は測定すべきヌクレオチド配列（それが一本鎖
を生じるように適当な処理の後に）′＠：、８〜３０ヌ
クレオチドユニット長さの一本鎖オリゴ×クレオチドよ
りなり、立体的に認容しうる部位でそれに共有結合して
いる、少なくとも１ｏ００ダルトンの分子ｆｉ！有し、
非ラジオアイソトープ性信号を生じることができる残分
を有するオリゴヌクレオチド信号発生複合体試料（この
オリゴヌクレオチド信号複合体中のオリゴヌクレオチド
は、同定すべき又は測定すべき配列に対して相補的であ
るが、二者択一的配列に対しては相補的でない特定の配
列を有する）と接触させ： （ｂ）　　試料：テスト核酸ハイブリッド全交雑されて
いない試料から分離しかつ （ｅ）　　この交雑されたオリゴヌクレオチド−信号発
生複合体から生じる信号を出させるか又は観察する。

非ラジオアイソトープ信号を出すことのできるこの残分
け、少なくとも５ｏ００ダルトン、有利には少なくとも
２００００ダルトンの分子量を有するのが有利である。

理論的考察と結びつけられることを望まないが、一般に
、約２００００００ダルトンの高い分子量を有する残分
が、例えば有利に、本発明の方法で使用できることを確
認した。この残分は蛋白質性分子部分より成っているの
が有利である。

本発明の方法は、単に１個の僅かな単一ヌクレオチドで
異なっている２８１の相補的なヌクレオチド配列の間ｆ
ｔ識別するのに有効である。

本発明の方法は、殊に、遺伝子内の点突然変異の存在の
検査、特にこの点突然変異が特定の病的状態に対応して
いるか又はこれと関連している場合の検査のために有用
である。このような病的状態は、フェニルケトン尿、α
−アンチトリプシン不全、α−及びβ−地中海貧血及び
鎌状赤血球貧血である。更に、本発明の方法は、哺乳動
物ゲノム中の多形現象（これは屡々特定の病状と関連し
ている）の存在の検査に有用である。しかしながら、本
発明の方法は多くの他の分野でも有用である。例えばグ
ラスミド又はファージベクター内にクローン化された遺
伝子中のヌクレオチド配列の正確さを試験するために有
用である。

オリプヌクレオチド信号発生コンプレックスは、この相
補的配列中の１個（又はそれよシ多い）単一塩基変化が
ハイブリッド形成を減少するか又は妨げるような状況下
で相補的なテスト核酸配列とのハイブリッド金形成する
ことができる。

試料中に含有される核酸は、りざヌクレオチド又はデオ
キシリがヌクレオチド又はこれら２種の混合物であって
よい。

この一本鎖オリゴヌクレオチドは、試料が哨乳動物核酸
金有する場合、有利に、１２〜２５個のヌクレオチドユ
ニット、よシ有利には１７〜２０個のヌクレオチドユニ
ットよシなる。

非ラジオアイソトープ性信号を出すことのできる残分け
、オリゴヌクレオチドの塩基、糖又は［利にホスフェー
トに共有結合していてよい。

このような結合は、このオリゴヌクレオチドの３′−又
は５′−末端の末端塩基、糖又はホスフェート上に存在
するのが有利である。この結合がホスフェートを介して
いる場合、これは有利に５′−末端である。

共有結合がオリゴヌクレオチドの塩基上に存在する場合
、この結合は、立体的に許容しうる部位（これは、そこ
で、変性されたオリゴヌクレオチドが完全な相補的配列
と交雑する能力との干渉を起すことなしに塩基への置換
分の結合によシ変性を行なうことのできる塩基上の位置
である）に存在することが特に重要である。一般に、こ
の塩基の任意のへテロ原子（窒素又は散票）上の置換は
、あまり望ましくない。

あｔシ望ましくない特定部位は、アデニンのＮ１及びＮ
４　（Ｎ１はＮ６よシ望ましくない）、グアニンのＮ１
　、Ｎ２及び０６及びシトシンのＮ３及びＮ４である。

共有結合の有利な部位は、シトシン及びウラシルのＣ５
及びアデニン及びグアニンのＣ８である。

オリゴヌクレオチドの塩基中に共有結合した基を導入す
る方法は、例えば欧州特許公開第６３８７９号（Ｙａｌ
＠Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　）及び同第９７３７３号（Ｋ
ｎｚｏ　Ｂｌｏｅｈｅｍ、　）及びＰＯＴ特許公開ＷＯ
３４１０３２８５号（Ｍｏｌ＠ｃｕｌａｒＢｉｏｓｙｓ
ｔ＠ｍｓ　）明細書から公知である。

オリゴ９ヌクレオチドのホスフェート中への共有結合し
た基の導入法は、例えば欧州特許第９７３７３号（Ｅｎ
ｚｏ　）及び同第１１９４４８号（Ｗａｋｕｎａｇａ　
　Ｓ＊１ｙａｋｕ　　Ｋａｂｕａｈｌｋｌ　　Ｋｍｌｓ
ｈａ　　）　　ｑり測置及びケンベ（Ｔ、　Ｋ・ｍｐ・
）等による買クレイツク・アシド・リサーチ（Ｎｕｅｌ
ｅ量ｅＡｅ１ｄｌＲｅｓｅａｒｃｈ　）　ｌ　９８５、
■、４５頁から公知である。

オＩ）ｆヌクレオチドの糖残基中への共有結合基の導入
は、例えば次のようにして実施することができる。この
基は、例えば糠中のヒドロキシ基を介して、例えばエー
テル又はエステル結合で結合していてより、この反応は
、文献例えばスメル）　（Ｊ、　Ｓｍｒｔ　）による、
コル、スゼチ。

タム。コムａ　（Ｃｅ１１．　Ｃｓ＊ｏｈ＋＋　Ｃｈｅ
ｍ、　Ｃｏｍｍａ　）１９６８．３３，１４６２及びス
チェアート（Ａ、　５ｔｕａｒｔ　）等によるジャーナ
ル・オリ・アメリカン争ケミカル拳ソサエティ（Ｊ、Ａ
ｍ＊ｒ＊Ｃｈ＠ｍ、　Ｓｏｅ　）　１０６３．８５，２
３４６及びジャーナルψオブ・ビオロジカル・ケミスト
リイ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ＠ｍ、　）　ｌ　Ｑ　６
４．２３９．３８８５に公知の任意の標準法で実施でき
る。糖がデオ命シリゲースである場合、遊離のヒドロキ
シ基は、この糖を有するヌクレオチドがオリゴマーの３
′−又はδ′−末端に存在する場合にのみ利用できる。

この糖がリボースである場合に、遊離ヒドロキシ基は、
２′位でも利用でき、この糖を有するヌクレオチドはオ
リがマー中の任意の位置を占めることができる。この基
は、オリゴヌクレオチドのすメース中のジオールの開裂
によン得たアルデヒド官能基釜介して結合していてもよ
い、このようなジオールは、リテースを有するヌクレオ
チドがオリがマーの３′末端を占める場合にのみ利用で
きる。このような反応は、ハウスケ（Ｆａ　Ｈａｕｓｓ
ｋｅ　）及びクレマ−（Ｆ。

Ｃｒａｍｅｒ　）によるメソッズ・イン・エンライそロ
ジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　
）、１９７９．５Ｑ、１７２〜１・８１に記載されてい
る。

非ラジオアイソトープ性信号を出すことのできる残分は
、それ自体、信号発生することができるか又は自体公知
の方法により適当な試薬との反応により信号を出すこと
ができることは理解しうる。従りて、ここでこの残分け
、検出系に結合している１スペーサー原子団よシなると
定義され、この残分は少なくとも１００ｏダルトンの分
子量を有する。この検出系は蛋白質性分子部分より成る
のが有利である。

この検出系は、単独の、又はスペーサー原子団に結合す
るための連鎖に結合し比信号発生分子部分よシなる。従
って、信号発生分子部分は、直接共有結合でスペーサー
原子団に直接結合していてよいか又は、１連鎖を介して
スペーサー原子団に結合していてよ論。

従って、例えば蛋白質性分子部分が存在する場合には、
これは検出系の信号発生分子部分中に存在し得るか又は
、連鎖が存在する場合には、信号発生分子部分とスペー
サー原子団との間の連鎖内に、又はこのような連鎖及び
信号発生分子部分の双方中に存在しうる。従って、スペ
ーサ・−原子団は、所望の場合には、直接共有結合で、
複合体の信号発生分子部分に結合されていてよく、この
場合、信号発生分子部分は、蛋白質性分子部分例えば、
酵素活性化された色変化を生じさせるための系よシなる
のが有利である。

もう１つの態様で、スペーサー原子団は、所望の場合に
は、特異的結合対を有する蛋白質性分子部分例えば蛋白
質リガンドで、又は抗原−抗体反応例えばアビジン−ピ
オチン又はジニトロフェニル−抗ジニトロフェニル抗体
反応で検出系の信号発生分子部分に結合されていてよい
。

所望によル、この信号発生分子部分は、例えば信号発生
部分との関連で先に定義されているような蛋白質性分子
部分より成りていてもよい。

もう１つの態様で、スペーサー原子団は、例えば、単純
に、特異的な結合対又はこのような対の蛋白質性成分を
有する蛋白質性分子部分に結合していてよい。

この残分の有利な信号発生部は、酵素的に活性化された
色変化を生じるための系全合体する。

有利な酵素系には、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）
、酸性ホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、ルシ
フェラーゼ又は西洋ワさヒベルオキシダーゼが包含され
る。このような酵素系は、それら自体は信号発生できな
いが、適当な基質の存在で自体公知の方法で信号を出す
ことができる。共有結合した残分の信号発生部は、任意
の慣用法で、例えば発光又は螢光によ）又は色を用いて
操作することができる。

使用時には、一般に、核酸試料にとっては、完全な相補
的オリゴ９ヌクレオチド配列の微少素を検出することが
必要である。このような状況下では、試料内に、信号増
幅の手段全導入するのが有利である。この増幅は公知方
法で、例えば、欧州特許公開第２７０３６号（ＩＣＩ　
）　、同第４９６０６号（ＩＣＩ　）、 セ判撃す、同第５８５３９号（ＩＣＩ　）及び同第６０
１２３号（ＩＣＩ　）明細書中に記載の１種以上の系を
用いて実施することができる。

信号を出すか又は観察するために使用される手段は、信
号発生メカニズムに依シ決まる◎従全供給することが必
要である。

本発明の方法の使用時に、一般に、点突然変異が配列の
中央又は中央付近で起こるヌクレオチド配列に対して相
補的な試料を使用するのが有利である。この方法で、正
常配列と異常に変化した配列との間の、差は最適の方向
に向かう。

当業者によれば、点突然変異がオリゴヌクレオチド試料
の末端と反対の領域の方向に向って起るヌクレオチド配
列の識別は、スジスターク（５ｚｏｓｔａｋ　）等によ
るメソッズーイン・エンツィモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　１ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ入ｅａｄ＠ｍｌａ　Ｐｒ
ｅｓｓ　）　５５巻、４１９頁に説明されているように
、実際には、より困難であることは理解される。

ｂｌｏｔ　）、ドツト・プロット（ｄｏｔ　ｂｌｏｔ　
）又はサンドイッチ・ハイプリダイゼーシ覆ン（Ｓｉｎ
ｄｗｉａｈ　ｈｙｂｒｉｄｉ４ａｔｉｏｎ　）法を用い
て実施する。

本発明は、比較的値かなヌクレオチド配列で異なってい
る２種の相補的ヌクレオチド配列の間の識別のために特
に重要である交雑試料にも関する。

従って、本発明のもう１つの態様によれば、８〜３０個
のヌクレオチドユニット長さの一本鎖オリゴヌクレオチ
ドよＩ■、これに立体的に許容しうる部位で、スペーサ
ー原子団金倉して、酵素ラベルを有していてもよい特異
的結合対よＩ■、分子最少なくとも１０００ダルトンを
有する残分にもしくは１個の酵素ラベルがスペーサー原
子団を介してオリゴヌクレオチドに結合している場合に
はそのスペーサー原子団のオリゴヌクレオチドへの連結
が末端の塩基、糖又は有利にホスフェートを介している
条件で１個の酵素ラベルに共有結合しているオリゴヌク
レオチドイざ号発生複合体が得られる。

行な−）た実験に基づき、末端塩基、糖又はホスフェー
ト単独へのス（−サー原子団の連鎖は、オリゴヌクレオ
チド信号発生複合体の融解温度には無視しうる作用を有
するという結論を有する。これは、末端塩基、糖又はホ
スフェートのみ以外の位置での置換に関する文献に報告
されている融解温度の低下とは対照的である。

スペーサー原子団は、５′−末端でホスフェートを介し
てオリゴヌクレオチドに結合しているのが有利である。

酵素ラベルがスペーサー原子団を介してオリゴ０ヌクレ
オチドに直接結合している所では、このスペーサー原子
団は、有利にＡ式： 〔式中ｎは２〜１６有利に６であ夛、ａは０〜８であり
、ｂは０〜８であＩ、Ｒは直接結合又はシフｎヘキシ−
４−イル、２−フェニレン、３−フェニレン又は養−フ
ェニレン基でアリ、これらは場合によシＣ１〜６−アル
コキシ例えばメトΦシ及びジ（Ｃ１〜６−アルキル）ア
ミノ例えばジメチルアミノよフ選んだ１〜３個の基で置
換されていてよい〕である。１が０で、ｂが０で、Ｒが
３−フェニレンの場合が有利である。

前記オリイヌクレオチド−信号発生複合体のオリゴ９ヌ
クレオチドは、有利に１病的状況又は相応する正常配列
と関連したヌクレオチド配列に対して相補的な配列を有
する。

この特異的な結合対は、例えば免疫学的対、有利に抗原
／抗体相互作用体（ｍｎｔｉｇ＠ｒｎ／ａｎｔｌｂｏｄ
ｙ　Ｉｎｔ＠ｒａｃｔｌｏｎ　）例えばジニトロフェニ
ル−抗ジニトロフェニル抗体相互作用体は歿白質リガン
ド相互作用体有利にアビシン−ビオチンである。

ルー生じる系が前記の特異的結合対に共有結合している
。有利な酵素系には、アルカリ性ホスファターゼ、酸性
ホスファターゼ、ベーターガラクトシダーゼ、ルシフエ
ラーゼ又は西洋わさびペルオキシダーゼが包含される。

このような酵素系は、それら自体は信号を出さないが、
自体公知の方法によシ適当な基質の存在で信号を出すこ
とができる。共有結合した残分の信号発生部は、任意の
慣用法により、例えば発光、螢光によシ、又（よ色素を
用いて、蛋白質性分子部分が検出系の１部として存在す
るような条件で、操作することができる。

試料中に、信号を増幅する手段を導入することは一般的
に有利である。このような増幅は、公知方法で、例えば
欧州特許公開第２７０３６号、同第４９６０６号、同第
５８５３９号及び同第６０１２３号明細書に記載の系１
種以上を用いて実施することができる。

本発明のオリゴヌクレオチド試料は、Ｂ式を有するのが
有利である。

〔式中人はアビノン又はアビジン−酵素分子部分を表わ
し、ｍは養又は５であシ、ｐはＯ〜１６であシ、Ｘは直
接結合、−０−Ｐ（０）（ＯＨ）−０−１−８−、−ｏ
−１−ＣＯＮＨ−１−ＣＯＮＨＣＯ−であるか又はＮ−
Ｒ８であシ、ここでＲ８は直鎖又は分枝鎖のＣ１〜、。

−アルキル基である〕。通例、Ｘが−ＣＯＮＨ−又は−
ＣＯＮＨＣＯ−であり、ｍが４である。

Ｘは直接結合又は−〇−Ｐ（０）（ＯＨ）−０−である
のが有利である。

所望の場合には、Ａが７ビジン一酵素分子部分である場
合のＡは付加的に酵素に関する基質を有していてよい。

特に、オリゴ９ヌクレオチド試料は、殊にＢ式の、（ｉ
）ｘが直接結合、ｍが５及びｐが０であるか又は（ｉｉ
）ｘが一〇−Ｐ（０）（ＯＨ）−０”　、　ｍが５及び
ｐが８である試料である。

本発明のもう１つの態様によれば、前記定義のようなオ
リゴヌクレオチド信号発生複合体（ここで、残分は場合
によル酵素ラベルを有していてよい特異的結合対よりな
り、この残分は少なくとも１０００ダルトンの分子量金
有し、その特異的結合対は、有利に、スペーサー原子団
全弁して一本鎖オリゴヌクレオチドに共有結合している
）の製法が得られ、この方法は、酵素ラベル金有してい
てもよい前記の特異的結合対の１員を、８〜３０個のヌ
クレオチドユニット長さの一本鎖オリゴヌクレオチドよ
りなシ、立体的に許容しうる部位で、これに、スペーサ
ー原子団を介して共有前記の特異的結合対の他の員を共
有結合して有するオリゴヌクレオチド複合体と反応させ
ることよシなシ、反応成分は、得られる複合体中の残分
が少なくとも１０００ダルトンの分子量を有するように
選択されている。特異的結合対の少なくとも工員は、蛋
白質性分子部分より成っているのが有利である。

前記の特異的結合対の工員のみを有するオリゴヌクレオ
チド複合体は、有利に、８〜３０個のヌクレオチドユニ
ットの保護されたオリゴヌクレオチドを前記の特異的結
合対の工員の他の方法で保護されたホスフェートの遊離
ＯＨ基と反応させ、かつこの際形成される生成物の保護
基を除去することによル製造される。

特異的結合対の工員のホスフェートは、有利に、核員の
１個の一〇Ｈ基と式Ｒ−０−Ｐ（０）ＲＲ（ここでＲは
ホスフェートの保護基であり、Ｒ２及びＲは同−又は異
なるもので６ってよく、除去しうる基である）のホスフ
ェートとを反応させることによシ製造され、この際、ホ
スフェートが１個の単一ホスフエート保Ｓ基を有する、
特異的結合対の１員のホスフェートが得られる。

殊に、まず、前記定義の式：　Ｒ’　−０−Ｐ（０）（
Ｒ）２Ｒ３のホスフェートを用いて特異的結合対の１員
のみを有するオリゴ９ヌクレオチド複合体を製造し、次
いで、得られるこの複合体と酵素ラベルを有していても
よい特異的結合対の他の員と全反応させることによシ、
前記定義のようなオリゴヌクレオチド信号発生複合体（
ここでその残分け、酵素ラベルを有していてもよい１個
の特異的結合対よ）なる）を製造するのが有利である。

ホスフェート保護基金導入する（この際、２個のホスフ
ェート保護基を有する特異的結合対の１員のホスフェー
トを単離する）のに有効な薬剤の存在でこの反応全実施
するのが有利であり、引続き前記ホスフェート保護基の
１個全除去する。このような方法は、ホスホリル化法の
生成物の有利な精製法金提供する。

前記ホスフェートは、有利に、２−クロルフェニルジ（
１，２，４−トリアゾール）ホスフェートであシ、この
ホスフェート保護基は、有利に塩基例えばピリジンの存
在で導入される。

本発明のもう１つの態様によれば、酵素ラベルがＡ式の
スペーサー原子団を介して一本鎖オリゴヌクレオチドに
共有結合している前記定義の製法が得られ、これは、０
式： 〔式中Ｅは酵素例えばアルカリ性ホスファターゼ又は西
洋わさびペルオキシダーゼ全表わす〕の化合物と０式： ％式％）） 〔式中２はオリゴヌクレオチドであｎ、ｎは前記のもの
である〕の化合物とを反応させることよシなる。

０式の化合物は、有利に、酵素のアミノ基と２式： 〔式中Ｙは活性化されたエステルであＪ、Ｒ。

１及びｂは前記のものである〕の化合物とを反応させる
ことによシ製造される。

Ｙは、有利に、０式： 〔式中８７は水素又はスルホン酸塩有利にナトリウム塩
である〕の基である。式中のＲが水素であシ、ａＦｉｏ
、ｂはＯ，Ｒは３−フェニレン基（ｍ−フェニレン）で
あるＦ式の化合物を使用するのが有利である。式中のｎ
が前記のものであるＤ式の化合、物は、有利に、例えば
、Ｅ式：Ｐｈ”３Ｃ８（ＣＨ２）ｎ−０−Ｐ−０−Ｚ　
　　　　　　　（Ｅ１９ＯＨ の相応する化合物の加水分解による保護基除去により製
造される。Ｅ式の化合物は、保護された形の、有利に、
ポリマーサポート上で保護されたオリゴヌクレオチドと
Ｈ式： 〔式中ｎは前記のものであシ　１４及びＲ５は同−又は
異なるもので、Ｃ１〜、。−直鎖又は分枝鎖のアルキル
基有利にメチル又はイソプロピルであるか又はＲとＲは
これらの間の窒素原子と一緒になってモルホリンｍｔ表
わし、Ｒはホスフェートに対して好適な保護基有利にメ
チル基金表わす〕の化合物との反応により製造される。

Ｈ式の化合物は、有利に、１式： ｐｈ３ｃｍｓ−（ＯＨ２）ｎ−ＯＨ（Ｊ）〔式中ｎは前
記のものである〕の化合物とに式：〔式中Ｒ，Ｒ及びＲ
は前記のものであシ、Ｈａｌはハロゲン原子有利に塩素
を表わす〕の化合物と全反応させることによシ製造され
る。Ｋ式の化合物は、有利に、クロルＮ、Ｎ−ジイソプ
ロピルアミノメトキシホスフィンである。

オリゴ９ヌクレオチドー信号発生複合体及び本発明の方
法全病的状態と関連している遺伝子中の点突然変異の検
査で使用する場合には、一般に、オリがヌグレオチドー
信号複合体を診断キット中に導入するのが有利であり、
従って、このキットは本発明のもう１つの態様と認めら
れる。

従ってｔ本発明のもう１つの態様によれば、僅かに１個
のヌクレオチドで異なっている２種の相補的なヌクレオ
チド配列（この配列の１つは病的状態と関連してお）、
この配列の他の１つは相応する正常配列である）の間を
識別する九めの診断キットが得られ、このキットは、そ
のオリゴヌクレオチドが病的状態と関連している配列又
は相応する正常配列に対して相補的な配列を有し、その
オリゴヌクレオチドが立体的に許容しつる部位で、これ
に、分子最少なくとも１０００ダルトンを有し、非ラジ
オアイソトープ信号を出すことのできる残分を共有結合
して有する、８〜３０個のヌクレオチドユニット長さの
一本鎖オリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌクレオチド
−信号発生複合体試料少なくとも１個を有する。

このキットは、有利に１）病的状態に関連している配列
に対して相補的な配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチ
ドよシなるオリコ９ヌクレオチ記病的状態を示さないヒ
トに存在しうる相応する正常配列に対して相補的な配列
を有する一本鎖オリコ０ヌクレオチドよシなるオリゴヌ
クレオチド信号発生複合体試料少なくとも１種を有する
。

この関係で、特定の病的状態は、ヒ）　ＤＮＡダノゲノ
異なる領域中に現れる点突然変異で特徴的であることが
認められる。このような場合に、各々の関連する点突然
変異が存在するか又は不在であるかを検出することは重
要であり、従って、１種以上のオリゴ９ヌクレオチド信
号発生複合体試料、各々の点突然変異の存在又は不在を
検査するための１試料が使用される。このキット中に相
応する正常又は異常な配列に関する試料を包含するのも
有利である。

このキットは、適当な緩衝液及び／又は洗浄液を有して
いるのも有利°であシ、本発明の方法によるこのキット
の使用のための書かれたか又は印刷された指示をも有す
る。

添付図面において、第１図は、固定ぎメメｐＩＦ−２５
α２ＤＮＡに関して観察された交雑信号〔列Ｂｓ　３μ
５４（Ｂに近い）、１μＦＰ（ｎからはなれている）〕
及び突然変異体ＰＩＦ２５−１４α２プラスミ）’ＤＮ
Ａに関する信号は認められなかった事実〔Ａ列、３μＰ
（Ｂに近い欄）１μ（Ｂから遠い欄）〕を示している（
例７参照）。第２化 図は、固定メＡ、／ＥｐｌＦ５５α２プラスミドＤＮＡ
（Ａ列）０３００ｎ５Ｌ（ＡＫ近い欄）及び３０ｎ）　
（Ａからはなれた欄）とｐＩＦ’５５−Ｆ４α２−誘導
グラスミドＤＮＡ　（Ｂ列）との間のオリゴ９ヌクレオ
チドーアルカリ性ホスファターゼ複合体による識別を示
してｌ＾る。、ｐＩＦ５５α２プラスミドＤＮＡ　（Ｃ
列）及びその誘導ｐＩＦ５５−Ｐ６α２（Ｄ列）は、オ
リゴヌクレオチド−複合体なしでアルカリ性ホスファタ
ーゼで偽交雑した。Ｃ列及びＤ列の信号の不在は、アル
カリ性ホスファターゼの直接結合に依るアーチファクト （ａｒｔ＠ｆａｅｔｓ　）の存在を除外している（例８
参照）。

第３図はｐＩＦ５５α２（Ａ列）の３００　ｎｆ（人に
近い欄）及び３　Ｑ　ｎｆ　（Ａからはなれた欄）いる
。この試料によ夕得られる信号強度は、相同グラスミド
−Ｆ６α２に関してはよシ強い（例９参照）。

第４図は、この試料の相同プラスミド ｐＩＦ２５α２（Ａ列）の３００　＋ｌＦ、３０　ｎ９
−及−び３ｎ？（左から右）への交雑が！ラスミドｐｒ
Ｆ２５−４４ｃ！２　（Ｂ列）の３００ｎｆＰ１３０ｎ
％及び３　ｎｌＦへの交雑よ勺もよシ強力であることを
示している（例１０参照）。

第５図は、スーザンｉ　ｙ’＞”；ｅ〆２の後に、線状
化されたｐｌＦ５５−Ｆ６α２の３００　ｎＰが過剰の
と）　ＤＮＡの存在（レーン１）又は不在（レーン５）
の双方で単−帯として検出されることを示ＤＮＡの存在
（レーン２）又は不在（レーン６）で検出できなかつた
ことは、α２５５オリゴヌクレオチド−ＡＰ複合体によ
る、ＰＩＦα２ＤＮＡとｐＩＦ　５５−　Ｆ４α２　Ｄ
ＮＡとの間の識別を説明している。

次の実施例につき本発明全説明するが、本発明はこれの
みに限定されるものではない。例中で、特にことわりの
ないかぎシ、溶液は水溶液であシ、「チ」は「ｗ／ｖチ
」である。

種々の試薬の構成は次のとおシである：ＰＢＳ　　　１
５０ｍＭＮａＣｔ＋１０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，
４）ＳＳＣ０，１５ＭＮａＣ２＋０．０１５Ｍクエン酸
ナトリウムデンハ戸ト試薬（Ｄｅｎｈａｒｔ’ａ　ｒｅ
ａｇ＠ｎｔ　）０．０２１　　ＢＳＡ ０、０２　％　　フィニル（Ｆｉａｏｌ）　４００００
００、０２　％　　ＰＶＰ 次の略字音用いる： Ｍ・ＯＨメタノール ＥｔＯＡｃ　　酢酸エチル ＤＭＦ　　　ジメチルホルムアミド ｔＲＮＡ　　　）ランスファリボ核戯 ＨＲＰ　　　西洋すさびペルオキシダーゼＰＢ８　　　
燐酸塩緩衝塩 ＳＤＳ　　　ドデシル硫酸ナトリウム ２　ｘ　ｓｓｃ　　二倍濃度の５ＳＣ Ｑ、５ＸＳ８Ｃ半分濃度の５ＳＣ ＢＳＡ　　　牛血清アルブミン ＰｖＰ　　　ポリビニルピロリドン ＨＥＰＥＳ　　（Ｎ　−２−ヒドロキシエチル−Ｎ　−
２−エタンスルホン酸） Ｔｒｌｍ　　　）！Ｊス（ヒドロキシメチルコアミノメ
タン ＡＰ　　　　アルカリ性ホスファターゼフラクトシル（
Ｆｒａｅｔｏｓｉｌ　）、トｊトンーＸ／ニデｙ　）Ｐ
２Ｏ（Ｎｏｎｉｄ＠ｔＰ４０）、フイ３ル４０００００
　（Ｆｉｃｏｌ　４０００００　）、ノ９ル？イシｘｌ
Ｏ−８ＡＸ（Ｐａｒｔｉｓｉｌ　１Ｏ−８ＡＸ）、ネン
ソルプ（ＮＥＮＳＯＲＢ）　、ミレックス（Ｍｌｌｌｅ
ｘ）、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｌｃｏｎ　）、アン／
母ツク（Ａｍｐａｃｋ　）、コアーバッファ　（Ｃｏｒ
ｅ　Ｂｕｆｆｅｒ　）、Ｃｌ８−ｕｓンダノＪ？り（Ｃ
ｌ８−ｕＢｏｎｄａｐａｋ　）、セフ　７７’　ｙクス
Ｇ　−２５（８ｅｐｈａｔ＠ｘ　Ｇ　−２５）、セファ
デックスＧ　−５０（５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−５０）
。

例１ ビオチンの分子を、次の方法により（６）のヌクレオチ
ド配列を有する１５塩基長のオリゴヌクレオチドα２−
５５に結合させた。

ｄ［Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ
−Ｃ−Ｃ−Ｇコ　（６）製法１ ピリジン（３ｍ）中の２−クロルフェニルホスホロジク
ロリゾ−）（０，３２７１１７）と１．２．４−トリア
ゾール（７ｏＯ■）から製造したホスホリル化剤の溶液
を、無水ピオチノールα）（２３０１ｎ９）に加え、混
合物を２０℃で３０分攪拌した。

■ 次いで、２−ヒドロキシグロピオニトリル（０，６８ｍ
）を加え、攪拌をさらに１．５時間続けた。混合物を蒸
発させ、残留物をクロロホルム（２０１＋１／）と食塩
水（２０１ｄ）の間で分配させた。クロロホルム抽出物
を乾燥しくＭｇ５０４）、蒸発させた。残留物をシリカ
ゲル（５（１）のカラムで、最初の溶離剤としてＣＨＣ
Ｌｓ　：　ＭｅＯＨ（Ｉ　Ｑ　：　ｌ　ｖ／ｖ　：　１
００プ）を用い、次いでＣｕＯ２，：ＭｓＯＨ（９：　
１　ｖ／ｖ　）によって分別した。

合した適当な両分（溶離剤としてＣＨＣＬ３　：ＭｅＯ
Ｈ４：　１　ｖ／ｖをおよび検出のためヨウ素蒸気を用
いるシリカゲルでの薄層クロマトグラフィー分析によシ
指示されるような）から溶剤の蒸発後、こウシてビオチ
ニル２−クロルフェニル２−シアノエチルホスフェート
■（０，３２ｇ、６７％）が油状物として得られた。

製法２ ピリジン（３ｄ）、トリエチルアミン（１ｍｌ）および
水（０，５ｄ）の混合物中のビオチニル２−クロルフェ
ニル２−シアノエチルホスフェート■（２３０ｒｖ）の
溶液を２０℃で１時間放置し、次いで蒸発させた。残留
物をエーテル（６×２０　ｍｌ　）で抽出し、減圧で無
水ピリジンを用いる共沸蒸留によりて乾燥して、ビオチ
ニル２−クロルフェニルホスフェートのトリエチルアン
モニウム塩を得た。

製法３ ポリジメチルアクリルアミド樹脂に結合した、完全に保
護されたオリがデオキシリゾヌクレオチド配列〔エツジ
（Ｍ、　Ｄ、　Ｅｄｇｅ等）″′ヌクレイ。

クアシ、ズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉａ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
６！１．　）”−１９８３年第１１巻、第６４１９頁〜
第６４３５頁）により記載されているインターフェロン
α２遺伝子合成において配列５５として公知〕の試料（
ｌｏｌｌ）を、可変長のプランジャーおよびガラスウー
ルフリットを備えたガラスカラム（６，５Ｘ　５０ｘ　
）　Ｃｌ’　イ）　（Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ）等”シャぐカ ーナル・オプ・ケノ〆ル・ソサエティ（Ｊ、　Ｃｈｅｍ
。

Ｓｏｃ、　、Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　＋　）　’
　１９８２年、第３７頁〜第４０頁参照〕中で、ＤＭＦ
′中で膨潤させた（２０℃で１５分）。カラムの頂部を
４リテトラフルオロエチレン管を介して、溶剤を選択し
かつ窒素（１０ｐｍｔ）下に２〜３　ｍ／／ｍｉｎ　ノ
流量でカラムを通過させることのできる六方浴回転弁に
接続した。カラムを順次にピリジン、ＣＨＣＬｓ　：　
ＭｅＯＨ（７：　３　ｖ／ｖ　）　（それぞれ２分間）
、５′−ジメトキシトリチル基を除去するためＣＨＣＬ
ｓ　：　ＭｅＯＨ（７：　３φ）中の５チベンゼンスル
ホン酸（４０秒）、ＤＭＦ（２分）およびピリジン（２
分）で洗浄した。樹脂を、５０℃でカラムに窒素気流を
通して乾燥した。

カラムを溶剤送出系から分離し、カラム頂部を取外した
後、上述した乾燥樹脂に、無水ピリジン（０，３ｍ）中
の？オチニル２−クロルフェニルホスフェートトリエチ
ルアンモニウム塩（２３■）および（１−メシチレン）
−３−ユニトロー１．２．４−トリアゾール（５０〜）
の溶液を加えた。カラム頂部を再装着し、カラムを４５
℃のオープン中に４５分間装いた。（または、反応を２
０℃で１．５時間実施することができる）力２ムを溶剤
送出系に再接続し、次いで樹脂をピリジン（２分）、Ｄ
ＭＦ　（２分）、ｃＨ，ｃｔ：ＭｅｏＨ（７：　３　ｖ
／ｖ　）　（２分）、エーテル（２分）で洗浄し、最後
に窒素気流中で乾燥してＩリゾメチルアクリルアミド樹
脂に結合しピ た／オチニル化され、完全に保護されたオリゴヌクレオ
チド配列（イ）を得た。

ビオチニル化オリゴヌクレオチド配列を固形支持体から
分離し、エツジ（Ｍ、　Ｄ、　Ｅｄｇｅ　）　等（“ネ
ーチャ−（Ｎａｔｕｒ＠）”、１９８１年、第２９２号
、第７５６２頁〜第７６２頁〕により記載されたような
標準法（ただし８０ｃｌｂ酢酸での処理は必要でない）
により保護基を脱離し、次いでニュートン（Ｃ，Ｒ，Ｎ
ｅｗｔｏｎ　）等〔“アナライテヵＡ／−バイオケミス
トリー（Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｅｈｓｍ、　）”、１９８
３年、第１２９巻、第２２頁〜第３０頁〕にょシ記載さ
れたような２段高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）法によって精製して、ビオチニ１ル化オリゴデオキ
シリゾヌクレオチド配列（ハ）を得た。

（ハ） ノ４ルチシル（Ｐａｒｔｉｇｉｌ　）　１０−　ＳＡＸ
イオン交換樹脂での最初のＨＰＬＣ（ニュートン等から
の緩衝液系■または■使用）で、生成物ビオチニル化α
２５６オリゴヌクレオチド（０が、４２分の保持時間で
最大保持ピークとして得られｆｃ（緩衝液系■）。親オ
リゴヌクレオチド配列（α２−５５）　（６）ｄ［Ａ−
Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ
コ　　　（６）は、同じ条件下で分析した場合、３８分
の保持時間を有していた。

ピオチン残基がオリゴヌクレオチド配列に結合している
ことを確認するために、生成物の水溶液（１ｘ　ＰＨ１
２種ｌ中１．６０．　Ｄ、　２６８単位、０．１チツイ
ーン（Ｔｗｓｅｎ）　２０　）を、アビジン８．３単位
を含有する、アビジン・アガロース〔シグマケミカル社
（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｌ
ｔｄ　）のカラム（０，２５ｍ）に加えた。カラムを１
×ＰＢＳ、　０．１％ツ（−ンテ洗浄Ｌ、画分（１１１
Ｌｌ）３２ｐ標識オリゴヌクレオチド配列（α２−５５
）の試料を同様のカラムに加えた場合、すべての放射能
が溶離剤の最初の２　ｍｌでカラムを通過した。

アビジンおよびＨＲＰの複合体を、ベクタステイア　（
Ｖｅｅｔａｓｔａｉｎ　）　ＡＢＣキット〔ベクターラ
ゲラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ　）　、　　パーリングスハイム、カリフォルニア９
４０１０、ＵＳＡ）を使用してビオチニル化オリゴヌク
レオチドに結合した。ベクタスティン試薬人の１滴を、
０．１チツイーン２０（シグマケミカルカンノ臂二イ）
を含有するＰＢＳｌｄ中のビオチニル化オリコ０ヌクレ
オチド２μＩに加えた。混合した後、ベクタスティン試
薬Ｂの１滴を加え、混合し、混合物を室温で３０分間放
置した。

分析用グラスミドは、オリゴヌクレオチドα２−５５（
６）の配列と相同のインターフェロンα２遺伝子ヌクレ
オチド配列３’ＴＴＣＴＴＴＡＴＧＴＣＧＧＧ（：　５
’〔工、ジ等、“ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎｕ
ｅｌｅｌａ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ＊ｓ、　）　’　１９８３
年、第１１巻、第６４１９頁〕（このプラスミドを以下
ｐＩＦ’５５α２と呼称）か、またはオリゴヌクレオチ
ド中に末端の３つの塩基が非相同の誤対合区域（７／ダ
２インで示す）を有する配夕ＩＪ３’ＴＴＣＴＴＴＡＴ
ＧＴＣＧＡＣＧ５’のいずれかを含有していた。

後者のシラスミド（以下ｐＩＦ５５−Ｆ６と呼称）は次
のようにして得られた： 遺伝子を、合成オリゴ９ヌクレオチドから大体において
エツジ等〔６ヌクレイツクアシツズリサ一チ１１９８３
年、第１１巻、第６４１９頁〜第６４３５頁〕によシイ
ンターフェロンα２遺伝子の合成に記載されたようにし
て製造したが、ただしオリゴヌクレオチドｌ、２　、５
５．５６および５７はそれぞれ配列ｌ　Ｔａｑ　＊　２
　Ｔａｑ　、５５−Ｆ６　’閃−Ｆ６および５７−Ｆ６
により代えた：Ｉ　Ｔａｑ　　５’　ＣＧＡＣＧＡＴＧ
ＴＧＴＧＡＴ２　Ｔａｑ　　５’　ＣＧＧＣＡＧＡＴＣ
ＡＣＡＣＡＴＣＧＴ５５−Ｆ６５’ＡＡＧＡＡＡＴＡＣ
ＡＧＣＴＧＣ５６−Ｆ６　５’ＣＣＧＧＣＴＴＧＧＣＡ
ＧＣＴＧ５７Ｆ６　５’　ＣＡＡＧＣＣＧＧＧＣＡＧＣ
ＴＧ合成遺伝子は、標準法〔マニアテス（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）等、１モレキユラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｌｎｇ　）　’　１５　Ｎラトリイマニ
ュアル（ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　）　
：コールドスプリングハーパーラゲラトリイ、１９８２
年〕を使用し、シラスミドｐｓ’ｒｐ１　（クインダス
（Ｗｉｎｄａｓａ　）等１”ヌクレイックアシッズリサ
ーチ”、１９８２年、第１０巻、第６６３９頁〜第６６
５７頁）〕のＣＬ＊　１部位と５ａｔＩ部位との間でク
ローン化した。

プラスミドＤＮＡの著しく希釈した試料（最大１μｇ）
をシュライヒヤーおよびシュエル（５ａｈｌｅｉｃｈａ
ｒ　ｕ　５ｅｈｕｅｌｌ　、キーン、二、−ハングシャ
ー、米国）によシ適用された装置および指示を使用して
ニトロセルロースのフィルター上へ“ドツト−プロ９　
）　（ｄａをｂｌｏｔｔ＠ｄ　）　’または６スロ、ト
ープロット（５ｌｏをｂｌｏｔｔｅｄ　）　ｌ。

た。フィルターを回転し、真空中８０℃で２時間ベーキ
ングした。次いで、フィルターを２×ＳＳＣ中で湿らし
、５ｘ８ｓｃ、５ｘデンハート試薬（Ｄａｎｈａｒｄ（
ｇｒｅａｇｅｎｔ　）、１ｅｓグリセリン、０、１　％
　ＳＤＳ　、　５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐ）１７．０
）および変性ニシン精子ＤＮＡ　１００μルゼを含有す
る混合物中で６８℃で２時間前交雑した。フイルターを
、（Ｎｏｎ１ｄａｔ　）　Ｐ　４０および２５０μＩ−
ｌ　ｔＲＮＡを含有する混合物５　ｍｌに加えたオリゴ
ヌクレオチドタンＩＩり質（アビモノ十）［ＲＰ　）複
合体１プを使用し１，５　Ｘ　ＳＳＣ，０，５チノニデ
ツト室温で１６時間交雑した。次いで、フィルターを、
６ｘＳＳＣ，０，０６＊ピロ燐酸ナトリウムおよび２０
ｍＭ燐酸ナトリウム（−７，０）を含有する混合物中で
室温で５分間２回洗浄した。

さらに、フィルターを、６　Ｘ　ＳＳＣ，０，０６チビ
ロ燐酸ナトリウムおよび２０ｍＭ燐酸ナトリウム中で２
回３７℃で２分間洗浄し、１回４０℃で２分間洗浄した
が、この温度はプラスミドｐＩＦ５５−Ｆ６α２に交雑
された３つの末端誤対合を有するオリゴヌクレオチドが
フィルターからｐＩＦ５５α２ＤＮＡに交雑されたオリ
ゴヌクレオチドよシもはるかに多食洗浄された温度であ
る。

交雑されたオリゴヌクレオチドタンｚＪ？りヌク合体は
、次のようにして可視化された。フィルターを、２チＢ
ＳＡおよび０．１％トライトン（Ｔｒ％ｔｏｎ）−Ｘ−
１００を含有するＰＨ８中で３７℃で３０分間、次イテ
ＰＢｓ　（０，１％　）　５　イトン２０）１０１１１
７中で３７℃で３０分間ソーキングした。次いで、フィ
ルターを室温で５分間３回およびそれぞれ次の各溶液中
で２回洗浄した： 溶液１　：　　　０．５　Ｍ　　　ＮａＣｊｌｏｍＭ　
　　　燐酸ナトリウム（ｐｉ（６，５）０、１９６　　
　　ＢＳＡ ０．０５チ　　　ツイーン２０ 溶液２　：　　　２　Ｘ　５Ｓｃ Ｑ、　ｌ　％　ｗ／ｖ　　Ｂ　８Ａ ０．０５％　　　ツイーン２０ ジアミノペンジデン５■を１０ｍＭ）リス（ｐＨ７，５
）１０ｄに溶かしてＨＲＰ基質を製造した。

ｌ　Ｔｏ　ＣｏＣｌ２２００　μｔの溶液を加え、良く
混合シ、混合物を氷上で暗所に１０分間放置した。引き
続きこの１０分間インキュベージ、ンに続いて３０　％
　Ｈ２Ｏ２１５μノを加えた。最後に、フィルターを基
質混合物に入れて、交雑されたオリゴヌクレオチドタン
・ぐりヌク合体を暗褐色析出物として可視的局在化する
。ｐＩＦ５５α２ＤＮＡ最小３００ｒｇに相当する交雑
信号が検出されたが、オリゴヌクレオチドの一端におけ
る３つの塩基紙が相応する配列に対して非相対的である
ＰＩＦ５５−Ｆ６α２ＤＮＡの固定”ドツト”からの信
号は存在しなかった。この識別がオリゴヌクレオチド試
料に対し相同のヌクレオチド配列における交代を識別す
る試験に対する基礎を形成する。

アビジンとビオチニル化ＨＲＰの複合体を用いて検出さ
れたハイブリッドの分析は、こうして形成したオリゴヌ
クレオチド配列ノ９りヌク合体がビオチニル化Ｉ（ＲＰ
　３　Ｑ分子までおよびアビジン１０分子までを含有し
、約１８８００００ダルトンの最大全分子量を与えるこ
とを示す。例示したようなオリゴ９ヌクレオチド試料に
被結合したタンパク質の非常に大きい質量は、オリゴ３
ヌクレオチドタンパク質複合体の交雑選択性を妨げない
。

例２ 例１に記載した方法に従うが、ただしビオチニル化オリ
ゴヌクレオチドを交雑のためアビジン単独と結合した。

このアビジン結合は、ペクタスティン試薬Ｂ　（ＨＲＰ
　）の添加を省略した点を除き、例１に記載したように
実施した。交雑および相同性ハイブリッドからの誤対合
を識別するための温度での洗浄に続き、フィルターをＰ
Ｈ１（２＊　ＢＳＡ、　　０．１　％ドライドｙＸ−１
００）中で、例１に記載したように３７℃で３０分間、
次いでペクタスティン試薬８２滴を含有するｐｕｓ（０
，１％ツイーｙ２０）１０ＩＩＬｌ中で３７℃で３０分
ソーキングした。次の洗浄およびＨＲＰ可視化は、例１
に記載したように実施した。結果は、ｐＩＦ５５α２Ｄ
ＮＡだけに相当する交雑信号を有し例１で得られたもの
と同様であった。

例１および例２の試料の誤対合識別力を次の比較例Ａに
よって強調する： 例Ａ 例２に記載した方法を繰返したが、ただし交雑のため直
接にビオチニル化オリゴヌクレオチドを使用し、交雑前
のペクタスティン試薬の添加を省略した。交雑後、ベク
タスティン試薬Ａ２　Ｗｉｔ　ｐｓＢｌｏ、１％　レイ
−：ｙ　２０．１０ｍ１に加え、次いで例２に記載した
ようにベクタスティン試薬Ｂの添加を行なった。このベ
クタスティン試薬Ａと試薬Ｂの混合物を使用前に室温で
過間抜インキュベートし、アビジン（試薬人）とビオチ
ニル化ＨＲＰ　（試薬Ｂ）との間で橋かけ結合を形成さ
せた。ｐＩＦα２ＤＮＡ　３０　ｎｇに相当するハイブ
リッド検出限界はＮ　　ｐＩＦ　５５−　Ｆ６ＤＮＡ　
１μｙと比較して得られた。

例３ ピオチン１分子を、次の方法により（１υのヌクレオチ
ド配列を有する１５塩基長のオリゴヌクレオチドα２２
５に結合した： ｄ［Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ
−Ｃ−Ａ−Ｇコ　　（１１）製法１ 例１の製法１に記載したと同様の方法を使用するが、２
−ヒドロキシグロピオニ）ｌＪｙｌｃ代えオクタン−１
，８−ジオールを用いて、粗製ビｙｌ−ｆニル２−クロ
ルフェニル８−ヒドロキシオクチルホスフェートを得た
。粗製混合物をＥｔＯＡｅ　（１００ｒａｌ　）で泥状
にし、濾過しテ過剰のオクタン−１，８−ジオールを除
去した。ＥｔＯＡｅ抽出物を蒸発させ、残留物を再びＥ
ｔＯＡｃ　（１００１ｎｌ）で泥状ＫＬ、濾過した。溶
剤を除去した後、残留物を溶離剤としてＥｔＯＡｃ　：
　ＥｔＯＨ（４：　ｌ　ｖ／ｖ　）を使用するフラッシ
ュシリカゲルクロマトグラフィー（メルクシリカｆ／Ｌ
／６０ＡＲＴ　９３８５）Ｋより精製した。こうして、
適当な画分から溶剤を除去した後、ビオチニル２−クロ
ルフェニル８−ヒドロキシオクチルホスフェート■カ４
１チの全収率で得られた（分子イオン：Ｍ”５４９）：
製法２ 例１の製法１に記載したと同様の方法を使用するが、ピ
オチノールに代えて♂オチニル２−クロルフェニル８−
ヒドロキシオクチルホスフェ−）（０，６１１）を用い
て、化合物（８）の粗製試料を得た。

これを、製法１に記載したようなフラッシュクロマトグ
ラフィーによシ精製して、化合物の）を無色の油状物（
３００１ｎ９）として得た（分子イオン：　（Ｍ＋Ｈ）
”７９２　）。

製法３ ピリジン（３ゴ）およびトリエチルアミン（２ｄ）中の
化合物（８）　（２８０■）の溶液を、２０℃で６時間
放置し、次いで蒸発させた。油状残留物をエーテル（５
Ｘ２０ｍ）で抽出し、残留物を減圧下で無水ピリノンを
用いる共沸蒸留によって乾燥して化合物（９）のトリエ
チルアンモニウム塩を得た。

製法養 例１の製法３に記載した方法を、α２−５５に代えてオ
リゴデオキシリ−ヌクレオチド配列α２−２６〔工、ゾ
等“ヌクレイ、クアシッズリサーチ″、１９８３年、第
１１巻、第６４１９頁〜第６４３５頁）を用い、ビオチ
ニル２−クロルフェニルホスフェートのトリエチルアン
モニウム塩に代えて化合物（９）のトリエチルアンモニ
ウム塩を用いて繰返し、ビオチニル化オリビデオキシリ
？ヌクレオチド配列（１０）を得た。

分析用グラスミドは、オリゴヌクレオチドの配列（１１
） ｄ　［Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−
Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ　］　（ｌｌ）に相同のインターフェロ
ンα２遺伝子ヌクレオチド配列３’　ＣＴＴＴＡＣＴＡ
ＡＧＴＴＧＴＣ５’（エツジ等、“ヌクレイックアシッ
ズリサーチ”、１９８３年、第１１巻、第６４１９頁〜
第６４３５頁〕またはアングラインした残基によって相
違する配列３’　ＣＴＴＧＡＣＴＡＡＧＴＴＧＴＣ５’
を有する誘導体を含有していた。この後者のプラスミド
は次のようＫして得られた： 遺伝子を、合成オリゴヌクレオチドから、大体において
エツジ等（１ヌクレイツクアシツズリサーチ”、１９８
３年、第１１巻、第６４１９頁〜第６４３５頁）によシ
インターフェロンα２遺伝子の合成につき記載されたよ
うにして、ただしオリゴヌクレオチド１　、２　、２４
および２５をそれぞれｌ　Ｔａｑ　、　２　Ｔａｑ　１
２４−　Ｉ　４および２５−Ｉ４に代えて製造した。

ｌ　Ｔａｑ　５’　ＣＧＡＣＧＡＴＧＴＧＴＧＡＴ２　
Ｔａｑ　５’　ＣＧＧＣＡＧＡＴＣＡＣＡＣ＾ＴＣＧＴ
２４−Ｉ４５’　　人ＴＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＡＧＴ２
５−　Ｉ４５’　ＧＡＡＣＴＧＡＴＴＣＡＡＣＡＧ茨い
で、合成遺伝子を例ＩＫ記載した方法によシフローン化
した。オリゴヌクレオチド２５−！養を含有するプラス
ミドを、以下ｐＩＦ２５−Ｉ４α２と呼称する。

プラスミドを例１に記載したように“ドツト−プロット
”した。

アビシン・アルカリホスファターゼ（ＡＰ　）複合体を
、ビオチニル化ヌクレオチドに次のようＫして結合した
。

ＡＰ・アビジンＤ複合体（ベクターラデラトリーズ）を
水を用いて１ｒｌＬｌあたシ酵素２００００単位に再構
成した。この溶液を１０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳｌｏ、１５
Ｍ　ＮａＣ２（ｐＨ７，５）で５倍に希釈し、この混合
物ｌ　ａｔをビオチニル化オリゴヌクレオチドα２−２
５（ｕ）２μｇとともに室温で３０分間インキュベート
した。次いで、溶液を、あらかじめ５　ｘ　ｓｓｃで平
衡化したアガロース・アビジンカラム（シグマ社）０．
５１１１ｔ／に通過させた。カラムを５×Ｓａｃ　２　
ｍｌで洗浄し、ためた溶離液を、アガａ　−ス・アビジ
ンクロマトグラフィーの２以上のサイクルにかけた。ｔ
ＲＮＡを最終溶離液に加えて２５０μ９／ｒｘｌの濃度
にし、この溶液を交雑に使用した。フィルター製造およ
び交雑は例１に記載したように実施した。交雑後、フィ
ルターをａ　ｘ　ｓｓｃ、　ｏ、ｏ　ｅチ燐酸ナトリウ
ムおよび２０城燐酸す）　１７ウム（ＰＨ７・）を含有
する混合物中で２回、室温で５分間および１回４０℃で
３分間洗浄した。次いでフィルターを０．１Ｍ）リス・
ｕｃＬ（ｐＨ７，５）、０．１　Ｍ　ＮａＣｔ、　２　
ｍＭ　ＭｇＣｌ２および０．０５％トライトンＸ−１０
０中で５分間３回洗浄した。最後に、フィルターを、０
．１Ｍ）リス（＋Ｉ９．５）、０．１　Ｍ　ＮａＣ２，
５ｍＭ　ＭｇＣｌ２中で５分間２回洗浄した。交雑した
ビオチニル化オリゴヌクレオチド・ＡＰ複合体の可視化
のため、フィルターをレアリイ（Ｌｅａｒｙ　）等〔“
プロシーデングスオプデナショナルアカデミーオプサイ
エンセスエナイテッドステーツオプアメリカ（Ｐｒｏｃ
、ＮａｔｌａＡｃａｄ＊　Ｓａｌ、ＵＳＡ　）”、１９
８３年、第８０巻、第４０４６１頁〕に記載されたよう
にして製造したＡＰ基質混合物中でインキユベートした
。得られる、交雑し九オリコ０ヌクレオチド・ＡＰ複合
体に局在化された青色析出物は、ｐＩＦ２５−Ｉ牛α２
に比べて固定化ｐＩＦ２５α２ＤＮＡに対して著しく強
力であった。この識別が、オリゴヌクレオチド試料に対
し相同のヌクレオチド配列における１つ以上の交代を有
するＤＮＡ配列を検出するための試験の基礎を形成する
。

飼養 例３に記載した方法を、繰返したが、ただしビオチニル
化オリゴヌクレオチＰを例２に記載した方法と同様に、
交雑のためアビジン単独と結合した。交雑および相同ノ
・イゾリッドからの誤対合を識別するための温度におけ
る洗浄に続き、フィルターを洗浄緩衝液１（０，１Ｍ）
リスＨＣＬ　（Ｐ［（７−５）　、０．　ｌ　Ｍ　Ｎａ
ＣＬ１２　ｒｎｈ／ｉ　Ｍｇｃｔ２および０．０５％　
）　ライ）ｙＸ−１００）中の３％ＢＳＡ中で３７℃で
２０分間洗浄した。引き続き、ビオチニル化ＡＰを、ビ
オチニル化ＡＰポリマー〔ベセスダリサーチラゴラトリ
ーズ（ＢｅｔｈｓａｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ　：　ＢＲＬ　）　〕としてまたはビオ
チニル化ＡＰ（ベクターラデラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｔｅ＠）　）として洗浄緩衝液１
中１μν寥の濃度で加えた。１０分後、フィルターを、
例３に記載したようにＡＰ基質混合物中でのインキュベ
ーションに先立ち、室温で洗浄緩衝液１中で２分間、２
回、次いで洗浄緩衝液２（０，ＩＭ）リス（ｐＨ９，５
）、０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣＬ１２　ｒｒＭＭｇｃＬ２）
中で２回洗浄した。得られる可視化結果物は、例３のも
のと比較可能であった。

例３および例４の試料の単−誤対合識別力は、次の比較
例Ｂによって強調される。

例Ｂ 飼養に記載した方法を繰返したが、ただしビオチニル化
オリゴヌクレオチドを、ストレプトアビジンの添加に先
立って交雑した。交雑および相同ハイブリッドからの誤
対合を識別するための温度における洗浄に引き続き、飼
養におけるように洗浄し、ストレプトアビジン（ペセス
ダリザーテラ？２トリーズ）中で洗浄緩衝液中２μｍ１
／Ｉｌｌの濃度で室温で１０分間インキュベートした。

ストレプトアビジンでのインキュページ、ンに引き続き
、フィルターを、飼養に記載したように、ビオチニル化
ＡＰポリマー（ＢＲＬ）の添加に先立ち、洗浄緩衝液１
中で２分間３回洗浄した。引き続く洗浄およびＡＰの検
出は、例養に記載したようにして実施した。得られる可
視化結果物は、例３および飼養のものと比較可能であっ
た。

例５ 例〕、の製法５に記載した方法を、ビオチニル化２−ク
ロルフェニル−ホスフェートのトリエチルアンモニウム
塩の代りに（９）のトリエチルアンモニウム塩を使用し
て繰返して、ビオチニル化オリゴデオキシヌクレオチド
配列（１２）を得た。

例１に記載した交雑法を、試料としてビオチニル化オリ
ゴデオキシリ？ヌクレオチド配列（１２）を使用して繰
返したが、ただし標準インターフェロンα２遺伝子源と
してシラスミドｐＩＦ８１１０１　（エツジ等“ヌクレ
イツクアシ、ズリサーチ”、第１１巻（１９８３年）第
６４１９頁〕を使用した。例１に観察されたように、ｐ
ＩＦｓ１１０１ＤＮＡ３００　ｎｇに相当する交雑信号
が得られたが、突然変異体ｐＩＦ　５５−Ｆ６α２プラ
スミドＤＮＡ　ｉμｇからの信号は存在しなかった。

例６ 例２に記載した方法を、プラスミドｐＩＦｓ１１０１お
よびｐＩＦ　５５−Ｆ’６α２に交雑するためアビジン
単独と結合したビオチニル化オリゴデオキシリメヌクレ
オチド配列（１２）を使用して繰返した。

この実験において、ｐＩＦ５５−Ｆ６ＤＮＡ　１μ９か
らの信号ノ不存在で、ｐＩＦｓｌｌｏｌ　ＤＮＡ　１　
ｐｆｉ　力検出可能であった。

例５および例６の試料の誤対合識別力は、次の比較例Ｃ
によって強調される： 例Ｃ 例Ａに記載した方法を、シラスミドｐＩＦｓ１１０１お
よびｐＩＦ５５Ｊ’６α２への交雑のためビオチニル化
オリがデオキシリがヌクレオチド配列（１２）　を使用
して繰返したが、交雑はストレプトアビジンの添加に先
立って行なう。この方法によりて、ｐＩＦ５５−Ｆ６α
２ＤＮＡ　３００　ｎＩ　Ｏ最小量と比較して、ＰＩＦ
８１１０１ＤＮＡ　３　ｎ、ｊｉｌの最小量が検出され
た。

例７ 例１の製法３に記載した方法を、α２−５５のオリゴデ
オキシリボヌクレオチド配列（０の代シにα２−２５の
オリがデオキシリ？ヌクレオチド配列（１１）　（エツ
ジ等、“ヌクレイックアシッズリサーチ’（１９８３年
）、第１１巻、第６４１９頁〜第６４３５頁〕を使用し
て繰返し、ビオチニル化オリ♂デオキシリゲヌクレオチ
ド配列（１３）を得た。

例３に記載した交雑法を、試料としてビオチニル化オリ
ゴデオキシヌクレオチド配列（１３）を使用して繰返し
た。第１図に示したように、固定化ｐＩＦ−２５α２Ｄ
ＮＡに対する交雑信号が観察された（Ｂ列、３および１
μｇ１左から右へ）が、突然変異ｐＩＦ２５−Ｉ養α２
プラスミドＤＮＡ　（Ａ列、３および１μｇ）からの信
号は存在しなかった。

例８ アルカリホスファターゼ１分子を、次の方法によ＃）（
６）のヌクレオチド配列を有する１５塩基長のオリゴヌ
クレオチドα２−５５に共有結合した：製法１ クロルＮ、Ｎ−ジイソグロピルアミノメトキシホスフィ
ンを、Ｓ−トリチル−６−メルカデトヘキサノール（２
，０，１およびＮ−エチルイソグロビルアミン（４，２
９）の溶液に０℃で徐々ラム溶液（１００８１／）で抽
出し、次いで塩水（１００１１Ｌｉ！りで抽出した。酢
酸エチル抽出物を乾ｆｉｊ、（ＭｇＳＯ４）、４．０１
ｄＫ濃ＭＬ、シリカｙル、ＩＦＦ　、Ｆ　ム（キーセル
ケル（Ｋｉｓｓ＊１ｇｅｌ）　６０．１２５αＸ　５．
Ｑ　ｃｍ　）に適用し、石油エーテル（沸点４０〜６０
℃）ニトリエチルアミン（９：　ｌ　Ｖマ）を使用して
分別した。合した適当な両分から溶剤の蒸発後、Ｎ、Ｎ
−ジイソゾロピルアミノメトキクＳ−トリチル−６−メ
ルカデトヘキソキシホスフイン（１４）が得られた。

製法２ 完全に保護されたオリゴデオキシリボヌクレオチド配列
α２−５５を、フラクトクルに３’−ＯＨを介して結合
された５′−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル
−２′−デオキシグアノシンとスクシュルグリシルアミ
ノデロビルスペ−？　−（ＢＤＨケミカル社）、または
５′−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ペンゾイルー２′−
デオキシアデノシン、５′−ジメトキシトリチル−Ｎ４
−ベンゾイル−２１−デオキシシチジン、６′−ジメト
キシトリチル−Ｎ−インブチリル−２１−デオキシグア
ノシンおよび５′−ジメトキシトリチルチミジン（ＢＤ
Ｈケミカル社）からアゾライドバイオシステム（Ａｐｐ
Ｈ＊ｄ　Ｂｔｏｓｙｓｔｅｍｓ　）　３８０ＡＤＮＡシ
ンセサイザー（５ｙｎｔｈ＠ｇｉｍａｒ　）で製造した
。または、完全に保護されたオリゴ９デオキシリ？ヌク
レオチド配列は、アトキンソン（Ａｔｋｉｎｓｏｎ　）
および（Ｏ１ｉｇｏｎｕｃｌ＠ｏｔｉｄ＠５ｙｎｅｈｅ
ｓｌｓ　＋　＆　ＰｒａｃｔｌｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ
　’　（１”イト編集、ＩＲＬ７’レス、オックスフォ
ード、ワシントンＤＣ，第３５頁〜第８１頁）に記載さ
れたマニュアルな方法によって製Ｎ、Ｎ’−ジイソグロ
ピルアミノメトキシ５−トリチル−６−メルカゾトヘキ
ンキシホスフイン（５３，７ダ）を、無水アセトニトリ
ル（３×１ｍｌ　）を用いる共沸蒸留によυ乾燥し、次
に１．２−ジクロルエタン：アセトニトリル（３：　２
　ｖ／ｖ）の無水混合物（１，δｍｌ）に溶かした。こ
の溶液を、普通のヌクレオシドホスホルアミシトの代り
に、アプライトノ々イ、オシステム３３　Ｑ　Ａ　ＤＮ
Ａシンセサイデーでの標準カッグリフグ反応において使
用し、上記の完全に保護されたオリカブオキシリがヌク
レオチド配列α２−５５に加えた。

方法は、簡単には次のものからなる二０１，２−ジクロ
ルエタン中の３チドリクロル酢酸を用いるジメトキシト
リチル基の除去；■テトラゾール活性化後のＮ、Ｎ−ジ
インプロピルアミノメトキシ８−）ジチル−６−メルカ
ゾトヘキソキシホスフイン（溶剤０．１５１１Ｚ中ａ、
ｓ７ｍｐ）のカッブリング；■中間体ホスファイトのホ
スフェートへのヨウ素酸化；（４）無水酢酸を用いるキ
ャッピング（（ｌａｐＰｉｒｔｇ　）フラクトシル支持
体からのオリゴ９ヌクレオチド配列の部分的保護基脱離
お自 よび開裂は、ＤＮＡシンセサイデーで７動的に行なわれ
た。次いで、ホスフェート保護基を、チオフェルレート
での処理、次いで水酸化アンモニウム（比重０．８８）
を用いる処理によシ除去したが、後者はまた支持体から
オリゴ０デオキシリゲヌクレオチド配列を分離する。水
酸化アンモニウム溶液を５５℃で６時間加熱し、次いで
蒸発し、残留物をエタノール／水（３：７マ／マ１、５
　＃！／　’）に溶かした。トリチル保護された配列は
、最初に例１の方法３に記載されたよりなノ４ルチジル
（Ｐａｒｔｉａｉｌ　）　Ｉ　Ｏ−８ＡＸイオン交換樹
脂でのＨＰＬＣによシ精製した。次の精製は、ニュート
ン（Ｃ，Ｒ，Ｎ＠ｖｔｔｏｎ　）等〔“アナライティカ
ルバイオケミストリイ（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ＠ｍ、　
）’　ｅ１９８３年、第１２９巻、第２２頁〜第３０頁
〕により記載されたようなＣ１８μゲンダパツク（Ｂｏ
ｎｄａｐａｋ　）カラムでの逆相ＨＰＬＣを用いて達成
されたが、ただし０．１Ｍ酢酸アンモニウム中のアセト
ニトリル５％−１２チの勾配は０．１Ｍ酢酸アンモニウ
ム中のアセトニトリル５％から４０分にわたり　０．１
　Ｍ酢酸アンモニウム中のアセトニトリル５０チの勾配
に代えた。

製法３ 化合物（１５）　（４０ｐｍｏｌ　）を、製造業者によ
シ指示されたように３′−エンドラベリングキット（３
’　−ｅｎｄ　ｌａｂｅｌｌｌｎｇ　ｋｌｔ　）　［ア
マーデムインターナシロナル社（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉ
ｎｔ＠ｒｎａｔｉｏｎａｌＰＬＣ）を使用して２’、３
’−ジデオキシアデノシン−５’−［α−３２Ｐ］　）
リホスフェートにより、ただしこの場合２’、３’−ジ
デオキシアデノシン−５′−トリホスフェートと［α−
３２Ｐ］誘導体の混合物（４：１）を使用して　Ｐ標識
付けした。この標識付けしたオリコ９デオキシリ？ヌク
レオチドを、製造業者により指示されたようにＮＥＷＳ
ＯＲＢ２０カートリッジ（デュポン／　ＮＥＮリサーチ
ゾロダクツ）で精製した。

水（１，２５１ｄ）中の硝酸銀（６１ｎｍｏｌ　）を、
水中の（１５）　（１，５ｎｍｏｌ　）および水（２４
６μｌ）中の３′−エンド標識化合物（１５）　（０，
０１ｎｍｏｌ　）の溶液に加えた。２０℃で３０分後、
水中のジチオトレイトール（６３ｎｍｏｌ）の溶液を加
えた。

さらに２０℃で３０分後、混合物をミレックス（Ｍｉｌ
ｌ＊ｘ）−Ｇ　Ｓフィルタユニット（０，２２μｍ）　
　　　　□を通してｒ過し、容積２５０μノに蒸発させ
て化金物（１６）　（１，５ｎｍｏｌ　）および　ｐ３
’　−ｚ　７ド標識誘導体（０，０１ｎｍｏｌ　）の溶
液を得た。

製法舎 ・ジメチルホルムアミド（ＤＭＦＸ　５．ｏ　ｐｉ　）
中のｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル（ＭＢＳ）　（０，１２ｖｕｉ　）の
溶液を、０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液ｐＨ７，０（０，７４
）中の子牛の腸アルカリホスファターゼ（ペーリンガー
マンハイム５６７７５２）（３，０ｉｎ？）の溶液に加
えた。混合物を２０℃で３０分間攪拌し、次いで０．１
Ｍ燐酸塩緩衝液ｐＨ５，６で平衡化した一１＝７７デ、
クス（Ｓ＠ｐｈａｄｅｘ）Ｇ　−２５カラム（５Ｘ１．
５ｃ１ｎ）に適用し、ヰ℃で同じ緩衝液を用いて溶離し
た。両分を集め、２８０ｎｍでＵＶ吸光を検査して化合
物（１７）を得た。

製法５ 痕跡量の　Ｐ３′−エンド標識誘導体（製法３から）を
含有する（１６）　（２５０μｌ）の溶液を、誘導され
たアルカリホスファターゼ（１７）　（製法生から）の
溶液に加えた。２０℃で１時間後に溶液を、セフアデッ
クス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）　Ｇ　−５０カラム（２６
閏Ｘ　１．　Ｏａｎ　）　（ｏ、　１　Ｍ燐酸塩緩衝液
；ｐＨ５，６で平衡化）に適用し、０．９　ｍｌ／ｍｌ
　ｎで同じ緩衝液を用いて溶離した。両分（ｌ　ｍｌ　
）を集め、シンチレーション計数および２８０　ｎｍに
おけるＵＶ吸光によシ検査した。こうして、アルカリホ
スファターゼ（２８０ｎｍにＵＶ吸光）および５２ｐ放
射性標識の双方を含有する両分は、α２−５５オリゴヌ
クレオチド・アルカリホスファターゼ複合体（１８）を
含有する。

（坊）　　　　　　　　　　　　　　　０ＨＡ−Ａ−Ａ
−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ］ｐＨ５，６の
０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液０．８８ｄ中のα２−５
５オリゴヌクレオチドアルカリホスファターゼ複合体（
１８）　４５　ｐｍｏ　１を、次のように同じ緩衝液中
０．２５１ｄに濃縮した：　ＢＳＡ　（画分Ｖ　ｒ　Ｍ
ｌｌｅｓ　）を１μｇ／ＩＲＩに加え、２つの等しい少
量の試料をセントリコン遠心微量濃縮器（Ｃｅｎｔｒｉ
ｃｏｎ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ｍ１ａｒｏｅｏｎｅ
＠ｎｔｒａｔｏｒ：アミコン社（Ａｍ１ａｏｎ　Ｌｔｄ
、　ｅスト−７ハウス英国）〕に負荷した。試料は、装
置をソルパｋ　（Ｓｏｒｖａｌｌ　）８８３４中で１０
０ＯＧで３０分回転することにょυ濃縮した。

例１に記載したように、著しく希釈したｐＩＦ５５ａ２
’ｔ　ｆｃｔｄ　ＰＩＦ５５−Ｆ１ａ、グラ、ｘ、ミド
（Ｄ試料を、ニトロセルロース上へ１ドツト−プロット
”した。前交雑も例１に記載したごとくであった。

交雑溶液は、緩衝液２．５０μｊ中の５　ｘ　５ｓｃ（
ｔＲＮＡ　２５０μＶゴ含有）２ｄ１　オリゴヌクレオ
チドアルカリホスファターゼ複合体（１８）　４５ｐｍ
ｏｌを含有していた。

室温で一夜の交雑に続き、フィルターを′２回、５　ｘ
　Ｓａｃ、　０．０６　％ピロ燐酸ナトリウムおよび２
０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ７，０）を含有する混合物
中で室温で５分間洗浄した。次いで、フィルターをさら
に、上述した緩衝液中で３９℃で２分間洗浄し、３つの
末端誤対合を有するインターフェロンα２遺伝子配列に
交雑されたオリゴ９ヌクレオチド複合体をフィルターか
ら、インターフェロンα２遺伝子での完全なハイブリッ
ドが形成するよりもはるかに大きく洗浄した。さらにフ
ィルターを３回、０．１　Ｍ　）リス・ＨＣｌ　（ｐＨ
７，５）、Ｏ，ｌ　Ｍ　ＮｈＣＬ　、　２種Ｍ　ＮａＣ
ｔ２および０．０５チトライトンＸ−１００中で５分間
洗浄した。最後に、フィルターを２回、Ｏ，１Ｍトリス
（）Ｊ（９，５）、０．１　Ｍ　ＮａＣｔ、　５　ｍＭ
　ＮａＣｔ２中で５分間洗浄し、引き続き例３に記載し
たようなＡＰ基質混合物とともに保温した。第２図はこ
の実験の結果を示し、固定ｐＩＦ５５α２ｆラスミドＤ
ＮＡ（Ａ列）およびインターフェロンα２遺伝子からの
３つの塩基組偶奇を有するｐＩＦ　５５−Ｐ６α２誘導
７’ラスミ）’ＤＮＡ（例１参ｆｉ）（Ｄ列）０３００
ｎ９と３０　ｎ９０間（左から右へ）におけるオリゴヌ
クレオチド・アルカリホスファターゼ複合体による識別
を指示する。ｐＩＦ５５α２プラスミドＤＮＡ　（Ｃ列
）およびその誘導ｐＩＦ５５Ｆ６α２（Ｄ列）は、オリ
ゴヌクレオチド複合体なしであるが、上述したような交
雑緩衝液２　ｍｌ中に含有されているアルカリホスファ
ターゼ（ペーリンガー社、コード番号５６７’７５２　
）１４℃ｍｏｌを用いて偽交雑（ｍｏｃｋ　ｈｙｂｒｉ
ｄｉｓｅｄ　）　した。Ｃ列およびＤ列における固定Ｄ
ＮＡと関連した明らかな信号は認められず、こうしてア
ルカリホスファターゼの直接結合によるアーチファク）
　（ａｒｔｅｆａｃｔｓ）は除外された。

例Ｑ １分子のアルカリホスファターゼを、例８の製法２．３
．４および５に記載した、次の変更を有する方法により
　（２Ｄ）のヌクレオチド配列を有する１５塩基長の ｄ［Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ
−Ｔ−Ｇ−Ｃ］　（２０）オリがデオキシリゲヌクレオ
チドα２−５５Ｆ６に共有結合した： １）製法２ 完全に保護された、ヌクレオチド配列を有するオリがデ
オキシリＩヌクレオチドα２５δＦ　６　（２））を、
制御された多孔ガラス〔孔径５００Ｘ：粒径１２５〜１
７４ミクロン；負荷２０〜５０１’ｍｏ１７”ｌｌ　ｓ
クララシャンケミカル社（ＣｒｕａｃｈａｎＣｈｅｍｉ
ｃａｌ　Ｃｏ、　Ｌｔｄ　）製品〕に結合した５′−ジ
メトキシトリチル−Ｎ４−ベンゾイル−２′−デオキシ
シチジンから、アゲ２イドバイオシステム３８０　Ａ　
ＤＮＡシンセサイデーで製造した。制御された多孔ガラ
スに結合した、部分的に保、護基を脱離したオリゴデオ
キシリ？ヌクレオチドに、テトラゾール活性化ホスフィ
ンの２つの付加反応（それぞれ１００秒）によりで結合
した（工程２）。キャッビング工程（工程４）は省略し
た。支持体から開裂した後、オリコ９デオキシリ？ヌク
レオチドを含有する水酸化アンモニウム溶液を５０℃で
４時間加熱した。

２）　　Ｍ法３ 硝酸銀およびジチオスレイトールの量を、それぞれ１２
０　ｎｍｏＬおよび１２２　ｎｍｏｔに増加した。

３）製法養 ＭＢＳの量を、ＤＭＦ　（３，４ａｌ　）中０．０８ｍ
９１Ｃ減少し、アルカリホスファターゼを０．０５Ｍｍ
Ｗ＆塩緩衝液（ｐＨ７，５：　０．２３ｍ／　）中２．
０１ｎ９に減少した。

４）製法５ 反応を３７℃で１時間実施し、カラムを−５、Ｏの０．
１Ｍ燐・酸塩緩衝液で平衡化した。

この方法を用いて、α２−５５Ｆ、オリゴヌクレオチド
・アルカリホスファターゼ複合体（１９）が得られた。

α２−５５Ｆ６オリゴヌクレオチド・アルカリホスファ
ターゼ複合体を直接に交雑して１周知ｐＩＦ５５α２ま
たはｐＩＦ５５−Ｆ６α２ＤＮＡの希釈物を得た。前交
雑、交雑および洗浄の条件は例８に記載し友ごとくであ
るが、ただし交雑は、Ｏ，１Ｍ燐酸ナトリｆｙ　Ａ　（
ｐＨ５，０）　０．９１ｍ中Ｏα２−５５Ｆ６　オリｆ
ヌクレオチド・ＡＰ複合体（１９）　１２０　ｐｍｏｌ
　ｆ含有する緩衝液ＩＱｄ中で実施した。第３図はこの
実験の結果を示し、同様にｐＩＦ５５α２（Ａ列）およ
びｐｌＦ５５−Ｆ６α２（Ｂ列）の３００ｎｇと３０ｎ
ｇの間（左から右へ）のオリゴヌクレオチド・ＡＰ複合
体による識別を指示し、試料によシ生じる信号の強さは
相同プラスミドｐＩＦ５５−Ｆ６α２に関してはより強
い。

例１０ 例９に記載された方法を、オリゴ０デオキシリゴヌクレ
オテド配列（２０）に代えオリゴデオキシリがヌクレオ
チド配列（１１）　を用いて繰返した。

例９の製法２におけるオリがデオキシヌクレオチドを、
制御された多孔ガラスに結合した５′−ジメトキシトリ
チル−Ｎ２−インブチリル−２′−デオキシグアノシン
から製造した。製法３は、例８の製法３に記載したよう
にして実施し次。

例８に記載し念ようにｐｌＦ２５α２またはｐ　Ｉ　Ｆ
２５−Ｉ４α２ＤＮＡのいずれかの著しく希釈された材
料を、ニトロセルロースフィルター上へ固定した。

このフィルターを次いで例９に記載し念ように前交雑し
、交雑し、洗浄したが、ただしこの場合交雑はＯ，１Ｍ
燐酸ナトリウム（ＰＨ５，６）１ゴ中のα２−２５オリ
ゴヌクレオチド−ＡＰ複合体（２１）１７０　ｐｍｏｌ
を含有する緩衝ｇ１０ｍｌ中で実施した。

−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ］第Φ
図は、この実験の結果を示し、オリゴヌクレオチド試料
に対し単一塩基非相対性を有するグラスミドｐＩＦ２５
−１４α２（Ｂ列）　３００　ｎｌ　。

３０　ｎｊ’および３　ｎＩＩよシも、相同グラスミド
ｐＩＦ２５α２（Ａ列）３００ｎＪＪ、３０ｎ１ｉおよ
び３ｎ、９（左から右へ）に対する試料のはるかく強い
交雑を指示する。

例１１ 例８に記載した方法を繰返したが、ただしこの場合交雑
は緩（ｌｉ液（０，０２５Ｓ　ＢＳＡ　、５ＸＳＳＣお
よびｔＲＮＡ２５０μＩ／／ｄ　、全量４ｄ中）０．４
ｄ中のα２−５５オリゴヌクレオチド・アルカリホスフ
ァターゼ複合体（１８）　４５　ｐｍｏｌを含有してい
た。

交雑後、フィルターを例９におけ委、ように洗浄し九が
、友だしＯ，１Ｍ）リス（ＰＨ９，５）、０．１Ｍ　Ｎ
ａＣＬおよび５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２中での最後の８分間
洗浄をアムパック酵素拡大キッ）　（Ａｍｐａｋ＠ｎｚ
ｙｍ＠ａｍｐ１％ｆｉａａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；　ＩＱ（
Ｂｌｏ）　Ｌｔｄ、、ケンプリッゾ、英国）からの洗浄
液（作業濃度）中で室温での５分間洗浄に代え７’Ｃ，
０，１Ｍ）リス（ｐＨ９，５）　、０．Ｉ　ＭＮ＆Ｃｔ
および５　ｒｒＪ／ｉ　Ｍ１ｇＣＬ２中で室温でのさら
に５分間の洗浄に、アムパック洗浄緩衝液＜ｍｙｘ液）
中でそれぞれ５分の連続する５つの室温洗浄を続は友。

前後に、個々の固定ＤＮＡ試料をフィルターから切り離
し、微量滴定皿の個々の凹み（２４の凹み、ファルコン
３０４７　’）に入れた。それぞれの試料に、再構成し
几アムノ４ツク基質混合物を加え、室温で２０分インキ
為ベートした。再構成したアムノぐツクアンブリファイ
ヤー混合物２００μｌを加え、溶液を遅い発色のため１
０分間放置し、医いで凹み１つＫつき５μノの停止液を
加えた。次いで、４９５　ｎｍにおける吸光を読取った
。篩導体シラスミドｐＩＦ５５−Ｆ６α２ＤＮＡに比べ
てｐ　Ｉ　Ｆ５５α２プラスミドＤＮＡに交雑されたオ
リゴヌクレオチド複合体の吸光に明瞭な増加が存在した
。たとえば、　ｐＩＦ５５α２　ＤＮＡ　３０　ｎｊ’
は、パックグラウンドの約０．７単位上のＯＤＡ　９５
を生じるが、ｐＩＦ５５−Ｆ６α２からの信号はパック
グラウンドの著しく上ではなかった。

例１２ 例９に記載したような、オリゴヌクレオチド（α２−５
５　）・アルカリホスファターゼ複合体（１８）ヲ、ニ
トロセルロースへのスーデンプロット転写（Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｔｒａｎｓｆｓｒ　）後、！ラスミ
ドＤＮＡ　／ヒトＤＮＡへの交雑に使用した。ＤＮＡを
、ヒトのドーデイ・バーキットリンパ腫（ＤａｕｄｌＢ
ｕｒｋｉｔｔ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ　）細胞からプリン（
Ｂ１１ｎ）およびスタフオード（Ｓｔ畠ｔｔｏｒａ）　
（″′ヌクレイックアシッズリサーチ”、第３巻（１９
７６年）第２３０３頁）の方法により抽出し、ｌ　Ｏｍ
Ｍ　）リスＨＣ１（ｐＨ８）、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中に
ｌ　ｍ９　／　Ｋｌで溶かした。

このＤＮＡ′Ｍ液２００μｔに、Ｂ２０１２０μｔ。

１０Ｘコア緩衝液（Ｃｏｒｅ　Ｂｕｆｆｅｒ：ペセスダ
リサーチ２がラドリーズ（Ｂａｔｈｓｍｄａ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉ＠ｇ　）　）　４０　ａ
ＬおよびＥｃｏＲＩ　Ｃケムブリッジバイオテクノロジ
イラ・？ラトールス（Ｃａｍｂｒｌｄｇｅ　Ｂｌｏｔ＠
ｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｓｓ）　、ケム
ブリッジ英国；２０μ／μｔ］４０μｔｆ：加えた。こ
の溶液ｆ、３７℃で３時間保温し、次いでフェノール／
クロロホルム（１：１）で１回、クロロホルムで１回、
エーテルで３回抽出した。

次いでＤＮＡを、酢酸ナトリウム（０，３Ｍ）およびエ
タノール２容を加えて沈殿させた。イレット化ＤＮＡを
７ｏ％エタノール中で洗浄し、Ｈ２Ｏ２００μｔに再溶
解した。

インターフェロンα２遺伝子（ｐｒＦ、５５α２）また
はオリゴヌクレオチドα２−５５を含有するその誘導体
（ｐ　Ｉ　Ｆ５５−　Ｆ５α２）のいずれかを含有する
プラスミド１．５μｌＩを、ｐＩＦ５５α２に対し２０
単位、ｐ　ＩＦ５５−Ｆ５α２に対し４０単位をそれぞ
れ１０μｔおよび２ｏμｊの童で使用しＥｃｏＲＩで同
様に消化した。ＤＮＡを浴剤抽出し、上記のようにエタ
ノール沈殿させ、最後にＨ２Ｏｌ　５μｌに浴かした。

ドーデイ（Ｄａｕｄｉ）細胞ＤＮＡの試料１０μｙをｐ
ＩＦ５５α２ｉたはＰＩＦ’５５−Ｆｅ１２　ＤＮＡ　
３００　ｎｌおよび３Ｏｎ、！ｉ’と混合し、マニアチ
ス（Ｍａｎｌａｔｉｍ）等〔１モレキユラークローニン
グ（Ｍｏｌｅａｕｌａｒ−ＣＩｏｎｉｎｇ）”　：アー
ラゴラトリイマニ、アル（ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ
ａｎｕａｌ　）　：コールドスプリングハーー望−ラＲ
ラトリイ、１９８２年〕Ｋより記載されたように１チア
ガロースｒル中で電気泳動した。次いで、ＤＮＡをマニ
アチス等（上記参照）Ｋ記載されたように、スーデン転
写法を使用してニトロセルロースに転写した。フィルタ
ーを風乾し、真空中８０℃で２時間ベーキングした。前
交雑、交雑およびフィルター洗浄条件は例８に記載され
友ごとくである力Ｘ　％　７’２＋だし交１ａｒｄ　９
５　ｐｍｏｌα２−５５オリゴヌクレオチド・アルカＩ
Ｊ　＊　スフ　７　ｐ　−セ、５　ｘ　ＳＳＣ、２５０
ａｌ／ｍｅｔＲＮＡ　、　０．０５％ＢＳＡおよびＱ、
６ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐ１４５．６）の混合物８ｖ中
で実施した。第５図は、この分析の結果を示し、まっす
ぐにしたプラスミドｐ　Ｉ　Ｆ５５α２３００　ｎＪＦ
は過剰のヒトＤＮＡの存在（レーンｌ）ｔたけ不在（レ
ーン５）のいずれかで単一バンドとして検出でき九こと
を指示する。同じ条件下で、まっすぐＫしたｐＦ　Ｉ　
５５−　Ｆｅ１２　ＤＮＡ　３００　ｎＪｉ’は、ｒ−
ディＤＮＡの存在（レーン２）または不在（レーン６）
で検出できず、スーデン転写法に続＜　ｐＩＦ５５α２
と、ＩＦ５５−Ｆｅ１２の同じのα２５５オリゴヌクレ
オチド・ＡＰ複合体（１８）による識別を表わす。

例１３ 例１ｏに記載されたようなオリゴヌクレオチドα２２５
−ＡＰ複合体（２１）を、ニトロセルロースへのスーデ
ンプロット転写後、プラスミドＤＮＡ／ヒ）　ＤＮＡ混
合物への交雑に使用した。実験において使用したプラス
ミドＤＮＡは、例１２にｐＩＦ５５α２およびｐＩＦ２
５−Ｆｅ１２につきそれぞれ記載され次ようにして消化
したｐｒ′Ｆ５５α２および、ｌＦ２５−Ｉ４α２であ
った。ＥｃｏＲＩ消化の、プラス・ミドＤＮＡの試料を
、ＥｃｏＲＩ消化のドーデイ細胞ＤＮＡと混合し、例１
２におけるように電気泳動にかけた。前交雑、交雑、洗
浄およびオリゴヌクレオチド・ＡＰ検出条件は例１ｏに
おけるごとくであった。例１２につき観察されたように
、試料に対し相同のｐ　Ｉ　Ｆ２５α２プラスミドＤＮ
Ａの少量は、ドーデイ細胞ＤＮＡの存在または不在′で
単一バンドとして同程度に検出することかで゛きた。

これらの同じ条件下で、ドーデイ細胞ＤＮＡの存在かま
たは不在のいずれかにおいてプラスミ「ＰＩＦ２５−Ｉ
４α２に相当する信号は検出できず、スーザン転写に続
く、相同プラスミド、ｐＩＦ２５α２と、試料に対し非
補完的な単一塩基を有するプラスミドｐ　ｌＦ２５−　
Ｉ　４α２との間でα２２５オリゴヌクレオチド−ＡＰ
試料（２１）による識別を表わす。

下記式において、２は、オリゴヌクレオチドを表わし、
ＡＰはアルカリホスファターゼを表わす。明細書を通じ
て、オリゴヌクレオチドの末端ホスフェートは、オリゴ
ヌクレオチｒの部分であると考えられているが、図面で
は末端ホスフェートは別個に、このホスフェート部分に
おいて生起する反応を説明するために示されている。

Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ａ 員　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−Ｇ〕突然
変異体ＰＩＦ−２５−Ｉ養α２デ２スばドＤＮム（Ａ列
）に関する交雑信号を示す図であり、第２図ｔｆ　固定
Ｚ　Ｘ　Ｉｅ　ｐ　ｆＦ　５５（１２テ９　ｘ　ｔ　Ｐ
　ＤＮＡ　ＣＡ　列）及びｐｌＦ５５−Ｆ４　ｍ導プラ
スイドＤＮ人（Ｂ列）のオリプヌクレオチドーアルカリ
性ホスファｐ　−ゼ複合体による識別状態を、オリジヌ
クレオチド複合体なしの場合（０列、Ｄ列）と対比して
示し北回であす、　＄３図ＵｐＩＦ’５５（Ｘ２（Ａ列
）３００　ｎｇ及び３０　ｎｇとｐｌＦ’５５−’Ａα
２（Ｂ列）との間のオリゴヌクレオチド−ＡＰ−複合体
による識別状態を示す図であり、第４図は、相同プラス
イドｐＩＦ２５α２（Ａ列）とプラスミド１）ＩＰ”２
５−Ｉ養α２は不存在下における線状化され７’ｔ　ｐ
ＩＦ５δ−Ｆ′６α２ＤＮムとｐｌＦ５５−α２ＤＮム
との間のα２５５オリ！ヌクレオチド−ＡＰ複合体によ
る識別を説明してｈる図である。

Ａ＠ｌ”。

−　　　　　　　　　　　　−炉 筒５図 区　　く■

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、僅かに１〜３個のヌクレオチドで異なっている２種
   の相補的なヌクレオチド配列の間を識別するために、 （ａ）２個の相補的なオリゴヌクレオチド鎖の間の交雑
   を促進するか又は助成する条件下で、同定すべき又は測
   定すべきヌクレオチド配列（一本鎖を生じるように適宜
   処理の後）を、８〜３０のヌクレオチドユニット長さの
   一本鎖オリゴヌクレオチドよりなり、これに、立体的に
   認容性の位置で、共有結合している、分子量最低１００
   ０ダルトンを有し、非ラジオアイソトープ信号を出すこ
   とのできる残分を有するオリゴヌクレオチド信号発生複
   合体試料（このオリゴヌクレオチド信号複合体中のオリ
   ゴヌクレオチドは、同定すべき又は測定すべき配列に対
   して相補的であるが、二者択一的配列に対しては相補的
   ではない特定の配列を有する）と接触させ、 （ｂ）試料：テスト核酸ハイブリットを交雑されていな
   い試料から分離し、 （ｃ）交雑されたオリゴヌクレオチド−信号発生複合体
   から生じる信号を出させるか又は僅かに 観察することを特徴とする、僅かに１〜３個のヌクレオ
   チドで異なっている２種の相補的なヌクレオチド配列の
   間を識別する方法。 ２、残分は少なくとも５０００ダルトンの分子量を有す
   る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、残分は少なくとも２００００ダルトンの分子量を有
   する、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、僅かに１個の単一ヌクレオチドで異なっている２種
   の相補的なヌクレオチド配列の間を識別するために有効
   な、特許請求の範囲第１項から第３項のいずれか１項に
   記載の方法。 ５、非ラジオアイソトープ信号を出すことのできる残分
   は、蛋白質性分子部分よりなる、特許請求の範囲第１項
   から第４項までのいずれか１項記載の方法。 ６、オリゴヌクレオチド信号発生複合体試料がスペーサ
   ー原子団を介して、それに共有結合している検出系を有
   する一本鎖オリゴヌクレオチド配列よりなり、前記検出
   系は、酵素的に活性化された色変化を形成するための系
   よりなり、この系は直接的な共有結合で又は特異的な結
   合対によりスペーサー原子団に結合している、特許請求
   の範囲第１項から第５項までのいずれか１項記載の方法
   。 ７、立体的に認容性の位置でスペーサー原子団を介して
   共有結合している、場合により酵素ラベルを有する特異
   的結合対よりなり、少なくとも１０００ダルトンの分子
   量を有する残分又は酵素ラベルがスペーサー原子団を介
   してオリゴヌクレオチドに結合していて、このスペーサ
   ー原子団のオリゴヌクレオチドへの結合は、末端の塩基
   、糖又はホスフェートを介していることを条件として１
   個の酵素ラベルを有する残分を有する、８〜３０個のヌ
   クレオチドユニット長さの一本鎖オリゴヌクレオチドよ
   りなることを特徴とするオリゴヌクレオチド信号発生複
   合体。 ８、オリゴヌクレオチドは病的状態又は相応する正常配
   列と関連しているヌクレオチド配列に対して相補的な配
   列を有する、特許請求の範囲第７項記載のオリゴヌクレ
   オチド信号発生複合体。 ９、一方の病的状態と関連している配列及び他方の相応
   する正常な配列よりなる、僅かに１個の単一ヌクレオチ
   ドで異なっている２種の相補的なヌクレオチド配列を識
   別するための診断キットにおいて、このキットは、８〜
   ３０個のヌクレオチドユニット長さの一本鎖オリゴヌク
   レオチド（このオリゴヌクレオチドは、病的状態に関連
   している配列又は相応する正常配列に対して相補的な配
   列を有し、このオリゴヌクレオチドは、立体的に許容し
   うる部位でこれに共有結合している、少なくとも １０００ダルトンの分子量を有し、非ラジオアイソトー
   プ信号を出すことのできる残分を有する）よりなるオリ
   ゴヌクレオチド信号発生複合体少なくとも１種を有する
   ことを特徴とする、僅かに１個の単一ヌクレオチドで異
   なっている２種の相補的なヌクレオチド配列の間を識別
   するための診断キット。 １０、１）病的状態と関連している配列に相補的な配列
   を有する一本鎖オリゴヌクレオチドよりなるオリゴヌク
   レオチド信号発生複合体試料少なくとも１種及び２）ヒ
   ト中に存在しうる前記の病的状態を示さない相応する正
   常配列に対して相補的な配列を有する一本鎖オリゴヌク
   レオチドよりなるオリゴヌクレオチド信号発生複合体試
   料少なくとも１種を有する、特許請求の範囲第９項記載
   の診断キット。