JPH0329400B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】

本発明は生体成分の測定法に関し、より詳しく
は、特に反応により生成した過酸化水素をパーオ
キシダーゼの存在下比色定量する際に共存するビ
リルビンの反応干渉を回避することを特徴とする
生体成分の測定法及びそれに用いる試薬組成物に
関する。 近年、臨床化学分析における酵素的分析法の進
歩はめざましく、グルコースオキシダーゼ、コレ
ステロールオキシダーゼ、ウリカーゼ、アシルコ
エンザイムＡオキシダーゼ、コリンオキシダー
ゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼなど
の酸化酵素が広範に用いられている。これら酸化
酵素の作用で生成した過酸化水素はパーオキシダ
ーゼ−水素供与体系を用いる方法で比色定量され
るのが常である。パーオキシダーゼを用いる反応
系においては、生体試料中に存在する種々の還元
物質、投与薬剤、生体色素などにより干渉を受け
易い。これら干渉物質のなかで、ビリルビンによ
る干渉については、例えば臨床化学第８巻、63〜
72ページ、1979年に記載されている。これによる
とビリルビンによる干渉の機序としては、 (1) ビリルビンの吸収による直接的影響 (2) ビリルビンがパーオキシダーゼの水素供与体
となる (3) 生成された呈色色素に直接的に作用して分解
する などが考えられている。 ビリルビンの血清中濃度は、正常人では１mg／
dl以下であるが、病的には20mg／dlに達すること
もあり、臨床検査上その影響は重大な問題であ
る。 これらの問題に関する公知技術としては、例え
ばグルコースオキシダーゼ−パーオキシダーゼ系
によりグルコースを定量する方法においてフエロ
シアン化物を用いる方法（特公昭55−25840号公
報及びクリニカルケミストリー第26巻、227〜231
ページ、1981年）、ウリカーゼ−パーオキシダー
ゼ系により尿酸を定量する方法においてフエロシ
アン化イオンを用いる方法（特開昭55−138656号
公報）、ピクリン酸との反応で尿酸を定量する方
法においてアスコルビン酸によりビリルビンの酸
化を阻止する方法（特開昭55−29718号公報）、多
波長光度計を用いてビリルビンによる干渉を補正
する方法（特開昭56−104239号公報）、過酸化水
素−パーオキシダーゼ系により血清成分を測定す
る方法においてEDTA−鉄錯体を添加する方法
（特開昭57−71398号公報）など、及び特開昭54−
151193号公報にはビリルビン特異性菌性酵素組成
物によりビリルビンを減成せしめる方法について
記載されている。最後に述べたビリルビン特異性
菌性酵素組成物はビリルビンに反応し、525nｍ
の螢光を発する物質及び過酸化水素を生成する。
従つて本酵素組成物は本発明の目的とする過酸化
水素−パーオキシダーゼ系に対するビリルビンの
干渉の回避法としては有利な方法ではない。 本発明者らは生体成分測定に際し、共存するビ
リルビンによる干渉を回避する方法について鋭意
検討した結果、ビリルビンオキシダーゼにそのよ
うな作用のあることを見い出した。ビリルビンオ
キシダーゼは本発明者らが新しく見い出した酵素
であり、反応により過酸化水素を生成しない。 本発明の方法について以下詳述する。 本発明の実施態様の一つであるビリルビンオキ
シダーゼは、二種類供給することができる。その
一つは、ミロセシウム属菌の生産するビリルビン
オキシダーゼNS−１として特願昭57−25613号に
開示されている。本ビリルビンオキシダーゼNS
−１はビリルビンを分子状酸素の存在下に酸化
し、緑色物質を生成するも過酸化水素は生成しな
い。本酵素は直接型（グルクロナイド型）ビリル
ビンには作用するが、アルブミンと結合した間接
型ビリルビンには作用しない。ビリルビンによる
干渉の回避のためにはこれら総ビリルビンを除去
することが必要とされる。この問題の解決のため
には界面活性剤、芳香族カルボン酸、サルフア剤
又はプロテアーゼよりなる群から選ばれる１種又
は２種以上の添加が効果のあることを見い出し
た。これらの１種又は２種以上よりなる反応促進
物質（以下単に反応促進物質という）はビリルビ
ンオキシダーゼNS−１と間接型ビリルビンとの
反応を促進する働きがあるものと思われる。界面
活性剤としては陽イオン、陰イオン、非イオン、
両性のいずれでも上記作用があればよく、例えば
シヨ糖脂肪酸エステル、胆汁酸塩、ドデシル硫酸
塩、ｐ−トルエンスルホン酸、セチルピリジニウ
ムクロライド、ノニルフエノールエトキシレート
系、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン
縮合物系などの界面活性剤があげられる。芳香族
カルボン酸の例としてはサリチル酸、スルホサリ
チル酸など、サルフア剤としてはスルフアニルア
ミド、アセトスルフアミンナトリウムなど、プロ
テアーゼとしてはプロナーゼ（科研化学製）など
があげられる。 ビリルビンオキシダーゼNS−１を用いるビリ
ルビンの干渉の回避法は、具体的には生体成分の
測定に際し反応系にビリルビンオキシダーゼNS
−１及び前記反応促進物質を添加するだけでよ
い。これによりビリルビンは酸化されてビリルビ
ン特有の黄色が減少、消失するとともに、ビリベ
ルジンに変化し、パーオキシダーゼの水素供与体
となつたり、色素に作用することもない。なお酵
素ビリルビンオキシダーゼNS−１自身が発色系
に作用する場合は、必要に応じ発色反応阻害物質
を添加すればよい。これら阻害物質はビリルビン
オキシダーゼの発色系への作用は阻害するが、ビ
リルビンへの作用は阻害してはならない。これを
満足する阻害剤としてはフツ化ナトリウム、ヒド
ロキシルアミン、フエナントロリンなどがあげら
れる。 他の種類のビリルビンオキシダーゼは、本発明
者らがスクリーニングの結果コプリナス属菌中に
見い出したものである。本酵素はビリルビンオキ
シダーゼNS−１とは異り、間接型ビリルビンに
も作用する。しかしより速く反応を進めるために
は界面活性剤などの反応促進物質を添加するのが
よい。本酵素を用いるビリルビンによる干渉の回
避法は、前記ビリルビンオキシダーゼNS−１と
同様に行うことができる。 本発明の方法に使用する試薬組成物について説
明する。試薬組成物に含まれる酵素量はビリルビ
ンオキシダーゼ活性として0.01ｍμ／ml〜20μ／
ml使用できる。最も好ましいのはビリルビンオキ
シダーゼ、は反応液中で0.01〜10μ／mlである。
反応促進物質は、例えばドデシル硫酸ナトリウム
の場合は反応液中で0.02〜0.2％、好ましくは0.05
〜0.1％、コール酸ナトリウムの場合は同じく0.1
〜1.0％、好ましくは0.5〜0.7％である。反応阻害
物質は、フツ化ナトリウムの場合は反応液中で
0.5〜10ｍＭ、好ましくは１〜７ｍＭ、ヒドロキ
シルアミン、フエナントロリンの場合もこれに同
じである。その他緩衝液、酵素の安定剤などは必
要に応じて加えればよい。 以下、酵素の活性測定法及び試験例、実施例を
もつて本発明を詳細に説明する。 ビリルビンオキシダーゼ活性測定法 エチレンジアミン四酢酸１ｍＭを含む0.2M−
トリス塩酸緩衝液（PH8.4）250mlに試薬ビリルビ
ン（和光純薬製）５mgを溶解し、この２mlと酵素
液0.2mlを37℃で反応させ440nｍの吸光度の減少
を測定する。１分間に１マイクロモルのビリルビ
ンを酸化する酵素量を１単位とする。 試験例 １ ビリルビンオキシダーゼNS−１の調製 ミロセシウム・ベルカリア（Myrothecium
verrucaria）MT−1FERM−BP No.653（FERM
−Ｐ No.5918）株をグルコース・ジヤガイモ培地
に培養しビリルビンオキシダーゼNS−１を含む
培養液を得た。該培養液を順次硫安塩析、透析、
活性炭処理、QAE−セフアデツクスＡ−50カラ
ムクロマトグラフイー、限外過及びセフアデツ
クスＧ−100カラムクロマトグラフイーを行い精
製ビリルビンオキシダーゼNS−１を得た。本標
品はポリアクリルアミドゲルデイスク電気泳動的
に単一であつた。 試験例 ２ コプリナス属菌の産するビリルビンオキシダー
ゼの調製 コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）
IFO8371株をポテト・グルコース培地に培養し、
ビリルビンオキシダーゼ活性を含む培養液を得
た。該培養液を順次、硫安塩析、透析、DEAE−
セルロースカラムクロマトグラフイー、DEAE−
セフアロースカラムクロマトグラフイー、限外
過、セフアデツクスＧ−100カラムクロマトグラ
フイーを行い精製ビリルビンオキシダーゼを得
た。 試験例 ３ ポリポラス属菌の産するラツカーゼの調製 ポリポラス・ベルシカラー（Polyporus
versicolor）IFO9791株をグルコース、Ｌ−アス
パラギン、DL−フエニルアラニン、アデニン、
チアミン及び無機塩を含有する培地に培養しラツ
カーゼ活性を含む培養液を得た。該培養液を順
次、硫安塩析、透析、限外過、DEAE−セフア
デツクスＡ−50カラムクロマトグラフイー、限外
過、及びセフアデツクスＧ−100カラムクロマ
トグラフイーを行い精製標品を得た。本標品はデ
イスク電気泳動的に単一であつた。 試験例 ４ マツシユルーム起源のチロシナーゼの調製 シグマ社製チロシナーゼ（グレイド）を用
い、これをさらにDEAE−セフアデツクスＡ−50
カラムクロマトグラフイー、ハイドロキシアパタ
イトカラムクロマトグラフイー、DEAE−セフア
デツクスＡ−50カラムクロマトグラフイーを行い
精製標品を得た。本標品はデイスク電気泳動的に
約90％の純度であつた。 試験例 ５ ウルシラツカーゼの調製 ウルシの汁液を塩析、透析、限外過後セフア
デツクスＧ−200カラムクロマトグラフイーを行
い部分精製標品を得た。 試験例 ６ 各種酵素の基質特異性 本発明の方法に用いられるビリルビンオキシダ
ーゼと他の類似酵素の差を明確にするため基質特
異性について検討した。酵素は試験例１〜４で調
製したビリルビンオキシダーゼNS−１（Ａと略
称、以下同様）、コプリナス属菌の生産するビリ
ルビンオキシダーゼ(B)、ポリポラス属菌の生産す
るラツカーゼ(C)、マツシユルーム起源のチロシナ
ーゼ(E)ならびにウルシ起源のラツカーゼ(D)及びき
ゆうり起源のアスコルビン酸オキシダーゼ（東洋
紡績製、グレイド）(F)を用いた。第１表に示し
た７ｍＭ濃度の各種基質と上記酵素の一定量とを
37℃で反応させ酵素活性を測定した。結果を第１
表に示す。同表には各基質に対する最高の活性を
示す酵素を100とした相対活性で表示した。

【表】 第１表に示すように、ビリルビンに対する作用
はビリルビンオキシダーゼが最も強力であつた
が、他の酵素にも弱いながら反応性が認められ
た。 試験例 ７ 反応促進物質の効果 下記組成の反応液を37℃で反応させ、440nｍ
の吸収の減少を測定した。基質としてアルブミン
結合ビリルビンであるビリルビンコントロール
（デイド社製）を使用した。 0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.4） ３ml ビリルビンコントロール（デイド社製、20mg／
dl） 20μ 反応促進物質（10％水溶液）（ただしプロナーゼ
Ｐは0.1％水溶液） 50μ ビリルビンオキシダーゼNS−１（15u／ml）（試
験例１で調製したもの） 20μ 結果を第２表に示す。

【表】 第２表からわかるように、本発明に使用する酵
素とビリルビンとの反応を促進する物質として特
に好ましいのはコール酸ナトリウム、ドデシル硫
酸ナトリウム、サリチル酸であつた。 試験例 ８ 発色反応阻害物質の効果 0.4ｍM4−アミノアンチピリン及び15ｍＭフエ
ノールを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）の３ml
とビリルビンオキシダーゼNS−１（15u／ml）
30μ及び各種濃度のフツ化ナトリウム又はフエ
ナントロリン200μとを、37℃、40分間反応さ
せ505nｍの吸光度の増加を測定した。結果を第
３表に示す。

【表】 第３表から、ビリルビンオキシダーゼNS−１
の影響による色素の発色がフツ化ナトリウム又は
フエナントロリンの添加により阻害されたことが
分る。 実施例 １ グルコースの測定 試薬組成物Ａ 下記を含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5） ４−アミノアンチピリン 0.4ｍＭ フエノール 15ｍＭ フツ化ナトリウム １ｍＭ グルコースオキシダーゼ（天野製薬製）17μ／ml パーオキシダーゼ（ベーリンガー製） 0.3μ／ml コール酸ナトリウム 0.6％ ビリルビンオキシダーゼ NS−１（試験例１で調
製したもの） 0.1μ／ml 検液Ｂ グルコース溶液（各種濃度のビリルビンコントロ
ールを含む） 200mg／dl 試薬組成物A3mlと検液B20μを混合し、37
℃、20分反応させた後、505nｍにおける吸光度
を測定した。対照として、ビリルビンオキシダー
ゼNS−１及び／又はビリルビンコントロールを
除いた系について同様に操作した。結果を第１図
に示す。同図において−〇−はビリルビンオキシ
ダーゼNS−１を添加した場合、−●−は無添加の
場合をそれぞれ表わす。本発明の方法により、検
液に共存するビリルビンの影響がほとんど無視で
きることがわかつた。 実施例 ２ グルコースの測定 前記実施例１に記載の検液Ｂのグルコース溶液
の濃度を各種変えて実施例１と同様に操作した。
なお検液Ｂに含まれるビリルビンコントロールの
濃度は20mg／dlである。結果を第２図に示す。同
図中−〇−は本発明の方法による検量線であり、
他は対照として行つたビリルビン及びビリルビン
オキシダーゼNS−１を含まない場合−△−、ビ
リルビンオキシダーゼNS−１を含まない場合−
●−をそれぞれ表わす。本発明の方法による測定
値はビリルビンによる干渉がほとんど認められな
かつた。 実施例 ３ グルコースの測定 実施例２のビリルビンオキシダーゼNS−１に
代えて試験例２で調製したコプリナス属菌のビリ
ルビンオキシダーゼ（３ｍμ／ml）を用い実施例
２と同様に操作した。その結果、検量線は実施例
２の結果と同一であつた。 実施例 ４ コレステロールの測定 試薬組成物Ａ 総コレステロール測定用キツトであるコレステ
ロールＣ−テスト「和光」（和光純薬製、コレス
テロールエステラーゼ、コレステロールオキシダ
ーゼ、パーオキシダーゼを含む）を75mlの緩衝液
に溶解し、これにフツ化ナトリウムを１ｍＭ、コ
ール酸ナトリウムを0.6％、試験例１で調製した
ビリルビンオキシダーゼNS−１を0.1u／mlにな
るようにそれぞれ溶解した。 検液Ｂ コレステロールＣ−テスト「和光」に付属の標
準血清を使用し、これにビリルビンコントロール
を各濃度添加した。 試薬組成物A3mlと検液B20μを37℃、20分間
反応させた後、505nｍの吸光度を測定した。対
照としてビリルビンオキシダーゼNS−１及び／
又はビリルビンコントロールを除いた系について
同様に操作した。結果を第３図に示す。同図にお
いて−〇−はビリルビンオキシダーゼNS−１を
添加した場合、−●−は無添加の場合をそれぞれ
表わす。本発明の方法により、検液に共存するビ
リルビンの影響がほとんど無視できることがわか
つた。 実施例 ５ 中性脂肪の測定 試薬組成物 中性脂肪測定用の市販キツトであるTGキツト
−GN（日本商事製リポプロテインリパーゼ、グ
リセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸
オキシダーゼ、パーオキシダーゼを含む）を用い
た。 Ａ溶液−キツト中の酵素試薬１バイアルを呈色試
薬15mlで溶解した。 Ｂ溶液−呈色試薬にフツ化ナトリウムを１ｍＭ、
コール酸ナトリウムを0.6％及び試験例１で調
製したビリルビンオキシダーゼNS−１を
0.2u／mlの濃度になるようにそれぞれ溶解し
た。 検液Ｃ 各種濃度のトリオレイン溶液を用意し、これに
ビリルビンコントロールを10mg／dlの濃度になる
ように溶解した。 Ａ溶液1.5mlと検液C20μを混合し、37℃、５
分間予熱し、次いでＢ溶液1.5mlを加えて、37℃、
15分反応後505nｍの吸光度を測定した。結果を
第４図に示す。同図中−〇−は本発明の方法によ
る検量線であり、他は、対照として行つたビリル
ビン及びビリルビンオキシダーゼNS−１を含ま
ない場合−△−、ビリルビンオキシダーゼNS−
１を含まない場合−●−をそれぞれ表わす。本発
明の方法による測定値はビリルビンによる干渉が
ほとんど認められなかつた。 実施例 ６ 中性脂肪の測定 実施例５のＢ溶液からフツ化ナトリウム及びコ
ール酸ナトリウムを除き、さらに、ビリルビンオ
キシダーゼNS−１に代えて試験例２で調製した
コプリナス属菌産生のビリルビンオキシダーゼ
（0.2u／ml）、を用い実施例５と同様に操作した。
その結果検量線はすべて実施例５の結果と同一に
なつた。 実施例 ７ グルコースの測定 実施例１の検液Ｂの代りに、ヒト血清にビリル
ビンコントロールを各種濃度添加した検液につき
実施例１と同様に操作した。なお用いた血清中の
グルコース濃度は96mg／dlであり、ビリルビンの
濃度は0.6mg／dlであつた。結果を第５図に示す。
同図において−〇−はビリルビンオキシダーゼ
NS−１を添加した場合、−●−は無添加の場合を
それぞれ表わす。第５図より本発明の効果が明ら
かである。 実施例 ８ 血清中のグルコースの測定 実施例１の試薬組成物からフツ化ナトリウムを
除き、血清サンプルを検液として用い実施例１と
同様に操作した。あらかじめグルコース標準液を
使用して作成した検量線からグルコース濃度を求
めたところ96.1mg／dlであつた。対照としてコー
ル酸ナトリウム及びビリルビンオキシダーゼを除
いて操作したところ90.2mg／dlであつた。又、上
記の試薬にさらにフツ化ナトリウム１ｍＭを追加
して操作したところ、サンプル中のグルコース濃
度は変わらなかつたが、ブランク反応液の吸光度
が低くて操作が便宜であつた。なお、用いたサン
プル中の総ビリルビン濃度は12.5mg／dlであつ
た。 実施例 ９ 血清中の総コレステロールの測定 実施例４の試薬組成物中のコール酸ナトリウム
に代えてドデシル硫酸ナトリウム（0.07％）を用
い、血清サンプルを検液として実施例４と同様に
操作した。あらかじめコレステロール標準液を使
用して作成した検量線から総コレステロール濃度
を求めたところ163mg／dlであつた。対照として
フツ化ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム及び
ビリルビンオキシダーゼを除いて操作したとこ
ろ、145mg／dlであつた。なお、用いたサンプル
中の総ビリルビン濃度は15.2mg／dlであつた。 実施例 10 血清中の中性脂肪の測定 実施例５の試薬組成物中フツ化ナトリウムに代
えてフエナントロリン（2.5ｍＭ）及びビリルビ
ンオキシダーゼNS−１に代えてコプリナス属菌
産生のビリルビンオキシダーゼ（0.05u／ml）を
用い、血清サンプルを検液として実施例５と同様
に操作した。あらかじめトリオレイン標準液を使
用して作成した検量線からサンプル中の中性脂肪
濃度を求めたところ、トリオレインとして78.0
mg／dlであつた。対照としてフエナントロリン、
コール酸ナトリウム及びビリルビンオキシダーゼ
を除いて操作したところ、68.6mg／dlであつた。
なお、用いたサンプル中の総ビリルビン濃度は
14.2mg／dlであつた。 実施例 11 血清中の遊離脂肪酸の測定 試薬組成物 下記を含む0.1Mリン酸緩衝液（PH6.75） アシルコエンザイムＡシンセターゼ（天野製薬
製） 0.4u／ml アシルコエンザイムＡオキシダーゼ（天野製薬
製） 5u／ml パーオキシダーゼ（ベーリンガー製） 5u／ml アデノシン三リン酸 4μM 発色剤MMX（協和メデイツクス製） 50μM トリトンＸ−100 0.1％ ビリルビンオキシダーゼNS−１ 0.1u／ml コール酸ナトリウム 0.6％ フツ化ナトリウム 2.5ｍＭ 上記試薬組成物３mlと血清サンプル20μを混
合し、37℃、20分反応させた後、660nｍにおけ
る吸光度を測定し、あらかじめオレイン酸標準液
を使用して作成した検量線からサンプル中の遊離
脂肪酸濃度を求めたところ、210μEq／であつ
た。対称として、ビリルビンオキシダーゼ、コー
ル酸ナトリウム及びフツ化ナトリウムを除いて操
作したところ、182μEq／であつた。なお、用
いたサンプル中の総ビリルビン濃度は10.8mg／dl
であつた。 実施例 12 血清中リン脂質の測定 リン脂質測定用の市販キツトであるデタミナー
PL（協和メデイツクス社製、４−アミノアンチピ
リン、フエノール、ホスホリパーゼＤ、コリンオ
キシダーゼ、パーオキシダーゼを含む）を用い、
該キツトの溶液にドデシル硫酸ナトリウムを0.07
％、フエナントロリンを2.5ｍＭ及び試験例２で
調製したコプリナス属菌産生のビリルビンオキシ
ダーゼを0.05u／mlになるようにそれぞれ溶解し
た。該試薬溶液３mlと血清サンプル20μを混合
し、37℃、20分間反応させた後、500nｍの吸光
度を測定し、あらかじめ塩化コリン標準液を使用
して作成した検量線からサンプル中のリン脂質濃
度を求めたところ、塩化コリンとして277mg／dl
であつた。対照としてドデシル硫酸ナトリウム、
フエナントロリン及びビリルビンオキシダーゼを
除いて操作したところ、262mg／dlであつた。な
お、用いたサンプル中の総ビリルビン濃度は14.1
mg／dlであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法によりグルコースを定量
した場合の共存するビリルビンの干渉を表わす図
である。同図において−〇−は本発明の方法によ
る結果であり、−●−はそれからビリルビンオキ
シダーゼNS−１を除いた結果を表わす。第２図
は本発明の方法によるグルコースの検量線を表わ
す図である。同図において−〇−は本発明の方法
による結果であり、−●−はそれからビリルビン
オキシダーゼNS−１を除いた場合、−△−はビリ
ルビンオキシダーゼNS−１及びビリルビンを除
いた結果を表わす。第３図は本発明の方法により
コレステロールを定量した場合の共存するビリル
ビンの干渉を表わす図である。同図において−〇
−は本発明の方法による結果であり、−●−はそ
れからビリルビンオキシダーゼNS−１を除いた
結果を表わす。第４図は本発明の方法による中性
脂肪の検量線を表わす図である。同図において−
〇−は本発明の方法による結果であり、−●−は
それからビリルビンオキシダーゼNS−１を除い
た場合、−△−はビリルビンオキシダーゼNS−１
及びビリルビンを除いた結果を表わす。第５図は
本発明の方法により血清中のグルコースを定量し
た場合の共存するビリルビンの干渉を表わす図で
ある。同図において−〇−は本発明の方法による
結果であり、−●−はそれからビリルビンオキシ
ダーゼを除いた結果を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒト血清中の生体成分を測定する方法におい
   て、ビリルビンオキシダーゼと界面活性剤、芳香
   族カルボン酸、サルフア剤及びプロテアーゼより
   なる群から選ばれる１種又は２種以上の反応促進
   物質を添加することにより検体に共存するビリル
   ビンの干渉を回避することを特徴とする生体成分
   の測定法。 ２ ビリルビンオキシダーゼがミロセシウム属に
   属する菌株又はコプリナス属に属する菌株の生産
   する酵素である特許請求の範囲第１項記載の生体
   成分の測定法。 ３ 生体成分を測定する方法が過酸化水素−パー
   オキシダーゼ−発色性水素供与体系を含む特許請
   求の範囲第１項記載の生体成分の測定法。 ４ ビリルビンオキシダーゼと界面活性剤、芳香
   族カルボン酸、サルフア剤及びプロテアーゼより
   なる群から選ばれる１種又は２種以上の反応促進
   物質に加えて、必要に応じ、発色反応阻害物質を
   も添加することにより該酵素による発色系への作
   用を阻害する特許請求の範囲第１項又は第３項記
   載の生体成分の測定法。 ５ 発色反応阻害物質が酵素のビリルビンへの作
   用は阻害しないが酵素の発色系への作用を阻害す
   る性質を有する特許請求の範囲第４項記載の生体
   成分の測定法。 ６ 発色反応阻害物質がフツ化ナトリウム、ヒド
   ロキシルアミン又はフエナントロリンである特許
   請求の範囲第４項又は第５項記載の生体成分の測
   定法。 ７ ビリルビンオキシダーゼと界面活性剤、芳香
   族カルボン酸、サルフア剤及びプロテアーゼより
   なる群から選ばれる１種又は２種以上の反応促進
   物質を含み、ヒト血清中の生体成分の測定におけ
   るビリルビンの干渉を回避する性質を有する試薬
   組成物。 ８ ビリルビンオキシダーゼがミロセシウム属に
   属する菌株又はコプリナス属に属する菌株の生産
   する酵素である特許請求の範囲第７項記載の試薬
   組成物。 ９ 生体成分の測定が過酸化水素−パーオキシダ
   ーゼ−発色性水素供与体系を含む特許請求の範囲
   第７項記載の試薬組成物。 １０ ビリルビンオキシダーゼと界面活性剤、芳
   香族カルボン酸、サルフア剤及びプロテアーゼよ
   りなる群から選ばれる１種又は２種以上の反応促
   進物質に加えて、必要に応じ、発色反応阻害物質
   をも含み、該酵素による発色系への作用を阻害す
   る性質を有することを特徴とする特許請求の範囲
   第７項記載の試薬組成物。 １１ 反応阻害物質が酵素とビリルビンとの反応
   は阻害しないが酵素の発色系への作用を阻害する
   性質を有する特許請求の範囲第１０項記載の試薬
   組成物。 １２ 反応阻害物質がフツ化ナトリウム、ヒドロ
   キシルアミン又はフエナントロリンである特許請
   求の範囲第１０項又は第１１項記載の試薬組成
   物。