JPS6283664A - イムノアツセイ用試薬 - Google Patents
イムノアツセイ用試薬Info
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- JPS6283664A JPS6283664A JP22506485A JP22506485A JPS6283664A JP S6283664 A JPS6283664 A JP S6283664A JP 22506485 A JP22506485 A JP 22506485A JP 22506485 A JP22506485 A JP 22506485A JP S6283664 A JPS6283664 A JP S6283664A
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- Japan
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- hpth
- pth
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- immunoassay
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ｈＰＴＨ（ヒト副甲状腺ホルモン）のイムノ
アッセイに用いる新規な試薬に関するものである。
アッセイに用いる新規な試薬に関するものである。
ＰＴＨは、８４個の構成アミノ酸からなるペプチドであ
り、その血中濃度の測定はカルシウムやリンの代謝異常
に関する種々の副甲状腺疾患や代謝性骨疾患の診断およ
び病態解析に重要な役割を果している。
り、その血中濃度の測定はカルシウムやリンの代謝異常
に関する種々の副甲状腺疾患や代謝性骨疾患の診断およ
び病態解析に重要な役割を果している。
Ｐ Ｔ Ｈの測定法として、１９６３年Ｂｅｒｓｏｎら
によりラジオイムノアッセイが開発されて以来（ｐｒＯ
ｃ、 ｆｉＪａｔｌ、 、４Ｃａｄ、 ３Ｃｉ、１１．
３Ａ、、 ＶＯｌ、 ４９、ｐ６１３ （１９６３））
、種々の改良が加えられてきている。
によりラジオイムノアッセイが開発されて以来（ｐｒＯ
ｃ、 ｆｉＪａｔｌ、 、４Ｃａｄ、 ３Ｃｉ、１１．
３Ａ、、 ＶＯｌ、 ４９、ｐ６１３ （１９６３））
、種々の改良が加えられてきている。
トレーサーには、当初、ウソＰＴＨ（１−８４）を放射
性同位元素で標識化したものが用いられていたが、ウシ
ＰＴＨ（１−８４）は非特異的結合性が大きく、たとえ
ば試験管壁などにも吸着するなど、測定感度、精度上の
問題があった。
性同位元素で標識化したものが用いられていたが、ウシ
ＰＴＨ（１−８４）は非特異的結合性が大きく、たとえ
ば試験管壁などにも吸着するなど、測定感度、精度上の
問題があった。
近年、合成ヒトＰＴＨフラグメントをトレーサーおよび
標準物質として用いるホモジエナスＲＩＡ法が０４発さ
れ、Ｍａｒｘらは、トレーサーとしてｈＰＴＨ（４４−
６８）フラグメ、ントを用いることにより、ガラス壁へ
の吸着が少なく、しかも保存安定性、ＤＣＣによるＢＦ
分離性がすぐれたＲＩＡ法を報告しティる（ ＪＣｌｉ
ｎ、 ＥｎｄＯＣｒｉｎｏｌ、１ｖｆｅｔａｂ、 。
標準物質として用いるホモジエナスＲＩＡ法が０４発さ
れ、Ｍａｒｘらは、トレーサーとしてｈＰＴＨ（４４−
６８）フラグメ、ントを用いることにより、ガラス壁へ
の吸着が少なく、しかも保存安定性、ＤＣＣによるＢＦ
分離性がすぐれたＲＩＡ法を報告しティる（ ＪＣｌｉ
ｎ、 ＥｎｄＯＣｒｉｎｏｌ、１ｖｆｅｔａｂ、 。
Ｖｏｌ、５８、ｐｐ７６−８４ （１９８１） ）。さ
らに、５ｈａｒｐラバ、トレーサーとしてｈＰＴＨのＮ
末端にチロシン残基を導入した（Ｔｙｒ ４３） ｈ
Ｆ’ＴＨ（４ａ −６８）を用いることにより、ｈＰＴ
Ｈ（４，４−６８）を用いた場合よりも１５〜５０９６
感度カ向上スルコトヲ報告した〔（：１ｉｎｉｃａ、
（：ｈｉｍｉｃａ。
らに、５ｈａｒｐラバ、トレーサーとしてｈＰＴＨのＮ
末端にチロシン残基を導入した（Ｔｙｒ ４３） ｈ
Ｆ’ＴＨ（４ａ −６８）を用いることにより、ｈＰＴ
Ｈ（４，４−６８）を用いた場合よりも１５〜５０９６
感度カ向上スルコトヲ報告した〔（：１ｉｎｉｃａ、
（：ｈｉｍｉｃａ。
Ａｃｔａ Ｖｏｌ、１４５．ｐｐ ５９−６８、（１９
８５） ）。
８５） ）。
他のＰＴＨフラグメントを用いるラジオイムノアッセイ
としては、ｈＰＴＨ（１−８４）（たとえば、７ｔｔｘ
ａｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｆ３ｉ０．ｆｉ７ｆｌｌｄ、、
ＶＯｌ、 ８３ 、ｐ４５７（１９７５））、ｈＰＴＨ
（４４−６４）（Ｌｉｇａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗ、 Ｖｏ
ｌ、 ２．１）？ （１９８０） ）、ｈＰＴＨ（６５
−８４）（たとえば、ホルモンと臨床、Ｖｏｌ、 ３０
％Ｉ）ｐ８８５−８８８、ｐＩ）１３０９−１３１３、
（１９８２）が知られている。
としては、ｈＰＴＨ（１−８４）（たとえば、７ｔｔｘ
ａｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｆ３ｉ０．ｆｉ７ｆｌｌｄ、、
ＶＯｌ、 ８３ 、ｐ４５７（１９７５））、ｈＰＴＨ
（４４−６４）（Ｌｉｇａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗ、 Ｖｏ
ｌ、 ２．１）？ （１９８０） ）、ｈＰＴＨ（６５
−８４）（たとえば、ホルモンと臨床、Ｖｏｌ、 ３０
％Ｉ）ｐ８８５−８８８、ｐＩ）１３０９−１３１３、
（１９８２）が知られている。
従来のｈＰＴＨの°ラジオイムノアッセイにおいては、
測定感度等の問題は解決されたものの、アッセイに３〜
４日間という長時間を要し、より短時間に迅速１こ正確
な測定が可能なアッセイシステムの開発が望まれていた
。
測定感度等の問題は解決されたものの、アッセイに３〜
４日間という長時間を要し、より短時間に迅速１こ正確
な測定が可能なアッセイシステムの開発が望まれていた
。
本発明者らは、上記の問題を解決するために鋭意研究を
進めた結果として、トレーサーとしてｈＰＴＨ〔（３９
〜４８）−６８）の標識化物を用いることにより、ｈＰ
ＴＨ’のイムノアッセイ操作を２４時間以内に完了でき
ることを知見し、本発明を完成した。
進めた結果として、トレーサーとしてｈＰＴＨ〔（３９
〜４８）−６８）の標識化物を用いることにより、ｈＰ
ＴＨ’のイムノアッセイ操作を２４時間以内に完了でき
ることを知見し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、標識物質で標識されたｈＰＴＨ〔
（８９〜４８）−６８）からなるイムノアッセイ用試薬
を提供するものである。さらに、ｈＰＴＨの競合的イム
ノアッセイ用キットにおいてトレーサーとして標識物質
で標識されたｈＰＴＨＥ（３９〜４３）−６８）を構成
試薬として含有することを特徴とするイムノアッセイ用
試薬キットを提供するものである。
（８９〜４８）−６８）からなるイムノアッセイ用試薬
を提供するものである。さらに、ｈＰＴＨの競合的イム
ノアッセイ用キットにおいてトレーサーとして標識物質
で標識されたｈＰＴＨＥ（３９〜４３）−６８）を構成
試薬として含有することを特徴とするイムノアッセイ用
試薬キットを提供するものである。
本発明において、トレーサーとして用いられるｈＰＴ）
〔（（３９〜４３）−６８）は次のようなＮ末端が３９
ないし４３番目のアミノ酸であるアミノ酸配列を有する
ものである。
〔（（３９〜４３）−６８）は次のようなＮ末端が３９
ないし４３番目のアミノ酸であるアミノ酸配列を有する
ものである。
（ＡＩａ −ｐｒｏ ４ｅｕ −ＡＩａ−Ｐｒｏ） −
Ａｒｇ −ＡＳ＋） −Ａｌａ −Ｇｌｙ −５ｅｒ
−Ｑｌｕ −Ａｒｇ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ −１ｙｓ−ｔ
、ｙｓ −Ｑｌｕ −Ａｓｐ −Ａｓｎ −Ｖａｌ −
Ｌｅｕ −Ｖａｌ −Ｇｌｕ−８ｅｒ −）（ｉｓ −
（、ｌｕ −１，ｙｓ −５ｅｒ −Ｌｅｕ −Ｑｌｙ
Ｈ（４３−６８）が挙げられる。標識物質として放射性
ヨード（１２５工、 １３１１）を用いる場合には、こ
れらのフラグメントのＮ末端にチロシン残基を導入した
ものが用いられる。ｍｇｌｆｉＷｍ−ｌｕｍに適合する
ものを選択すればよく、一般には放射性同位元素（たと
えば１２５１．１３１１．３Ｈ，１４（など）、酵素（
たとえばβ−ガラクトシダーゼ、ベルオキ←ンダーゼ、
アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ
など）、蛍光物質（たとえば、ウムベリフエロン、フル
オレセイン、ローダミン、フルオレセインイソシアネー
ト、フルオレセインイソチオシアネート、フイコエリト
リンなど）、化学発光物質（たとえば、ルミノールなど
）などが適用される。これらの標識物質の標識化法はい
ずれも公知であり、公知の方法によって行えばよい。こ
れらの一般的技術手段の詳細については、総説、成書な
どを参照することができる（たとえば、入江實編、「ラ
ジオイムノアッセイ」 （株式％式％） 實編、Ｖ続うジオイム／アッセイ」 （株式会社講談社
、昭和５４年５月１日発行）、石川栄治ら編、「酵素免
疫測定法」第２版（株式会社医学書院、昭和５７年１２
月１５日発行）、日本臨林、第４２巻、春季臨時増刊（
１９８４）ｒ臨床免疫ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｊ （株式
会社日本臨林社、昭和５９年３月２０日発行）、第１１
ｂ８〜１２２７頁、Ｈ０■、ブナキスら著、「Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｊ Ｖｏｗ。
Ａｒｇ −ＡＳ＋） −Ａｌａ −Ｇｌｙ −５ｅｒ
−Ｑｌｕ −Ａｒｇ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ −１ｙｓ−ｔ
、ｙｓ −Ｑｌｕ −Ａｓｐ −Ａｓｎ −Ｖａｌ −
Ｌｅｕ −Ｖａｌ −Ｇｌｕ−８ｅｒ −）（ｉｓ −
（、ｌｕ −１，ｙｓ −５ｅｒ −Ｌｅｕ −Ｑｌｙ
Ｈ（４３−６８）が挙げられる。標識物質として放射性
ヨード（１２５工、 １３１１）を用いる場合には、こ
れらのフラグメントのＮ末端にチロシン残基を導入した
ものが用いられる。ｍｇｌｆｉＷｍ−ｌｕｍに適合する
ものを選択すればよく、一般には放射性同位元素（たと
えば１２５１．１３１１．３Ｈ，１４（など）、酵素（
たとえばβ−ガラクトシダーゼ、ベルオキ←ンダーゼ、
アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ
など）、蛍光物質（たとえば、ウムベリフエロン、フル
オレセイン、ローダミン、フルオレセインイソシアネー
ト、フルオレセインイソチオシアネート、フイコエリト
リンなど）、化学発光物質（たとえば、ルミノールなど
）などが適用される。これらの標識物質の標識化法はい
ずれも公知であり、公知の方法によって行えばよい。こ
れらの一般的技術手段の詳細については、総説、成書な
どを参照することができる（たとえば、入江實編、「ラ
ジオイムノアッセイ」 （株式％式％） 實編、Ｖ続うジオイム／アッセイ」 （株式会社講談社
、昭和５４年５月１日発行）、石川栄治ら編、「酵素免
疫測定法」第２版（株式会社医学書院、昭和５７年１２
月１５日発行）、日本臨林、第４２巻、春季臨時増刊（
１９８４）ｒ臨床免疫ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｊ （株式
会社日本臨林社、昭和５９年３月２０日発行）、第１１
ｂ８〜１２２７頁、Ｈ０■、ブナキスら著、「Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙｊ Ｖｏｗ。
７０、［、）ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ ｐａｒｔ ＡＪ （アカデミツクプレス、
１９８０）、Ｊ、Ｊ、ランボンら著、ｊ”Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＪ ＶＯｌ、 ７８
、「ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ Ｐａｒｔ ＢＪ、同書、ＶＯＩ。
ｉｑｕｅｓ ｐａｒｔ ＡＪ （アカデミツクプレス、
１９８０）、Ｊ、Ｊ、ランボンら著、ｊ”Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＪ ＶＯｌ、 ７８
、「ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ Ｐａｒｔ ＢＪ、同書、ＶＯＩ。
７４ ［ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ｐａｒｔ （： Ｊ、（アカデミツクプレス、
１９８１）など参照）。
ｕｅｓ ｐａｒｔ （： Ｊ、（アカデミツクプレス、
１９８１）など参照）。
たとえば、１２５工、１８１１ などの放射性ヨード
で標識する場合はクロラ、ミンＴ法、ラクトペルオキシ
ダーゼなどが適用され、酵素標識する場合は、酸無水物
法、カルボジイミド法、グルタルアルデヒド架橋法、過
ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法などが適用される（
特開昭５５−２６４７７号公報参照）。
で標識する場合はクロラ、ミンＴ法、ラクトペルオキシ
ダーゼなどが適用され、酵素標識する場合は、酸無水物
法、カルボジイミド法、グルタルアルデヒド架橋法、過
ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法などが適用される（
特開昭５５−２６４７７号公報参照）。
本発明トレーサーが適用されるイムノアッセイは、被分
析物質とトレーサーとを抗体などの受容体に対して競合
的に結合反応を行わせ、それらの存在比による結合もし
くは不結合標識量の変化を測定して被分析物質を定量す
る測定原理に基づ（方法であればよい。そのようなイム
ノアッセイのシステムとしては、■可溶性抗体に対して
被分析試料中の物質とトレーサーを順次にまたは同時に
反応させて抗原抗体反応を行わせ、次いでＢＰ分離剤を
用いてＢＦ分離し、Ｂ（結合トレーサー）またはＦ（遊
離トド・−サー）の標識量を測定する液相法、■不溶性
担体に対して被分析試料中の物質と１−レーサーを順次
にまたは同時に反応させて抗原抗体反応を行わせ、次い
で液相と固相とに分離し、液相中のＦまたは固相中のＢ
の標識量を測定する固相法がある。
析物質とトレーサーとを抗体などの受容体に対して競合
的に結合反応を行わせ、それらの存在比による結合もし
くは不結合標識量の変化を測定して被分析物質を定量す
る測定原理に基づ（方法であればよい。そのようなイム
ノアッセイのシステムとしては、■可溶性抗体に対して
被分析試料中の物質とトレーサーを順次にまたは同時に
反応させて抗原抗体反応を行わせ、次いでＢＰ分離剤を
用いてＢＦ分離し、Ｂ（結合トレーサー）またはＦ（遊
離トド・−サー）の標識量を測定する液相法、■不溶性
担体に対して被分析試料中の物質と１−レーサーを順次
にまたは同時に反応させて抗原抗体反応を行わせ、次い
で液相と固相とに分離し、液相中のＦまたは固相中のＢ
の標識量を測定する固相法がある。
本発明のトレーサーを用いるイムノアッセイに用いる抗
ｈ Ｐ Ｔ Ｈ抗体としてはｈＰＴＨｌこ対して特異性
を有し、ｈＰＴＨの中央領域（ｍｉｄｒｅｇｉｏｎ ）
、特に３９番目のアラニンから６８番目のグリシノまで
の領域を抗原決定基として認識しうるものであればよい
。抗体の調製は、常法によって行われる。たとえば、ウ
シもし、くはヒトＰＴＨまたは中央領域のＰＴＨフラグ
メントを、ウサギ、ラット、ヒツジ、ウマ、ウシ、ニワ
トリなどの異種動物に免疫し、免疫動物から抗血清を採
取する方法、または免疫動物から肺臓細胞、胸腺細胞ま
たは末梢リンパ節細胞などの抗体生産細胞を取得し、こ
れと 厚ミエローマ細胞とを細胞融合させ、得られたハイブリ
ドーマを細胞培養もしくはマウス腹水形成法で培養し、
生産された抗体を取得する方法などにより得ることがで
きる。
ｈ Ｐ Ｔ Ｈ抗体としてはｈＰＴＨｌこ対して特異性
を有し、ｈＰＴＨの中央領域（ｍｉｄｒｅｇｉｏｎ ）
、特に３９番目のアラニンから６８番目のグリシノまで
の領域を抗原決定基として認識しうるものであればよい
。抗体の調製は、常法によって行われる。たとえば、ウ
シもし、くはヒトＰＴＨまたは中央領域のＰＴＨフラグ
メントを、ウサギ、ラット、ヒツジ、ウマ、ウシ、ニワ
トリなどの異種動物に免疫し、免疫動物から抗血清を採
取する方法、または免疫動物から肺臓細胞、胸腺細胞ま
たは末梢リンパ節細胞などの抗体生産細胞を取得し、こ
れと 厚ミエローマ細胞とを細胞融合させ、得られたハイブリ
ドーマを細胞培養もしくはマウス腹水形成法で培養し、
生産された抗体を取得する方法などにより得ることがで
きる。
固相法においては、抗体を不溶性担体に固相化したもの
が用いられる。不溶性担体としては、たとえば、ンリコ
ーン、ガラス、セラミック、ポリスチレン、スチレン−
ジビニルベンゼン共重合体、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、架橋ポリアクリルアミド、ハロゲン化シアン活性
化セルロース、０Ｍセルロース、ＤＥＡＥセルロース、
架橋デキストランなどの一般のイム／アッセイで用いら
れうる材質のものを適用すればよい。担体の形状は任意
であり、たとえばラテックス状、ディスク状、粒子状、
チューブ状などのいずれでもよい。抗体得 の軍曹性担体への固相化法も公知の方法が適用さ・れ、
たとえば、物理的吸着法、グルタルアルデヒド、コハク
酸、２．２−ジピリジルサルファイド、２４時間以内で
行われる。反応にあたって、抗体およびトレーサーは既
定量用いられ、標準液および試料液中のＰＴＨを競合的
反応が行われる。緩衝液としては、イム／アッセイに常
用されるものが用いられ、たとえばトリス塩酸緩衝液、
りん酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液などが使用
できる。
が用いられる。不溶性担体としては、たとえば、ンリコ
ーン、ガラス、セラミック、ポリスチレン、スチレン−
ジビニルベンゼン共重合体、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、架橋ポリアクリルアミド、ハロゲン化シアン活性
化セルロース、０Ｍセルロース、ＤＥＡＥセルロース、
架橋デキストランなどの一般のイム／アッセイで用いら
れうる材質のものを適用すればよい。担体の形状は任意
であり、たとえばラテックス状、ディスク状、粒子状、
チューブ状などのいずれでもよい。抗体得 の軍曹性担体への固相化法も公知の方法が適用さ・れ、
たとえば、物理的吸着法、グルタルアルデヒド、コハク
酸、２．２−ジピリジルサルファイド、２４時間以内で
行われる。反応にあたって、抗体およびトレーサーは既
定量用いられ、標準液および試料液中のＰＴＨを競合的
反応が行われる。緩衝液としては、イム／アッセイに常
用されるものが用いられ、たとえばトリス塩酸緩衝液、
りん酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液などが使用
できる。
抗原抗体反応後、液相法の場合はＢＦ分離剤を用いてＢ
Ｆ分離が行われる。ＢＦ分離剤としては、ＤＣＣ（デキ
ストラン被覆活性炭）、ポリエチレ＝７グリコール、硫
酸アンモニウム、抗ＰＴＨ抗体に対する第二抗体などが
用いられる。第二抗体は、可溶性抗体として用いること
もできるが、前記したような不溶性担体に固相化したも
のとして用いることもできる。このような分離剤により
ＢＦいずれかを沈澱もしくは吸着させて、両者の分離を
迩 行う。固相法の場合は、吸引、傾−１ろ過などにｌＢＦ
分離を実施することができる。
Ｆ分離が行われる。ＢＦ分離剤としては、ＤＣＣ（デキ
ストラン被覆活性炭）、ポリエチレ＝７グリコール、硫
酸アンモニウム、抗ＰＴＨ抗体に対する第二抗体などが
用いられる。第二抗体は、可溶性抗体として用いること
もできるが、前記したような不溶性担体に固相化したも
のとして用いることもできる。このような分離剤により
ＢＦいずれかを沈澱もしくは吸着させて、両者の分離を
迩 行う。固相法の場合は、吸引、傾−１ろ過などにｌＢＦ
分離を実施することができる。
標識１の測定は、各標識物質の種類に応して公知の手段
を採用して行う。たとえば、放射性同位元素の放射能の
測定は、液体シンチレーションカウンター、ガンマ−カ
ウンターなどの放射性同位元素の放射能量を測定できる
機器を用いて実施できる。酵素の酵素活性の測定は、そ
の酵素の種類に応じた活性測定法により、基質を選択し
て酵素反応の進行に伴う物質の消費、生成の量もしくは
速度を電気化学的、分光光学的、蛍光的手法などにより
測定して行うことができる。
を採用して行う。たとえば、放射性同位元素の放射能の
測定は、液体シンチレーションカウンター、ガンマ−カ
ウンターなどの放射性同位元素の放射能量を測定できる
機器を用いて実施できる。酵素の酵素活性の測定は、そ
の酵素の種類に応じた活性測定法により、基質を選択し
て酵素反応の進行に伴う物質の消費、生成の量もしくは
速度を電気化学的、分光光学的、蛍光的手法などにより
測定して行うことができる。
被検試料中のＰＴＨ含量は、試料に対する標識黴の測定
値を標準溶液に対する標識の測定値と対照させて求めら
れる。
値を標準溶液に対する標識の測定値と対照させて求めら
れる。
本発明トレーサーを用いるＰＴＨイムノアッセイ用試薬
キットの、本発明トレーサー以外の試薬構成はそれぞれ
イムノアッセイシステムに応じて選択、決定される。た
とえば液相法用キットの基本的な試薬構成は次のとおり
である。
キットの、本発明トレーサー以外の試薬構成はそれぞれ
イムノアッセイシステムに応じて選択、決定される。た
とえば液相法用キットの基本的な試薬構成は次のとおり
である。
■ 本発明トレーサー
０ 抗ＰＴＨ抗体試薬
■ ＰＴＨ標準液
■ ＢＦ分離剤
また、固相法用キットの基本的な試薬構成は次のとおり
である。
である。
■ 本発明トレーサー
■ 固相化抗ＰＴＨ抗体試薬
■ ＰＴＨ標準液
たとえば酵素を標識とするイムノアッセイ用キットには
さらにこれら基本的試薬構成に基質溶液、反応停止剤な
どが組み合わせられ、これら基本的試薬構成への改変、
付加は任意である。
さらにこれら基本的試薬構成に基質溶液、反応停止剤な
どが組み合わせられ、これら基本的試薬構成への改変、
付加は任意である。
本発明によれば、トレーサーとして標識化ｈｐＴＨ〔（
３９〜４３）−６８３を用いることにより、従来のすく
れたトレーサーとされていた標識化ｈＰＴＨ（４４−６
８）を用いる場合よりも、抗ＰＴＨ抗体への結合反応率
が向上し、より短時間に抗原抗体反応を行うことができ
、アッセイ所要時間の大幅な短縮が可能となった。また
、より低濃度領域の精度の高いＰＴＨの測定が可能であ
る。
３９〜４３）−６８３を用いることにより、従来のすく
れたトレーサーとされていた標識化ｈＰＴＨ（４４−６
８）を用いる場合よりも、抗ＰＴＨ抗体への結合反応率
が向上し、より短時間に抗原抗体反応を行うことができ
、アッセイ所要時間の大幅な短縮が可能となった。また
、より低濃度領域の精度の高いＰＴＨの測定が可能であ
る。
実施例〕
実施例 １
０．０５Ｍ＋）ん酸緩衝液（ｐＨ７，４） ２０８ｇ
ヲ小試験管にとり １２Ｊ １ｍＣ１を加えた後、Ｔｙ
ｒ４２− ｈ ＰＴＨ（４３−６８） （Ｃａｌｂｉ
ｏｃｈｅｍ社製）１１２．５μｇ を加え、さらにクロ
ラミンＴ（１１１ｇ、／ ｍｌの００５Ｍりん酸緩衝液
（ｐＨ７，４）溶液）、１０７ｚｌを加えて撹拌し、ピ
ロ亜硫酸ナトリウム（１，２ｆｆｇ／−の０．０５Ｍり
ん酸緩衝液（ｐＨ７，４８，２）を２００μｅ加え、こ
れをセファデックスＧ−２５のカラム（径１Ｇ×３０α
）でゲルろ過した。０．１ Ｍ ）リス塩酸緩衝液（０
，１％ＢＳＡ、１０ｍＭＥＤＴＡ、Ｉ）Ｈ８，２）で溶
出し、各画５〕の放射能を測定し、第１の放射能ピーク
の内分を集め、（１２５■）−Ｔｙｒ４２−ｈＰＴＨ（
４８−６８）含有区分を得た。
ヲ小試験管にとり １２Ｊ １ｍＣ１を加えた後、Ｔｙ
ｒ４２− ｈ ＰＴＨ（４３−６８） （Ｃａｌｂｉ
ｏｃｈｅｍ社製）１１２．５μｇ を加え、さらにクロ
ラミンＴ（１１１ｇ、／ ｍｌの００５Ｍりん酸緩衝液
（ｐＨ７，４）溶液）、１０７ｚｌを加えて撹拌し、ピ
ロ亜硫酸ナトリウム（１，２ｆｆｇ／−の０．０５Ｍり
ん酸緩衝液（ｐＨ７，４８，２）を２００μｅ加え、こ
れをセファデックスＧ−２５のカラム（径１Ｇ×３０α
）でゲルろ過した。０．１ Ｍ ）リス塩酸緩衝液（０
，１％ＢＳＡ、１０ｍＭＥＤＴＡ、Ｉ）Ｈ８，２）で溶
出し、各画５〕の放射能を測定し、第１の放射能ピーク
の内分を集め、（１２５■）−Ｔｙｒ４２−ｈＰＴＨ（
４８−６８）含有区分を得た。
実施例 ２
次のような構成試薬からなるＰ Ｔ Ｈ測定用ラジオイ
ムノアッセイキットを作製した。
ムノアッセイキットを作製した。
１、ＰＴＨ標準液
ｈＰＴＨ（１−８４）
Ｏｐｇ／ｍｌ ５ ｍｌ １バイアル１０
０ ｐｇ／ｗｔ Ｌｍｔ １バイアル２０
０ ｐｇ／ｘｔ １ ｍｌ １バイアル４
００ ＋）ｇ／ｇｌ１Ｍ１１バイアル８００ ｐｇ／鹸
１ ｍｌ １バイアル１６００ ｐｇ／ｍ
ｅ １肩ｌ １バイアル３２００ ［）ｇ／
譚／ １ ｍｔ１バイアル２、ＰＴＨ抗血清液 抗ＰＴＨニワトリ血清 １０．５ｍ／１バイアル１
（’２５Ｉ）ＰＴＨ液 （１２５Ｉ）−Ｔｙｒ４２−ｈＰＴＨ（４３−６８）１
、１７１Ｃ４／ １１肩ｔ １バイアル４、 第二抗体
液 抗ニワトリＩｇＧ ヤギ血清 １．０．５ ｍｌ
１バイアル参考例 Ｉ Ｐ Ｔ Ｈ標準液は、ｈＰＴＨ（１−８４）を１０％ヒ
ト血清を含む０．１ Ｍ トＩＪス塩酸緩衝液（１０ｍ
ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，２） で各濃度に希釈シテ調製し
た。
０ ｐｇ／ｗｔ Ｌｍｔ １バイアル２０
０ ｐｇ／ｘｔ １ ｍｌ １バイアル４
００ ＋）ｇ／ｇｌ１Ｍ１１バイアル８００ ｐｇ／鹸
１ ｍｌ １バイアル１６００ ｐｇ／ｍ
ｅ １肩ｌ １バイアル３２００ ［）ｇ／
譚／ １ ｍｔ１バイアル２、ＰＴＨ抗血清液 抗ＰＴＨニワトリ血清 １０．５ｍ／１バイアル１
（’２５Ｉ）ＰＴＨ液 （１２５Ｉ）−Ｔｙｒ４２−ｈＰＴＨ（４３−６８）１
、１７１Ｃ４／ １１肩ｔ １バイアル４、 第二抗体
液 抗ニワトリＩｇＧ ヤギ血清 １．０．５ ｍｌ
１バイアル参考例 Ｉ Ｐ Ｔ Ｈ標準液は、ｈＰＴＨ（１−８４）を１０％ヒ
ト血清を含む０．１ Ｍ トＩＪス塩酸緩衝液（１０ｍ
ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，２） で各濃度に希釈シテ調製し
た。
参考例 ２
ＰＴＨ抗血清液は、抗原としてウシＰＴＨを二’７ ト
ＩＪ Ｉｃ免疫させて、Ｈｒｕｓｋａらの方法（Ｊ、
Ｃｌ１ｎ■ｎｖｅｓｔ、 Ｖｏｌ、 ５６ 、ｐｐ３
９−４５、（１９７５）に従って調製した。
ＩＪ Ｉｃ免疫させて、Ｈｒｕｓｋａらの方法（Ｊ、
Ｃｌ１ｎ■ｎｖｅｓｔ、 Ｖｏｌ、 ５６ 、ｐｐ３
９−４５、（１９７５）に従って調製した。
参考例 ３
（１２５■）−Ｔｙｒ ４ ２ − ｈ ＰＴＨ
（４３−６８）は、実施例１で得られたものを０．１
Ｍ ｌ−ＩＪス塩酸緩衝液（０，１９６Ｂ Ｓ Ａ、ｔ
ＯｍＭＥＤＴＡ％ｐＨ８，２）を用いて希釈して調製
した。
（４３−６８）は、実施例１で得られたものを０．１
Ｍ ｌ−ＩＪス塩酸緩衝液（０，１９６Ｂ Ｓ Ａ、ｔ
ＯｍＭＥＤＴＡ％ｐＨ８，２）を用いて希釈して調製
した。
参考例 ４
抗ニワトリＩｇＧ ヤギ血清は、市販品のニワトリＩｇ
Ｃｑ↑ギに皮下注射して感作させて採血し、遠心分離し
て１ｆ［Ｌ清を取得した。これにポリエチレングリコー
ルを加えて第二抗体液とした。
Ｃｑ↑ギに皮下注射して感作させて採血し、遠心分離し
て１ｆ［Ｌ清を取得した。これにポリエチレングリコー
ルを加えて第二抗体液とした。
応用例
番号（１〜１８）を記入した小試験管を準備し、Ｎα１
．２はトータルカウント用、Ｎα３．４は非特異的結合
値（ＮＳＢ ）用、Ｎα５〜１８は標準曲線用とした。
．２はトータルカウント用、Ｎα３．４は非特異的結合
値（ＮＳＢ ）用、Ｎα５〜１８は標準曲線用とした。
ＰＴＨ標準ＨＯｐＶ／ ｍｅ ８００ｕｅをＮａ ８．
４に分注し、各標準液（０，１’Ｏ’０，２００．４０
０．８００．１６００，８２００ｐ９／厘／）２００μ
ｌずつをＮα５〜１８に分注した。
４に分注し、各標準液（０，１’Ｏ’０，２００．４０
０．８００．１６００，８２００ｐ９／厘／）２００μ
ｌずつをＮα５〜１８に分注した。
諌
被層血清２００μｅを別に準備した検体用試験管（２本
）にそれぞれ分注した。
）にそれぞれ分注した。
ＰＴＨ抗血清１００μｌを定３．４を除（すべての試験
管に加え、ポルテックスミキサーを用いて混和した。
管に加え、ポルテックスミキサーを用いて混和した。
室温で４時間放置した。
（１２Ｊ）ＰＴＨ液１００１ｔｊ’ヲｔヘテ（Ｄ５−ユ
−フニ加え、ポルチックミキサーを用いて混和した。
−フニ加え、ポルチックミキサーを用いて混和した。
氷水中に１８時間放置した。
第２抗体液１ ｔｉｅをＮα１．２を弥くすべての試験
−；− 管に分注し、ポルテックスミキサを用いて混和した。
−；− 管に分注し、ポルテックスミキサを用いて混和した。
氷水中に１時間放置した。
Ｎα１．２を除くすべて試験管を冷却遠心分離（３００
０１ｍ、 ２〜８°０１２０分間）した。
０１ｍ、 ２〜８°０１２０分間）した。
上ｙＷ Ｈをアスピレータを用いて吸引除去し、すべて
の試験管の放射能をガンマ−カウンターで測定した。
の試験管の放射能をガンマ−カウンターで測定した。
放射能測定結果から次式により結合率を計算した。
（Ｂｏ）−（ＮＳＢ）
ｆＢｌ 被検試料または各標準液の平均測定値（Ｂ
Ｌ） ＮＳＢ 平均測定値 （Ｂｏ） 標準液Ｏｐｇ／ゴの平均測定値片対数グラ
フ用紙の横軸にＰＴＨ漂準液の各濃度をとり、縦軸に各
標準液に対応するＢ／Ｂｏ（％９をプロットして標準曲
線を作成した。
Ｌ） ＮＳＢ 平均測定値 （Ｂｏ） 標準液Ｏｐｇ／ゴの平均測定値片対数グラ
フ用紙の横軸にＰＴＨ漂準液の各濃度をとり、縦軸に各
標準液に対応するＢ／Ｂｏ（％９をプロットして標準曲
線を作成した。
被検試料のＢ ／ Ｂｏ Ｋｌを同様に計算し、標準曲
線からＰＴＨａ度を読み取った。
線からＰＴＨａ度を読み取った。
測定管理として、Ｂｏ／Ｔ（％ｌを計算し、トレーサー
と抗体の結合力価を求める。
と抗体の結合力価を求める。
比較例
Ｔｙｒ ４３ ｈ ＰＴ’Ｈ（４４−６８） （Ｂｅ
ｋｅｍ社製）を用いて実施例１および参考例３と同様に
して（１２５Ｉ）−Ｔｙｒ４８ｈＰＴＨ（４４−６８）
を調製した。これを対照として、応用例に記載の操作法
で操作し、両者の結合率の相違をみた。その結果を下表
に示した。
ｋｅｍ社製）を用いて実施例１および参考例３と同様に
して（１２５Ｉ）−Ｔｙｒ４８ｈＰＴＨ（４４−６８）
を調製した。これを対照として、応用例に記載の操作法
で操作し、両者の結合率の相違をみた。その結果を下表
に示した。
両者をそれぞれ用いて作成した標準曲線は第１図のとお
りであった。
りであった。
これらの結果から、本発明トレーサーでは十分高い結合
率が得られ、一方、対照トレーサーでは応用例のアッセ
イ時間では反応が十分でなく、高い結合率が得られない
ことが明らかである。
率が得られ、一方、対照トレーサーでは応用例のアッセ
イ時間では反応が十分でなく、高い結合率が得られない
ことが明らかである。
両トレーサーを用いて応用例記載の操作法にょり臨床検
体（患者血清）の測定を行ったところ、第２図に示した
とおり良好な正の相関が得られた。
体（患者血清）の測定を行ったところ、第２図に示した
とおり良好な正の相関が得られた。
相関係数 γ＝０゜９６８７ Ｎ＝１７回帰式 ：
Ｙ＝−０，０１６４＋１．０８３８Ｘ
Ｙ＝−０，０１６４＋１．０８３８Ｘ
第１図は、本発明トレーサーと従来法トレーサーを用い
たＲＩＡ法によって作成したＰＴＨの標準曲線を示し、
第２図はそれらにより臨床検体を測定した結果の相関図
を示す。 特許出願人 （６７７）ヤマサ醤油株式会社’／Ｔ％
＄１図
たＲＩＡ法によって作成したＰＴＨの標準曲線を示し、
第２図はそれらにより臨床検体を測定した結果の相関図
を示す。 特許出願人 （６７７）ヤマサ醤油株式会社’／Ｔ％
＄１図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）標識物質で標識された ｈＰＴＨ〔（３９〜４３）−６８〕からなるイムノアツ
セイ用試薬。 ２）標識物質が放射性同位元素である特許請求の範囲第
１項記載のイムノアツセイ用試薬。 ３）ｈＰＴＨの競合的イムノアツセイ用キツトにおいて
、トレーサーとして標識物質で標識されたｈＰＴＨ〔（
３９〜 ４３）−６８〕を構成試薬として含有することを特徴と
するイムノアツセイ用試薬キツト。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60225064A JPH0672880B2 (ja) | 1985-10-09 | 1985-10-09 | イムノアッセイ用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60225064A JPH0672880B2 (ja) | 1985-10-09 | 1985-10-09 | イムノアッセイ用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6283664A true JPS6283664A (ja) | 1987-04-17 |
| JPH0672880B2 JPH0672880B2 (ja) | 1994-09-14 |
Family
ID=16823469
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60225064A Expired - Fee Related JPH0672880B2 (ja) | 1985-10-09 | 1985-10-09 | イムノアッセイ用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0672880B2 (ja) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5112922A (en) * | 1974-07-19 | 1976-01-31 | Eiken Chemical | Kasuitaihorumonno sokuteihoho |
| JPS5730953A (en) * | 1980-07-15 | 1982-02-19 | Imuno Niyuukuriaa Corp | Radioimmunoassay of accessory thyroid glands |
| JPS5781448A (en) * | 1980-11-11 | 1982-05-21 | Toyo Jozo Co Ltd | Human parathyroid hormone (1-38) fragment |
| JPS57126456A (en) * | 1980-12-29 | 1982-08-06 | Toyo Jozo Co Ltd | Peptide for determining human parathormone |
| JPS57184969A (en) * | 1981-04-16 | 1982-11-13 | Toyo Jozo Co Ltd | Measuring method for immunity of homo-pth |
| JPS5824860A (ja) * | 1981-03-16 | 1983-02-14 | Toyo Jozo Co Ltd | ヒト−ｐｔｈの測定法 |
| JPS5855449A (ja) * | 1981-09-25 | 1983-04-01 | Toyo Jozo Co Ltd | ｈ−ＰＴＨ誘導体 |
-
1985
- 1985-10-09 JP JP60225064A patent/JPH0672880B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5112922A (en) * | 1974-07-19 | 1976-01-31 | Eiken Chemical | Kasuitaihorumonno sokuteihoho |
| JPS5730953A (en) * | 1980-07-15 | 1982-02-19 | Imuno Niyuukuriaa Corp | Radioimmunoassay of accessory thyroid glands |
| JPS5781448A (en) * | 1980-11-11 | 1982-05-21 | Toyo Jozo Co Ltd | Human parathyroid hormone (1-38) fragment |
| JPS57126456A (en) * | 1980-12-29 | 1982-08-06 | Toyo Jozo Co Ltd | Peptide for determining human parathormone |
| JPS5824860A (ja) * | 1981-03-16 | 1983-02-14 | Toyo Jozo Co Ltd | ヒト−ｐｔｈの測定法 |
| JPS57184969A (en) * | 1981-04-16 | 1982-11-13 | Toyo Jozo Co Ltd | Measuring method for immunity of homo-pth |
| JPS5855449A (ja) * | 1981-09-25 | 1983-04-01 | Toyo Jozo Co Ltd | ｈ−ＰＴＨ誘導体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0672880B2 (ja) | 1994-09-14 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |