JPS6310736A

JPS6310736A - 免疫学的アジュバント

Info

Publication number: JPS6310736A
Application number: JP62092947A
Authority: JP
Inventors: ジョン、エル、カントレル
Original assignee: Ribi Immunochem Research Inc
Current assignee: Ribi Immunochem Research Inc
Priority date: 1986-04-15
Filing date: 1987-04-15
Publication date: 1988-01-18
Also published as: FR2598622B1; JPH041728B2; GB2189141A; FR2598622A1; FR2596990B1; US4806352A; GB2189141B; AU574014B2; ES2005166A6; FR2596990A1; CA1300503C; IT8747855A0; IT1205819B; AU7156687A; DE3712767C2; GB8709023D0; DE3712767A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は一般的に免疫学的アジュバントに関する。−面
に４ｊいて、本発明は、抗原に対する免疫応答性を高め
、もってワクチンにおいて使用される免疫学的アジュバ
ント系に関する。他面において、本発明は、生物学的ア
ジュバントと併用される脂質エマルジョン系及び抗原を
含有する免疫学的アジュバント系に関する。本発明は、
免疫学的アジュバントの製造方法及び抗原に対する免疫
応答性を高めるためのその用途にも関する。

本発明以前に、多数の抗原に対する免疫応答性、特にワ
クチンに対する免疫応答性を増強する様々なアジュバン
ト類が文献で報告されてきた。フロイント完全又は不完
全アジュバントは、大半の他のアジュバントに匹敵する
古典的アジュバントとして考えられることが知られてい
る。しかしながら、それらの反応原性（ｒｅａｅｔｏｇ
ｅｎｌｃｉｔｙ）は動物又はヒトにおけるかかる一アジ
ュバントの臨床的使用を妨げている。他の物質、例えば
鉱油及び水酸化アルミニウムはアジュバントとしても使
用されるｂ（、それらは常に欠点を有する。例えば、油
は組織刺激を生じることが知られており、水酸化アルミ
ニウムは最少限でしか抗体応答性を高めることができな
い。しかも多数の市販アジュバントはヒトで代謝されな
い成分を含有しており、したがってこのことはそれらの
使用を極めて制限する。

更に、現在使用されている大半のアジュバントは、ワク
チン及びアジュバント系を処方する上で、時間のかかる
操作、及び特定の場合にば手間がかかりかつ高価な装置
の使用を必要とすることから、製造が困難である。

近年、感染と免疫（Ｉｎｆ’ｅｃＬｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉ
ａ＋ｌｌ１ｕｎｌＬｙ）　。

第２８巻、第３号、第９３７−９４３頁。

１９８０年においてレイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）ら
により報告されているように、代謝性脂質エマルジョン
のあるアジュバント活性が不活化ウィルスワクチンにお
いて発見された。この研究では、かかる脂質エマルジョ
ンアジュバントは不活性化ウィルス抗原に対するいくつ
かの温血動物種の免疫応答性を有意に高めることが示唆
されている。水性ワクチン中グリセロール及びレシチン
で乳化された高精製ピーナツ浦からなるこの脂質エマル
ジョンは、他の油基質アジュバント以上の利点を有する
ことも示唆されている。例えば、エマルジョンの脂質成
分は、ヒト又は動物で使用された場合に、正常な宿主に
よって代謝可能であり、しかも緩和な攪拌により簡単に
乳化され、比較的非反応原性でもある。

アメリカン・ジャーナル拳オブ・ベテリナリーＱリサー
チ（ＡＩＩｌｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ’　
ＶｅＬｅｒｉｎａｒｙＲｅｓｅａｒｃｈ）　、第４４巻
、第１号、第７２−７５頁。

１９８３年では、異なるエマルジョンアジュバントを含
有する不活化ウィルスワクチンの比較が記載されている
。この論文において、免疫研究では鉱油アジュバント類
及びレイノルズらの文献に記載された脂質エマルジョン
アジュバントの有効性に関して顕著な差違を示すことが
明らかにされている。

しかしながら、文献では本発明以前にアジュバントとし
ての代謝性脂質エマルジョンの用途を開示しているもの
の、免疫応答性を更に増強させ得るように他の成分と併
用された代謝性脂質エマルジョンの用途については開示
されていない。

広汎な面において、本発明は免疫学的アジュバント、そ
の製造方法及び抗原に対する免疫応答性を増強せしめる
その用途に関する。

上記のように、本発明は新規免疫学的アジュバント、そ
の製造及びその用途に関する。

本発明の新規免疫学的アジュバントは下記のものからな
る：１、ａ）代謝性油、ｂ）低分子量ポリオール、Ｃ）レシチン、を含有する脂質エマルジョン系（ＬＥＳ）　、及び２、
精製無毒化細菌生物学的アジュバント；但し精製無毒化
エンドトキシン（ＲＤＥ）　、トレハロースジミコレー
ト（ＴＤＭ）　、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｌｍｕｒｌｕｍ）由来タンパ
ク質（ＳＴＭ）等であるが、格別限定されない。

本発明の免疫学的アジュ１＜　：／　）、、は、ウィル
ス、細菌、真菌又は原生動物の抗原をはじめとする天然
及び合成双方の広汎な抗原に対する免疫応答性を著しく
高めることが見出された。本発明の免疫学的アジュバン
ト系で使用される抗原において唯一必要とされることは
、それが宿主中で免疫応答を発現することができ、かつ
応答が併用される本発明のアジュバントにより高められ
ることである。

本発明のアジュバントは、遺伝子工学処理タンパク質た
る抗原及びイン・ビトロ合成ペプチドたる抗原に対する
免疫応答性を高めるためにも使用される。これら抗原と
しては、ポリオウィルス、インフルエンザウィルス、エ
イズ関連ウィルス、肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、
サイトメガロウィルス、口蹄疫ウィルス、ネコ白血病ウ
ィルス、狂犬病ウィルス、感染性ウシ鼻腔気管炎ウィル
ス、ウシ下痢ウィルス、ニューカッスル病ウィルス、家
禽肝炎ウィルス、豚コレラウィルス、偽狂犬病ウィルス
、マラリアペプチド等に関連した抗原があるが、これら
に格別限定されない。本発明のアジュバント系は、ジフ
テリア菌、破傷風菌、腸毒素原大腸菌及び百日咳菌由来
のトキソイドのような天然タンパク質と一緒でも使用さ
れる。

肺炎双球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ
エ（ｌＩｅｎ＋ｏｐｈｌｌｕｓ　ｌｎｆ’１ｕｅｎｚａ
ｅ　）もしくは真菌類の莢膜由来多糖類、又はダラム陽
性菌もしくはダラム陰性菌双方の細胞壁由来多糖類のよ
うな多糖類ワクチンに対する免疫応答硅は、アジュバン
ト系により高められる。

更に、不活性されたすべてのウィルス、細菌、真菌又は
原生動物からなるワクチンは、本アジュバント系におい
てより高、い免疫能を有する。これらのものとしては、
上記病原体の他に、ミコ細菌、クロストリジウム菌、腸
内バチルス菌、ワクシニアウィルス等がある。

上記のように脂質エマルジョン系及び適切な精製細菌ア
ジュバント双方を含Ｈする本発明のアジュバントは、抗
原を補助する上でいずれかの単独成分よりも有効である
ことが判明した。事実、両成分の使用は、各成分の合計
有効率よりも優れた高い効果を発揮する。

しかも、本発明の免疫学的アジ−ユバントに使用される
脂質エマルジョンは、代謝可能であるという特徴を有し
ており、したがって鉱油のような従来のアジュバントに
は見られない望ましい性質を示す。前述のように、鉱油
等の非代謝性アジュバントは動物において肉芽腫応答を
誘導するため、ヒトの治療には使用し得ないことが知ら
れている。

更に、抗原及び本発明の免疫学的アジュバントを含有す
るワクチンのような組成物の製造コストは、従来の油中
水型エマルジョンよりも著しく低いことも認められた。

本発明のアジュバント系を製造するにはより少ない時間
で済むため、更に節約することもできる。

上述のように、本発明の免疫学的アジュバントの第一成
分は、代謝性油、グリセリン等の低分子量ポリオール及
びレシチンを含有する脂質エマルジョ、ン系（ＬＥＳ）
である。実際面では、代謝性油は好ましくは主にオレイ
ン酸及びリノール酸のジグリセリド類及びトリグリセリ
ド類からなる脂肪油であることが判明した。特に好まし
くは、ピーナツ油、ヒマワリ種子油、ベニバナ種子油、
コーン油等の中に含まれ又はそれらから得られたものの
ような脂肪植物油である。オリーブ油、綿実油又はスク
アレンのような他の油類も本発明のアジュバントに使用
することができる。このように、主な基準は、油が代謝
可能であって、エマルジョン系の他の成分及びアジュバ
ント自体と融和性があり、しかも抗原に対する免疫応答
を高めるために他の成分と併用されても有効であること
である。

実際には、広汎なポリオール類が脂質エマルジョン系に
おいて使用することができる。使用されるポリオール類
は、液体であって代謝性油と混和可能であり、しかもレ
シチン成分が溶解し得る低分子量ポリオールである。適
切なポリオール類としては、特にエチレングリコール、
１．２−プロパンジオール、１．３−プロパンジオール
、グリセリン、１，４−ブタンジオール、１．３−ブタ
ンジオール、１．２．４−ブタントリオール、１゜５−
ベンタンジオール等がある。

上記のように、脂質エマルジョン系の第三成分はレシチ
ンである。明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって
用いられる“レシチン°という語は、下記一般式のリン
脂質類をいずれも包含する意味である：ＣＨ２０ＰＯ２０ＨＲ３上記式中、Ｒ及びＲ２は炭素原子２２個以下の脂肪酸で
あり、Ｒ３はコリンである。これらのリン脂質は、通常
、リン酸コリンエステルに結合するステアリン酸、パル
ミチン酸、リノール酸又はリルン酸の脂肪酸のジグリセ
リド類の混合物である。

代謝性油、ポリオール及びレシチンからなる脂質エマル
ジョン系の３成分は公知物質であり、かつ市販されてい
る。脂質エマルジョン系で使用される３成分は、当然に
高度に精製されており、薬学−１−許容される等級のも
のである。

実際面において、脂質エマルジョン系は代謝性油約３０
〜約６０重量％、低分子量ポリオール約３０〜約６０重
量％及びレシチン約１〜約１５重二％を含有するのが好
ましいことが判明した。

脂質エマルジョン系の製造法を説明すると、まず無菌レ
シチン１部（１０ｇ）は棒磁石で攪拌しながらホットプ
レート上６０℃で温和に加熱することにより白色グリセ
リン１０部（１００ｇ）に溶解される。使用前に、グリ
セリンはそれを０．２μｍフィルターユニットに通過さ
せることにより無菌化される。次いで、グリセリン及び
レシチン混合物は無菌ブレングーカップ中に入れられ、
０．２μｍフィルターで同様に無菌化されたピーナツ油
１０部（１００ｇ）が中速度で混合しながらグリセリン
及びレシチン混合物に徐々に加えられる。

免疫学的アジュバントの第二成分は精製無毒化細菌アジ
ュバントである。特に好ましいのは以下ＲＤＥと称され
る精製無菌化エンドトキシンであり、サルモネラ属のＲ
ｅ変異株から得られる。無毒化エンドトキシンは、参考
のため本明細書に包含される米国特許第４，４３６．７
２８号明細書に記載されている他の腸内細菌からも得る
ことができる。無毒化エンドトキシンは合成により及び
遺伝子工学技術によっても製造し得る。他の精製無毒化
細菌アジュバントも単独で又はＲＤＥと一緒に使用され
、これらにはトレハロースシミコレ−ト（ＴＤＭ）　、
サルモネラ・チフィムリウム由来タンパク質（ＳＴＭ）
等があるが、格別限定されない。

本発明の免疫学的アジュバント系の製造において、抗原
及び第二成分は、無菌塩水中の抗原を同様に無菌塩水中
の精製無毒化エンドトキシンに加えることにより別々に
製造されるが、この場合に抗原濃度は約１〜約１０００
μｇ１０．２ｍｌ、エンドトキシン濃度は約２５〜約２
００μｇ７０．２ｍｌである。

脂質エマルジョン系、生物学的アジュバント及び抗原を
含有する本発明の免疫学的アジュバントは、好都合には
、まず脂質エマルジョン系を形成するために代謝性油、
ポリオール及びレシチンを混合することにより製造され
る。上記精製無毒化エンドトキシンは別個に無菌塩水中
で調製され、この塩水中に同様に無菌塩水中の抗原が加
えられる。次いで、抗原及び精製無毒化エンドトキシン
含有の無菌塩水はｒＮ１質エマルジョン系に加えられ、
混合物はエマルジョンが得られるまで撹拌機又はブレン
グー中で混合される。

実際面において、抗原−ＲＤＥ溶液３容量部が脂質エマ
ルジョン系１容量部に加えられ、混合物は白色乳化液（
エマルジョン）を得るために上記のように混合される。

エマルジョンを得るための２成分の混合は、通常２〜５
分間で終了する。

免疫学的アジュバントの２成分の最適比は抗原−ＲＤＥ
塩溶液３容量部対脂質エマルシコン系１容は部であるが
、抗原−ＲＤＥ混合物対脂質エマルジョン系の比は約１
＝１〜約８＝１であって、約３：１の比が好ましい。

上記方法により、エマルジョンが抗原水溶液として得ら
れるが、この溶液は抗原の緩徐な放出、抗原性刺激の持
続化、及び無毒化細菌アジュバントにより誘導される抗
原近くの細胞刺激を生じる。

活性のこの組合せが、後記実施例の表１から明らかなよ
うに、宿主の抗原応答を高める。

上記のように、様々な抗原と混合される本発明の免疫学
的アジュバントは、かかる抗原に対する免疫応答を高め
ることから、動物及びヒト双方の宿主用のワクチンとし
て使用される。

本発明のアジュバントは、遺伝子工学処理タンパク質た
る抗原及びイン・ビトロ合成ペプチドたる抗原に対する
免疫応答性を高めるために使用される。これらの抗原と
しては、ポリオウィルス、インフルエンザウィルス、エ
イズ関連ウィルス、肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、
ティトメガロウィルス、口蹄疫ウィルス、ネコ白血病ウ
ィルス、狂犬病ウィルス、感染性ウシ鼻腔気管炎ウィル
ス、ウシ下痢ウィルス、ニューカッスル病ウィルス、家
禽肝炎ウィルス、豚コレラウィルス、偽狂犬病ウィルス
、マラリアペプチド等に関連した抗原があるが、格別限
定されない。本発明のアジュバント系は、ジフテリア菌
、破傷風邪菌、腸毒素原大腸菌及び百日咳菌由来のトキ
ソイドのような天然タンパク質と一緒でも使用される。

肺炎双球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ
エもしくは真菌類の莢膜由来多糖類、又はダラム陽性菌
もしくはダラム陰性菌双方の細胞壁由来多糖類のような
多糖類ワクチンに対する免疫応答性は、アジュバント系
で一層高められる。

更に、不活性されたすべてのウィルス、細菌、真菌又は
原生動物からなるワクチンは、本アジュバント系におい
てより高い免疫能を有する。これらのものとしては、上
記病原体の他に、ミコ細菌、クロストリジウム菌、腸内
バチルス菌、ワクシニアウィルスその他がある。

実際上は、精製無毒化エンドトキシンは約２５〜約２０
０μｇ／１回投与の濃度で使用され、特に高い免疫応答
性は約１００μｇ／１回投与で得られることが判明した
。所望であれば、他の成分又は添加物が本発明のアジュ
バントと一緒に使用することができる。

下記例は本発明の実例である。

例　　１０蹄疫ウイルスペプチド（ＦＭＤ）単独で、及び本発明
の免疫学的アジュバントと一緒に免疫されたマウスの抗
体応答を測定した。６〜８週令迎合ＬＢ／Ｃマウスにロ
蹄疫ウィルス合成ペプチド（ＦＭＤ）を１回皮下注射（
０，２ｍ１）　した。

投与量は２００μｇ／マウスであった。別の注射では、
ＦＭＤはＲＤＥ及び／又はＬＥＳと併用された。ＲＤＥ
を１００μｇのｍｍで投与した。

ＬＥＳを１：１ｖ／ｖ比でＦ　Ｍ　Ｄ水溶液と混合した
。混合物を室温で約２分間攪拌した。マウスがら、接種
後の様々な時点で眼窩静脈より採血した。

得られた結果は下記表Ｉに記載されている：＊＊　口蹄
疫ペプチド（ＦＭＤ）は、スクリップス・クリニックや
アンド・リサーチ書ファンデーション（Ｓｃｒｉｐｐｓ
　Ｃ１１ｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｏｕｎ
ｄａ−Ｌｉｏｎ）　、う・ジョラ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）
　、カリフォルニアのジエイ・ビトル博士（Ｄｒ、　Ｊ
、Ｂｉｔｔｌｃ）から入手した。それはスクリップスの
科学者により合成されたもので、ＦＭＤペプチド６５と
称される：それは使用前に破傷風トキソイドと結合せし
められた。

２成分系免疫学的アジュバントの使用が予想外かつ驚異
的に免疫応答性を高め、その結果抗原性刺激を著しく持
続化させることは、得られたデータより明らかである。

特に１００μｇ用量のＲＤＥが使用された場合には、更
に著しく高い免疫応答性が観察された。

例２この実験では、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（マウス６匹／１群
）に下記の皮下注射（０、２ｍｌ　／動物）をした二群
１．塩水中のデキストラン１００μｇ；群２．塩水中の
デキストラン１００μｇ　＋　ＲＤ　Ｅ５０μｇ；群３
１等容量のＬＥＳ中で乳化されデキストラン１００μｇ
＋ＲＤＥ　　５０μｇ；群４；ＲＤＥ　　５０μｇ＋）
レバロースシミコレート（ＴＤＭ）５０μｇの凍結乾燥
エマルジョン含有バイアル中で乳化されたデキストラン
１００μｇ；群５．抗原なし。

第１回免疫後２０日目に、各群のすべてのマウスは、第
１回注射と同様に調製された第２回注射の投与をうけた
。

各血清試料を免疫後の様々な時点で数回採血することに
より集めた。

得られた結果は下記表Ｈに記載されている。

本結果は各群における・１ノ均逆数力値として示されて
いる。各血清試料用の開始希釈倍率は１：１０であった
。括弧内の数値は０．１Ｍ２−メルカプトエタノール処
理血清の平均力価であって、ＩｇＧ抗体に基因する応答
性を示す。

出願人代理人　　佐　　藤　　−雄手続相１正書（方式）昭和６２年７月λゾ日

Claims

【特許請求の範囲】１、（１）（ａ）代謝性油、（ｂ）低分子量ポリオール、（ｃ）レシチン、を含有する脂質エマルジョン系、及び（２）精製無毒化細菌アジュバントからなる免疫学的ア
ジュバント。２、代謝性油が、主に、オレイン酸及びリノール酸のジ
グリセリド類及びトリグリセリド類からなる脂肪油であ
る、特許請求の範囲第１項記載のアジュバント。３、代謝性油が植物油又は動物油である、特許請求の範
囲第１項又は第２項記載のアジュバント。４、植物油がピーナツ油、ヒマワリ種子油又はベニバナ
種子油である、特許請求の範囲第３項記載のアジュバン
ト。５、動物油がスクアレンである、特許請求の範囲第３項
記載のアジュバント。６、脂質エマルジョン系が、代謝性油約３０〜約６０重
量％、ポリオール約３０〜約６０重量％及びレシチン約
１〜約１５重量％からなる、特許請求の範囲第１〜５項
のいずれか一項に記載のアジュバント。７、抗原及び特許請求の範囲第１〜６項のいずれか一項
に記載の免疫学的アジュバントを含有するアジュバント
系。８、抗原及び精製無毒化細菌アジュバントが無菌塩溶液
中に存在する、特許請求の範囲第７項記載のアジュバン
ト系。９、無菌塩溶液中の抗原濃度が約５〜約５０００μｇ／
ｍｌであり、無菌塩溶液中の精製無毒化細菌アジュバン
ト濃度が約１２５〜１０００μｇ／ｍｌである、特許請
求の範囲第８項記載のアジュバント。１０、脂質エマルジョン系が代謝性油約３０〜約６０重
量％、ポリオール約３０〜６０重量％及びレシチン約１
〜約１５重量％からなり、しかも、無菌塩溶液中の抗原
濃度が約５〜約５０００μｇ／ｍｌで、無菌塩溶液中の
精製無毒化細菌アジュバント濃度が約１２５〜１０００
μｇ／ｍｌである、特許請求の範囲第７項記載のアジュ
バント。１１、精製無毒化細菌アジュバントが精製無毒化エンド
トキシン、トレハロースジミコレート又はサルモネラ・
チフィムリウム由来タンパク質である、特許請求の範囲
第１〜１０項のいずれか一項に記載のアジュバント。１２、精製無毒化細菌アジュバントが精製無毒化エンド
トキシンである、特許請求の範囲第７項記載のアジュバ
ント。