JPS63190863A - γ−Ｌ−グルタミル−ｐ−アミノアニリド誘導体及びこれを用いるγ−ＧＴＰの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の分野〕 本発明は、Ｔ−グルタミルトランスフェラーゼ（以下、
γ−ＧＴＰという）の測定方法に関するものである。　
　　・ γ−ＧＴＰは肝臓機能検査上、重要な指標となる生体酵
素で、ｒ−ｉｃ’ｒｐの活性測定は極めて測定頻度の高
い測定項目である。

〔従来技術とその欠点〕

従来ｒ−ＧＴＰ活性値の測定には、基質としてγ−Ｌ−
グルタミルーｐ−ニトロアニリドが使用されている。し
かしながらこの基質は酵素反応を行うための緩衝液に極
めて溶は難く、そのための可溶化剤の使用を必要として
いる。且つ酵素反応によって生成したｐ−ニトロアニリ
ン量を波長４１０ｎ＋ｗの吸光度で測定しているので、
血清成分中に存在する同波長域に吸収を持つ物質、詩に
ビリルピンの影響は避けられないと言う欠点を有する。

〔発明の目的〕

本発明者らはかかる欠点に鑑み鋭意研究の結果、γ−Ｌ
−グルタミルーｐ−アミノアニリド誘導体ＣＩ）又はそ
の塩であって上記欠点を悉く解消し、基質としてのｒ−
ＧＴＰの反応性が高く且つ十分な溶解性を有し、測定の
波長も４１０ｎｍよりも長波長域で測定できる等の極め
て顕著な効果を奏するものを見出すに至った。

〔発明の構成〕

本発明は、一般式 （式中、Ａは低級アルキレン基を表わし、Ｒ１およびＲ
ｚはそれぞれ低級アルキル基を表わす、）で示されるγ
−Ｌ−グルタミルーｐ−アミノアニリド誘導体又はその
塩及びこれを基質として用いることを特徴とするγ−〇
ＴＰＯ測定方法である。

本発明のγ−Ｌ−グルタミルーｐ−アミノアニリド誘導
体ＣＩ）又はその塩の例としてはｒ−Ｌ−グルタミルー
〇−メチル−ｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル
アミノ）アニリド、γ−Ｌ−グルタミルー〇−エチエチ
ｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシプロピルアミノ）ア
ニリド又はこれらの塩が挙げられる。

本発明のγ−Ｌ−グルタミルーｐ−アミノアニリド誘導
体（１）又はその塩は、通常、例えば次のような方法に
より容易に製造することができる。

即ち、例えばＮ−フタリル−γ−Ｌ−グルタミン酸無水
物等のＮ−保護−γ−Ｌ−グルタミン酸無水物と一般式 （式中、Ａは低級アルキレン基を表わし、Ｒ１およびＲ
ｚはそれぞれ低級アルキル基を表わす。）で示されるｐ
−フェニレンジアミン誘導体ＣＩ＋）とを反応させて、
Ｎ−フタリル−γ−Ｌ−グルタミルーｐ−アミノアニリ
ド誘導体等のＮ−保護−γ−Ｌ−グルタミルーｐ−アミ
ノアニリド誘導体を得、次いで自体公知の方法例えば常
法によりフタリル基等の保護基を除去し、本発明のγ−
Ｌ−グルタミルーｐ−アミノアニリド誘導体（ｒ）又は
その塩を得る。

本発明に係る低級アルキレン基の例としてはメチレン基
、エチレン基、プロピレン基等の炭素数１〜５の低級ア
ルキレン基が挙げられ、低級アルキル基の例としてはメ
チル基、エチル基、プロピル基等の炭素数１〜５の低級
アルキル基が挙げられる。Ｒ１とじてはメチル基又はエ
チル基が好ましい。

前段の反応に際し、Ｎ−保護−γ−Ｌ−グルタミン酸無
水物はｐ−フェニレンジアミン誘導体Ｃ１１）に対して
当量若しくはやや過剰に使用するのが好ましく、要すれ
ば溶媒例えばクロロホルム、ジクロルエタン等を使用し
、必要に応じて有機酸例えば酢酸等を共存させて、通常
は２０−１００’Ｃで反応させる０反応終了後は常法に
従ってＮ−保護−ｒ−Ｌ−グルタミルーｐ−アミノアニ
リド誘導体を分離し、次に例えばヒドラジンを、要すれ
ば溶媒の存在下に反応させる。ヒドラジンはそのままで
も水加物でもそれらの塩であっても良く、通常水加物の
使用が便利である。この反応は通常水又は溶剤を用いる
が、反応に影響を与えないものであればいずれでもよく
、例えばメチルアルコール、エチルアルコール等のアル
コール類、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテ
ル類等水溶性溶剤の使用が好ましい。

後段の反応はＮ−保護−γ−Ｌ−グルタミルーｐ−アミ
ノアニリド誘導体に対し当量若しくはやや過剰のヒドラ
ジンを用いて６０℃以下、好ましくは１０〜３０℃で行
う０反応後、常法に従い目的物を単離し、要すれば酸又
はアルカリで中和すれば所望する塩が得られる。

本発明の新規なγ−Ｌ−グルタミルーｐ−アミノアニリ
ド誘導体（１）又はその塩はｒ−ＧＴＰ活性値測定用基
質として用いられ、通常は至適条件であるｐＨ８，０〜
８，５で測定されるが、従来のγ−ＧＴＰ活性値測定用
基質として広く用いられてきたｒ−Ｌ−グルタミル−ｐ
−ニトロアニリドは上記弱アルカリ側のｐＨ範囲では溶
解度が極めて低く、たとえばＰ　Ｈ８，０の０．０５Ｍ
ホウ酸緩衝液に０．０９％（０，００３Ｍ）溶解するの
みで基質量として必要な０，０１〜０，０１５Ｍ溶液に
するには塩酸塩として熔解したのち、緩衝液でうすめ、
過飽和溶液として測定時間中かろうじて必要温度をもた
せるか、界面活性剤等で溶解を補助する必要があり、い
ずれの場合でも満足されるものではない。

しかるに本発明の新規な基質であるγ−Ｌ−グルタミル
ーｐ−アミノアニリド誘導体（１）又はその塩は優れた
溶解性を有する。たとえば前記のｒ−ｃＴｐ活性値測定
条件下で、γ−Ｌ−グルタミルー〇−メチメチｐ−（Ｎ
−エチル−１Ｎ−ヒドロキシエチルアミノ）アニリドは
８．７％（０，２８Ｍ）の溶液を作ることができ、必要
温度を容易に満すことが出来る。

一例としてγ−Ｌ−グルタミルーｐ−（Ｎ、Ｎ−ジエチ
ルアミノ）アニリドの溶解度は前記と同条件において１
．３％（０，０４５Ｍ、）であり、本発明のγ−Ｌ−グ
ルタミルーｐ−アミノアニリド誘導体（１）又はその塩
の溶解度がいかに優れているかがわかる。

加うるに工業的製造に際して溶解性が優れているので、
試薬製剤を製造するにあたっても本発明のγ−Ｌ−グル
タミルーｐ−アミノアニリド誘導体（１）又はその塩は
濃厚な状態で取り扱うことができ、たとえば凍結乾燥製
剤製造に際し、濃厚な溶液から凍結乾燥できるので蒸発
水分量が少なくてすみ省エネルギーという観点からも極
めて有利である。

本発明の新規なγ−Ｌ−グルタミルーｐ−アミノアニリ
ド誘導体（１）又はその塩はγ−ＧＴＰに対して優れた
基質反応性を有している。

その１例を挙げると本発明のγ−Ｌ−グルタミルーｐ−
アミノアニリド誘導体ＣＩ）又はその塩のｒ−ＧＴＰに
対する基質親和性（基質反応性）は従来量も広く使用さ
れてきたγ−Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドやγ
−Ｌ−グルタミルーｐ　−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）
アニリドやＴ−Ｌ−グルタミル＝ｐ−（Ｎ、Ｎ−ジエチ
ルアミノ）アニリド等と比較して優れその若干例につい
てこれを示すと表１のとおりである。

表１　基質反応性 本発明のｒ−Ｌ−グルタミル−ｐ−アミノアニリド誘導
体（１）又はその塩を基質として用いてγ−ＧＴＰ活性
値を測定するためにγ−ＧＴＰの酵素反応によって遊離
生成するｐ−フェニレンジアミン誘導体（Ｉ［）を定量
するには、芳香族アミンを比色定置する従来公知の方法
、たとえばジアゾカフプリング法やアルデヒド類と反応
させて生成するシッフ塩基を定量する方法などが適用で
きるが、酸化によって生成する着色化合物を定量する方
法は、操作の簡便性、迅速性あるいは測定値の正確度の
点で最も好ましい方法である。すなわち、ｐ−フェニレ
ンジアミン誘導体（［３を直接酸化して着色化合物を生
成させるか或は酸化縮合して着色化合物を生成する方法
、たとえばフェノール、ｍ−アセチルアミノフェノール
、ｐ−クロロフェノール、ブチルヒドロキシアニソール
などのフェノール類、１−ナフトール−２−スルホン酸
、４−クロロ−１−ナフトール−２−スルホン酸、８−
オキシキノリンなどのナフトール類等の存在下にメタ過
ヨウ素酸塩、過酸化水素とペルオキシダーゼまたは赤血
塩などの酸化剤で酸化して着色化合物に誘導して比色定
量する。

前記のほかに用いることのできるフェノール類は例えば
２．４−ジクロロ−３−メチルフェノール、２−クロロ
−３−メチル−４−メトキシカルボニルメトキシフェノ
ール、２−クロロ−３−メチル−４−カルボキシメトキ
シフェノール、２゜４−ジクロロ−３−メチル−６−ベ
ンズアミドフェノール、２，４−ジブロモ−３−メチル
フェノール、２−プロピオンアミドフェノール、２−プ
ロピオンアミド−５−メチルフェノール、２−フェニル
ジクロロメチル−４−クロロフェノール、２−メチル−
４−メタンスルホニルアミドフェノール、２−ヒドロキ
シベンズアミド、２−アセチルアミノフェノール、２．
５−ジクロロフェノール、オルトクレゾール、メタクレ
ゾール、２−クロロフェノール、３−クロロフェノール
、２−メトキシフェノール、（２−２３）３−メトキシ
フェノール、３−アセチルアミノ−５〜メチルフエノー
ル、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−２−ナフトアミド、
１−ヒドロキシ−Ｎ−フェニル−２−ナフトアミド。

前記のナフトール類以外に用いることのできるナフトー
ル類の好ましい例は、１−ヒドロキシ−２−ナフトアミ
ドである。

本発明のγ−Ｌ−グルタミルーｐ−アミノアニリド誘導
体（１）又はその塩はγ−ＧＴＰ活性値測定用の基質と
して、反応性、溶解性等に極めて優れ、正確かつ迅速に
測定できる比色定量法に導くことができ、またその簡便
さから自動分析装置への適用も容易である。

以下に実施例を述べ本発明を更に説明する。

実施例Ｉ Ｎ−フクリルーし一グルタミン酸無水物２８．４ｇと４
−アミノ−３−メチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）
−Ｎ−エチルアニリン１９．４　ｇをジオキサン１００
−にとかし、トリエチルアミン１５．２．Ｉｔ！を加え
る。油浴上で２時間還流する。その後濃縮し、残留物を
メタノール４０Ｊ！に加熱溶解する。泡水ヒドラジン４
０．ｅを加え放置すると全体が固まる。よくかきまぜ吸
引ろ過する。メタノールで十分洗浄後乾燥する。２Ｎ塩
酸で抽出し炭酸ナトリウム水溶液で中和すると目的物が
析出する。ろ取し、水洗後、メタノールで洗浄し乾燥す
る。精製は、塩酸に溶解、炭酸ナトリウム水溶液で中和
する方法をくり返す、　ｒ−Ｌ−グルタミル−〇−メチ
ルーｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ−β−ヒドロキシエチルアミ
ノ）アニリドｌ１ｇが得られた。

融点１７１〜１７８°Ｃ 実施例２ Ｎ−フタリル−し−グルタミン酸無水物２８．４　ｇと
４−アミノ−３−メチル−Ｎ−ヒドロキシプロピル−Ｎ
−エチルアニリン２０．３ｇをジオキサン１００、ｅに
とかし、トリエチルアミン１５．２−を加える。油浴上
で２時間還流する。その後濃縮し、残留物をメタノール
４０−に加熱溶解する。泡水ヒドラジン４０Ｊを加え放
置すると全体が固まる。よ（かきまぜ吸引ろ過する。メ
タノールで十分洗浄後乾燥する。２Ｎ塩酸で抽出し炭酸
ナトリウム水溶液で中和すると目的物が析出する。ろ取
し、水洗後、メタノールで洗浄し乾燥する。精製は、塩
酸に溶解、炭酸ナトリウム水溶液で中和する方法を（り
返す、ｒ−Ｌ−グルタミル−〇−メチルーｐ−（Ｎ−エ
チル−Ｎ−ヒドロキシプロピルアミノ）アニリド１２ｇ
が得られた。

融点１６７〜１７５°Ｃ 実施例３　（分析例） Ａ　試薬 （１）基質緩衝液：γ−Ｌ−グルタミルー〇−メチメチ
ｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアミノ）アニ
リド１２閣−／ｉ！、、グリシルグリシン５０ｍＭ／ｊ
！、１−ナフトール−２−スルホン酸０．２ｍＭ／ｌ、
エチレングリコール、重量％を含有する、ｐＨ８３の０
．０５Ｍ＃！ホウ酸緩衝液を調製する。

（２）酸化試薬：０．５％フェリシアン化カリウムを含
有するｐＨ８，３の０．３Ｍ＃ホウ酸緩衝液を調製した
。

Ｂ　測定操作 基質緩衝液１．０ヨｅに血清試料０．０２Ｊ！を加えて
よく混合した後３７°Ｃの恒温槽で１５分間加温する０
次いで酸化試液２０−を加えた。試料の代りに水０．０
２ョ（を用い試料と同様に操作して得られる試薬盲検を
対照として６５０ｎｍに於ける吸光度を測定した。

Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアミノ−３−メチル
−４−アミノアニリンを使用して常法に従ってあらかじ
め作成した検量線と対比して、γ−ＧＴＰ活性値を算出
した。

実施例４（分析例２） 基質として分析例１のγ−Ｌ−グルタミルー〇−メチメ
チｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアミノ）ア
ニリドの代りにγ−Ｌ−グリタミルー０−メチルーｐ−
（Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシプロピルアミノ）アニリ
ドを用い、使用例１に準じて６５０ｎｍに於ける吸光度
を測定しｒ　−Ｇ　ＴＰ活性値を算出した。

特許出願人　　富士フィルム株式会社 １、事件の表示　　　　昭和１２年詩願第２２゜６ｊ号
３、補正をす６者　ｐｏ“Ｊ！７Ｆ！ 事件との関係　　　　　　　特許出願人４、補正の対象
　　明細書の「発明の詳細な説明」の硼 ５、補正の内容 発明の詳細な説明の記載を別紙の通り補正する。

１）明細書第１４ページ第１２行の「、重量％」を「１
重量％」に訂正する。

２）同第１４ページ第１３行のｒｐＨ８３Ｊを’ＰＨ８
，３Ｊと補正する。

３）同第１５ページ第１０行の「Ｌ−グリタミ」を「Ｌ
−グルタミ」に訂正する。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 （式中、Ａは低級アルキレン基を表わし、Ｒ＾１および
   Ｒ＾２はそれぞれ低級アルキル基を表わす。）で示され
   るγ−Ｌ−グルタミル−ｐ−アミノアニリド誘導体又は
   その塩
2. （２）一般式〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 （式中、Ａは低級アルキレン基を表わし、Ｒ＾１および
   Ｒ＾２はそれぞれ低級アルキル基を表わす。）で示され
   るγ−Ｌ−グルタミル−ｐ−アミノアニリド誘導体又は
   その塩を基質として用いることを特徴とするγ−グルタ
   ミルトランスフェラーゼの測定方法。