JPS63198700A - コロニ−刺激因子及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は人尿から分離され、哺乳動物の単球−マクロフ
ァージ系細胞のコロニー形成を刺激する新規なコロニー
刺激因子とその製造法に関するものである。

［従来の技術］ コロニー刺激因子（以下Ｃ８Ｆと略記する）は、哺乳動
物の造血組織、例えば骨髄などに存在する造血幹細胞の
分化・増殖を刺激する造血因子であり、多くのＣ８Ｆは
糖蛋白質から成っている。これまで、単球−マクロファ
ージ系幹細胞に作用する因子（Ｍ−Ｃ３Ｆ又はＣ３Ｆ−
１）、顆粒球−単球系幹細胞に作用する因子（ＧＭ−Ｃ
８Ｆ）、顆粒球系幹細胞に作用する因子（Ｇ−Ｃ８Ｆ）
、更に顆粒球、単球、赤血球及び巨核球に共通な多能性
幹細胞に作用する因子（Ｍｕｌｔｉ　−ＣＳ　Ｆ、イン
ターロイキン−３又はＩＬ−３）の４種が知られている
。

Ｈｕｌｔｉ　−ＣＳＦを除く上記３種の人由来Ｃ８Ｆは
、それぞれのアミノ酸配列をコードする遺伝子ＣＤＮＡ
がクローニングされており、蛋白質構造が明らかにされ
ている［Ｇ、　Ｇ、　ｉ＋ｏｎｇら、　５ｃｉｅｎｃｅ
　。

２２８巻、８１０〜８１５頁、１９８５年；Ｅ、　Ｓ、
　Ｋａｗａｓａｋｉら、　５ｃｉｅｎｃｅ　、　　２３
０巻、２９１−２９６頁、１９８５年：　Ｓ、　ｎａｇ
ａｔａら、　Ｎａｔｕｒｅ。

３１９巻、４１５−４１８頁、１９８６年］。

人尿中に存在するＣ３Ｆとしては、単球−マクロファー
ジ系細胞に作用する因子（Ｃ８Ｆ−１又はＭ−Ｃ８Ｆ）
［Ｓ、に、　ＤａＳ　＆　Ｅ、　Ｒ，５ｔａｎｌｅｌ／
　。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅ
ｌｓｔｒｙ　、　２５７巻。

１３６７９〜１３６８４頁、１９８２年］、顆粒球コロ
ニーを刺激するＨＧＩ−糖蛋白質［特公昭６０−３０２
９１号公報］及びｃｓＦ−ＨＵ［Ｋ。

Ｈｏｔｏｙｏｓｈｉ　ら、　Ｂｆｏｏｄ　、　５２巻、
１０１２〜１０２０頁、１９７８年及びＢｆｏｏｄ　、
　６０巻、１３７８〜１３８６頁、１９８２年コが報告
されている。

それらのうち、単球−マクロファージ系細胞に作用する
上記Ｃ３Ｆ−１は完全に純化され、またその蛋白質をコ
ードするｃＤＮＡがクローニングされティる（上記、Ｅ
、　Ｓ、Ｋａｗａｓａｋｉら）。

純化Ｃ３Ｆ−１の構造は、糖鎖を含む二本のポリペプチ
ドがジスルフィド結合により、生物学的に活性なホモ２
ｆ１体を形成している。この２量体はジスルフィド結合
を還元剤により切断することにより同一の２個のサブユ
ニットを生成する。この生物学的活性を有する糖蛋白質
の、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気
泳動法により測定した分子量は、４５．０００〜６０，
０００ダルトンである。また２量体を形成するポリペプ
チドサブユニットの糖鎖を除いた分子量は１４０００〜
１７．０００ダルトンである。このＣ３Ｆ−１サブユニ
ツトのアミノ酸配列をコードしていると考えられるＣＤ
ＮＡから推定されたアミノ酸数は２２４個、分子１２６
，０００ダルトンのポリペプチドである。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明者らは人尿中に、Ｃ３Ｆ−１と同様に作用するが
、理化学的にＣ３Ｆ−１とは区別される従来知られてい
なかった新規な糖蛋白Ｃ８Ｆが存在することを見い出し
てこれを単離し、その理化学的及び生物学的性質を明ら
かにすることにより本発明を完成した。

本発明の目的は、抗ガン剤化学療法による白血球減少症
、免疫不全及び骨髄移植等に治療効果がある新規なＣ８
Ｆとその製造法を提供することにある。

即ち、本発明は、　　　　−下記の理化学的性質を有し
、且つ哺乳動物の単球−マクロファージ系細胞のコロニ
ー形成刺激作用を有する糖蛋白よりなる新規なＣ８Ｆを
提供する。

ａ）分子量 Ｃ３Ｆ−１と同様に還元剤により同一のサブユニット２
個に解離されるホモ２量体であり、ドデシル硫酸ナトリ
ウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定した分子
量が７０．０００〜９０゜ＯＯＯダルトンであって、還
元剤で解離させ、生物活性を消失させたサブユニットに
ついてドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で測定した分子量は３５．０００〜４５．Ｏ
ＯＯダルトンである。

（ハ）　サブユニットのアミノ酸配列 ホモ２量体を構成するサブユニット蛋白質は、次に示す
少なくとも１８９個のアミノ酸配列から成り、 １２２番目及び１４０番目のアスパラギン（ＡＳｎ）は
それぞれアスパラギン（ＡＳｎ）−Ｘ−スレオニン（Ｔ
ｈｒ）又はセリン（Ｓｅｒ）で表わされる典型的なＮ−
グリコシド結合部位を有する。ただしＸは任意のアミノ
酸を表わす。

Ｃ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点（ｐｌ
）は３．１〜３．７である。

ｄ）糖鎖の構成単糖 加水分解後高速液体クロマトグラフィーで分析し、糖鎖
の構成単糖として、マンノース、ガラクトース、Ｎ−ア
セチルグルコサミン及びＮ−アセチルノイラミン酸が同
定された。

ｅ）円二色性スペクトル 円二色性分散系による遠紫外部ＣＤスペクトルは波長２
０８　ｎ１ｌｌ及び２２２ｎｍにそれぞれ極少ピークが
あり、α−へリツクス構造を含んでいる。

ｆ）熱安定性 ６０＋０．５℃で６０分間加熱しても生物活性は失なわ
れない。

ｇ）赤外線吸収スペクトル 第３図に示す赤外線吸収スペクトルを有する。

不溶物を沈澱せしめ、その上澄を限外濾過膜で脱塩し、
少なくとも２００倍以上に濃縮した後、ｐＨを６．５〜
７．５に調整し、６０℃で１０時間加熱処理し、生ずる
沈澱物を遠心除去後、陰イオン交換体へ吸着させ、０．
２〜０．４Ｍ！ｌ衝液で溶出させ、次いで１〜４Ｍ緩衝
液中でゲル濾過して分子量７０．０００ダルトン以上の
両分を回収し、該画分を疎水性親和体に吸着させて０．
５〜１Ｍの緩衝液で溶出させ、該溶出物を高速液体ゲル
濾過にかけ、分子量７０．０００〜１５０．０００ダル
トンの画分を回収し、該画分をｐｌ１１〜２に調整して
逆相高速液体クロマトグラフィーにかけ、有効成分を溶
出せしめることを特徴とするコロニー刺激因子の製造法
である。

［発明の詳細な説明］ ＋１）Ｃ８Ｆの製造 本発明のＣ８Ｆは次のようにして製造される。

健康人の尿をｐＨ８，０〜９．０に調整し、尿中の粘性
物質を沈澱・除去し、その上澄を分子量１０゜ＯｏＯ〜
５０，０００ダルトンを通過させる限外濾過膜を用いて
濃縮と脱塩を行う。

少なくとも２００倍以上に濃縮（蛋白質濃度として１％
（ｗ／ｖ）以上）しだ後ｐＨを６．５〜７．５に調整し
、６０℃で１０時間加熱処理（ウィルス等の不活化）す
る。形成された沈澱物を遠心除去し、陰イオン交換体、
例えばＤＥＡＥ−セルロース等、に有効成分を吸着させ
る。

次に０．０５〜０．１Ｍの緩衝液（ｐＨ６，５〜７．５
）で該イオン交換体を洗浄した後０．２〜０．４Ｍの緩
衝液（ｐＨ６，５〜７．５）で有効成分を溶出する。該
溶出液を必要ならば限外濾過膜で濃縮し、１Ｍ〜４Ｍの
塩類、例えば硫安、食塩等を含有する緩衝液（ｐＨ１６
，５〜７．５）で平衡化させたゲル濾過剤、例えば５ｅ
ｏｈａｃｒｙ＋■５−３００　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
製）でゲル濾過し、分子量範囲が７０．０００〜１５０
，０００ダルトンの両分を回収する。次に咳画分を上記
１Ｍ〜４Ｍ塩含有緩衝液で平衡化させた疎水性親和体、
例えばＰｈｅｎｙｌ−８ｅｐｈａｒｏｓｅ’　（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ社製）に吸着させ、０゜５〜１．０Ｍの塩
含有緩衝液（ｐＨ６，５〜７．５）で溶出する。該溶出
液を限外濾過膜で濃縮し、高速液体ゲル濾過カラム、例
えばＴＳＫＧ−３０００８Ｗ（東洋曹遠製）でゲル濾過
し、分子憬笥囲が７０．０００〜１５０．０００ダルト
ンの画分を回収する。咳画分を再度、濃縮し、０．１％
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液（１）８１〜２）で平
衡化した高速液体逆相カラム、例えば、／ぐ 旧−ＰｏｒｅＯＲＰ　−３０４（−＃ゼオ５１社製）に
吸着させ、０．１％ＴＦＡを含む溶剤、例えばアセトニ
トリル又はイソプロパツールの直線濃度勾配溶出法によ
り溶出する。このようにして得られたＣ８Ｆは、比活性
１Ｘ１０８単位／Ｒｇ・蛋白質以上を有する純粋な物質
である。

ｆ２１ｃｓＦの理化学的性状 以上のようにして製造された本発明のＣ８Ｆは次のよう
な理化学的性状を有している。尚、この理化学的性状の
試験には、実施例１の方法により純化したＣ８Ｆを用い
た。

（２）　分子量 、□、７）イ□工１、５．ニーｍ’ｌ　ｉ　　　（Ｎａ
ｔｕｒ。、　２２７巻、６８０−６８５頁、１９７０年
）の方法によるドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で分子量を測定すると、７０，００
０〜９０．０００ダルトンであった。

次に、０．２Ｍメルカプトエタノールで還元し、同様の
方法で測定すると、分子１３５．０００〜ウム・ポリア
クリルアミド電気泳動の泳動図であり、Ａ−Ｅは非還元
（２量体）、Ｆ、Ｇは分子量マーカー蛋白質、Ｈ〜しは
還元（サブユニット）を示し、縦軸の数字は分子量（Ｘ
１０”ダルトン）を示す。

（ハ）　サブユニット蛋白質のアミノ酸配列ＮＨ２−末
端アミノ酸配列は、純化Ｃ８Ｆを気相アミノ酸シーケン
サ−で常法により分析した。

次に純化Ｃ３Ｆを６Ｍグアニジンで変性させ、モノヨー
ド酢酸でアルキル化した後、脱塩し、トリプシン消化を
行なった。トリプシン処理ペプチドをｖｙｄａｃ　Ｃ−
１８逆相高速液体クロマトグラフィーで分画し、２３の
ペプチド画分を得、各画分をそれぞれ気相アミノ酸シー
ケンサ−で分析し、ペプチド断片のアミノ酸配列を分析
した。トリプシン消化ペプチド断片のアミノ酸配列と本
発明者らがクローニングしたｍＲＮＡの塩基配列から、
サブユニット蛋白質のアミノ酸−次構造を決定した。

その結果は表１に示すとおりである。

ＮＨ２−末端のアミノ酸であるグルタミン酸から１４９
番目のグルタミンまでは、公知のＣ３Ｆ−１と同一であ
るが、１５０番目から１８９番目までの４０個のアミノ
酸は、公知のそれと全く異なっていた。またＣ００Ｈ−
末端アミノ酸であるロイシンの次に、少なくとも α、β、γの三個のアミノ酸の存在が定性され、αはス
レオニン、βはトリプトファン、γはグルタミン酸であ
ることが予測された。１２２番目と１４０番目のアスパ
ラギンは、Ａｓｎ−Ｘ−３ｅｒ／Ｔｈｒの典型的なＮ−
グリコシド結合構造を有し、この部位で糖鎖を結合して
いるものと推定された。ここにＸは任意のアミノ酸を示
す。

（へ）　糖鎖の構成単糖 ポリペプチドと結合している糖鎖の構成単糖は、加水分
解して遊離させた後、高速液体クロマトグラフィーで分
析した。アルドース、シアル酸は陰イオン交換カラム、
ヘキソサミンは陽イオン交換カラムでホウ酸緩衝液濃度
勾配溶出法で分画し、シアノ；セタミド又はアルギニン
によるポストカラム標識した復、ケイ光拡により同定し
た。本Ｃ８Ｆ分子に含有される糖鎖は不均一であり、定
ｍすることは困難であったが、構成単糖としてマンノー
ス、ガラクトース、Ｎ−アセチルグリコサミン及びＮ−
アセチルノイラミン酸が同定された。

そのモル比はおよそ２．５＋１．４：２．５：２．１で
あった。

四　等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシュクロ
ース密度勾配等電点電気泳動法により、等電点を測定し
た結果、ｐＩは３．１〜３．７であった。

＜ｅ＞　　円二色性（ＣＤ）スペクトル円二色性分散計
（ＪＡＳＣＯ社製Ｊ−６００）で遠紫外部に於けるＣＤ
スペクトルを測定したく第２図）。

図２は本発明のＣ８ＦのＣＤスペクトルを示し、横軸は
波長（ｎＩｌｌ）、縦軸は楕円率（ｉｄｅｇ　）を示す
。

波長２０８　ｎｍ及び２２２ｒｌｌにおいて極少ピーク
がみとめられ、本Ｃ８Ｆの二次構造にα−ヘリックス構
造が含まれているものと推定された。

（０熱安定性 本Ｃ８Ｆを１μｇ／！ｄの濃度で、希薄緩衝液（ＤＨ７
，０）に溶解し、６０±０．５℃で６０分間加熱し、そ
のコロニー刺激活性（後述）を測定したが、活性の低下
はほとんど認められなかった。

（へ）　赤外線吸収スペクトル 本Ｃ３Ｆの凍結乾燥粉末について透過測定法（ＫＢｒ窓
）によりフーリエ変換赤外分光装置（Ｎｉｃｏｌｅｔ社
製５ＤＸｃ）を用いて測定した赤外線吸収スペクトルは
ｅに示すとおりであった。

第３図の横軸は波数＜ｃｍ−’）を縦軸は透過率を示す
。

本Ｃ８Ｆは１６５０ｃｍ　　、１２０１ｃｍ−’及び１
１３３　ｃｍ　　に強い吸収、１５３７（：ＩＩ＋−’
、１４３２α　及び１０６８ｃｍ−’に中程度の吸収を
示した。

！３１０ＳＦの生物学的活性 （０コロニー刺激活性及び比活性 本発明のＣ８Ｆのコロニー刺激活性は、マウス骨髄細胞
による単層軟寒天ゲルでのコロニー形成試験法で測定し
た。Ｃ８Ｆ試料を０．３％寒天、２０％牛脂児血清（Ｆ
ｅ２）及びマウス骨髄細胞１×１０５個を含むＨｃＣｏ
ｙ’ｓ　５　Ａ培地１ｄと混合し、７．５％ＣＯ２通気
下、３７°Ｃで７日間培養した。培養後、５０個以上の
ｆＩｌｌ胞集塊をコロニーと判定し、形成されたコロニ
ー数を計測した。コロニー刺激活性は単位で表現し、１
単位は１コロニーを形成させるに必要なＣ３Ｆ量と規定
した。

また比活性は、Ｃ３Ｆ蛋白質ＩＲｇ当り形成されるコロ
ニー数（単位）で表わした。その結果、本発明のＣ８Ｆ
は、１．４×１０８単位／ＩＩｔｇ・蛋白質の比活性を
有していた。また形成されたコロニーをヘマトキシリン
−エオシン染色して形態学的に分類したところ、９５％
以上のコロニーが単球−マクロファージから形成されて
いた。

ｅｄ　　ｉｎ　ＶｉｔｒＯ及びｉｎ　ｖｉｖｏでのマウ
ス骨髄単球−マクロファージ系幹細胞（ＣＦＵ−Ｍ）の
増殖に及ぼす促進作用 ｂ−１）　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験 ０５□Ｂしマウスの骨髄ｌｌｌ１胞を平板吸着法にて、
非吸着骨髄細胞とし、２０％ＦＣ８を含むＨｃｃｏｙ’
ｓ　５Ａ培地へ１×１０６個／ｄの濃度に添加し、本発
明のＣ８ＦをＯ（対照）、１００単位／Ｉｄ、５００単
位／ｄ、１．０００単位／ｄ及び２．０００単位／ｄの
割合でそれぞれ加え、７．５％ＣＯ２通気下、２４時間
、３７℃で培養した。培養後、各骨髄細胞を遠心法で洗
浄した後、同じ培地で５倍に希釈し、各群４枚のシャー
レに、それぞれＣ３ＦＩ、０００単位、０．３％寒天及
び２０％ＦＣ８を含む＋ｃｃｏｙ’ｓ　５　Ａ培地１！
ｄに対して０．１−添加し、７．５％００２通気下、３
７℃で７日間培養した。培養後、５０個以上の細胞集塊
を単球−マクロファージ系幹細胞＜ＣＦＬＩ−Ｍ）と判
定し、形成されたＣＦ（Ｊ−Ｍ数を計測した。その結果
は表２に示すとおりであった。

表２　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏのＣＦｔＪ−Ｍ増殖促゛進作
用（注）１及び０は、それぞれ５％及び１％の危険率で
有意の差があることを示す。

表２に示すようにＣ３Ｆの添加濃度に依存して、マウス
骨髄細胞中のＣＦｔＪ−Ｍ数は増加した。

ｂ−２）　　ｉｎ　ｖｉｖｏ試験 Ｃ５□ＢＬマウス（５匹／群）に対して体重Ｉ　Ｋｇ当
りＯ（生理食塩液）、８０×１０４単位、１６０Ｘ１０
　　Ｉｉ位及ＣＦ３２０ｘ１０’ｌｉ位Ｃ８Ｆを１日１
回、連続３日間腹腔内に投与した。投与終了の翌日に、
各マウスにより大腿骨骨髄及び牌臓を摘出し、骨髄及び
牌臓中の単球−マクロファージ系幹細胞（ＣＦｔＪ−Ｍ
）数を、１，０００単位のＣ８Ｆを刺激因子とする前記
軟寒天平板法によるコロニー形成試験で測定した。その
結果は表３及び表４に示すとおりであった。

表３　マウス骨髄ＣＦＵ−Ｍ増殖促進作用（注）０は１
％の危険率で有意の差のあることを示す。

表４　マウス牌臓ＣＦＵ−Ｍ増殖促進作用（注）　は１
％の危険率で有意の差のあることを示す。

表３及び表４に示す如く、８０×１０４単位／に９体重
のＣ８Ｆ投与により、骨髄及び牌臓でのＣＦＵ−Ｍの増
加が認められ、１６０Ｘ１０４単位／に’Ｊ体重以上の
投与では顕著な増加が認められた。

以上のような理化学的性質及び生物学的活性を有する本
発明のＣ３Ｆを公知の類似した物質と比較すると次のと
おりである。

本発明のＣ８Ｆは、Ｃ３Ｆ−１と同様に糖鎖を含む二本
のポリペプチドがジスルフィド結合し、生物学的に活性
なホモ２吊体から構成されていて分子量は、７０．００
０〜９０，０００ダルトンであり、Ｃ３Ｆ−１のそれよ
りも大きい。更に、本発明のＣ８Ｆを構成しているサブ
ユニットのポリペプチドは、少なくとも１８９個のアミ
ノ酸から成り、分子１２１，４００ダルトンであり、Ｃ
３Ｆ−１のそれの１４，０００〜１７，０００ダルトン
よりも大ｊい。また、サブユニットのアミノ酸配列をＣ
３Ｆ−１と比較すると、ＮＨ２−末端の１番から１４９
番目までのアミノ酸配列は同じであったが、１５０番か
ら１８９番目までのアミノ酸配列はＣ３Ｆ−１のｃＤＮ
Ａから推定されるものと異なっており、Ｃ３Ｆ−１遺伝
子上にコードされていなかった。従って、本発明のＣ８
Ｆは、一部Ｃ３Ｆ−１と共通性を有するが、遺伝子的に
も、構造的にも、公知のＣ３Ｆ−１とは別個な因子であ
ることが判明した。また、前記公知のＨＧＩ−糖蛋白質
及びＣ３Ｆ−ＨＵとは、生物学的活性及び理化学的性状
が全く異なっている。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１ 健常人の尿２００１をｐＨ８，５に調整し、沈澱物を濾
過除去し、分画分子１５０．０００ダルトンの限外濾過
膜（アミコン社、Ｈ１０Ｘ５０）で濃縮と脱塩を行った
。次に、濃縮液をｐＨ７，０に調整し、密封容器中で６
０℃、１０時間加熱殺菌した。殺菌後、遠心分離（５，
０ＯＯｘｑ　　３０分間）して沈澱物を除去した後、０
．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で平衡化したＤＥ
ＡＥ−セルロースと混合し、吸着させた。ＤＥＡＥ−セ
ルロースを０．０２Ｍリン酸緩衝液、０．０５Ｍ食塩添
加０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で洗浄した後
、０．２５Ｍ食塩添加緩衝液（ｐＨ７，２＞で溶出させ
た。溶出液を限外濾過膜（アミコン社Ｈ１Ｐ１０）１’
濃縮して、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−３００（ファル
マシア社、φ４Ｘ８０ｃｌＲ＞を用い、１Ｍ硫安添加緩
衝液（ｐＨ７，２）でゲル濾過した。ゲル濾過での分子
量範囲７０，０００〜１５０．０Ｏｏダルトンの両分を
上記１Ｍ硫安添加緩衝液で平衡化したｐｈｅｎｙｌ　−
５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂカラム（ファルマシア社製
、φ２　Ｘ　２０　Ｃｌ１１＞に吸着させ、次いで０．
５Ｍ硫安添加緩衝液（ｐＨ７，２）で溶出させた。溶出
液を限外濾過膜（脂化成製、ＮＭ−３＞で濃縮して、Ｔ
ＳＫＧ−３，０ＯＯ８Ｗカラムく東洋曹達製、φ４Ｘ６
００ｓＸ２）で高速液体クロマトグラフィーにかけ、分
子ｌ範囲７０，０００〜１５０，０００ダルトンの両分
を得た。こノ両分を再度濃縮し、Ｈｉ−Ｐｏｒｅ　　Ｒ
Ｐ−３０４（バイオラド社製、φ４Ｘ１５０＋ｓ＋）の
逆相カラムで０．１％トリフルオロ酢酸を含む、アセト
ニトリル０−１００％（ｐＨ２，０）の直線濃度勾配に
よる高速液体クロマトグラフィーにかけ、Ｃ３Ｆを溶出
し、精製された比活性１．４×１０８単位／Ｉｌｌ！Ｊ
・蛋白質のＣ８Ｆを得た。上記製造工程の各ステップに
おけるＣ３Ｆの精製度は表５に示すとおりであった。

実施例２ 実施例１の方法テ５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−３００を
ＴＳＫＧ−３，０ＯＯ８Ｗ　（東洋曽達、ＨＬＣ−８３
７＞　、ｐｈｅｎｙｌ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｂ
をＴＳＫｐｈｅｎＶｌ−５１）　Ｗ　（東洋曹達）にか
えて、全て高速液体クロマトグラフィーにより精製した
。得られたＣ８Ｆは、比活性１．５Ｘ１０８単位／１１
１９であり、回収率も実施例１と同等であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のＣ８Ｆのドデシル硫酸ナトリウム・ポ
リアクリルアミド電気泳動（ＳＯ８−ＰＡＧＥ）の泳動
図であり、第２図及び第３図はそれぞれ本発明Ｃ３Ｆの
遠紫外部ＣＤスペクトル及び赤外線吸収スペクトルを示
す。 第１図において、

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）哺乳動物の単球−マクロファージ系細胞のコロニ
   ー形成刺激作用を有し、次の理化学的性質を有すること
   を特徴とするコロニー刺激糖蛋白質。 ａ）分子量 同一のサブユニット２個から成るホモ２量体であつて、
   ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気
   泳動で測定した分子量が７０，０００〜９０，０００ダ
   ルトンであり、還元剤で解離させて生物活性を消失させ
   たサブユニットについてドデシル硫酸ナトリウム・ポリ
   アクリルアミドゲル電気泳動で測定した分子量は、３５
   ，０００〜４５，０００ダルトンである。 ｂ）サブユニットのアミノ酸配列 ホモ２量体を構成するサブユニット蛋白質は、次に示す
   少なくとも１８９個のアミノ酸配列から成り、１２２番
   目及び１４０番目のアスパラギン（Ａｓｎ） 【アミノ酸配列があります。】 はそれぞれアスパラギン（Ａｓｎ）−Ｘ−スレオニン（
   Ｔｈｒ）／セリン（Ｓｅｒ）で表わされる典型的なＮ−
   グリコシド結合部位を有する。ここでＸは任意のアミノ
   酸を示す。 ｃ）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法及びシユクロ
   ース密度勾配等電点電気泳動法で測定した等電点（ｐＩ
   ）は３．１〜３．７である。 ｄ）糖鎖の構成単糖 加水分解後高速液体クロマトグラフィーで分析したとこ
   ろ、同定された糖鎖の構成単糖は、マンノース、ガラク
   トース、Ｎ−アセチルグルコサミン及びＮ−アセチルノ
   イラミン酸である。 ｅ）円二色性スペクトル 円二色性分散計による遠紫外部ＣＤスペクトルは波長２
   ０８ｎｍ及び２２２ｎｍにそれぞれ極少ピークがあり、
   α−ヘリックス構造を含んでいる。 ｆ）熱安定性 ６０±５０．５℃で６０分間加熱しても生物活性は失な
   われない。 ｇ）赤外線吸収スペクトル 第３図に示す赤外線吸収スペクトルを有する。
2. （２）人尿をｐＨ８〜９に調整し、不溶物を沈殿せしめ
   、その上澄を限外濾過膜で脱塩し、少なくとも２００倍
   以上に濃縮した後、ｐＨを６．５〜７．５に調整し、６
   ０℃で１０時間加熱処理し、沈殿物を遠心除去後、陰イ
   オン交換体に吸着させ、０．２〜０．４Ｍ緩衝液で溶出
   させ、次いで１〜４Ｍ緩衝液中でゲル濾過して分子量７
   ０，０００ダルトン以上の画分を回収し、該画分を疎水
   性親和体に吸着させ、０．５〜１Ｍの緩衝液に溶出させ
   、該溶出物を高速液体ゲル濾過にかけ、分子量７０，０
   ００〜１５０，０００ダルトンの画分を回収し、該画分
   をｐＨ１〜２に調整して逆相高速液体クロマトグラフィ
   ーにかけ、有効成分を溶出せしめることを特徴とする哺
   乳動物の単球−マクロファージ系細胞のコロニー刺激性
   糖蛋白因子の製造法。