JPS63264533A - 殺細胞性免疫グロブリンとその製造方法 - Google Patents
殺細胞性免疫グロブリンとその製造方法Info
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- JPS63264533A JPS63264533A JP9629487A JP9629487A JPS63264533A JP S63264533 A JPS63264533 A JP S63264533A JP 9629487 A JP9629487 A JP 9629487A JP 9629487 A JP9629487 A JP 9629487A JP S63264533 A JPS63264533 A JP S63264533A
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- immunoglobulin
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は新規な殺細胞性免疫グロブリンとその製造方法
に関する。
に関する。
さらに詳しくは、殺すべき細胞のもつ特定の抗原と選択
的に結合する免疫グロブリンまたはその抗原結合部位を
含むフラグメントに、システィン残基とその硫黄原子に
よるスルフィド結合を介してメントレキセートまたはア
ミノプテリンを結合して成る、新規な殺細胞性免疫グロ
ブリンとその製造方法に関する。
的に結合する免疫グロブリンまたはその抗原結合部位を
含むフラグメントに、システィン残基とその硫黄原子に
よるスルフィド結合を介してメントレキセートまたはア
ミノプテリンを結合して成る、新規な殺細胞性免疫グロ
ブリンとその製造方法に関する。
〈従来の技術〉
免疫グロブリンまたはそのフラグメントに、メントレキ
セートまたはアミノプテリンを結合させて殺細胞免疫が
グロブリンを得る例としては、例えば、メソトレキセー
トが有する２つのカルボキシル基を部分的に、反応性の
活性エステルに変換し、得られたメソトレキセートの活
性エステル誘導体を抗体蛋白質に反応せしめ、抗体中の
アミノ基に、アミド結合によって結合させ、メソトレキ
セートー抗体複合体を得たことが報告されている（Ｐ、
Ｎ、 Ｋｕｌｋａｒｎｉら、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ 。
セートまたはアミノプテリンを結合させて殺細胞免疫が
グロブリンを得る例としては、例えば、メソトレキセー
トが有する２つのカルボキシル基を部分的に、反応性の
活性エステルに変換し、得られたメソトレキセートの活
性エステル誘導体を抗体蛋白質に反応せしめ、抗体中の
アミノ基に、アミド結合によって結合させ、メソトレキ
セートー抗体複合体を得たことが報告されている（Ｐ、
Ｎ、 Ｋｕｌｋａｒｎｉら、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ 。
４１、２７００ （１９８１）参照）。
く本発明が解決しようとする問題点〉
上記報告のクルカルニ（Ｋ ｕｌｋａｒｎｉ）らの方法
は次の理由により満足すべき方法とは言い難い。
は次の理由により満足すべき方法とは言い難い。
薬物−抗体複合体を用いるこうした試みにおいては、抗
原認識能力を有する抗体の誘導効果によって、複合体が
抗原を有する細胞に選択的に結合し、細胞性を発揮する
ことが重要な条件となる。
原認識能力を有する抗体の誘導効果によって、複合体が
抗原を有する細胞に選択的に結合し、細胞性を発揮する
ことが重要な条件となる。
しかし、クルカルニらの方法によって作製したメントレ
キセートー抗体複合体では、後述する参考例２の如く、
殺すべき細胞に対する選択性が充分に大きくはない。
キセートー抗体複合体では、後述する参考例２の如く、
殺すべき細胞に対する選択性が充分に大きくはない。
く問題点を解決するための手段〉
そこで本発明者らは、かかる問題点を解決すべく鋭意検
討の結果、メソトレキセートまたはアミノプテリンのカ
ルボキシル基にシスティンをアミド結合させた誘導体を
、そのシスティン部の硫黄原子を含むスルフィド結合を
介して免疫グロブリンに結合した修飾免疫グロブリンは
、上記の公知方法による殺細胞性免疫グロブリンよりも
、はるかに明瞭な標的細胞選択性をともなう細胞毒性を
発現することを見い出して、本発明に到達したものであ
る。
討の結果、メソトレキセートまたはアミノプテリンのカ
ルボキシル基にシスティンをアミド結合させた誘導体を
、そのシスティン部の硫黄原子を含むスルフィド結合を
介して免疫グロブリンに結合した修飾免疫グロブリンは
、上記の公知方法による殺細胞性免疫グロブリンよりも
、はるかに明瞭な標的細胞選択性をともなう細胞毒性を
発現することを見い出して、本発明に到達したものであ
る。
従って本発明は、一般式［Ｉ］
Ｏ２Ｈ
・・・・・・［Ｉ］
で表わされる殺細胞性免疫グロブリン及び、一般式［ｆ
ｆ］ （Ｉ−ＣＨｚ ＣＯ＋１Ａｂ ・・・・・・［
ＩＩ］または一般式［■コ で表わされる、ヨードアセチル基またはマレイミド基を
導入した免疫グロブリンまたはそのフラグメントに、一
般式［ＩＶ］ ＣＯ□ Ｈ で表わされるメントレキセートまたはアミノプテリンの
システィンアミド誘導体を反応させることを特徴とする
、上記一般式［Ｉ］で表わされる殺細胞性免疫グロブリ
ンの製造方法である。
ｆ］ （Ｉ−ＣＨｚ ＣＯ＋１Ａｂ ・・・・・・［
ＩＩ］または一般式［■コ で表わされる、ヨードアセチル基またはマレイミド基を
導入した免疫グロブリンまたはそのフラグメントに、一
般式［ＩＶ］ ＣＯ□ Ｈ で表わされるメントレキセートまたはアミノプテリンの
システィンアミド誘導体を反応させることを特徴とする
、上記一般式［Ｉ］で表わされる殺細胞性免疫グロブリ
ンの製造方法である。
本発明において、免疫グロブリンとは、殺すべき細胞（
以下、標的細胞と言う）のもっている特定の抗原と選択
的に結合し得る免疫グロブリンを言う、かかる免疫グロ
ブリンは、例えば次の様にして製造される。即ち、腫瘍
細胞あるいは特定のリンパ球等の標的細胞で免疫された
サル、ウマ。
以下、標的細胞と言う）のもっている特定の抗原と選択
的に結合し得る免疫グロブリンを言う、かかる免疫グロ
ブリンは、例えば次の様にして製造される。即ち、腫瘍
細胞あるいは特定のリンパ球等の標的細胞で免疫された
サル、ウマ。
ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ニワトリ等の動物から分
離された抗血清より、エタノール分画、硫安分画、イオ
ン交換あるいは分子篩カラムクロマトグラフィー、プロ
ティンＡ−セファロースカラムクロマトグラフィー等の
公知の手段によって製造される。また例えば、標的細胞
で免疫した動物より採取されたリンパ球を、ウィルスで
形質転換を起させた形質転換細胞や、骨髄腫細胞等と細
胞融合させて融合細胞（ハイブリドーマ）を得、抗体産
生性のクローンを選別した後、それらを細胞培養してそ
の培養液から、またはこれらのクローンを動物に接種し
てその血清または腹腔液からも本発明で用いる免疫グロ
ブリンを得ることができる。なお、上記の抗血清あるい
は抗体産生性リンパ球を得るための免疫に用いる抗原と
しては、標的細胞の他に、標的細胞より抽出された抗原
物質、あるいは人工的に合成された標的細胞の抗原を用
いることもできる。さらに、上記の免疫グロブリンの製
造において、形質転換または細胞融合に用いられる抗体
産生性リンパ球としては、ヒトから得られ、必要に応じ
抗原物質で処理した、抗原に感作されたリンパ球も用い
ることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＡ
、ＩｇＭ。
離された抗血清より、エタノール分画、硫安分画、イオ
ン交換あるいは分子篩カラムクロマトグラフィー、プロ
ティンＡ−セファロースカラムクロマトグラフィー等の
公知の手段によって製造される。また例えば、標的細胞
で免疫した動物より採取されたリンパ球を、ウィルスで
形質転換を起させた形質転換細胞や、骨髄腫細胞等と細
胞融合させて融合細胞（ハイブリドーマ）を得、抗体産
生性のクローンを選別した後、それらを細胞培養してそ
の培養液から、またはこれらのクローンを動物に接種し
てその血清または腹腔液からも本発明で用いる免疫グロ
ブリンを得ることができる。なお、上記の抗血清あるい
は抗体産生性リンパ球を得るための免疫に用いる抗原と
しては、標的細胞の他に、標的細胞より抽出された抗原
物質、あるいは人工的に合成された標的細胞の抗原を用
いることもできる。さらに、上記の免疫グロブリンの製
造において、形質転換または細胞融合に用いられる抗体
産生性リンパ球としては、ヒトから得られ、必要に応じ
抗原物質で処理した、抗原に感作されたリンパ球も用い
ることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＧ、ＩｇＡ
、ＩｇＭ。
ＩｇＤ、ＩｇＥの５種類があることが知られているが、
そのどれでも本発明に用いることができる。
そのどれでも本発明に用いることができる。
本発明において、免疫グロブリンはそのままでも、ある
いは抗原と結合し得る部分を含む限りにおいては、その
フラグメント（例えば、Ｆａｂ。
いは抗原と結合し得る部分を含む限りにおいては、その
フラグメント（例えば、Ｆａｂ。
Ｆａｂ’ 、 Ｆ（ａｂ’） ２ ）でも用いることが
できる。
できる。
一般式ＣＩ］において、Ｘに結合しているＣＯはメソト
レキセートまたはアミノプテリンのカルホキシル基に由
来するカルボニル基であり、Ｘはメソトレキセートまた
はアミノプテリン残基である。即ち、Ｘは式 ［Ｒはメチル基または水素原子を表わす。］または式 ％式％ ［Ｒの定義は上記に同じ］ で表わされるメントレキセート残基である。また、一般
式［Ｉ］中 Ｎ ＨＣＨＣＨ２−ＩＳ 鉦 Ｏ２Ｈ はシスティンに由来する残基である。
レキセートまたはアミノプテリンのカルホキシル基に由
来するカルボニル基であり、Ｘはメソトレキセートまた
はアミノプテリン残基である。即ち、Ｘは式 ［Ｒはメチル基または水素原子を表わす。］または式 ％式％ ［Ｒの定義は上記に同じ］ で表わされるメントレキセート残基である。また、一般
式［Ｉ］中 Ｎ ＨＣＨＣＨ２−ＩＳ 鉦 Ｏ２Ｈ はシスティンに由来する残基である。
一般式［Ｉ］においてＡｂに結合しているＹは、免疫グ
ロブリンまたはそのフラグメントに外部から導入したチ
オール反応性基を有する有機基に由来し、隣接するＩＳ
で表わされる硫黄原子に対しＣＨ２、ｔたはＣＨ基で結
合している２価の有機基である。即ち、Ｙは例えば、免
疫グロブリンまたはそのフラグメントに、チオール反応
性架橋剤Ｎ−サクシンイミジルヨードアセテート Ｎ０２）等、あるいは、Ｎ−サクシンイミジルマレイミ
ドブチレート Ｎ−サクシンイミジルメタマレインミドベンゾエ等を反
応させることによって導入されたヨードアセチル基マレ
イミド基に、メソトレキセートまたはアミノプテリンの
システィンアミド誘導体をチオール基で反応させて生ず
る２価の有機基である。
ロブリンまたはそのフラグメントに外部から導入したチ
オール反応性基を有する有機基に由来し、隣接するＩＳ
で表わされる硫黄原子に対しＣＨ２、ｔたはＣＨ基で結
合している２価の有機基である。即ち、Ｙは例えば、免
疫グロブリンまたはそのフラグメントに、チオール反応
性架橋剤Ｎ−サクシンイミジルヨードアセテート Ｎ０２）等、あるいは、Ｎ−サクシンイミジルマレイミ
ドブチレート Ｎ−サクシンイミジルメタマレインミドベンゾエ等を反
応させることによって導入されたヨードアセチル基マレ
イミド基に、メソトレキセートまたはアミノプテリンの
システィンアミド誘導体をチオール基で反応させて生ず
る２価の有機基である。
即ち、Ｙの好適な例としては、隣接しているｌｓで表わ
される硫黄原子とともにチオアセチル基（Ｓ ＧＨｚ
ＣＯ）またはチオサクシンイミ［Ｚは２価の有機基を表
わす］）を挙げることができる。ここでＺは、マレイミ
ド基導入剤に由来する２価の有機基であり、例えば、ト
リメチレンをその例として挙げることができる。
される硫黄原子とともにチオアセチル基（Ｓ ＧＨｚ
ＣＯ）またはチオサクシンイミ［Ｚは２価の有機基を表
わす］）を挙げることができる。ここでＺは、マレイミ
ド基導入剤に由来する２価の有機基であり、例えば、ト
リメチレンをその例として挙げることができる。
本発明の一般式［Ｉ］で表わされる殺細胞性免疫グロブ
リンは、上述の如く、例えば、一般式［ＩＩ］で表わさ
れるヨードアセチル基を導入した免疫グロブリンまたは
そのフラグメント、あるいは一般式［１［］で表わされ
るマレイミドを導入した免疫グロブリンまたはそのフラ
グメントに、式［ＩＶ］で表わされるメソトレキセート
またはアミノプテリンのシスティンアミド誘導体を反応
させることによって製造することができる。
リンは、上述の如く、例えば、一般式［ＩＩ］で表わさ
れるヨードアセチル基を導入した免疫グロブリンまたは
そのフラグメント、あるいは一般式［１［］で表わされ
るマレイミドを導入した免疫グロブリンまたはそのフラ
グメントに、式［ＩＶ］で表わされるメソトレキセート
またはアミノプテリンのシスティンアミド誘導体を反応
させることによって製造することができる。
かかる本発明の方法で製造原料として用いられ、式［１
］で表わされるヨードアセチル基を導入した免疫グロブ
リンまたはそのフラグメントは、免疫グロブリンまたは
そのフラグメントに、例えば、先に例示したヨードアセ
チル基の導入剤、Ｎ−サクシンイミジルヨードアセテー
ト、バラニトロフェニルヨードアセテート等を反応させ
ることにより容易に得ることができる。また、式［ＩＩ
［］で表わされるマレイミド基を導入した免疫グロブリ
ンまたはそのフラグメントは、免疫グロブリンまたはそ
のフラグメントに、例えば、先に例示したマレイミド基
導入剤、Ｎ−サクシンイミジルマレイミドブチレート、
Ｎ−サクシンイミジルメタマレイミドベンゾエート等を
反応させて、容易に得ることができる。また、もう一つ
の原料である式［ＴＶ］で表わされるメソトレキセート
またはアミノプテリンのシスティンアミド誘導体は、例
えば、下記の反応式で示す方法によってメソトレキセー
トまたはアミノプテリンより誘導して得られる。
］で表わされるヨードアセチル基を導入した免疫グロブ
リンまたはそのフラグメントは、免疫グロブリンまたは
そのフラグメントに、例えば、先に例示したヨードアセ
チル基の導入剤、Ｎ−サクシンイミジルヨードアセテー
ト、バラニトロフェニルヨードアセテート等を反応させ
ることにより容易に得ることができる。また、式［ＩＩ
［］で表わされるマレイミド基を導入した免疫グロブリ
ンまたはそのフラグメントは、免疫グロブリンまたはそ
のフラグメントに、例えば、先に例示したマレイミド基
導入剤、Ｎ−サクシンイミジルマレイミドブチレート、
Ｎ−サクシンイミジルメタマレイミドベンゾエート等を
反応させて、容易に得ることができる。また、もう一つ
の原料である式［ＴＶ］で表わされるメソトレキセート
またはアミノプテリンのシスティンアミド誘導体は、例
えば、下記の反応式で示す方法によってメソトレキセー
トまたはアミノプテリンより誘導して得られる。
Ｒ＝ ＣＨ３またはＨ
１、［Ｈ２Ｎ ＣＨＣＯ２ＣＨｓ
畷
ＣＨ２Ｓ ］ ２ 、 Ｄ ＣＣ２、ＮａＯＨ
グロブリンの製造方法においては、式［ＩＩ］で表わさ
れるヨードアセチル基を有する免疫グロブリンまたはそ
のフラグメント、あるいは式［１１１］で表わされるマ
レイミドを有する免疫プロプリンまたはそのフラグメン
ト１分子に対して、式［ＩＶ］で表わされるメソトレキ
セートまたはアミノプテリンのシスティンアミド誘導体
を、１〜１００分子使用するのが好ましい０反応は、好
ましくは、ヨードアセチル基またはマレイミド基を有す
る免疫グロブリンまたはそのフラグメントを、Ｉ）８５
〜９のｍ街液に溶解（蛋白質濃度は好ましくは０．１〜
４０■／ｍｌに調製する。）シ、さらに、０〜３７℃で
撹拌しながら、少量の溶媒（例えば、０．１Ｍ塩化ナト
リウムを含む０，１Ｍリンｒｌｉｙ１ｗ液あるいはＮ、
Ｎ−ジメチルホルムアミド等）に溶かしたメソトレキセ
ートまたはアミノプテリンのシスティンアミド誘導体を
添加して、１５分〜４８時間行われる。その後、反応混
合物をゲルア過あるいは透析することによって、未反応
のメントレキセートまたはアミノプテリンのシスティン
アミド誘導体と低分子の反応生成物を除き、殺細胞性免
疫グロブリンを精製することができる。
れるヨードアセチル基を有する免疫グロブリンまたはそ
のフラグメント、あるいは式［１１１］で表わされるマ
レイミドを有する免疫プロプリンまたはそのフラグメン
ト１分子に対して、式［ＩＶ］で表わされるメソトレキ
セートまたはアミノプテリンのシスティンアミド誘導体
を、１〜１００分子使用するのが好ましい０反応は、好
ましくは、ヨードアセチル基またはマレイミド基を有す
る免疫グロブリンまたはそのフラグメントを、Ｉ）８５
〜９のｍ街液に溶解（蛋白質濃度は好ましくは０．１〜
４０■／ｍｌに調製する。）シ、さらに、０〜３７℃で
撹拌しながら、少量の溶媒（例えば、０．１Ｍ塩化ナト
リウムを含む０，１Ｍリンｒｌｉｙ１ｗ液あるいはＮ、
Ｎ−ジメチルホルムアミド等）に溶かしたメソトレキセ
ートまたはアミノプテリンのシスティンアミド誘導体を
添加して、１５分〜４８時間行われる。その後、反応混
合物をゲルア過あるいは透析することによって、未反応
のメントレキセートまたはアミノプテリンのシスティン
アミド誘導体と低分子の反応生成物を除き、殺細胞性免
疫グロブリンを精製することができる。
く参考例・実施例〉
以下に本発明を参考例と実施例により詳述する。
参考例１．メントレキセートのシスティンアミド誘導体
の合成 メソトレキセートの粉末３００■を約１２ｍ１の０．１
ＮＮａ ＯＨ水溶液に加えて溶解し、得られた溶液に水
冷下に、Ｌ−シスチンジメチルエステル・２ＨＣＩの粉
末２７０■を０． Ｉ Ｎ Ｎ ａ ＯＨ１５，８＋ｎ
ｌに溶解して得な溶液を添加し、生じた溶液に２ＮＨＣ
Ｉ水溶液を滴下して溶液のＩ）Ｈを６．７とした。
の合成 メソトレキセートの粉末３００■を約１２ｍ１の０．１
ＮＮａ ＯＨ水溶液に加えて溶解し、得られた溶液に水
冷下に、Ｌ−シスチンジメチルエステル・２ＨＣＩの粉
末２７０■を０． Ｉ Ｎ Ｎ ａ ＯＨ１５，８＋ｎ
ｌに溶解して得な溶液を添加し、生じた溶液に２ＮＨＣ
Ｉ水溶液を滴下して溶液のＩ）Ｈを６．７とした。
この溶液に水冷、撹拌下に、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩１９０
■の粉末を加え、水浴を除き室温下で１５時間撹拌した
。生じた沈澱を濾別し、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（＋）Ｈ７，４）５０ｍｌとエタノール１０ｍ１でこ
れを洗浄した後減圧乾燥して、粉末３２８■を得た。粉
末を０．ＩＮ Ｎａ ＯＨの１７．３ｍｌに加えてサ
スペンションとし、室温下に５時間撹拌すると、反応が
進むにつれて徐々に溶解し、均一の黄色溶液となった。
メチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩１９０
■の粉末を加え、水浴を除き室温下で１５時間撹拌した
。生じた沈澱を濾別し、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（＋）Ｈ７，４）５０ｍｌとエタノール１０ｍ１でこ
れを洗浄した後減圧乾燥して、粉末３２８■を得た。粉
末を０．ＩＮ Ｎａ ＯＨの１７．３ｍｌに加えてサ
スペンションとし、室温下に５時間撹拌すると、反応が
進むにつれて徐々に溶解し、均一の黄色溶液となった。
０．２Ｎ ＨＣＺを加えて溶液のｌ）Ｈを８．５とし
た後、０．２Ｍホウ酸ナトリウムＭ衝液２ｍｌを加え、
次いでジチオスレイトールの粉末２６．７．を添加して
５０’Ｃで３０分間加熱した。
た後、０．２Ｍホウ酸ナトリウムＭ衝液２ｍｌを加え、
次いでジチオスレイトールの粉末２６．７．を添加して
５０’Ｃで３０分間加熱した。
次に溶液を水冷し、２ＮＨＣ１及び０．１ ＮＨＣｆを
加えて溶液のＩ）Ｈを３．９５とし、１時間放置した後
生じた沈澱を濾取した。沈澱を水５０ｍ１とエタノール
２０の１で洗浄し、減圧下に乾燥して、メソメレキセー
トのシスティンアミド誘導体の粉末２００■を得た（収
率５４，４％）。
加えて溶液のＩ）Ｈを３．９５とし、１時間放置した後
生じた沈澱を濾取した。沈澱を水５０ｍ１とエタノール
２０の１で洗浄し、減圧下に乾燥して、メソメレキセー
トのシスティンアミド誘導体の粉末２００■を得た（収
率５４，４％）。
物理化学的性状
１、ｐ、 ： １９５〜２０１°Ｃ（変色分解）ツイー
ルドブソープション質量分析（ＦＤ−ＭＳ）： Ｍ＋Ｈ＋５５８ Ｒｒ Ｉ Ｒ： ｖ ３３５０ （ｓ 、ｂｒ）
、２５５０（ｓｈ）。
ルドブソープション質量分析（ＦＤ−ＭＳ）： Ｍ＋Ｈ＋５５８ Ｒｒ Ｉ Ｒ： ｖ ３３５０ （ｓ 、ｂｒ）
、２５５０（ｓｈ）。
１１ａＸ
１８４０ （ｓ ）、１５４０ （ｓ ）ａｏ″１
参考例参考例句の方法により作成したメントレキセート
ー抗体複合体の培養腫瘍細胞に 対する殺細胞効果 前記のクルカルニらの方法に準じて合成したメソトレキ
セートの活性エステル誘導体を、マウス乳癌細胞ＭＭ４
６に対するマウスモノクローナル抗体１ｇＧ２ａ、また
は、正常（非特異的）マウスγ−グロブリンに結合させ
、メソトレキセートを１分子あたりそれぞれ８．０個、
５．８個結合した特異的複合体、非特異的複合体を得た
。
参考例参考例句の方法により作成したメントレキセート
ー抗体複合体の培養腫瘍細胞に 対する殺細胞効果 前記のクルカルニらの方法に準じて合成したメソトレキ
セートの活性エステル誘導体を、マウス乳癌細胞ＭＭ４
６に対するマウスモノクローナル抗体１ｇＧ２ａ、また
は、正常（非特異的）マウスγ−グロブリンに結合させ
、メソトレキセートを１分子あたりそれぞれ８．０個、
５．８個結合した特異的複合体、非特異的複合体を得た
。
マウス乳癌ＭＭ４６細胞を２．５ Ｘ１０４細胞／ｍｌ
となるように１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４
０培地に懸濁し、９６穴平底プレートの各穴に２００μ
ｍずつ分注した０次に、上記培地に溶解した種々の濃度
の検体を２０μ！添加して撹拌し、５％ＣＯ２雰囲気下
に３７°Ｃで３日間培養した０以上の操作は無菌的に実
施した。培養後３％トリピンブルー溶液２０μ！を添加
し、トリパンブルー非染色の生細胞を顕微鏡下に計数し
た。
となるように１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４
０培地に懸濁し、９６穴平底プレートの各穴に２００μ
ｍずつ分注した０次に、上記培地に溶解した種々の濃度
の検体を２０μ！添加して撹拌し、５％ＣＯ２雰囲気下
に３７°Ｃで３日間培養した０以上の操作は無菌的に実
施した。培養後３％トリピンブルー溶液２０μ！を添加
し、トリパンブルー非染色の生細胞を顕微鏡下に計数し
た。
結果を第１表にまとめな、特異的複合体は、メソトレキ
セート相当０． （１３８μＭ以上で濃度依存性に殺細
胞効果を示したが、非特異的複合体においても０．０７
５μＭ以上で殺細胞効果を示しな。即ち、特異的複合体
の効果は、非特異的複合体の２〜３倍程度の強さであり
、公知法により製造したかかる複合体では、抗体の抗原
認識能に基く標的細胞への誘導効果か充分大きなもので
はなかった。
セート相当０． （１３８μＭ以上で濃度依存性に殺細
胞効果を示したが、非特異的複合体においても０．０７
５μＭ以上で殺細胞効果を示しな。即ち、特異的複合体
の効果は、非特異的複合体の２〜３倍程度の強さであり
、公知法により製造したかかる複合体では、抗体の抗原
認識能に基く標的細胞への誘導効果か充分大きなもので
はなかった。
実施例１
（イ）殺細胞性免疫グロブリンの製造
マウス乳癌細胞ＭＭ４６に対するマウスモノクローナル
抗体Ｉｇ Ｇ２ａ （以下、抗ＭＭ４６抗体と言う）１
０■を、０．１ Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン
酸Ｍ街液（１）Ｈ７，Ｏ）１．２ ｍｌに溶解し、これ
にサクシニミジル マレイミドブチレートのＮ、Ｎ−ジ
メチルホルムアミド溶液（３，７■／ ｍｌ ） ５０
μ！を添加して２５℃で１時間反応させた後、上記緩衝
液に充分透析した。
抗体Ｉｇ Ｇ２ａ （以下、抗ＭＭ４６抗体と言う）１
０■を、０．１ Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン
酸Ｍ街液（１）Ｈ７，Ｏ）１．２ ｍｌに溶解し、これ
にサクシニミジル マレイミドブチレートのＮ、Ｎ−ジ
メチルホルムアミド溶液（３，７■／ ｍｌ ） ５０
μ！を添加して２５℃で１時間反応させた後、上記緩衝
液に充分透析した。
次いで、得られたマレイミド基を有する抗ＭＭ４６抗体
７．４ｍｇを含む溶液１．２ｍｌに、参考例にて合成し
たメントレキセートのシスティンアミド誘導体のＮ、Ｎ
−ジメチルホルムアミド溶液（９，５＃／ ｍｌ ）
６０μ！を添加して、室温で１８時間反応させた後、反
応液を０．１４Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，２）に充分透析した。
７．４ｍｇを含む溶液１．２ｍｌに、参考例にて合成し
たメントレキセートのシスティンアミド誘導体のＮ、Ｎ
−ジメチルホルムアミド溶液（９，５＃／ ｍｌ ）
６０μ！を添加して、室温で１８時間反応させた後、反
応液を０．１４Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，２）に充分透析した。
こうして、メソトレキセートのシスティンアミド誘導体
を１分子あたり平均５，３個結合した抗ＭＭ４６抗体（
殺細胞性免疫グロブリン） ５．６．を得た。
を１分子あたり平均５，３個結合した抗ＭＭ４６抗体（
殺細胞性免疫グロブリン） ５．６．を得た。
（朗 殺細胞性免疫グロブリンの培養腫瘍細胞に対する
殺細胞効果 マウス乳癌ＭＭ４６細胞を２５ｘ１０４細胞／ｍｌとな
るように１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培
地に懸濁し、９６穴平底プレートの各穴に２００μ！ず
つ分注した０次に、上記培地に溶解した種々の濃度の殺
細胞性免疫グロブリン（上記（イ）にて製造）を２０μ
！添加して撹拌し、５％ＣＯ２雰囲気下に３７℃で３日
間培養しな。以上の操作は無菌的に実施した。培養後３
％トリパンブルー溶液２０μ！を添加し、トリバンプル
ー非染色の生細胞を顕微鏡下に計数した。
殺細胞効果 マウス乳癌ＭＭ４６細胞を２５ｘ１０４細胞／ｍｌとな
るように１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０培
地に懸濁し、９６穴平底プレートの各穴に２００μ！ず
つ分注した０次に、上記培地に溶解した種々の濃度の殺
細胞性免疫グロブリン（上記（イ）にて製造）を２０μ
！添加して撹拌し、５％ＣＯ２雰囲気下に３７℃で３日
間培養しな。以上の操作は無菌的に実施した。培養後３
％トリパンブルー溶液２０μ！を添加し、トリバンプル
ー非染色の生細胞を顕微鏡下に計数した。
結果を第２表に示しな、ＭＭＪ８４１１１胞は、検体非
添加で３日間培養すると６．８ Ｘ １０’ ／ａ＋Ｉ
まで増殖したが、（イ）にて製造した殺細胞性免疫グロ
ブリンを添加すると、添加量に依存して生細胞数が減少
した。
添加で３日間培養すると６．８ Ｘ １０’ ／ａ＋Ｉ
まで増殖したが、（イ）にて製造した殺細胞性免疫グロ
ブリンを添加すると、添加量に依存して生細胞数が減少
した。
特にメントレキセート相当０．１６μＭ以上で非常に高
い抑制効果を有することが分った。
い抑制効果を有することが分った。
抗ＭＭ４６抗体の代わりに正常（非特異的）マウスγ−
グロブリンを用い、上記（イ）と同様にして、メントレ
キセートのシスティンアミド誘導体を、１分子あたり平
均６．２個結合した非特異的免疫グロブリンを得た。こ
のものの殺細胞効果を第３表に示しな。非特異的免疫グ
ロブリンはメントレキセート相当２μＭ以上で殺細胞効
果を有し、稚細胞性免疫グロブリンよりかなり活性が低
かった。
グロブリンを用い、上記（イ）と同様にして、メントレ
キセートのシスティンアミド誘導体を、１分子あたり平
均６．２個結合した非特異的免疫グロブリンを得た。こ
のものの殺細胞効果を第３表に示しな。非特異的免疫グ
ロブリンはメントレキセート相当２μＭ以上で殺細胞効
果を有し、稚細胞性免疫グロブリンよりかなり活性が低
かった。
即ち、本発明により製造した殺細胞性免疫グロブリンは
、非特異的免疫グロブリンより１０倍以上強い効果を示
し、抗体の標的細胞への誘導効果が強く発揮された６以
上から、公知法によるメントレキセート抗体複合体より
、本発明による殺細胞性免疫グロブリンの方が、標的細
胞に対する選択性において優れた複合体であることが証
明された。
、非特異的免疫グロブリンより１０倍以上強い効果を示
し、抗体の標的細胞への誘導効果が強く発揮された６以
上から、公知法によるメントレキセート抗体複合体より
、本発明による殺細胞性免疫グロブリンの方が、標的細
胞に対する選択性において優れた複合体であることが証
明された。
第２表
実施例２゜
メソトレキセートのシスティンアミド誘導体の代りにア
ミノプテリンのシスティンアミド誘導体を用い、実施例
１（イ）と同様にして、アミノプテリンのシスティンア
ミド誘導体を、スルフィド結合を介して抗ＭＭ４６抗体
１分子に平均５．５個結合させた、殺細胞性免疫グロブ
リンを作製しな。
ミノプテリンのシスティンアミド誘導体を用い、実施例
１（イ）と同様にして、アミノプテリンのシスティンア
ミド誘導体を、スルフィド結合を介して抗ＭＭ４６抗体
１分子に平均５．５個結合させた、殺細胞性免疫グロブ
リンを作製しな。
かくして得た修飾免疫グロブリンは、実施例１（ロ）の
方法により抗ＭＭ４６細胞に対する殺細胞活性を調べた
ところ、抗体で規定される優れた選択的殺細胞活性を示
しな。
方法により抗ＭＭ４６細胞に対する殺細胞活性を調べた
ところ、抗体で規定される優れた選択的殺細胞活性を示
しな。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）一般式［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・［ I
］ 〔Ａｂは免疫グロブリンまたはそのフラグメントを表わ
す。Ｘに結合しているＣＯはメソトレキセートまたはア
ミノプテリンのカルボキシル基に由来するカルボニル基
である。＾１Ｓは硫黄原子を表わす。Ｘはメソトレキセ
ート残基を表わす。Ａｂに結合しているＹは、外部から
免疫グロブリンまたはそのフラグメントに導入された基
に由来し、隣接する＾１Ｓで表わされる硫黄原子に対し
ＣＨ＿２またはＣＨ基で結合している２価の有機基を表
わす。ｎは１〜３０の整数を表わす。〕 で表わされる殺細胞性免疫グロブリン。 ２）Ｙが隣接している＾１Ｓで表わされる硫黄原子とと
もにチオアセチル基（−Ｓ−ＣＨ＿２ＣＯ−）またはチ
オサクシンイミド基を含む２価の有機基（▲数式、化学
式、表等があります▼）［Ｚは２価の有機基を 表わす］である、特許請求の範囲第１項記載の殺細胞性
免疫グロブリン。 ３）一般式［II］ （Ｉ−ＣＨ＿２ＣＯ）−＿ｍＡｂ・・・・・・［II］〔
Ａｂの定義は［ I ］に同じ、Ｉはヨー素原子を表わす
。ｍは１〜３０の整数を表わす。〕または一般式［III
］ ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・［III
］ 〔Ａｂの定義は式［ I ］に同じ、Ｚは２価の有機基を
、ｐは１〜３０の整数を表す。〕 で表わされる、ヨードアセチル基またはマレイミド基を
導入した免疫グロブリンまたはそのフラグメントに、一
般式［IV］ ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・［IV］ 〔ＸおよびＸに結合しているＣＯの定義は式［ I ］に
同じ。〕 で表わされるメソトレキセートまたはアミノプテリンの
システインアミド誘導体を反応させることを特徴とする
、一般式［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼・・・・・・［ I
］ 〔Ａｂは免疫グロブリンまたはそのフラグメントを表わ
す。Ｘに結合しているＣＯはメソトレキセートまたはア
ミノプテリンのカルボキシル基に由来するカルボニル基
である。＾１Ｓは硫黄原子を表わす。Ｘはメソトレキセ
ート残基を表わす。Ａｂに結合しているＹは、外部から
免疫グロブリンまたはそのフラグメントに導入された基
に由来し、隣接する＾１Ｓで表わされる硫黄原子に対し
ＣＨ＿２またはＣＨ基で結合している２価の有機基を表
わす。ｎは１〜３０の整数を表わす。〕 で表わされる殺細胞性免疫グロブリンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9629487A JPS63264533A (ja) | 1987-04-21 | 1987-04-21 | 殺細胞性免疫グロブリンとその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9629487A JPS63264533A (ja) | 1987-04-21 | 1987-04-21 | 殺細胞性免疫グロブリンとその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63264533A true JPS63264533A (ja) | 1988-11-01 |
Family
ID=14161035
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9629487A Pending JPS63264533A (ja) | 1987-04-21 | 1987-04-21 | 殺細胞性免疫グロブリンとその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63264533A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006056907A (ja) * | 1993-10-15 | 2006-03-02 | Conjuchem Inc | 細胞および血清タンパク質アンカー並びに接合体 |
-
1987
- 1987-04-21 JP JP9629487A patent/JPS63264533A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006056907A (ja) * | 1993-10-15 | 2006-03-02 | Conjuchem Inc | 細胞および血清タンパク質アンカー並びに接合体 |
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