JPS63152330A - 修飾免疫グロブリンを活性成分とする抗腫瘍剤 - Google Patents
修飾免疫グロブリンを活性成分とする抗腫瘍剤Info
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- JPS63152330A JPS63152330A JP27395286A JP27395286A JPS63152330A JP S63152330 A JPS63152330 A JP S63152330A JP 27395286 A JP27395286 A JP 27395286A JP 27395286 A JP27395286 A JP 27395286A JP S63152330 A JPS63152330 A JP S63152330A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は新規な殺細胞性修飾免疫グロブリンに関する。
更に詳しくは、殺すべき細胞のもつ特定の抗原と選択的
に結合する免疫グロブリンまたはその抗原結合部位を含
むフラグメントに、ジスルフィド結合を介してメソトレ
キセートを結合して成る、新規な殺細胞免疫グロブリン
に関する。
に結合する免疫グロブリンまたはその抗原結合部位を含
むフラグメントに、ジスルフィド結合を介してメソトレ
キセートを結合して成る、新規な殺細胞免疫グロブリン
に関する。
〈従来技術〉
免疫グロブリンまたはそのフラグメントに、ジスルフィ
ド結合を介して生物活性物質を結合させて殺細胞性免疫
グロブリンを得る例としては、例えば、ジフテリア毒素
のフラグメントＡあるいは植物ヒマの毒素のＡ鎖を、免
疫グロブリンフラグメントに結合させた複合体を挙げる
ことができる。
ド結合を介して生物活性物質を結合させて殺細胞性免疫
グロブリンを得る例としては、例えば、ジフテリア毒素
のフラグメントＡあるいは植物ヒマの毒素のＡ鎖を、免
疫グロブリンフラグメントに結合させた複合体を挙げる
ことができる。
（特開昭５５−１３６２３５及び５６−１６４１８参照
）。また、関連技術としては、メソトレキセートを２−
メルカプトエチルアミド誘導体とした後、ジスフィト結
合を介してポリーＤ−リジンに結合させて、殺細胞性複
合体を得たことが報告されている［シ工ン（Ｓｈｅｎ）
ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、） 。
）。また、関連技術としては、メソトレキセートを２−
メルカプトエチルアミド誘導体とした後、ジスフィト結
合を介してポリーＤ−リジンに結合させて、殺細胞性複
合体を得たことが報告されている［シ工ン（Ｓｈｅｎ）
ら、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー
（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、） 。
２６０巻、 １０９０５−１０９０８．１９８５年］
。これらの例では、キャリヤー高分子と生物活性物質を
結合するジスルフィド結合が、細胞内で効率的に開裂し
て生物活性物質を放出するがために、殺細胞効果が得ら
れる。
。これらの例では、キャリヤー高分子と生物活性物質を
結合するジスルフィド結合が、細胞内で効率的に開裂し
て生物活性物質を放出するがために、殺細胞効果が得ら
れる。
〈発明が解決しようとする問題点〉
本発明者らは、同じくジスルフィド結合を介して作製さ
れた免疫グロブリンまたはそのフラグメントとメソトレ
キセート複合体であってもジスルフィド結合の種類によ
って活性に差があることを知見し、そしてメソトレキセ
ートをシスティンアミド誘導体とした後システィン酸基
のチオールを結合に用いた場合は、メソトレキセートを
２−メルカプトエチルアミド誘導体としだ後２−メルカ
プトエチルアミン残基のチオール基を結合に用いた場合
よりも著しく活性の高い複合体が得られることを知った
。
れた免疫グロブリンまたはそのフラグメントとメソトレ
キセート複合体であってもジスルフィド結合の種類によ
って活性に差があることを知見し、そしてメソトレキセ
ートをシスティンアミド誘導体とした後システィン酸基
のチオールを結合に用いた場合は、メソトレキセートを
２−メルカプトエチルアミド誘導体としだ後２−メルカ
プトエチルアミン残基のチオール基を結合に用いた場合
よりも著しく活性の高い複合体が得られることを知った
。
〈問題点を解決するための手段〉
従って、本発明は、一般式［エコ
［Ａｂは免疫グロブリンまたはそのフラグメントを表わ
す。Ｘに結合しているＣＯはメソトレキセートのカルボ
キシル基に由来するカルボニル基である。Ｘはメソトレ
キセート残基を表わす。Ａｂに結合しているＳは、免疫
グロブリンまたはそのフラグメント自身の硫黄原子また
は外部から免疫グロブリンまたはそのフラグメントに導
入された硫黄原子であ。ｎは１〜３０の整数を表わす。
す。Ｘに結合しているＣＯはメソトレキセートのカルボ
キシル基に由来するカルボニル基である。Ｘはメソトレ
キセート残基を表わす。Ａｂに結合しているＳは、免疫
グロブリンまたはそのフラグメント自身の硫黄原子また
は外部から免疫グロブリンまたはそのフラグメントに導
入された硫黄原子であ。ｎは１〜３０の整数を表わす。
］
で表わされる殺細胞性修飾免疫グロブリンである。
本発明において、免疫グロブリンとは、殺すべき細胞（
以下、標的細胞と言う）のもっている特定の抗原と選択
的に結合し得る免疫グロブリンを言う。かかる免疫グロ
ブリンは、例えば次の様にして製造される。即ち、腫瘍
細胞あるいは特定のリンパ球等の標的細胞で免疫された
サル、ウマ。
以下、標的細胞と言う）のもっている特定の抗原と選択
的に結合し得る免疫グロブリンを言う。かかる免疫グロ
ブリンは、例えば次の様にして製造される。即ち、腫瘍
細胞あるいは特定のリンパ球等の標的細胞で免疫された
サル、ウマ。
ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ニワトリ等の動物から分
離された抗血清より、エタノール分画、硫安分画、イオ
ン交換あるいは分子篩カラムクロマトグラフィー、プロ
ティンＡ−セファロースカラムクロマトグラフィー等の
公知の手段によって製造される。また例えば標的細胞で
免疫した動物より採取されたリンパ球を、ウィルスで形
質転換を起させた形質転換細胞や、リンパ球を骨髄腫細
胞等と細胞融合させて融合細胞（ハイブリドーマ）を得
、抗体産生性のクローンを選別した後、それらを細胞培
養してその培養液から、またはこれらのクローンを動物
に接種してその血清または腹腔液からも本発明で用いる
免疫グロブリンを得ることができる。なお、上記の抗血
清あるいは抗体産生性リンパ球を得るための免疫に用い
る抗原としては、標的細胞の他に、標的細胞より抽出さ
れた抗原物質、あるいは、人工的に合成された標的細胞
の抗原を用いることもできる。さらに、上記の免疫グロ
ブリンの製造において、形質転換または細胞融合に用い
られる抗体産生性リンパ球としてはヒトから得られ、必
要に応じて抗原物質で処理した抗原に感作されたリンパ
球も用いることができる。免疫グロブリンには、Ｉ（］
Ｇ、Ｉ（］ Ａ。
離された抗血清より、エタノール分画、硫安分画、イオ
ン交換あるいは分子篩カラムクロマトグラフィー、プロ
ティンＡ−セファロースカラムクロマトグラフィー等の
公知の手段によって製造される。また例えば標的細胞で
免疫した動物より採取されたリンパ球を、ウィルスで形
質転換を起させた形質転換細胞や、リンパ球を骨髄腫細
胞等と細胞融合させて融合細胞（ハイブリドーマ）を得
、抗体産生性のクローンを選別した後、それらを細胞培
養してその培養液から、またはこれらのクローンを動物
に接種してその血清または腹腔液からも本発明で用いる
免疫グロブリンを得ることができる。なお、上記の抗血
清あるいは抗体産生性リンパ球を得るための免疫に用い
る抗原としては、標的細胞の他に、標的細胞より抽出さ
れた抗原物質、あるいは、人工的に合成された標的細胞
の抗原を用いることもできる。さらに、上記の免疫グロ
ブリンの製造において、形質転換または細胞融合に用い
られる抗体産生性リンパ球としてはヒトから得られ、必
要に応じて抗原物質で処理した抗原に感作されたリンパ
球も用いることができる。免疫グロブリンには、Ｉ（］
Ｇ、Ｉ（］ Ａ。
Ｉ（］ Ｍ、Ｉｏ Ｄ、ＩｇＥの５種類があることが知
られているが、そのどれでも本発明に用いることができ
る。
られているが、そのどれでも本発明に用いることができ
る。
本発明において、免疫グロブリンはそのままでも、ある
いは抗原と結合し得る部分を含む限りにおいては、その
フラグメント［例えば、Ｆａｂ。
いは抗原と結合し得る部分を含む限りにおいては、その
フラグメント［例えば、Ｆａｂ。
Ｆａｂ’ 、 Ｆ （ａｂ’ ） ２ ］でも用いるこ
とができる。
とができる。
一般式［Ｉ］において、Ｘに結合しているＣＯはメソト
レキセートのカルボキシル基に由来するカルボニル基で
あり、Ｘはメソトレキセート残基である。即ち、Ｘは式 ％式％ または式、 で表わされるメソトレキセート残基である。また、一般
式［Ｉ］中 −Ｎ ＨＣＨＣＨ２Ｓ− ＣＯ之Ｈ はシスティンに由来する残基である。
レキセートのカルボキシル基に由来するカルボニル基で
あり、Ｘはメソトレキセート残基である。即ち、Ｘは式 ％式％ または式、 で表わされるメソトレキセート残基である。また、一般
式［Ｉ］中 −Ｎ ＨＣＨＣＨ２Ｓ− ＣＯ之Ｈ はシスティンに由来する残基である。
一般式［Ｉ］においてＡｂに結合しているＳは、免疫グ
ロブリンまたはそのフラグメント自身の硫黄原子であっ
ても、あるいは外部から免疫グロブリンまたはそのフラ
グメントに導入された硫黄原子であってもよい。即ち、
免疫グロブリンまたはそのフラグメントのジスフィト基
を、例えば、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイ
トール等のメルカプト試薬で還元開裂して生成せしめチ
オール基の硫黄原子、または免疫グロブリンのＦａｂ’
フラグメントのヒンジ部、あるいはＩｇＭ免疫グロブ
リンの単量体［ＭｓのＪ鎖のチオール基の硫黄原子等の
、免疫グロブリンまたはそのフラグメント自身の硫黄原
子であってもあるいは、例えば、Ｎ−サクシンイミジル
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート の、ジスルフィド基またはチオール基導入剤を用いて外
部から免疫グロブリンまたはそのフラグメントに導入さ
れたジスルフィド基またはチオール基に基づく硫黄原子
であってもよい。
ロブリンまたはそのフラグメント自身の硫黄原子であっ
ても、あるいは外部から免疫グロブリンまたはそのフラ
グメントに導入された硫黄原子であってもよい。即ち、
免疫グロブリンまたはそのフラグメントのジスフィト基
を、例えば、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイ
トール等のメルカプト試薬で還元開裂して生成せしめチ
オール基の硫黄原子、または免疫グロブリンのＦａｂ’
フラグメントのヒンジ部、あるいはＩｇＭ免疫グロブ
リンの単量体［ＭｓのＪ鎖のチオール基の硫黄原子等の
、免疫グロブリンまたはそのフラグメント自身の硫黄原
子であってもあるいは、例えば、Ｎ−サクシンイミジル
３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート の、ジスルフィド基またはチオール基導入剤を用いて外
部から免疫グロブリンまたはそのフラグメントに導入さ
れたジスルフィド基またはチオール基に基づく硫黄原子
であってもよい。
本発明の一般式［Ｉ］で表わされる殺細性胞修飾免疫グ
ロブリンは、例えば、一般式［］Ｉ］、（Ｙ−８＋％Ａ
ｂ ・・・・・・［Ｉ［］［Ａｂ及Ｓの定義
は式［Ｉ］に同じ。ＹはＹに結合している硫黄原子と一
緒になって活性ジスルフィド基を形成する有機基を表わ
す。ｍは１〜３０の整数を表わす。コ で表わされる活性ジスフィト基を有する免疫グロブリン
またはそのフラグメントに、一般式［Ｉ］、Ｘ −ＣＯ
Ｎ ＨＣＨＣＨ２Ｓ Ｈ−−・・−［ｍ ］Ｏ２Ｈ ［Ｘ及びＸに結合しているＣＯの定義は式％式％］ で表わされるメソトレキセートのシスティンアミド誘導
体を反応させるか、あるいは、一般式［］ ％式％［］ ［×およびＸに結合しているＣＯの定義は式［Ｉ］に同
じ。Ｙの定義は式［ＩＩ］に同じ。］で表わされるメソ
トレキセートのシスティンアミド活性ジスルフィド誘導
体に、一般式［Ｖ］、（Ｈ３−） Ａｂ
・・・・・・［Ｖ］勺Ｌ ［Ａｂの定義は式［Ｉ］に同じ。Ｓおよびｍの定義は式
［ＩＩ］に同じ。］ で表わされるチオール基を有する免疫グロブリンまたは
そのフラグメントを反応させることにより製造すること
ができる。
ロブリンは、例えば、一般式［］Ｉ］、（Ｙ−８＋％Ａ
ｂ ・・・・・・［Ｉ［］［Ａｂ及Ｓの定義
は式［Ｉ］に同じ。ＹはＹに結合している硫黄原子と一
緒になって活性ジスルフィド基を形成する有機基を表わ
す。ｍは１〜３０の整数を表わす。コ で表わされる活性ジスフィト基を有する免疫グロブリン
またはそのフラグメントに、一般式［Ｉ］、Ｘ −ＣＯ
Ｎ ＨＣＨＣＨ２Ｓ Ｈ−−・・−［ｍ ］Ｏ２Ｈ ［Ｘ及びＸに結合しているＣＯの定義は式％式％］ で表わされるメソトレキセートのシスティンアミド誘導
体を反応させるか、あるいは、一般式［］ ％式％［］ ［×およびＸに結合しているＣＯの定義は式［Ｉ］に同
じ。Ｙの定義は式［ＩＩ］に同じ。］で表わされるメソ
トレキセートのシスティンアミド活性ジスルフィド誘導
体に、一般式［Ｖ］、（Ｈ３−） Ａｂ
・・・・・・［Ｖ］勺Ｌ ［Ａｂの定義は式［Ｉ］に同じ。Ｓおよびｍの定義は式
［ＩＩ］に同じ。］ で表わされるチオール基を有する免疫グロブリンまたは
そのフラグメントを反応させることにより製造すること
ができる。
これらの、式［工］で表わされる殺細胞性修飾免疫グロ
ブリンの製造方法においては、式［ＩＩ］で表わされる
活性ジスルフィド基を有する免疫グロブリンまたはその
フラグメント、または、式［ＩＶ］で表わされるメソト
レキセートのシスティンアミド活性ジスルフィド誘導体
１モルに対して、それぞれ、式［Ｉ］で表わされるメソ
トレキセートのシスティンアミド誘導体、式［Ｖ］で表
わされるチオール基を有する免疫グロブリンまたはその
フラグメントを、１〜１００モル又は０．０１〜１モル
使用するのが好ましく、反応は、好ましくは、活性ジス
ルフィド基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ント、あるいは、チオール基を有する免疫グロブリンま
たはそのフラグメントの１）Ｈ５〜９の緩衝液の溶液（
蛋白濃度は好ましくは０．１〜４０ｍｇ／ ｍｌ、に調
節する）に、０〜３７°Ｃで撹拌しながら、それぞれ、
少量の溶媒、例えば、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．ＩＭリン酸緩衝液あるいはＮ、Ｎ−ジメチルホルムア
ミド等に溶かしたメソトレキセートのシスティンアミド
誘導体。
ブリンの製造方法においては、式［ＩＩ］で表わされる
活性ジスルフィド基を有する免疫グロブリンまたはその
フラグメント、または、式［ＩＶ］で表わされるメソト
レキセートのシスティンアミド活性ジスルフィド誘導体
１モルに対して、それぞれ、式［Ｉ］で表わされるメソ
トレキセートのシスティンアミド誘導体、式［Ｖ］で表
わされるチオール基を有する免疫グロブリンまたはその
フラグメントを、１〜１００モル又は０．０１〜１モル
使用するのが好ましく、反応は、好ましくは、活性ジス
ルフィド基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメ
ント、あるいは、チオール基を有する免疫グロブリンま
たはそのフラグメントの１）Ｈ５〜９の緩衝液の溶液（
蛋白濃度は好ましくは０．１〜４０ｍｇ／ ｍｌ、に調
節する）に、０〜３７°Ｃで撹拌しながら、それぞれ、
少量の溶媒、例えば、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．ＩＭリン酸緩衝液あるいはＮ、Ｎ−ジメチルホルムア
ミド等に溶かしたメソトレキセートのシスティンアミド
誘導体。
メソトレキセートのシスティンアミド活性ジスフィト誘
導体を添加し、１５分〜４８時間行われる。その後、反
応混合物をゲル濾過あるいは透析することによって未反
応のメソトレキセートのシスティンアミド誘導体または
メソトレキセートのシスティンアミド活性ジスフィト誘
導体と低分子の反応生成物を除き、殺細胞性修飾免疫グ
ロブリンを精製することができる。
導体を添加し、１５分〜４８時間行われる。その後、反
応混合物をゲル濾過あるいは透析することによって未反
応のメソトレキセートのシスティンアミド誘導体または
メソトレキセートのシスティンアミド活性ジスフィト誘
導体と低分子の反応生成物を除き、殺細胞性修飾免疫グ
ロブリンを精製することができる。
殺細胞性修飾免疫グロブリンの上記の製造方法において
用いる、一般式［Ｖ］で表わされるチオール基を有する
免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、免疫グロブ
リンまたはそのフラグメントに２−イミノチオラクトン
、Ｎ−アセチルホモシスティンチオラクトン等のチオー
ル基導入剤を用いてチオール基を導入するか、あるいは
Ｎ−ザクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート等のジスフィト基導入剤を用いて導入したジ
スルフィド基を、２−メルカプトエタノール、ジチオス
レイトール等のメルカプト試薬を用いてチオール基に変
換することによって得ることができる。また、元々チオ
ール基をもつ免疫グロブリンのＦ ａｂ’ フラグメン
トや、Ｉ（］ ＭＳフラグメントは、そのまま一般式［
Ｖ］で表わされるチオール基を有する免疫グロブリンま
たはそのフラグメントとして用いることができる。
用いる、一般式［Ｖ］で表わされるチオール基を有する
免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、免疫グロブ
リンまたはそのフラグメントに２−イミノチオラクトン
、Ｎ−アセチルホモシスティンチオラクトン等のチオー
ル基導入剤を用いてチオール基を導入するか、あるいは
Ｎ−ザクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート等のジスフィト基導入剤を用いて導入したジ
スルフィド基を、２−メルカプトエタノール、ジチオス
レイトール等のメルカプト試薬を用いてチオール基に変
換することによって得ることができる。また、元々チオ
ール基をもつ免疫グロブリンのＦ ａｂ’ フラグメン
トや、Ｉ（］ ＭＳフラグメントは、そのまま一般式［
Ｖ］で表わされるチオール基を有する免疫グロブリンま
たはそのフラグメントとして用いることができる。
一般式［ＩＩ］で表わされる活性ジスフィト基を有する
免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、元々チオー
ル基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメント、
あるいは、発生させるかまたは導入したチオール基を有
する免疫グロブリンまたはそのフラグメントに、２−ビ
リジルジスルフイビス（２−ニトロ安息香酸） ＝１１− 性ジスルフィド化合物を反応させて得ることができる。
免疫グロブリンまたはそのフラグメントは、元々チオー
ル基を有する免疫グロブリンまたはそのフラグメント、
あるいは、発生させるかまたは導入したチオール基を有
する免疫グロブリンまたはそのフラグメントに、２−ビ
リジルジスルフイビス（２−ニトロ安息香酸） ＝１１− 性ジスルフィド化合物を反応させて得ることができる。
また、Ｎ−ザクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ
）プロピオネート等の活性ジスルフィド基導入剤を、直
接、免疫グロブリンまたはそのフラグメントに反応させ
て得ることもできる。
）プロピオネート等の活性ジスルフィド基導入剤を、直
接、免疫グロブリンまたはそのフラグメントに反応させ
て得ることもできる。
式［Ｉ［［］で表わされるメソトレキセートのシスティ
ンアミド誘導体は、メソトレキセートとシスチンのジエ
ステルを縮合後、エステルの加水分解とジチオスレイト
ールによるジスルフィド基の還元を行うことによって得
ることができる。
ンアミド誘導体は、メソトレキセートとシスチンのジエ
ステルを縮合後、エステルの加水分解とジチオスレイト
ールによるジスルフィド基の還元を行うことによって得
ることができる。
式［ＩＶ］で表わされるメソトレキセートのシスティン
活性ジスフィト誘導体は、メソトレキセートのシスティ
ン誘導体を２−ピリジルジスルフィド、 ５．５’
−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）等の活性ジスルフ
ィド化合物と反応させることにより得ることができる。
活性ジスフィト誘導体は、メソトレキセートのシスティ
ン誘導体を２−ピリジルジスルフィド、 ５．５’
−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）等の活性ジスルフ
ィド化合物と反応させることにより得ることができる。
〈実施例及び参考例〉
以下に本発明を参考例と実施例により詳述する。
参考例 メソトレキセートのシスティンアミド誘導体の
合成 メソトレキセートの粉末３００ＩＩｔｇを約１２ｉ＋ｆ
の０．１ＮＮａ ＯＨ水溶液に加えて溶解し、得られた
溶液に水冷下に、Ｌ−シスチンジメチルエステル・２Ｈ
Ｃｕの粉末２７０Ｒ９を０．ＩＮ Ｎ ａ ＯＨ１５，
８＃１１！に溶解して得た溶液を添加し、生じた溶液に
２ＮＨＣ文水溶液を滴下して溶液のｐＨを６．７０とし
た。
合成 メソトレキセートの粉末３００ＩＩｔｇを約１２ｉ＋ｆ
の０．１ＮＮａ ＯＨ水溶液に加えて溶解し、得られた
溶液に水冷下に、Ｌ−シスチンジメチルエステル・２Ｈ
Ｃｕの粉末２７０Ｒ９を０．ＩＮ Ｎ ａ ＯＨ１５，
８＃１１！に溶解して得た溶液を添加し、生じた溶液に
２ＮＨＣ文水溶液を滴下して溶液のｐＨを６．７０とし
た。
この溶液に水冷、撹拌下に、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩１９０
ｒｎｇの粉末を加え、水浴を除き室温下で１５時間撹
拌した。生じた沈澱を濾別し、０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液（１）Ｈ７，４） ５０ｍ！！とエタノール１
０ｍでこれを洗浄した後減圧乾燥して粉末３２８ｒｙＪ
を得た。粉末を０．１ＮＮａＯＨの１７．３ｄに加えて
サスペンションとし、室温下に５時間撹拌すると、反応
が進むにつれて徐々に溶解し、均一の黄色溶液となった
。０．２Ｎ Ｓ Ｃ、Ｑを加えて溶液のｌ）Ｈを８．５
としたｌ ０１２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液２ｍを加え
、次いでジチオスレイトール粉末２６５．７Ｒｇを添加
して５０℃で３０分間加熱した。次に溶液を氷冷し、２
ＮＨＣｕ及び０．ＩＮ ＨＣｕを加えて溶液のｐＨを３
．９５とし、１時間放置した後生じた沈澱を濾取した。
メチルアミノ−プロピル）カルボジイミド塩酸塩１９０
ｒｎｇの粉末を加え、水浴を除き室温下で１５時間撹
拌した。生じた沈澱を濾別し、０．１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液（１）Ｈ７，４） ５０ｍ！！とエタノール１
０ｍでこれを洗浄した後減圧乾燥して粉末３２８ｒｙＪ
を得た。粉末を０．１ＮＮａＯＨの１７．３ｄに加えて
サスペンションとし、室温下に５時間撹拌すると、反応
が進むにつれて徐々に溶解し、均一の黄色溶液となった
。０．２Ｎ Ｓ Ｃ、Ｑを加えて溶液のｌ）Ｈを８．５
としたｌ ０１２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液２ｍを加え
、次いでジチオスレイトール粉末２６５．７Ｒｇを添加
して５０℃で３０分間加熱した。次に溶液を氷冷し、２
ＮＨＣｕ及び０．ＩＮ ＨＣｕを加えて溶液のｐＨを３
．９５とし、１時間放置した後生じた沈澱を濾取した。
沈澱を水５０７とエタノール２０Ｉｄで洗浄し、減圧下
に乾燥して、メソメレキセートのシスティンアミド誘導
体の粉末２００ｒＲｇを得た（収率５４．４％）。
に乾燥して、メソメレキセートのシスティンアミド誘導
体の粉末２００ｒＲｇを得た（収率５４．４％）。
物理化学的性状
ｍ、ｐ、： １９５〜２０１℃（変色分解）ツイール
ドブソープション質量分析（ＦＤ−ＭＳ）：Ｍ＋Ｈ＋
５５８ 、 にｂｒ ＩＲ，Ｕ ３３５０（Ｓ、ｂｒ）、２５５０（ｓ
ｈ）。
ドブソープション質量分析（ＦＤ−ＭＳ）：Ｍ＋Ｈ＋
５５８ 、 にｂｒ ＩＲ，Ｕ ３３５０（Ｓ、ｂｒ）、２５５０（ｓ
ｈ）。
ルゆ
１６４０ （Ｓ ） 、 １５４０ （Ｓ ） ｃｍ”
実施例１ （イ）殺細胞性修飾免疫グロブリンの製造マウス乳癌Ｍ
Ｍ ４６細胞に対するマウスモノクローナル抗体１（
ｌＧ２８１０ｍｇを、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５） −（以下、リン酸
緩衝液と言う） １．４ｍに溶解した後、１６ｍＭの
Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ビオネートを含むエタノール溶液０．０５’ ｄを徐々
に添加して撹拌し、２５℃で３０分間反応させた。反応
液を上記リン酸緩衝液によく透析し、３−（２−ピリジ
ルジチオ）プロピオニル基を１分子当り平均５．６個有
するＩｇＧ２ａを得た。
実施例１ （イ）殺細胞性修飾免疫グロブリンの製造マウス乳癌Ｍ
Ｍ ４６細胞に対するマウスモノクローナル抗体１（
ｌＧ２８１０ｍｇを、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５） −（以下、リン酸
緩衝液と言う） １．４ｍに溶解した後、１６ｍＭの
Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ビオネートを含むエタノール溶液０．０５’ ｄを徐々
に添加して撹拌し、２５℃で３０分間反応させた。反応
液を上記リン酸緩衝液によく透析し、３−（２−ピリジ
ルジチオ）プロピオニル基を１分子当り平均５．６個有
するＩｇＧ２ａを得た。
次いで、こうして得られた３−（２−ピリジルジチオ）
プロピオニル化Ｉ（］Ｇ２ａＲｇを含むリン酸緩衝液１
．２＃ｌｌ！にメソトレキセートのシスティンアミド誘
導体ｏ、１６ｍｇを含むリン酸緩衝液０．０５ｄを添加
して撹拌し、室温にて１７時間反応させた後、反応液を
０．１４ Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ ｍＭリン酸緩
衝液（ＩＩＨ７，２）に十分透析した。
プロピオニル化Ｉ（］Ｇ２ａＲｇを含むリン酸緩衝液１
．２＃ｌｌ！にメソトレキセートのシスティンアミド誘
導体ｏ、１６ｍｇを含むリン酸緩衝液０．０５ｄを添加
して撹拌し、室温にて１７時間反応させた後、反応液を
０．１４ Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ ｍＭリン酸緩
衝液（ＩＩＨ７，２）に十分透析した。
こうしてメソトレキセートのシスティンアミド誘導体を
、１分子当り平均４．２個結合したＩｇＧ２ａ （殺
細胞性修飾免疫グロブリン）５．９■を得た。
、１分子当り平均４．２個結合したＩｇＧ２ａ （殺
細胞性修飾免疫グロブリン）５．９■を得た。
（０）殺細胞性修飾免疫グロブリンの培養腫瘍細胞に対
する殺細胞 マウス乳癌ＭＭ４６細胞を２．５Ｘ １０４細胞／ａｔ
！となるように１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ Ｉ
１６４０培地に懸濁し、９６穴平底プレートの各穴に０
．２Ｉｄずつ分注した。次に、上記培地に、溶解した種
々の濃度の殺細胞性修飾免疫グロブリン（上記（イ）に
て製造）を０．０２ ｍ添加して撹拌し、５％ＣＯ２雰
囲気下に、３７℃で３日間培養した。以上の操作は無菌
的に実施した。
する殺細胞 マウス乳癌ＭＭ４６細胞を２．５Ｘ １０４細胞／ａｔ
！となるように１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ Ｉ
１６４０培地に懸濁し、９６穴平底プレートの各穴に０
．２Ｉｄずつ分注した。次に、上記培地に、溶解した種
々の濃度の殺細胞性修飾免疫グロブリン（上記（イ）に
て製造）を０．０２ ｍ添加して撹拌し、５％ＣＯ２雰
囲気下に、３７℃で３日間培養した。以上の操作は無菌
的に実施した。
培養後、３％トリパンブルー溶液０．０２ ｍを添加し
、トリバンブルーで染色されない生細胞を、顕微鏡下に
計数した。
、トリバンブルーで染色されない生細胞を、顕微鏡下に
計数した。
結果は第１表にまとめた。（イ）にて製造した殺細胞性
修飾免疫グロブリン（第１表のＡ）、メソトレキセート
相当０．０１μＭを越える濃度において、強い殺細胞活
性を示した。これに対しメソトレキセートの２メル力プ
トエチルアミド誘導体を結合した修飾免疫グロブリン（
第１表のＢ）では、弱い殺細胞活性しか示さなかった。
修飾免疫グロブリン（第１表のＡ）、メソトレキセート
相当０．０１μＭを越える濃度において、強い殺細胞活
性を示した。これに対しメソトレキセートの２メル力プ
トエチルアミド誘導体を結合した修飾免疫グロブリン（
第１表のＢ）では、弱い殺細胞活性しか示さなかった。
即ち、本修飾免疫グロブリンの方が、約３０倍強い殺細
胞活性を有することが分った。
胞活性を有することが分った。
第１表
Ａ：メソトレキセートのシスティンアミド誘導体を結合
した修飾免疫グロブリン Ｂ：メソトレキセートの２−メルカプトエチルアミド誘
導体を結合した修飾免疫グロブリン（比較例） 実施例２ 抗ＭＭ４６修飾免疫グロブリン、非特異的修飾免疫グロ
ブリン、及びメソトレキセートのシスティンアミド誘導
体の殺細胞性の比較 抗ＭＭ４６モノクローナル抗体の代りに正常（非特異的
）マウス免疫グロブリンを用い、実施例１（イ）と同様
の方法によって、メソトレキセートのシスティンアミド
誘導体を免疫グロブリン１分子当り平均３．４個結合し
た非特異的修飾免疫グロブリンを得た。
した修飾免疫グロブリン Ｂ：メソトレキセートの２−メルカプトエチルアミド誘
導体を結合した修飾免疫グロブリン（比較例） 実施例２ 抗ＭＭ４６修飾免疫グロブリン、非特異的修飾免疫グロ
ブリン、及びメソトレキセートのシスティンアミド誘導
体の殺細胞性の比較 抗ＭＭ４６モノクローナル抗体の代りに正常（非特異的
）マウス免疫グロブリンを用い、実施例１（イ）と同様
の方法によって、メソトレキセートのシスティンアミド
誘導体を免疫グロブリン１分子当り平均３．４個結合し
た非特異的修飾免疫グロブリンを得た。
実施例１（イ）で製造した抗ＭＭ４６殺細胞性修飾免疫
グロブリン、非特異的修飾免疫グロブリン、及びメソト
レキセートのシスティンアミド誘導体につき、実施例１
（Ｏ）の如くして、培養Ｍ Ｍ ４６細胞に対する効果
を調べた。
グロブリン、非特異的修飾免疫グロブリン、及びメソト
レキセートのシスティンアミド誘導体につき、実施例１
（Ｏ）の如くして、培養Ｍ Ｍ ４６細胞に対する効果
を調べた。
結果を第２表にまとめた。殺細胞性修飾免疫グロブリン
は、他二者に比し、はるかに低い濃度で殺細胞を発現し
た。
は、他二者に比し、はるかに低い濃度で殺細胞を発現し
た。
第２表
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 一般式［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］ ［Ａｂは免疫グロブリンまたはそのフラグメントを表わ
す。Ｘに結合しているＣＯはメ ソトレキセートのカルボキシル基に由来す るカルボニル基である。Ｘはメソトレキセ ート残基を表わす。Ａｂは結合しているＳ は、免疫グロブリンまたはそのフラグメン ト自身の硫黄原子または外部から免疫グロ ブリンまたはそのフラグメントに導入され た硫黄原子である。ｎは１〜３０の整数を表わす。］ で表わされる殺細胞性修飾免疫グロブリン。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61-200141 | 1986-08-28 | ||
| JP20014186 | 1986-08-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63152330A true JPS63152330A (ja) | 1988-06-24 |
| JPH053856B2 JPH053856B2 (ja) | 1993-01-18 |
Family
ID=16419470
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27395286A Granted JPS63152330A (ja) | 1986-08-28 | 1986-11-19 | 修飾免疫グロブリンを活性成分とする抗腫瘍剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63152330A (ja) |
-
1986
- 1986-11-19 JP JP27395286A patent/JPS63152330A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH053856B2 (ja) | 1993-01-18 |
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