JPS63269059A - カルシウム錯体化染料並びにその分析組成物，要素及び方法における使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、臨床化学に関し、更に詳しくは、新規なカル
シウムイオン錯体化剤（Ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ　ａｇｅ
ｎｔ）並びにこれを使用する分析組成物、要素及び方法
に関する。　　　　　　　　　　　　　　以下余白〔従
来の技術〕 種々の水性液体のカルシウム含量の分析は、多くの製造
及び環境目的のために重要である。例えば、廃水、地下
水、食品、化学工程液体、油井水、又は他の天然若しく
は廃物液体源中の、カルシウムの量を知ることがしばし
ば必要である。

生物学的液体中のカルシウム含量を測定することも、診
断の目的のために必要である。多くの体液中で、カルシ
ウムイオンは普通比較的一定している。血清中のカルシ
ウム濃度の変化は、いくつかの病的状態を示す。例えば
、高カルシウム血症は、サルコイド−シス及びいくつか
の転移性癌に於て、副甲状腺及び甲状腺の高機能化で生
ずる。

高カルシウム血症はまた骨粗鬆症性及び骨形成性癌、急
性肝臓炎、並びにアシド−シスに結びついている。

カルシウムを測定するために、多くの化学的及び物理的
方法が知られている。直接的な比色方法が、長時間かか
る沈澱、比重又は滴定方法より好ましい。一般に、この
ような比色方法には、染料吸収に於て測定可能なシフト
を与える染料とカルシウムイオンとの錯体化が含まれる
。

多くの液体中のカルシウムイオンの測定に於ける潜在的
問題は、潜在的に干渉するイオン（例えば、マグネシウ
ム又は燐酸塩）又は巨大分子（例えば、蛋白質又はビリ
ルビン）の存在である。マグネシウムイオンは、カルシ
ウムイオンと錯体化する同じ化合物と錯体化する傾向が
あるので、特に困難な問題がある。上記の技術による場
合、マグネシウムイオンは、カルシウムの測定に先立っ
て試験試料から物理的に除くか、又はマグネシウム選択
性（又は特異性）錯体化試薬でマスキングされる。

カルシウムイオンのための高度に選択性（又は特異性）
の化合物は、ＴｓｉｅｎによってＢｉｏｃｈｅｍ、　＋
１９巻、２３９６−２４０４頁（１９８０）に記載され
ている。これに記載された鋭化合物は、普通ＢＡＰＴＡ
として知られている、１．２−ビス（０−アミノフェノ
キシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テトラ酢酸であ
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、Ｔｓｉｅｎ文献に記載されている化合物
は、電磁スペクトルの紫外領域に於て　吸収するという
欠点を持っている。しかしながら、血漿、を髄液、尿及
び他の体液のような検体溶液中に見出される、ビリルビ
ン、ヘモグロビン及び他のポルフォリン種（ｓｐｅｃｉ
ｅｓ）並びにポルフォリンの変態副生物（ｎ＋ｅｔａｂ
ｏｌｉｃ　ｂｙ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）のような他の種も
、電磁スペクトルのＵＶ及び可視短波長部分で吸収し、
標準の比色装置及び方法でバックグラウンド干渉を呈す
る。そのために、より長い波長で検出でき、カルシウム
と錯体化したとき他の波長にシフトしてＵＶ及び短波長
可視光吸収種からの干渉無しにカルシウムの定量的分析
ができる、高度に選択性（又は特異性）のカルシウム錯
体化化合物を有することが望ましい。

〔課題を解決する手段〕

前記課題は、下記構造式（Ｉ）： 以下余白 （式中、Ｚ及びＺｌは独立に５〜１０員の芳香族、不飽
和炭素環状又は不飽和複素環状環を完結するに必要な炭
素原子及びヘテロ原子を表わし、Ｒは窒素原子に該環を
通して直接共役結合している染料部分であり、各Ｒ１は
独立にホルミル、置換若しくは非置換のアルキル、置換
若しくは非置換のアシル又はハロゲンであり、ｎは０．
１又は２である）を有し、カルシウムイオンの不存在下
に４００ｎｍより大きい最大吸収を示す、置換又は非置
換のカルシウム錯体化化合物を使用することによって克
服される。

本発明はまた、上記化合物を含有するｐＨ６〜９に緩衝
された水性組成物を提供する。

カルシウムイオンを測定するための分析要素は、上記の
化合物を含む。

更に、カルシウムイオンを測定するための方法は、 Ａ：前記錯体化化合物とカルシウムイオンを含有すると
思われる液体試料を接触させる工程とＢ：カルシウムイ
オンと該化合物との錯体化によって生ずる光学濃度の変
化を測定する工程とを含んでなる。

〔実施態様〕

本発明は、水性液体中のカルシウムイオンの分析（定性
又は定量測定）に関し、更に詳しくは、本発明は、油井
水、廃水、冷却水、地下水、製造、鉱業及び化学工程液
体及び廃液、食品、並びに動物又は人の生物学的液体を
分析するために使用できる。このような生物学的液体に
は、全血液、血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、を髄液
、唾液、汗、及び便分泌液のような類似物が含まれるが
、これらに限定されるものではない。青筋、心臓、腎臓
、肺臓、脳、骨髄、皮膚及び類似物のような人又は動物
組織の液体標本を分析することも可能である。

本発明のカルシウム錯体化化合物は、一般構造式； を有する。上記式において、Ｚ及びＺｌは独立に、５〜
１０員の置換又は非置換の芳香族、不飽和炭素環状又は
不飽和複素環状環（単−又は融合環）、例えば、ベンゼ
ン、ナフタレン、ターフェニル、チアゾール、フラン、
チオフェン、シクロへブタトリエン、オキサゾール、テ
ルラゾール及びピリジン環を完結するに必要な炭素原子
及びヘテロ原子（酸素、窒素、硫黄、セレン、テルル）
を表わす。これらの環は、１個又は２個以上の、１〜３
０個の炭素原子を含有するアルキル基（例えば、メチル
、エチル、ドデシル、ペンタコサニル、及び当該技術で
公知の他のもの）、又は当業者に容易に確認される他の
置換基で置換されていてもよい。好ましくは、Ｚ及びＺ
ｌは独立に、置換又は非置換の６員芳香族、例えば、ベ
ンゼン、ナフタレン及びピリジンを完結するために必要
な炭素原子を表わす。最も好ましくは、各環は下記に定
義するようなアルキル、ハロゲン又は好ましくは１〜２
０個の炭素原子のアルコキシのような３個までの置換基
を有するフェニル環である。

上記構造式に於て、各Ｒ１は独立にホルミル、置換若し
くは非置換のアルキル（好ましくは１〜２０個の炭素原
子を含有し、例えばメチル、クロロメチル、エチル、ｎ
−プロピル、ｔ−ブチル、ヘキシル又はドデシル）、置
換基しくは非置換のアシル〔即ち、−ＣＯＲ”　（但し
、Ｒ２はＲ１について上に定義したような置換若しくは
非置換のアルキルである）である〕、好ましくは、５〜
７個の炭素原子の置換若しくは非置換のシクロアルキル
（例えばシクロペンチル又はシクロヘキシル）、又はハ
ロゲン（例えばフルオロ、クロロ又はブロモ）である。

好ましくは、Ｒ１は上記のようなホルミル又は置換若し
くは非置換のアルキルである。

Ｒは、Ｚによって形成される芳香族、不飽和炭素環状又
は不飽和複素環状環を通して、該環に付いている窒素原
子に直接共役結合している染料部分である。それで、こ
の染料部分は、該環を通して該窒素原子に直接共役結合
を与える該環のあらゆる位置に結合し得る。該環がベン
ゼン環であるとき、該染料部分は窒素原子に対してバラ
位に結合しているのが好ましい。

上記構造式に於て、ｎは０．１又は２であり、好ましく
は、ｎは１である。

本明細書に於て、「染料部分」なる用語は、色原体自身
である部分、又は上記Ｚ環に共役結合で付いたとき色原
体を与える部分の何れかを示す。

該色原体は、紫外領域（一般的に４００ｎｎ＋より′も
小さい）において最大吸収を有するものとは対照的に、
電磁スペクトルの４００ｎｍよりも大きい最大吸収を有
する。有用な染料部分には、アゾ、ビリリウム、トリフ
ェニルメタン、シアニン及びインドアニリンが含まれる
。アゾ部分には、−Ｎ＝Ｎ−結合を通してＺ環に付いた
置換又は非置換のアリールが含まれる。ビリリウム染料
部分は、環に酸素又は硫黄のようなカルコーゲン原子を
有する６員の不飽和へテロ環である。トリフェニルメタ
ン部分は、＝Ｃ−結合を通してそれに付いている２個の
置換又は非置換のフェニル基を有するベンゼン環である
。シアニン部分には、共役炭素鎖を通してＺ環に結合し
た、メロシアニン、キノリン、ベンゾキサゾール又は他
の複素環が含まれる。本発明の実施に於て、アゾ及びシ
アニン染料部分が好ましい。

本発明の代表的化合物を、上記構造式を参照して下記第
１表に示す。化合物８．１７及び２０が、本発明の実施
に特に好ましい。

以下余白 本発明の化合物は、それぞれ使用される染料部分の種類
に特をのいくつかの一般的方法によって製造できる。代
表的合成法を下記例１〜３に示す。

全ての出発物質は、熟線化学者にとって容易に入手し得
る。

本発明のカルシウム錯体化化合物は一般的に水溶性であ
る。これらは、１種又は２種以上の適当な緩衝剤、例え
ば燐酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、２−（４−モルホリ
ノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−〔トリス（ヒド
ロキシメチル）メチルアミノコ−１−エタンスルホン酸
（ＴＢＳ）　、）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン（ＴＲＩＳ）及び当該技術で公知の他のもので、ｐ１
１６〜９に緩衝された水性組成物中で使用できる。他の
有用な緩衝剤は、Ｇｏｏｄ　ａｔ　ａｌによってＢｉｏ
ｃｈｅｍ、　＋　５＋　４６７（１９６６）及びＡｎａ
ｌ、Ｂｉｏｃｈｅ　、、１０４，３００（１９８０）に
報告されている。

一般的に、本発明の水性組成物は、少なくとも５０、好
ましくは、１００〜３００ミクロモル濃度の本発明のカ
ルシウム錯体化化合物からなる。緩衝剤の濃度は当業者
の技術範囲内である。

カルシウムイオンの溶液分析は、一般に、本発明の化合
物をカルシウムイオンを含有すると思われる液体の試料
と適当な容器（例えば試験管、ベトリ皿、ビーカー又は
キュベツト）中で混合することによって行なわれる。高
カルシウムイオン濃度の溶液は、本発明の化合物を添加
する前に希釈してもよい。得られた溶液を比較的短時間
（例えば２分間）適当な濃度（一般的に２５℃）で混合
する。次いで溶液を、適当な比色検出装置を使用して適
切な波長で、カルシウムイオンによる該化合物の錯体化
に起因する光学濃度変化（即ち、スペクトル吸収に於け
るシフト）を測定することによって評価される。吸収に
於けるシフトは、可視領域の一つの波長から可視領域の
他の波長への変化で有り得る。しかしながら、本発明の
多くの化合物は、カルシウムイオンと錯体化したとき無
色になる。そのために、このような場合には、吸収に於
けるシフトは、色の消失である。一般的に、本発明の化
合物は、錯体化前は４θ０ｎ１１より大きい波長で吸収
し、カルシウムイオンと錯体化したとき４００ｎｍより
小さい波長で吸収する。好ましくは、該化合物は、錯体
化前は６００ｎｍより大きい波長で吸収する。

分析は、また、試験すべき液体の試料を含有する多孔性
吸収性物質、例えば紙片を、本発明の組成物と接触させ
ることによっても行なうことができる。吸収性物質中の
カルシウムイオンは該組成物中に移動し、イオン測定に
必要な光学濃度の変化を促進する。

本発明の方法はまた、乾式分析要素で実施できる。最も
筒車な要素は、吸収性担持物質、例えば濾紙又は濾紙片
のような自己支持性吸収性又は吸水性物質の薄いシート
からなり、これは本発明の錯体化化合物を含有している
。該要素は担持物質の個々の帯域に倉入された異なった
試薬を持った２個又は３個以上の別個の帯域に分割され
得る。

このような要素は、当該技術分野で、試験片、診断要素
、浸漬棒、診断薬及び類（ｊ！物として公知である。

乾式分析要素で使用されるとき、本発明の化合物は適当
な吸収性担持物質中に吸収又は含浸によって倉入できる
か、又は適当な物質上に被覆できる。また、分析の間に
要素に添加できる。有用な吸収性担持物質は不溶性であ
り、水又は全血液若しくは血清のような生物学的液体に
露出したときその元の構造を維持する。有用な要素は、
紙、多孔性微粒子構造体、多孔性ポリマーフィルム、セ
ルロース、ガラス繊維、織布及び不織布（合成及び非合
成）並びに類似物から製造できる。

好ましくは、本発明の乾式分析要素は、吸収性担持物質
として作用する多孔性展開域からなる。

この帯域は、自己支持性（即ち、その元の状態を維持す
るために充分堅い物質からなる）で有り得るが、好まし
くは別の支持体上に担持される。このような支持体は、
適当な寸法安定性で、好ましくは、２００〜９００ｎ−
の波長の電磁放射線を透過する非孔性で透明な（即ち、
放射線透過性）物質で有り得る。特別の要素のための支
持体の選択は、意図する検出の形式（透過又は反射スベ
クトロスコービー）に適合させるべきである。

多孔性展開域は、適当な繊維状若しくは非繊維状物質又
はその何れか若しくは両者の混合物から製造できる。こ
の帯域の孔容積及び平均孔サイズは、意図する用途に依
存して変えることができる。

有用な展開域とは、米国特許第４．２９２．２７２号、
同第３．９９２．１５８号、同第４，２５８．００１号
、同第４．４３０，４３６号、および特開昭５７−１０
１７６０号に記載されたような、適当な結合剤物質と混
合するか又は織物に織った繊維性又は非繊維性物質を使
用して製造できる。

該要素は、同一層又は重ねた層の何れかに、２個又はそ
れ以上の別個の帯域を有することができる。少なくとも
一つのこれらの帯域は、好ましくは、多孔性展開域であ
る。他の帯域は、当該技術で公知である試薬域又は記録
域、追加の展開域、放射線−遮蔽又はフィルター域、下
塗域、又はバリヤー域である。これらの域は一般に互い
に液体接触状態であり、これは液体、試薬及び反応生成
物（例えば、色染料）が、隣接する帯域の重ねられた領
域間を遠退又は移動できることを意味する。

好ましくは、２個又はそれ以上の帯域は要素の単−ｉ内
で分離された区域であるけれども、要素内の帯域は別々
に被覆され重ねられた層である。

該要素に於て、本発明の錯体化化合物は、一般に、少な
くとも０．２５、好ましくは、０．２５〜１．５ｇ／ｄ
の被覆量で１個又はそれ以上の帯域内に存在する。他の
試薬及び物質は、当業者の技術範囲内の被覆量で存在す
る。

本発明の要素はまた、種々の製造又は操作上の利点のた
めに、普通要素内に置かれる１個又は２個以上の他の追
加物を含有し得る。

分析の方法により種々の異なった要素が本発明に従って
製造できる。要素は、所望の幅の長尺テープ、シート、
スライド又はチップを含む種々の形態に配置できる。

本発明の分析は、手動で又は自動的にできる。

一般に、乾式要素を使用する場合、カルシウムイオンの
測定は、供給ロール、チップ包み又は他の源から要素を
取り出し、それを試験すべき液体の試料（例えば、１〜
２００１１１まで）と物理的に接触させ、試料と試薬と
が要素内で混合するようにすることによって行なわれる
。このような接触は、適当な方法、例えば、要素を試料
中に浸漬するか、又は、好ましくは、要素に手又は機械
によって適当な分配手段で試料の液滴を滴注することに
よって行なうことができる。

試料を付けた後、要素をインキュベーション、加熱又は
類似の、試験結果を得ることを加速又は助長するために
望ましい条件に露出する。ついで吸収に於けるシフトを
測定し、試験液体中のカルシウムイオンの量を測定する
。

本発明の実施を示す次の実施例に於て、使用した物質は
イーストマンコダック社（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　Ｎｅ
ＩＩＹｏｒｋ）又は他の市販源から得たか、又は標準の
方法及び容易に入手し得る出発物質を使用して製造した
。

、　仕　　　　　Ａ　　６の　リ゛告 前記第１表の本発明に係る錯体化化合物６を、次の方法
で製造した。

工程Ａ：　１−　（２−ニトロ−４−ｔｅｒｔ−ブチル
フェノキシ）−２−（２−ニトロフェノキシ）エタン： ２−二トロフェノール（６０，３ｇ　、　　０．４３４
モル）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド２００　ｎｔＺ
中の水酸化カリウム（２４，３ｇ　、　　０．４３４モ
ル）と、５０℃で溶液が均一になるまで加熱した。２−
ブロモエタノール（６４，６ｇ　、　　０．５２１モル
）を添加し、得られた溶液を１２０℃で４０分間加熱し
た。溶液を冷却し、炭酸カリウム水溶液及びエチルエー
テルを添加した。３個の層が形成され、底部の層は生成
物を含有しておらず捨てた。上部の層は生成物を含有し
ており、分離した。中間層をジクロロメタンで抽出した
。有機層を一緒にし、水で５回洗浄して、Ｎ、Ｎ−ジメ
チルホルムアミドを除去し、次いで硫酸ナトリウムで乾
燥し、蒸発させて化合物ＮＯ□ ＼、／ ５７．０　ｇを油状で得たく７２％）。この化合物（５
０，０ｇ、　　０．２７５モル）のトシル化を一２０℃
でピリジン中でｐ−）ルエンスルホニルクロライド（５
９，２ｇ、０．３１モル）で２０時間処理することによ
って行なった。得られた溶液を冷希塩酸に注ぎ、生成し
た沈澱をエタノールから再結晶して、化合物Ｏ２ ７２ｇ（７７％収率）を得た。

２−ニトロ−４−ｔ−ブチルフェノール（５，４８ｇ、
２８．１ミリモル）と水酸化カリウム（１，５７ｇ、２
．８ミリモル）との混合物を、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルム
アミド５〇−中で溶解するまで加熱した。

上記トシル化化合物（９，５０ｇ　、　２８．２ミリモ
ル）を添加し、混合物を１２０℃で２時間加熱した。得
られた溶液を冷却し、ジクロロメタンと水とに分配した
。有機層を水で２回、及び塩水で１回抽出し、硫酸ナト
リウムで乾燥し、濾過し、蒸発させて黄色油を分離し、
二酸化珪素上で、ジクロロメタン：リグロインの容積比
１：１でクロマトグラフィによって精製し、所望の結晶
生成物（６，７ｇ、６６％）ｍ、ｐ、　１１４．５〜１
１６．５℃を得た。元素分析、計算値Ｃ＋５Ｉ（ｔｏＮ
ｔＯｂ　：　Ｃ，６Ｑ、ＯｌＨ，５，６、Ｎ、？、８゜
実測値：　Ｃ，５９，８、Ｈ，５，６、Ｎ、７．７゜Ａ
ｎｇｅｌｉｃｉｅｔ　ａｌ、Ｉｎｏｒ　、Ｃｈｅｍ、　
２上、２１７８−２１８４頁（１９８２）参照。

工程Ｂ：１−（２−アミノ−４−ｔ−ブチルフェノキシ
）−２−（２−アミノフェノキシ）エタンの製造； 工程Ａで製造した化合物（６，１ｇ、１７ミリモル）を
、１０％ｐｄ／ｃｏ、２０ｇを含む無水エタノール１０
０ｍ１中に懸濁させ、混合物を還流下に加熱した。ヒド
ラジン（５−）を添加し、得られた溶液を３０分間還流
した。溶液を熱い間にセリット（ｃｅｌｉｔｅ）を通し
て濾過し、次いで、０℃に冷却した。得られた白色沈澱
を捕集し、乾燥して、所望の生成物４．７ｇ（９２％）
　　ｍ、ｐ、１４７．５〜１５０．５℃を得た。元素分
析、計算値口５Ｈｚ４Ｎｚｏ□：　Ｃ，７２，０、Ｈ，
８，１、Ｎ、９．３゜実測値：　Ｃ，７２，４、Ｈ２Ｓ
、２、Ｎ、９．４゜ 工程Ｃ： の製造 この化合物は、工程Ｂからの化合物（３，ＯＯｇ、１０
．０ミリモル）をエチルブロモアセテ−）　１６．８　
ｇ（１００ミリモル）及びルチジン（１０，８ｇ、１０
０ミリモル）を含むアセトニトリル１００−中で２日間
還流することによって製造した。次いで溶液を濾過し、
濾液をジクロロメタンと水とに分配した。有機層を分離
し、希塩酸で２回、そして塩水で１回抽出した。有機層
を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させて油を分
離し、二酸化珪素上で、ジクロロメタンから５％酢酸エ
チル／ジクロロメタンの傾斜でクロマトグラフィによっ
て精製した。

このようにして得られた生成物をエタノールで再結晶し
て、所望の化合物（４，５ｇ、７０％）　ｍ、ｐ。

８９．５〜９１．５℃を得た。元素分析、計算値Ｃ＋Ｊ
４ｓＮｔＯｔｏ：Ｃ，６３，３、Ｈ，７，５、Ｎ、４．
３゜実測値：Ｃ１６３，１、Ｈ，７，３、Ｎ、３．９゜ 工程Ｄ： 工程Ｃの生成物（３，２ｇ、５．０ミリモル）をメタノ
ール７５−及び水酸化ナトリウム１．２ｇ（３０ミリモ
ル）中に懸濁させ、水７．５−に添加した。溶液を５０
℃で３０分間加熱し、冷却し、真空濃縮した。残渣を水
に溶解し、次いで濃塩酸で酸性にした。沈澱を捕集し、
水で洗浄し、乾燥して、所望の化合物 １．７ｇ（６４％）を得た。

工程Ｅ： 工程りの生成物（１，６ｇ、３．０１ミリモル）をメタ
ノール（３００ｍｌ＞　　に溶解し、ドライアイス−ア
セトン浴で冷却した。ジアゾニウム塩、２−メシル−４
−二トロベンゼンジアゾニウムへキサフルオロホスフェ
ート（１，１２ｇ、３ミリモル）をアセトン３００　ｍ
ｌに溶解し、上記テトラ酸の溶液に３０分間で滴加した
０次いで反応混合物を室温に加温し、真空濃縮した。残
渣をメタノール（２０ａＺ）に溶解し、水（２００ａｆ
）中に注いだ、沈澱を濾過によって捕集し、水で洗浄し
乾燥して黒色固体を得た。

この化合物のホウ酸塩緩衝液（ｐＨ９，３）中の溶液は
、λ−Ｘ５７０ｎｍ及びε＝２７．２００Ｍ−’ａｍ−
’で紫色であった（２ｇ、８６％）。

分析データ：　　’）（−ＮＭＲ（（ｃｏｘ）ｚｃｏ）
　１．０７　（ｊ。

９８、Ｃ（ＣＨ３）５）、　３．０８（簿、４Ｈ，５Ｏ
２ＣＨ３）、　３．６２（ｇ、４Ｈ。

ＮＣＩＩｚ）、　３．８８（ｂｓ、８Ｈ，ＮＣＩ（ｔ、
０ｃＨｚ）、　６．２０〜６．７５（ｍ。

７Ｈ，ＡｒＨ，Ｃ０Ｊ）、７．０７〜？、５０，８．０
０　　Ｂ、４０（ｍ、６Ｈ。

ＡｒＨ）。元素分析、計算値Ｃ５ｚＨ！ＪｓＯｔ＋Ｓ　
：　Ｃ，５２，２、Ｈ，４，９、Ｎ、９．２、Ｓ、４．
２．実測値：Ｃ２５１，８、Ｈ，４，４、Ｎ、９．４、
Ｓ、４．５゜２　：　ｉ　　　　　　、Ａ、Ｑの　１゛
告前記第１表の錯体化化合物１０として示した化合物を
、次の方法で製造した。

工程Ａ： 下記構造： の化合物（２０，０ｇ　、　３４．０ミリモル）をＮ、
Ｎ−ジメチルホルムアミド１００−中に溶解した。ＰＯ
（／！３（１０，１ｇ、　６６ミリモル）を添加し、混
合物を１００℃で４時間加熱し、次いで酢酸ナトリウム
の溶液に注いだ。１６時間放置後、沈澱を捕集しζ二酸
化珪素上で、２０％酢酸エチル／トルエンでクロマトグ
ラフィによって精製し、構造式の所望の生成物（６，３
ｇ、３０％）を未反応出発物質又はジアルデヒドの不純
物なしに得た。元素分析、計算値Ｃｓ＋Ｈ４゜ＮｚＯ＋
＋　　：　Ｃ，６０，４、Ｈ，６，５、Ｎ、４．５゜実
測値：　Ｃ，６０，６、Ｈ，６，６、Ｎ。

４．４゜ 工程Ｂ： 工程Ａで製造したテトラエステルアルデヒド（３，０８
ｇ　、　５．０．０ミリモル）をメタノール７５−に添
加し、攪拌しながら水７．５　＠ｌ中の水酸化ナトリウ
ム１．２ｇ（３０ミリモル）を添加した。得られた溶液
を５０℃で３０分間加熱し、次いで真空濃縮した。残渣
を水に溶解し、次いで塩酸で酸性にした。得られた粘着
性の沈澱を捕集し、冷水中で冷却し、微粉末に粉砕しそ
して濾過し、乾燥した後、化合物 ＨＯ ２，０ｇ（７９％）を得た 元素分析、計算値Ｃｚ３ＨｔａＮｚＯ＋　ｒ　　：　Ｃ
、５４，８、Ｈ２４，８、Ｎ、５．６゜実測値：　Ｃ，
５４，５、Ｈ，５，ＯｌＮ、　　５．１　＊　Ｔｓｉｅ
ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　１９＋　２３９６−２４０４
頁（１９８０）参照。

工程Ｃ： 固ＲＢで製造した化合物（１，０１ｇ、２．０θミリモ
ル）及びＤｅｔｔｙ　ｅｔ　ａｌ、ｏｒｇａｎｏｍｅｔ
ａｌｌｉｃｓ＋　５　＋　２２５０−２２５６頁（１９
８０）にテルリウム類似体について記載された技術によ
り製造した、構造式 ％式％） のビリリウム塩（０，７４ｇ、２．０ミリモル）を、ｎ
−プロパツール１０〇−中で３０分間１００℃で加熱し
た。得られた濃青色溶液を真空濃縮し、次いでエチルエ
ーテルで粉砕した。濾過及び乾燥して、所望の錯体化化
合物である濃栗色の固体（１，５ｇ、８８％）を得た。

元素分析、計算値Ｃ１７ＨａｓＣＩ！　ＮｚＯ＋　４ｓ
ｅ。

Ｈ２Ｏ：　ｃ、　５０．８、Ｈ，５，４、Ｎ、３．２゜
実測値：Ｃ，５０，７、Ｈ，５，３、Ｎ、２．９゜この
錯体化化合物の少量を炭酸ナトリウム希釈水溶液に溶解
すると、暗青色溶液（λ。、　＝６２０ｎｏ、）が得ら
れた。塩化カルシウムを添加すると溶液は無色になった
が、他方、塩化マグネシウムを添加したとき色の変化は
観察されなかった。

１」−り堤体ゴ　Ａ　１７の１１′告 前記第１表で錯体化化合物１７として示した化合物を、
次の方法で製造した。

工程Ａ：Ｎ−エチルベンズ（ｃｄ）インドール−２（Ｉ
Ｈ）−オンの製造： 水酸化カリウムの２０％水溶液中のベンズ（ｃｄ）イン
ドール−２（１）１）−オン（１５，０ｇ、８８．８ミ
リモル）混合物を、５５〜６０℃に加熱し、硫酸ジエチ
ル６０−を３時間かけて満月した。室温で１６時間及び
更に５５〜６０℃で１時間経った後、混合物をジクロロ
メタンと水とに分配した。有機層を濃縮し、二酸化珪素
上で、５％アセトン／ジクロロメタンでクロマトグラフ
ィによって精製し、所望の生成物（８，０ｇ、４５％）
を得た。

工程Ｂ：過塩素酸塩の製造： 工程Ａで製造した化合物（１，９７ｇ　、　１０．０ミ
リモル）を窒素下に乾燥テトラヒドロフラン５ｄに溶解
した。３モル濃度のエチルエーテル中のＣＨ，ＭｇＢｒ
の溶液５＋ｎＺ（１５ミリモル）を０℃で添加した。

１時間後、３モル濃度のＣＨ：＋ＭｇＢｒの溶液１０ｍ
１を添加し、溶液を１０分還流した。次いで混合物を７
０％１（ＣＩ！Ｏ，の２０ｍ１が添加されている氷２０
０ｇに注いだ。得られた沈澱を濾過により除き、水で充
分洗浄し、次いで乾燥して、構造式：を有する、ｍ、ｐ
、　２１５〜２１８℃（分解）の生成物２．４３ｇ（８
２％）を得た。

元素分析、計算値Ｃ１ｔＨ１４Ｃｊ２ＮＯ４：　Ｃ，５
６，９、Ｈ１４，８、Ｎ、４．７゜実測値：　Ｃ，５６
，５、Ｈ，４，６、ゝ°　４°４°　　　　　　　　　
　　　以下余白工程Ｃ： 例２に記載した方法によって、例２の工程Ｂで製造した
化合物（０，２５ｇ、０．５０ミリモル）と、本例の工
程Ｂで製造した化合物（０，１５ｇ、　０．５１ミリモ
ル）とを、エタノール中で反応させ、構造式：のスチリ
ル染料（０，３４ｇ、　８７％）を形成させた。

燐酸塩緩衝液中ｐＨ７，０で、染料はカルシウムイオン
の不存在下にλｍｓｘ＝６４０ｎｍ、　ｔ　＝３４１６
００Ｍ−’０１１１−’を有していた。カルシウムイオ
ンを添加すると、λ□８は５００ｎｍ、　ε＝１８，８
００Ｍ−’ｅｌｌ−’であった。

６４０ｎｍでの染料−カルシウム錯体の減衰係数は９．
１００ＭすＣａ１１−　’に減少した。元素分析、計算
値Ｃ３ＪｚｈＣ１？Ｊ３０＋ａ　：　Ｃ，５６，８、Ｈ
，４，６、Ｎ、５．４゜実測値：　Ｃ１５６，９、Ｈ，
４，６、Ｎ、５．３゜カルシウムイオンの溶液分析は、
錯体化化合物１を、種々の量のカルシウムイオン及びマ
グネシウムイオンを含有するホウ酸塩緩衝液（ｐｌ＋　
８．５　）に添加し、得られた吸光度に於ける変化（Ａ
）を測定することによって行なった。錯体化化合物１の
濃度は、５．ＯＸ　１０−”モル濃度に維持した。その
結果を下記第■表に示す。

以下余白 ｍ表 ０　　　　　　　　　０　　　　　１１．４０　　　２
．９００．０００５　　　　　　　０　　　　　１０．
７５　　　３．２５０．００１　　　　　　　　０　　
　　　　９．４５　　　３．８８０．００１５　　　　
　　　０　　　　　　８．３５　　　　４．５５０．０
０２　　　　　　　　０　　　　　　７．４０　　　　
５．３００．００２５　　　　　　　０　　　　　　６
．１５　　　５，９５０．００３　　　　　　　　０　
　　　　　５．１０　　　　６．７５０．００３５　　
　　　　　０　　　　　　３．８２　　　７．４５０．
００４　　　　　　　　０　　　　　　２．８５　　　
　Ｂ、０５０．００４５　　　　　　　０　　　　　　
２．３５　　　８，３５０．００５　　　　　　　　０
　　　　　　２．１８　　　　　Ｂ、３５０．００？５
　　　　　　　０　　　　　　１．９８　　　　　Ｂ、
６００．０１０　　　　　　　　０　　　　　　１．８
０　　　　　Ｂ、３５０　　　　　　　　　　０　　　
　　　１１．２０　　　　−〇　　　　　　　　　　〇
、００５　　　　　１０．８０　　　　　−〇　　　　
　　　　　　〇、０１０　　　　　１０．８０　　　　
−第■表のデータから、カルシウムイオンの存在がカル
シウムイオン−染料錯体の生成を示す５００ｎｍから３
９０ｎｏ＋への吸光度におけるシフトにより検出される
ことが分かる。マグネシウムイオンの存在は、非常に高
い濃度（５０Ｘ　１０−’モル濃度）で存在するまで吸
光度シフトを起こさなかった。

溶液分析を、燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）中で、化合物
１７　（５，０６Ｘ１０−’モル濃度）を使用して例４
と同様に行なった。結果を第■表に示す。

マグネシウムイオン濃度に於ける大きな変化（０〜５０
Ｘ１０−’モル濃度）は、非常に少ない吸光度における
シフト（１，７５〜１．６８へ）を起こした。

これは該錯体化化合物がマグネシウムイオンと意味のあ
る度合で錯体化しないことを示している。

５００ｎａ＋でのマグネシウムイオンを持つ化合物の吸
光度は、吸光度変化が小さすぎて意味がなかったので測
定しなかった。しかしながら、カルシウムイオン濃度は
、全ての濃度で意味のある吸光度変化を起こした。

０　　　　　　　０　　　　　１．７５　　　０．１Ｂ
０．０００００５０　　　　０　　　　　１．６３　　
　０．２１０．００００１　　　　　０　　　　　１．
５８　　　０．２５０．００００１５　　　　０　　　
　　１．４６　　　０．２Ｂ０．００００２　　　　　
０　　　　　１．４４　　　　Ｑ、３１０．００００２
５　　　　０　　　　　１．３６　　　０．３６０．０
０００５　　　　　０　　　　　１．１２　　　０．４
８０．００００５５　　　　０　　　　　１．１２　　
　０．５２０．００００６　　　　　０　　　　　１．
０Ｂ　　　　０．６００．０００１０　　　　　０　　
　　　０．８７　　　０，６５０．０００２０　　　　
　０　　　　　０．６６　　　０．７９０．０００５０
　　　　　０　　　　　０．４６　　　０．９５０　　
　　　　０．０００５０　　　１．６８　　　−６：カ
ルシウムイオンの 本発明の分析要素は、下記の構成を持って製造された。

展開層　　　　ポリ　（Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ド）接着剤　　　　　０．５４　ｇ　／耐ドデシル硫酸
ナトリウム　　　０．５４　ｇ　／　ｒｄこの要素を、
下記の方法でウシ血清アルブミン中のカルシウムイオン
を測定するために使用した。

種々の濃度（２〜２０■／ｄりのカルシウムイオンを含
有する蛋白質の試料（ＩＱｄ）を要素に適用した。カル
シウムイオンと要素中のカルシウム錯体化化合物との錯
体化の結果である反射濃度を、商業的に入手し得る分光
光度計を使用して６３０ｎｍで５分後に測定した。５分
で測定した各反射濃度対カルシウムイオンの濃度のプロ
ットは直線であった。

〔発明の効果〕

本発明の錯体化化合物の使用は、溶液又は乾式分析に於
てカルシウムイオンを測定するための高感度の手段を提
供する。この化合物はカルシウムイオンと錯体化したと
き、光学濃度の変化を生じる。一般的に、この変化はよ
り短い波長への吸光度最大値のシフトに起因する。更に
、該化合物はマグネシウムイオンよりもカルシウムイオ
ンに対して高度に選択的（又は特異的）であり、広範囲
の種々の液体中のカルシウムイオンを測定するための高
感度の手段を提供する。本発明の化合物は、上記のＢＡ
ＰＴＡよりも改良されたカルシウムイオンに対する感度
を提供する。この改良された感度は、本発明の新規な化
合物の共役環の一つが染料部分で置換されているために
達成される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記構造式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中、Ｚ及びＺ＾１は独立に５〜１０員の芳香族、不
   飽和炭素環状又は不飽和複素環状環を完結するに必要な
   炭素原子及びヘテロ原子を表わし、Ｒは窒素原子に該環
   を通して直接共役結合している染料部分であり、各Ｒ＾
   １は独立にホルミル、置換若しくは非置換のアルキル、
   置換若しくは非置換のアシル又はハロゲンであり、ｎは
   ０．１又は２である）を有し、カルシウムイオンの不存
   在下に４００ｎｍより大きい最大吸収を示す、置換又は
   非置換の化合物。 ２、請求項１記載の化合物を含有する、ｐＨ６〜９に緩
   衝された水性組成物。 ３、請求項１記載の化合物を含有する、カルシウムイオ
   ンを決定するための分析要素。 ４、（Ａ）請求項１記載の化合物とカルシウムイオンを
   含有すると思われる液体試料を接触させる工程と、 （Ｂ）カルシウムイオンと該錯体化化合物との錯体化に
   よって生ずる光学濃度の変化を測定する工程とを含んで
   なるカルシウムイオンの分析方法。