JPH01503434A - グルタミン合成酵素阻害剤に対する耐性を有する遺伝子操作により得られた植物細胞及び植物、前記細胞及び植物を産生するために使用するｄｎａフラグメント及び組換え体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 グルタミン合成酵素阻害剤に対する耐性を有する遺伝子操作により得られた植物 ＷＡｍ及び植物、前記細胞及び植物を産生するために使用するＤＮＡフラグメン ト及び組換え体本発明はグルタミン合成酵素阻害剤の作用に対して植物細胞及び 植物を保護する方法に関する。

本発明はこのような方法を特に所与の植物での除草剤耐性を発達させるために応 用することにも関する。

本発明はざらにグルタミン合成酵素阻害剤に対する耐性をコードするヌクレオチ ド配列を含有する適切なＤＮＡフラグメント及び組換え体、並びにグルタミン合 成酵素阻害剤に対する耐性を示す非生物学的に形質転換した植物ＩＢＩｎ及び植 物にも関する． グルタミン合成酵素《本明細書中以下では簡単にＧＳと記す》はほとんどの植物 中で植物細胞の発育と生存に必須な酵素の１つを構成している。ＧＳがグルタミ ン酸塩（ｇｌｌｌｔａｌｌａｔｅ）をグルタミンに変換することは公知である。

ＧＳはほとんどの植物中で、硝酸塩の還元、アミノ酸の分解又は光呼吸により放 出されたアンモニアを解毒するための有効な経路（現在知られてぃる唯一のもの ）に関与している。従って、ＧＳに対して効力を有する阻害剤は植物細胞にとっ て非常に毒性が高い．ｉａ物中でのＧＳの阻害による毒性作用に基いてある種の 除草剤が開発されてきた。

これらの除草剤は活性成分としてＧＳ阻害剤を含む。

グルタミン合成酵素の作用の阻害剤に対し植物を耐性にし得る少なくとも２つの 可能な方法がある。すなわち、（１）標的を変化させることによる。ＧＳ酵素内 の変異により除草剤に対する感受性をなクシ得ると考えられる．（２）除草剤を 不活化することによる．植物中で除草剤を破壊又は修飾することにより耐性とし 得るであろう。

ピアラホス（　Ｂｉａｌａｐｈｏｓ）及びホスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉ ｎｏｔｈｒｉｃｉｎ　，本明細書中以下では簡単にＰＰＴと記す》はＧＳの作用 に対する２つのこの種の阻害剤であり（文献１６．　１７）　、優れた除草特性 を有することが示されている（　Ｂｉａｌａｐｈｏｓに関する詳細は文献２を参 照のこと）． Ｂｉａｌａｐｈｏｓは次の式《Ｉ》： を有している。

ＰＰＴは次の式（■）： を有している。

このように、ＰＰＴとＢｉａｌａｐｈｏｓの差はＰＰＴには２つのアラニンアミ ノ酸がないということである。

これら２つの除草剤は非選択的である。これらは土壌上に存在する全てのいろい ろな種の植物の成長を阻害し、従ってそれら全体を破壊する。

Ｂｉａｌａｐｈｏｓは最初抗生物質特性をもつものとして開示され、この特性に より殺虫剤又は殺菌剤としての使用が可能であった。　Ｂｉａｌａｐｈｏｓは明 治製菓（ＨＥＩＪＩ　５ＥＩＫＡ　ＫＡＩＳＨＡ　ＬＴＤ、　）による米国特許 第３８３２３９４号明細書に開示の方法で製造することかできる。この特許は言 及によって本明細書中に取り入れられるものとする。この方法は、例えばＡｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎからＡＴＣＣＮｏ 、２１，７０５として入手しうる株のような、ｓｔｒｅＤｔｏｍＶｃｅｓ　ｈｖ ｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓを培養し、その培地力ＡらＢｉａｌａｐｈ。

Ｓを間取することからなる。しかしながら、ｓｔ　ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｒ ｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓのような他の株もこの化合物を産生する例えハ＊ 　９５　シン（ｐｈｏｓａｌａｃｉｎ、文献１５）のような、ＰＰＴ核を含有す る他のトリペプチド抗生物質も自然界で発見されるか又はされるかもしれない。

ＰＰＴも又化学合成により得られ、工業会社ＨＯＥＣＨ３Ｔから市原核細胞機能 即ち酵素を不活化することが知られている活性の高い抗生物質を産生する多くの ストレプトミセス（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種が開示されてきている。これ らの抗生物質を産生するストレプトミセス種は、もしこれらの抗生物質に対する 自己防ｔｉａｔｉ構を有していなければそれ自身が破壊されてしまうだろう。こ の自己防ｙｉＪ機構にはいくつかの場合、抗生物質の作用を阻害しえ、従って、 当該ストレプトマイセス種の自家中毒を回避しうる醇累を含まれることが発見さ れている。この修飾は一般に分子が細胞から排出されたときには取り消されてし まう。

宿主に対する抗生物質の作用を阻害するように抗生物質を修飾しうる酵素をコー ドする遺伝子が存在することは抗生物質を産生ずるいくつかのストレプトミセス 、例えば各々ネオマイシン、チオストレプトン、バイオマイシン及びＭＬＳ　（ マクロライド　リンコサミド　ストレプトグラミン）という抗生物質を産生する ｓ、　ｆｒａｄｉａｅ　、ｓ、　ａｚｕｒｅｕｓ　、ｓ、　ｖｉｎａｃｅｕｓ。

ｓ、　ｅｒｙｔｈｒｅｕｓで示されてきた（文献４）、（文献５）、（文献６　 ）　、　ＣＨＡＴＥＲ他（１９８２年）ｎ文献１４７はこれらの作用を明らかに するのに使用し得る標準的技術を記している。）本発明によって、Ｓｔｒｅｏｔ ｏｍｖｃｅｓ　ｈ　ｒｏｓｅｏｐｉｃｕｓ　ＡＴＣＣ２１，７０５もＢｉａｌａ ｐｈｏｓの抗生物質特性、を不活化する能力のある酵素をコードする遺伝子を有 することが発見された。本出願人が寅施し酸物に基づいてＧＳ阻害剤の作用を１ ｉｌＩｔＩｌする過程でその遺伝子を使用することができた。

節する新しい方法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、植物細胞及び植物内に取り込まれたときにＧＳ阻害 剤の作用に対してそれらを保護し得るヌクレオチド配列を含有するＤＮＡフラグ メント（断片）及びＤＮＡ組換え体、並びに前記ＤＮＡフラグメントを含有する 特別に修飾したベクターを提供することである。

本発明のさらに別の目的はＧＳｆｌ害剤を中和即ち不活化し得る非住物学的に形 質転換した植物ａ胞及び植物を゛提供することである。

本発明のもう１つの目的はＧＳ阻害剤型の除草剤に対し植物種を選択的に保５す る方法を提供することである。

体を保護しうる、植物細胞及び植物全体に伝達しうるＤＮＡフラグメントを提供 することである。

本発明の目的は構造中にＰＰＴ単位を有する、例えばＢｉａｌａｐｈｏｓのよう な種類の生成物に耐性な植物ｉ胞を提供することである。

ＧＳ阻害剤と接触したときに植物細胞及び植物中でＧＳ阻害剤の作用をＸ１節す るための本発明方法は、世代を通じて植物の細胞内に安定して異種ＤＮＡフラグ メントを組込むような条件下で、植物ａ胞及び植物中で蛋白質の形で発現しうる 外来性ヌクレオチド配列を含有する異種ＤＮＡフラグメントを植物に提供するこ とからなり、ここで前記蛋白質は前記グルタミン合成酵素阻害剤を不活化又は中 和さｔ！得る酵素活性を有している。

好ましいＤＮＡフラグメントは抗生物質産生ストレプトミセス株由来のもの（又 は同じ活性をコードするヌクレオチド配列を含む配列）であり、前記ＧＳ阻害剤 耐性をコードするものである。

本発明に使用する好ましいヌクレオチド配列は前記ＧＳｖＡ害剤に関しアセチル トランスフェラーゼ活性を有する蛋白質をコードする。

本発明の最も好ましいＤＮＡフラグメントはＰＰＴアセチルトランスフェラーゼ 活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる。

植物細胞の以後の形質転換のための本発明の特定のＤＮＡフラグメントは次の配 列： エ　ＳεＦＩ　ＰＲＯＧＬＬｔ ＶＡＬ　ｒＬＥ　にＬＹ　ＬＥＩＪ　ＰＲＯＡＳＮ　ＡＥＰ　ＰＦ！ＯＳ二ＲＶ ＡＬ　ＡＲＧ　ＭＥＴ　ＨＩＥ　ＣｉＬリ　＾し＾ＬＥソ　ＧＬＹ　ＴＹＲＡＬ Ａ　ＰＲＯＡＲＧ　ＧＬＹ　門ＥＴ　ＬＥリ　ＡＲＧ　ＡＬＡ　ＡＬＡ　ＧＬＹ 　ＰＨＥ　ＬＹＳＨＩＳ　ＧＬＹ　ＡＳＮ　ＴＲＰ　）−！Ｉｓ　ＡＥＰ　ＶＡ Ｌ　ｌ：＋ＬＹ　ＰＫ：’ＴＲＰ　Ｇ’ＬＮ　ＬミυＡＥＰ’　ＰＨ”−ＳＥq ７ａ ＬＥＬＩ　ＦＲＯＶＡＬ　ＰＲＯＰＲＯＡＲＧ　ＰＲＯＶＡＬ　Ｌ三ｕ　ＰＲＯ ＶＡＬ　τＨＲＧＬリ　エＬＥ［式中、ＸはＭＥＴ又はＶＡＬを表わす］を有す るポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列からなり、前記 ポリペプチドの一部とは、遺伝的に取り込まれ、植物細胞中で発現するときに植 物細胞にＢｉａｌａｐｈｏｓに対する保護（すなわち、以後Ｂｉａｌａｐｈｏｓ に対する「植物保護能」と記す）を付与するに十分な長さである。

好ましいＤＮＡフラグメントは次のヌクレオチド配列：、ＧＴｒ３　ＡＧｉ：　 ＣＣＡ　ＱＡ＾ヱε３ 又はその一部分でＢｉａｌａｐｈｏｓに対する植物保護能を有するポリペプチド を発現する部分からなる。

本発明は又、そのヌクレオチドのいずれかを他のもので置換することにより上記 の好適なものとは異なるが上記の好適なりＮＡ配列の遺伝情報（通常一般的な遺 伝子コードの意味において）を変えない任意のＤＮＡフラグメントにも関し、さ らに、例えば、本発明−のＤＮＡフラグメントのどちらかの側の末端部分をエキ ソヌクレオリティックな酵素、例えばＢａｔ　３１で除去し、適当なプラスミド 内で残りのフラグメントを再クローニングし、後記に開示するように、適当な細 胞を形質転換しＢｉａｌａｐｈｏｓ抗生物質又は除草剤に対し保護する前記修飾 プラスミドの能力をアッセイすることにより、本発明の任意のＤＮＡフラグメン トのいずれかの側から除去し得るヌクレオチド配列部分は当業者により容易に評 価されうろことは理解されよう。

ここで、前記のアッセイはどんなものでも適当である。

表記を簡単にするために、これらのＤＮＡフラグメントを以後ｒ　Ｂｉａｌａｏ ｈｏｓ−耐性ＤＮＡＪと古う。同様に、対応のポリペプチドをｒ　Ｂｉａｌａｐ ｈｏｓ−耐性酵素」と呼ぶ。

前記考察中で、植物細胞及び植物中に導入されたときにＢｉａｌａｐｈＯＳ又は ＰＰＴに対しそれらを保護しうるＤＮＡフラグメントを特に強調したが、本発明 はそれに限定されるものとみなされるべきではないことを理解すべきである。

同様に、本発明は、このような植物ｍ胞内に導入されたときに他のＧＳ阻害剤、 例えばホスフィノトリシンの天然の生合成に関与する中間産物、例えば式： の略号ＨＰ　１０１（Ｉ［ｌ）、　ＨＰ　１０２１０２（で表わされる化合物に 対しこのような植物ａ胞を保護するＤＮＡフラグメントにも関する。

より一般的には、本発明は、植物細胞及び植物に適当に導入されると、ＧＳｖＡ 害剤との接触に際し、ＧＳ阻害剤に対してそれらを保護しうるＤＮＡフラグメン ト製造への道を開いたものである。（Ｌれに関し、後記実施例中ではＢｉａｌａ ｐｈｏｓ及びＰＰＴに関して詳細に示す。

このことが確立されると、ＧＳ阻害剤を不活化することによする任意のフラグメ ントは上記に開示された好ましいフラグメントの均等物として見られるべきであ るということは理解されよう。これは、構造的に異なっていても、Ｂｉａｌａｐ ｈｏｓ又はＰＰＴ又は更に他のＧＳ阻害剤に関し同様の活性をコードする遺伝子 を有すると思われる株、特に抗生物質産生株のゲノムＤＮＡの遺伝子をスクリー ニングすることにより得られる任意のＤＮＡフラグメントについて特にあてはま ることであろう。ま上、ＰＰＴ誘導体を産生ずる他の株の準伝子についてもあて はまるであろう。

従って、簡便のために以後使用する「Ｂｉａｌａｐｈｏｓ−耐性ＤＮＡ」又Ｇ、 ｔ　ｒ　Ｂｉａｌａｐｈｏｓ−耐性酵素」という言葉はＰＰＴ又は最も直接的に 関係する誘導体に対する耐性に特異的に関係するＤＮＡ及び酵素にのみ関するこ とを８図するのではなく、より一般的に、同じ条件下で植物中でＧＳ阻寒剤の作 用を不活化しうる他のＤＮＡ及び酵素にも関すると意図していることを理解す本 発明は又、異種ＤＮＡと組換えた上記定義のＢｉａｌａＤｈＯＳ　−耐性ＤＮＡ フラグメントを含有するＤＮＡ組換え体にも関し、該異種ＤＮＡは調節要素を含 有し、前記Ｂｉａｌａｐｈｏｓ耐性ＤＮＡは該調節要素と適合し得る外来の細胞 環境内で発現し・得るように該調節要素の制御下にある。特に、前記ＤＮＡ１ｌ 換え体が含有している上記Ｂｉａｌａｐｈｏｓ−耐性ＤＮＡフラグメントは、こ のＢｉａｌａｐｈｏｓ−耐性ＤＮＡフラグメントがＢｉａｌａｐｈＯ３産生株か ら創作されている場合、Ｂｉａｌａｐｈｏｓの生合成に関与するＤＮＡ領域を全 熱もっていない。

「異種ＤＮＡＪは前記Ｂｉａｌａｐｈｏｓ−耐性ＤＮＡの起源とは異なる、例え ばＳｔｒｅｐｔｏｍ　ｃｅｓ　ｈｖｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ又は５ｔｒｅｐτｏ ｍｙｃｅｓ−丘仁ユ立部１エヅ咽Ｉ旦Ｍ到のものとは異なる起源のＤＮＡを、更 により好ましくはストレプトミセスのＤＮＡとは異なるＤＮＡを意味している。

特に、前記調節要素は通常それらに関連（結合）しているＤＮＡ配列の転写及び 翻訳を前記外来ｆｆ１ｊｊ！でコントロールしうるちのである。「細胞」とは微 生物と細胞培養物の両者を意味する。

特に、増幅のような目的で組換えＤＮＡを大量に製造することを望むときには、 この異種ＤＮＡはａ菌性ＤＮＡでありうる。

この点に関して、好ましい異種ＤＮＡは大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のＤＮＡ又は大 腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）と適合性のＤＮＡからなる。例えば、関与する１８胞内で 複製しうろことが知られて°いるウィルス性又はプラスミドＤＮＡのような、関 与する細胞のＤＮＡと別の起源のＤＮＡ又は同じ起源のＤＮＡであり得る。

好ましい組換えＤＮＡは植物ＩｉＢ胞と適合性の異種ＤＮＡ、特にＴｉ−プラス ミドＤＮＡを含んでいる。

特に好ましい組換え体は、植物細胞、特にＧＳ阻害剤の不活化が付与されるべき 植物細胞により認識されるプロモーターのコントロール下でＧＳＩ言剤を不活化 するＤＮＡを含有するものである。

本発明の好適な組換え体は、さらに、特にプロモーター要素を含む調節要素に関 して、異種ＤＮＡと適合性の細胞環境下で前記ＧＳ−阻害剤−不活化ＤＮＡが転 写及び翻訳されうるように配置された前記ＧＳ阻害剤−不活化ＤＮＡを含有して いる改変ベクター、特にプラスミドに関す、る。有利なベクターは、外来細胞中 、特にそのゲノムＤＮＡ中に安定的に前記ＧＳ阻害剤−不活化ＤＮＡを取り込む ように遺伝子操作されたものである。

好ましい改変ベクターは、植物細胞を安定に形質転換しえ、対応のｍ胞にＧＳＩ 書剤不活化能を付与するものである。

１ｃｕｓ株のＢｉａｌａｐｈｏｓ−耐性−遺伝子の開始コドンはＧＴＧフドンで あると思われる。しかし、好ましい組換えＤＮＡ又はベクター中では、その開始 コドンＧＴＧ＠ＡＴＧ開始コドンで置換することによりＢｉａｌａｐｈｏｓ−耐 性遺伝子が改変されている。このＡＴＧは植物細胞内で翻訳を開始させることが できる。

後述の実施例で使用した植物のプロモーター配列は３５３カリフラワーモザイク ウイルスのプロモーターで構成した。関与する植物種との関係でより適切である ときには、当業者は他の植物ブＯモーダーを選択しうろことは言うまでもない。

本発明のもう１つ別の好ましい実施態様によると、特にＢｉａｌａｐｈＯ３−耐 性ＤＮＡがコードする酵素を葉緑体内に運搬することを所望するときには、異種 ＤＮＡフラグメントを、トランジットペプチドをコードする遺伝子又はＤＮＡフ ラグメントに融合し、次にこの投石のフラグメントをＧＳ阻害剤不活化遺伝子と 選択した植物プロモーターとの間に挿入する。

このような構築を達成しうる方法については次のものを参照しえ、これらはすべ て引用によって本明細書に取り入れる：実印特許出願第８４３２７５７号（１９ ８４年１２月２８日出願）及び第８５００３３６号（１９８５年１月　７日出願 ）、並びに米国（Ｎｏ、　７５５．１７３、年１２月２０日出願）、日本（Ｎｏ 、　２９９７３０．１９８５年１２月２７日出願）、イスラエル（Ｎｏ、　７７ ４６６　、１９８５年１２月２７日出願）及びオーストラリア（Ｎｏ、　５１６ ５４８５．１９８５年１２月２４日出願）に出願した関連出願。

科学文献、特に次の論文ニ ーＶＡＮ　ＤＥＮ　ＢＲＯＥＣＫ他、１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ、３１３．　３ ５８−３６３；−５ＣＨＲＥＩＥＲ他、Ｅｍｂｏ、　Ｊ、、　Ｖｏｌ、４．　ｎ ”　１．２５−３２．も参照しうる。

これらの論文も引用によって本明細書に取り入れる。

記録するために、「トランジット（運搬）ペプチド」という表現は、植物細胞の 核ＤＮＡがコードする前駆体蛋白質中で葉緑体蛋白質サブユニット又は葉緑体蛋 白質と通常結合しているポリペプチドフラグメントを指すことをここで思い出そ う。次に、葉緑体蛋白質を葉緑体内に輸送する過程で、トランジットペプチドは 葉緑体蛋白質から分離され、又は蛋白質加水分解によって除去される。好適なト ランジットペプチドの例はりブロース−１，５−ニリン酸（ＲｕＢＰ）カルボキ シラーゼの小さなサブユニットと結合したもの又はクロロフィルａ／ｂ結合蛋白 質と結合したものである。

従って、後記定義の方法に使用するに適したＤＮＡフラグメントやＤＮＡ組換え 体が提供される。

より特定的には、本発明は植物及び該植物の生殖物質中に安定に組込まれ、かつ 該植物又は生殖物質中でグルタミン合成酵素阻害剤の作用を不活化又は中和しう る蛋白質の形で発現され得る異種遺伝物質を含む該植物及び該植物の生殖物質を 製造する方法として一般的に定義されうる方法にも関し、この方法は前記阻害又 は中和活性を発現しえない植物細胞又は植物組織の出発物質から前記異種遺伝物 質を含有する植物細胞又は植物組織を製造する非生物学的ステップと、前記遺伝 物質を含む前記植物細胞又は植物組織から植物又は該植物の生殖物質又はその両 者を再生させ、適宜、前記植物又は生殖物質又はその両者を生物学的に′ａ製す ることからなり、前記異種遺伝物質を含有する前記植物細胞又は植物組織を製造 する非生物学的方法は、前記蛋白質をコードするヌクレオチド配列と、前記植物 ｉ胞又は植物組織内で前記ヌクレオチド配列を発現させうるものの中から選択し た調節要素とを含有するＤＮＡ組換え体で前記出発物質の植物細胞又は植物組織 を形質転換し、前記植物細胞及び組織並びに植物及び世代を通してそこから得ら れる生殖物質中に前記ヌクレオチド配列を安定に組込ませることより成る。

本発明はｌ１ｉａｔａｐｈｏｓ−耐性ＤＮＡ、又はより一般的にはＧＳ−阻害剤 −不活化ＤＮＡを含有する細胞培養物にも関し、この細胞培養物は、非形質転換 細胞を破壊するような量でＧＳ阻害剤含有組成物を含有する培地中で培養すると きにこのような組成物に対して耐性であるという特性を有している。

本発明はより特定的にＢｉａｌａｐｈｏｓ−耐性ＤＮＡが安定的に組込まれ、植 物ｉｌｌ胞の連続する世代に亘り存続する植物細胞又は細胞培養物に係る。従っ て、ＧＳ阻害剤、より特定的にはＢｉａｌａｐｈｏｓ又はＰＰＴに対する耐性は 本発明の植物ｍ胞を特性化する一つの手段とも考えられる。

適宜、前記植物細胞から得たゲノムＤＮＡと、ＧＳ阻害剤不活化ＤＮＡ配列を含 有するプローブとの間のハイブリダイゼーション実験を利用することもできる。

より一般的には、本発明はその各々のゲノムＤＮＡに安定的に組込まれた外来性 又は異種ＤＮＡフラグメントを含有する植物と同様に植物ａ胞、生殖物質、特に 種子に関し、ここで、前記フラグメントはこのような植物細胞、生殖物質、種子 及び植物の世代を通して伝達され、前記ＤＮＡフラグメントはＧ３阻害剤、特に Ｂｉａｌａｐｈｏｓ及びＰＰＴを不活化又は中和しうる非種特異的酵素活性を誘 導する蛋白質をコードしており、より特定的には前記植物側り生殖物質、種子及 び植物にＧＳ阻害剤耐性という対応の非種特異的表珊型を付与する。

「非種特異的（ｎｏｎ−ｖａｒｉｅｔｙ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）Ｊ　ＷＥ素活性又 は表現型は、後述の実施例で非限定的に例示されるようにそれらが特定の植物遺 伝子又は種に特徴的なものではないという事実に関連している。それらは、通常 は互いに関係のない種に属する植物に適応でき、前記植物材料に異種ＤＮＡ、例 えば細菌性ＤＮＡ又は化学合成したＤＮＡを取り込ませることからなる本質的に 非生物学的な方法により前記植物材料内で誘導される。この異種ＤＮＡは前記植 物材料内には通常はなく又は天然の繁殖・生殖過程ではそれらに取り込まれ得な いものであり、それにもかかわらずそれらに対し共通の表現型（例えば除草剤耐 性）を付与するものである。

本発明は畑で栽培する植物種を雑草から保護する方法に使用するのに特に有利で あり、この方法は雑草を撲滅するのに有効な量の例えばＢｉａｌａｐｈｏｓ又は ＰＰＴのような除草剤で土地を処理するステップからなり、ここで、栽培する植 物種は前記ＧＳ阻害剤を中和又は不活化しうる酵素活性を有する蛋白質をコード するＤＮＡフラグメントをそのゲノム内に含有している。

例示のためだけであるが、上記の方法に使用する有効量は約０．４〜約１．６１ ６／ｈａのＢｉａｌａｐｈｏｓ又はＰＰＴである。

次に、例示のためだけに、／ｖｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎから寄託番号ＡＴＣＣ２１７０５として入手しうるｓｔｒｅｐ ｔｏｍｙｃｅｓｈｖ　ｒｏｓｃｏ　１ｃｕｓ株から上記の好ましいＤＮＡフラグ メントをどのようにして単離したのかを開示する。

・以下の開示はＰＰＴ核を有する化合物を産生ずる他の菌株に適用しうる手法も 提供する。

最後に、形質転換した細胞へのＢｉａ！ａｐｈｏｓ及びＰＰＴを不活性化する能 力を付与する好ましいＤＮＡフラグメントの挿入について記載する。従って、上 記の手法で単離した、以後Ｂｉａｌａｐｈｏｓ−耐性遺伝子又は「５ｆｒＪ遺伝 子と表わすＢｉａｌａｐｈｏｓ不活化ＤＮＡ−フラグメントをプラスミドに挿入 し、それを用いて、植物ｉｉｌ胞を形質転換し、それらにＢｉａｌａｐｈｏｓ酎 性を付与し、う耐ということも非限定的に説明するための例示として単に示した ものである。

次の開示は図面を参照して行う。

図面の簡単な説明 図中、 第１図は、Ｂｉａｔａｐｈｏｓ耐性をコードするｓｔｒｅｐｔｏｍ　ｃｅｓｈｖ ａｒｏｓｃｏ　１ｃｕｓ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントを含有するプラスミドの制限 地図であり、このプラスミドは以下１）ＢＧＩと表わすがこれは以下の開示に従 って構築した。

第２図は、ｐＢＧＩから得、他のプラスミド（ｐＢＧ３９）内でサブクローニン グした、耐性遺伝子を含有する小さい方のフラグメントのヌクレオチド配列を示 す。

第３図は、例として示した一連のプラスミドの構築を示す。

これらのプラスミドはそこにＢｉａｌａｐｈｏｓ−耐性遺伝子すなわち「５ｆｒ Ｊ３！ｌ伝子を挿入する適切な適応手段を提供することを目的とする。

第４Ａ図及び第４Ｂ図は例として示した一連のプラスミドの構築を示す。これら のプラスミドはそれらの制御下にプラスミド内に挿入された外来遺伝子の転写及 び発現を開始しうる適切な植物ａ胞プロモーター配列を含有している。

第５Ａ図は第３図で得たプラスミドのヌクレオチド配列の決第５Ｂ図は、ｐＢＧ ３９から得たＬ姑工／旦」１．■フラグメントからのＢｉａｌａｐｈｏｓ−耐性 遺伝子の最初のコドンの再構築と、天然の「５ｆｒＪ遺伝子のＧＴＧ開始コドン のＡＴＧＲ始コドンでの置換を示す。

第５Ｃ図は完全な「５ｆｒＪ遺伝子すなわちその最後のコドンの再構築と、第４ Ａ図及び第４Ｂ図で得たプラスミド内へのその挿入を示す。

第６Ａ図は植物細胞プロモーターの制御下に置かれた「ｓｒｒ」遺伝子含有発現 ベクターを示す。

第６Ｂ図は、いくつかのヌクレオチドを置換することによって、第６Ａ図に示し たものから得た他の発現ベクターを示す。

第７図はプロモーター領域の制御下でかつトランジットペプチド配列の下流にｊ ｓｆｒＪ遺伝子を挿入するための、所与の植物Ｉｔ胞遺伝子のトランジットペプ チド配列とプロモーター領域を含有するプラスミドを最終的に製造するための、 例とじて示した一連のプラスミドの構築を示す。

第８図〜第１１図については後述する。

Ｓ、　ｈｖ　ｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓからＢｉａｌａｐｈｏｓ耐性道伝子を単＠す るために行った。

文献６に記載の方法に従い、２．５埒のＳ、　ｈｖ　ｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのゲ ノムＤＮＡと０．５ＩＩｓのＳｔｒｅｏｔｏｍｖｃｅｓベクターｐｌＪ６１　’ ｅ　Ｐ　ｓｔ　Ｔで開裂した。ベクターフラグメントとゲノムフラグメントを混 合シ、全ＤＮＡ）Ｉｆｔ４０Ｒｄ−１ｒＴ４　ＤＮＡＩＪガーゼにより連結した （　６６ｍＨのＴｒｉｓ　−ＨＣ１（ｐ）ｌ　７．５）、　１ｍＨのＥＤＴＡ、 １０ｍＨのＭＱＣ１！、１（ｈｌｌＨの２−メルカプトエタノール及び０．１ｘ Ｍ（７）Ａ７Ｐを含有する連結塩中で１０℃で４時間、次に４℃で７２Ｗ！Ｉｆ ：ｉり。

下記のように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を介した形質転換操作により ３Ｘ　１０９のｓ、　ｌｌｖｉｄａｎｓ株６６のプロトプラストに上記連結産物 を導入した。これらのプロトプラストは、０．５％のＤｉｒｃｏ酵母抽出物を含 有するＲ２寒天（Ｒ２ＹＥ）の２０枚のプレート上で再生させると、５ｘ１ｏ７ 個のコロニーと４ｘ　１０’個のポックを生じた。本明ＩＯＢ中に開示する実験 で使用した種々の培地やバッフ？の製法及び組成は下記に示す、これらノｏ−ン （ｌａｗｎ）ヲ５０刀ｄ−’＋７）　Ｂｉａｌａｐｈｏｓｔ−含有Ｔル１Ｂ少培 地プレート上でレプリカ培養すると、形質転換体１０　個当り１つの頻度で薬剤 耐性コロニーが出現した。薬剤耐性コロニーをＨｌｉした後、これらのプラスミ ドＤＮＡを単離し、ｓ、　＋　１ｖｉｄａｎｓブＯドプラストを再度形質転換す るために使用した。非選択的に再生した後Ｂｉａｌａｐｈｏｓ含有培地に、レプ リカ培養するとポックとＢｉａｌａｐｈｏｓ耐性の成長との間は１００％の相関 を示した。数個の耐性クローンの組換えプラスミドは全て１．７ＫｂのＰ　Ｓｔ 　］挿入物を含有していたく第１図参照）。

除草剤耐性遺伝子のサブクローニング 次に、プラスミドｐＢＧ　２０を生成させるために高いコピー数の５ｔｒｅｐｔ Ｏ１ｙＣｅｔｅベクターｐＩＪ　３８５に１．７Ｋｂ　（７）　Ｐ　Ｓｔ　Ｉ挿 入物をサブクローンした。　ｐａｃ　２０を含有するＳ、　ｌ　１ｖｉｄａｎｓ 株はＢｉａｌａＤｈＯＳに対する耐性が５００倍以上高かった。Ｓ、ｌ　１ｖｉ ｄａｎｓの増殖は通常ＢｉａｌａｐｈＯ３を１埒／ｄ含有する最少培地で阻害さ れるが、１ｌＧＢ２０を含有する形質転換体の増殖はＢｉａ！ａｐｈｏｓを５０ ０Ｊ＋９／ｄ含有する培地中でも顕著には阻害されなかった。また、ｐｓｔｌフ ラグメントをプラスミドｐＢＲ３２２のＰ」」」一部位に両方の配向でサブクロ ーンし、その配向に応じてプラスミドｐＢＧ　１及びｐＢＧ　２を生成した。最 少Ｍ９培地上でのテストではｐＢＧ　１又はｐＢＧ　２を含有する六１！菌（Ｅ 、ｃｏｌｉ）　Ｅ８７６７はＢｉａｌａｐｈｏｓに対し耐性であつた。

±１．６５にｂ　ＰｓｔＩ　−ＢａｍＨＩフラグメントをＤＢＧｌからプラスミ ドｐＵｃ　１９にサブクローンしてプラスミドｐＢＧ　３９を製造し、Ｅ、ｃｏ ｌｉ　Ｗ３１１０．　Ｃ６００及びＪＭ８３をＢｉａｌａｐｈｏｓ耐性とした。

−ｆ１ｍ±」−フラグメントは２２Ｋｄ蛋白質の合成を指令することが示された 。この１．６５にｂｌ入物は２２Ｋｄ蛋白質をコードするフラグメントを含有し ており、以降ｒｓｆｒＪ遺伝子と呼ぶ。

遺伝子の微細な　図及びＩＰＪの決 ６２５　ｂｐ　虱３ＡフラグメントをｐＢＧ　３９からｐＵｃ　ｉ９にサブクロ ーンし、［、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０宿主をＢｉａｌａｐｈｏｓ耐性にした。得ら れたクローンは配向によりｐＢＧ　９３とｐＢＧ　９４であった。

ａ且３Ａフララグメント中の遺伝子の配向は、ｐＢＧ　９３中のｐＵｃ　１９１ ａｃプロモーターからＩＰＴＧにより　Ｂｉａｌａｐｈｏｓ耐性が誘導されえた ことを示す実験により示された。ＩＰＴＧ　（０，５ｍＭ）が存在すると、Ｂｉ ａｌａｐｈｏｓ含有Ｍ９培地上でのｐＢＧ９３／Ｗ３１１０の耐性は５から５０ 埒／ｄへと増加した。ｐＢＧ　９３のない一３１１０宿主はＢｉａｌａｐｈｏｓ 　５　ｔａ／−を含有するＭ９培地上では増殖しなかった。

これらの実験は、比ト３Ａフラグメントは活性を失うことなくサブクローンされ うることを示した。これらの実験は、添付第２図に示すように適当な配向も提供 した。これらのクローンがコードする蛋白質は、Ｓ、　Ｉ＋ＶｉｄａｎＳの抽出 物由来の結合転写−翻訳システム（文献７）を使用して検出した。３ａｕ３Ａフ ラグメントの配向に応じ、異なる大きさの翻訳産物、すなわちｐＢＧ９４につい ては２２Ｋｄ、　ｐＢＧ　９３については±２８Ｋｄが観察された。このことは 、ａ肚３Ａフラグメントは完全な耐性遺伝子を含有しないことと、ｐＵｃ　１９ 配列の翻訳の結果としてのポリペプチド配列を含む融合蛋白質が形成されること を示した。

大量の蛋白質を得るため、ｐＢＧ　１からの１．７Ｋｂ　ＰｓｔＩフラグメント を高いコピー数のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅレプリコンｐＩＪ　３８５に検体 は５倍以上のＰＰＴアセチル化活性を有し、又、ドデシル硫酸ナトリウムゲル（ ＳＯＳゲル）上で大量の２２Ｋｄ蛋白質を有していた。さらに、Ｂｉａｌａｐｈ ｏｓの産生が始まったときに、アセチルトランスフェラーゼと２２Ｋｄ蛋白質の 両者が出現した。　ｉｎ　Ｖｉｔ＋”Ｏのデータ、合成速度（ｋｉｎｅｔｉｃｓ ）　、及びｐＢＧ　２０形質転換体に伴う増幅された発現の相関は、この２２Ｋ ｄバンドが遺伝子産物であることを強く示唆した。

６２５　ｂｐの１且３Ａフラグメントの完全ヌクレオチド配列をそのフランキン グ（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列と共に決定した。コンピューターでの分解により、 １鉦３Ａフラグメントの全長に亘り読み取り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆ ｒａｍｅ）が存在することが明らかになった。

５ｆｒ３Ｉ伝子産物の特性化 ｒｓｆｒＪ遺伝子の読み取り枠が実際にＢｉａｌａｐｈｏｓ耐性酵素をコードし ていることを決定するために一連の実験を実施した。

耐性遺伝子の５°末端を決定するために該酸素のＮＨ２末端配列を決定した。前 記の配列を決定するために使用した手法の詳細に関しては、Ｊ、　ＶＡＮＤＥに ＥＲＣＫＨＯＶＥ　（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃ、　１５２．　ｐ９〜１９゜１ ９８ｓ）が開発した５沫と、１８８５年１０月　１日出願の他国特許出願Ｎｏ、 　８５１４５７９及び１９８５年９月２日出願の他国特許出願Ｎｏ、　’　８５ この手法により、登録商標ＰＯＬＹＢＲＥＮＥとして市販のポリ四級アミンでコ ートしたグラスファイバーシート上に、ドデシル硫酸ナトリウムを含有するポリ アクリルアミドゲルで予め分離した核酸と蛋白質を固定化できる。本質的にニト ロセルロース膜上への蛋白質プロッティングによって移す（文献８）。このこと によりアミノ酸組成と、固定化した蛋白質の部分配列が決定される。Ｓ、　ｈｖ ａｒｏｓｃｏ　ｔｃｕｓ　ｐＢＧ　２０により産生された固定化した２２にｄ蛋 白質を含有するシートの部分を切り取り、このディスクをガス相シーケンサ−（ ５ｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の反応空に載置し、グラスファイバーに結合した２２Ｋ ｄ蛋白質をＥｄｍａｎ分解操作にかけて、次のアミノ酸配列：　Ｐｒｏ−Ｇｌｕ −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇを得た。

この配列は、ｅ２ｓｂｐの３ａｕ３Ａフラグメントの読み取り枠から推定された アミノ酸配列と一致した。これはコドン３から１２までの範囲に対応した。

従って、２２Ｋｄ蛋白質のＮＨ２−末端はこの配列の上流にあった。実際の蛋白 質の翻訳はアミノ酸２個分前のＧＴＧ開始コド始コドンとしてしばしば使用され 、メチオニンとして翻訳される。ＧＴＧ開始コドンから翻訳される蛋白質は１８ ３個のアミノ酸長であり、分子量２０５５０を有するであろう。これは観察され た約２２０００の分子量と良く一致した。

グメントのクローニングでは終結コドンは再構築されなかった。

このことにより、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの転写−翻訳分析で観察さ、れた融耐性遺伝 子そしてその遺伝子産物の最初の表現型と物理的特性のいくつかを定義した後、 耐性を付与する機構を理解するために一連の実験を行った。上述のように、ＰＰ Ｔはグルタミン合成酵素（ＧＳ’）を阻害するＢｉａｌａｐｈｏｓの部分であり 、Ｎ−アセチルＰＰＴは阻害剤ではない。標準アッセイ（文献９）を使用すると 、Ｓ、　ｈｙｏｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　ＡＴＣＣ２１７０５１ＥＫ１体はＳ、　 Ｉ　１ｖｉｄｎａｓ内に見られないＰＰＴアセチルトランスフェラーゼを含有す ることが示された。活性はＢｉａｌａｐｈｏｓトリペプチドをアセチル化しない 。ｐＢＧ　２０又はｐＢＧ１６　（もう１つのｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅベク ターＩＩＪ　６８０内でクローン化した６２５　ｂｐ　、旦ａｕ　３Ａフラグメ ントを含有するプラスミド）内にクローン化した耐性遺伝子を有するｓ、　ｌ１ ｖｉｄａｎｓも、ＰＰＴをアセチル化しＢｉａｌａｐｈｏｓをアセチル化しえな い活性を有していた。ｐＢＧ　２０／Ｓ、　ｌ１ｖｉｄａｎｓの抽出物により製 造されたＰＰＴ由来の反応産物を単離して、それが実際アセチル−ＰＰＴである ことを確認した。質量分光分析により、分子量はＰＰＴに対して１つのアセチル 基と等しい分だラグメントはＰＰＴアセチルトランスフェラーゼをコードする配 列を含有すると結論した。

上記開示の手法に使用した実験条件及び試薬は次の通りであった： 上記で使用した培地及びバッファのｍ法及び組１°Ｐ培地：庶糖１０．３９　、 　Ｋ２　Ｓ　Ｏａ　０−０２５９９Ｍ　Ｑ　Ｃｊ！　２・６８２００．２０３ｇ 及び微量元素溶液０．２ｉを８０ｓｅの蒸留水に溶解し、オートクレーブにかけ る。次いで、１１ｄｃ）ＫＨ２ＰＯ（０，５％）、１０ｄ（７）ＣａＣｆｉ　− ２Ｈ２０（３，６８％）及ヒ１〇−のＴＥＳバッファ（０，２５Ｍ、　ｐＨ７， ２）を順次加える。微量元素溶液（１１当り）：　ＺｎＣｆ　、４０ｒＩｇ：　 ＦｅＣｆＩ　−６Ｈ２０゜２０（ｌｙ：ＣｕＣ！！　−２ＨＯ，１０ａｙ；Ｍｎ Ｃｆｆ　−４Ｈ２０゜１０ａｙ：Ｎａ２５４ｏ７−１０Ｈ２０，１ｏｒｑ：　（ ＮＨ４）６Ｍｏ７０２４・４　Ｈ２０、１０Ｉ！９゜ ２°＆ヱヱ王：置部１０．３９　、　Ｋ　２　Ｓ　ＯＯ，０２５ｇ、　Ｍ　Ｑ　 ｃ１２−５）Ｉ　Ｑ　１．０１２９．　／ｊＪＬｔコース１ｇ、　Ｄｉｆｃｏカ ザミノ酸０．０１グ及びＤｉｒｃｏ寒天２．２ｇを８０Ｈ１の蒸留水に溶解し、 オートクレーフニカける。微量元素溶液０．２＋ｄ！、　ＫＨ２ＰＯ４（０，５ ％）　ＩＩｉ。

ＣａＣｌ２　・２Ｈ２０（３，６８％）　８．０２ｄ、　Ｌ−ブＯリン（２０％ ）１．５　ｄ、ＴＥＳバッフｙ　（０，２５Ｍ、　ｐＨ７，２）　１０ｄ、　Ｎ 　ａＯＨ（１Ｍ）　０．５ｄ、酵母抽出物（１０％）５Ｍ１を順次加える。

３＠ＬＥ　：　１０ｍＨＴＲｌ５　ＨＣｆ　、　１ｍＨＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０ ４°と旦旦上：　Ｄｉｆｃｏ醇母抽出液（０，３％）　、　Ｄｉｒｃｏペプトン （０，５％）、オキソイ下モルト抽出物（０，３％）、グルコース（１％）。

Ｓ、　１ｉｖｉｄａｎｓプロトプラストの形質転換１、　２５０−のバッフル付 きのフラスコ中で、ＹＥＭＥ２５！ｄ。

３４％庶糖置部　０．００５ＨＭ　Ｑ　ＣＬ）　、０．５％グリシンからなる培 置物を３０〜３６時間遠心する。

２、ベレットを１０．３％庶置部に！！濁し、遠心する。この洗浄をもう１回繰 り返す。

の濃度を０．００２５　Ｍに減少させたＰ培地中１１９／ｍｅ）に懸濁し、３０ ℃で１５〜６０分間インキュベートする。

４．５−のピペットで３回ピペッティングすることにより溶液を混合し、さらに １５分間インキュベートする。

５、　Ｐ培地（５ｄ）を加え、ステップ４と同様にピペッティングして混合する 。

６、綿ウールを通して溶液を一過し、ベンチ遠心（８００Ｘ　Ｇ　）　７分間で ゆり（つとプロトプラストを沈澱させる。

７、プロトプラストを４ａｅのＰ培地に懸濁し、再度遠心する。

８、ステップ７を繰り返し、上清を捨てた後に残ったＰ培地の滴にプロトプラス トを懸濁する（形質転換用）。

９、２０４未満のＴＥ中のＤＮＡを加える。

１０、直ちに０．５ｄのｐ　［：Ｇ１０００溶液（２，５９Ｐ　Ｅ　Ｇを、２． ５％庶置部、５ｄ、　０．０Ｏ１４Ｋ　Ｓｏ　、　ｏ、１Ｈｃａｃ！ｌ、Ｏ，ｏ ５ＨＴＲＩＳ−マレイン酸、　ｐＨ８，０に溶解し、微量元素を加えたもの）を 加え、成分を混合するために１回ピペッティングする。

１１、６０秒後に、５ｄのＰ培地を加え、ゆっくり遠心してプロトプラストを沈 降させる。

１２、ベレットをＰ培地Ｃ１ｄ　）に懸濁させる。

１３、　０．１−をＲ２ＹＥプレート（例えば層流キャビネット中で新鮮重量の ８５％まで乾燥した形質転換用プレート）に載せる。

１４、３０℃でインキュベートする。

−４ｓｆｒ　伝　カセットの　築 植物の発現ベクター内でクローニングさせるために「５ｆｒＪ遺伝子カセツトを 構築した。

「５ｆｒＪ遺伝子フラグメントを含有するプラスミドｐＢＧ　３９から」Ｉ　１ ｉＬＩ［フラグメントを単離すると、開始コドンを含む最初の数コドンと終結コ ドンを含む最後の数コドンが消失した。

「５ｆｒＪ遺伝子のこのフラグメントは適当なアミノ酎をコードする合成オリゴ ヌクレオチドによりｉｎ　ＶｉｔｒＯで再構築することができた。

相補的な合成すりゴヌクレオチドは５°−ＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡＣ及び３ °−ＴＣＧＧＧＴＣＴＴＧＣＴＧＣであった。

このような合成オリゴヌクレオチドを使用することにより、「５ｆｒＪ遺伝子の ５°末端を再形成でき、ＧＴＧ開始コドンは、植物細胞によって良く翻訳される コドン、特にＡＴＧコドンで置換され得た。

次に、ｒｓｆｒＪ遺伝子と結合したオリゴヌクレオチドを含有するＤＮＡフラグ メントを適当なプラスミドに挿入した。このプラスミドは所与のヌクレオチド配 列を含有しており、以後「アダプター」フラグメントで示す。

このアダプターフラグメントはニ ーｒｓｆｒＪ遺伝子の最後の数コドンを再形成しうるＴＧＡ終結コドン； 一合成オリゴヌクレオチドで部分的に再形成した「５ｆｒＪ遺伝子を含むヌクレ オチド配列のフラグメントを挿入させうる適当な制限部位、この挿入により完全 な（ｉｎｆａｃｔ）　ｒ　ｓｆｒ　Ｊ遺伝子を再構築した； −「５ｆｒＪ遺伝子全体を単離するための適当な制限部位からなっていた。

次に、適当な植物のプロモーター配列を有するもう１つのブ列はカリフラワーモ ザイクウィルスのプロモーター配列（ｐ３５Ｓ）からなった。もちろん本発明は この特定のプロモーターの使用に限定されるものではない。他の配列、例えば後 記するＴＲＩｏ−２°プロモーター領域及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌ ｉ　ｎａからのＲｕｂｉｓｃｏ小サブユニット遺伝子のプロモーターフラグメン トも植物に適するプロモーターとして選択し得た。

１°プラスミドｐＬに５６．２の構築（第３図）プラスミドＩＩＬＫ　５６．２ の構築は次の一逮の制限部位子弁：江１　、　Ｌａ！ＨＩ　、　ＮｃｏＩ　、　 Ｋｔ＋ｎＩ　、　Ｂ且■、Ｍｌｕｉ、３ａｍＨｌ。

ｄ工ｉｎｄ　ｍ及びＬｕ１を含む好適なアダプターを得ることを目的とした。

この構築に使用した出発プラスミドｐＬに５６．、　ＤＪＢ　６４及びｐＬＫ３ ３はＢＯＴＴＥＲＨＡＮ　（文献１１）が開示したものであった。

本明細書中以下に記載のＤＮＡフラグメントを単離し、低融点アガロース（ＬＧ Ａ）から分離した。

酵素ＬｕＨＩ及び１髄ＩでプラスミドｐＬに５６を開裂した。プラスミドｐＪＢ 　’６４から得たＮｃｏｌ−Ｎｄｅｌフラグメント（図面中、破線の弧ｒａＪで 示した）でｐＬＫ　５６中のｒｂＪで示すｌ！ＨＩ−又戯１フラグメントを置換 した。Ｅ、　ｃｏｌｔのＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント、）でＢ ａｌｍＨＩとｆｓＪ　ｃｏ　ｉのはみ出した末端を充填（ｆｉｌｌ　ｉｎ）シた 後、連結できた。

Ｔ４　ＤＮＡリガーゼにより特に再環化を行った。新しいプラスミドｐＬに５６ ．３が得られた。

１）ＬＫ　Ｓ６．３のと旦Ｉ−ＰＳｔＩフラグメント（ｄ）と置換した。

Ｔ’４ＤＮＡリガーゼで再環化した後、得られたプラスミドＥＩＬＫ　５６．２ は以後の［５ｒｒＪ遺伝子の挿入のために必要な制限部位を含むヌクレオチド配 列を含有した。

２°プラスミドｏＧｓ）ｌ　１ｏｏ　（、４Ａ図）の構築最後に述べた構築と平 行して、植物細胞のポリメラーゼが識別するプロモーター配列を含有し、転写方 向でこのプロモーター配列の下流に好適な制限部位を含むプラスミドが製造され た。

この制限部位は、次にｐＬに５６．２から得られる「５ｆｒＪ遺伝子を植物プロ モーターの制御下で挿入し得るようにするためのものである。

プラスミドｐＧＶ　８２５　ハＢＥＢＬＡＥＲＥ他（文献１０）に記載されてい る。プラスミドＤＪＢ　６３はＢＯＴＴＥＲＨＡＮ　（文献１１）から９もので ある。

ｐＧＶ　８２５　ヲＰ　％ツ■で直線化し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで再環化させ ると、（ｅ）で示す内ｓｐｖｕｍフラグメントが欠落した（プラスミドＤＧＶ　 ９５６）。

次にＢａ１ｌｌＨＩ及びｌ阻ＩＩｒｐＧＶ　９５Ｇ　ヲｎ’ｌＪシタ。

ＨＩ　−江Ｔｌフラグメントに代えて挿入した。

’Ｔ４ＤＮＡリガーゼで再環化させ、プラスミドｐｅｖ　１５００を得た。

プラスミドｐＧＳＨ５０から得たＬ９ＲＩ　−Ｈｉｎｄ　ｍフラグメントヲ！Ｉ ＩＦｉ！シタ。７５　スミｔ’　ｐＧＳＨ５０Ｌｔ　ＶＥＬＴＥＮ他（文献１３ ）ニ記載の２重のＴ’Ｒ１°−２°プロモーターフラグメントを有していた。

このフラグメントをｐＧＶ　１５００に挿入し、Ｈｐａｌ及びＨｉｎｄＩ［Ｉで 消化するとｐＧｓＨ１５０が得られた。

このプラスミドはＴ−ＤＮＡ転写体７の３゛末端の前のブロモ−ターフラグメン ト及びクローニング用のｌ！Ｈ１と立」１部位を含有している。

ＣＦ２はｐＢＲ３２２由来のプラスミドで易り、ｌ！ＨＩフラグメント内にカリ ７ラワーモザイクウイルスの３５ＳプＯ−モーター領域を含んでいる。

ｐＧＳＨ１５０を１■Ｈ１と江■で切った。

Ｄ３５Ｓプロモーターのヌクレオチド配列を含有するＣＦ２のＢ曲ＨＩ−江■フ ラグメント（ｈ）でＩ）ＧＳＨ１５０のＢａ１ＨＩ−江■フラグメント（ｉ）を 置換してプラスミドｐＧＳＪ　２５０を形成した。

次にｌｉＩ［制限部位でｐＧＳＪ　２５０を開環した。

ｍＧＶ２　（文献１２）カら得たＬ！！ＨＩフラグメントヲｐＧｓＪ　２５０（ ７）ＢｏｌＩ［部位に挿入してプラスミドｐＧＳＪ　２６０を形成した。

しかしながら、ｐＬＫ　５６．２から得られる「５ｆｒＪ遺伝子をプラスミドｐ ＧＳＪ　２６０に挿入する前に、より実際的な方法で挿入させるためにＤＬに５ ６．２を更に改変することが依然望ましかった。従うて、ｐＬＫ　５６．２はｐ ＧｓＲｌを得るため、に下記のようにさらに改変した。

プラスミドｐＧＳＪ　２６０から出発して、植物ｍ胞の形質転換のために２つの プラスミドが構築されたニ ー植物細胞の細胞質内で「５ｆｒＪ遺伝子を発現させる第１のブ第１の場合：植 物１Ｂ胞の細　で「ｓｆｒ　伝　を　し〜ニング（第５図） 第５Ａ図に、ｐＬに５６．２のアダプターのヌクレオチド配列を示す、特にＬＡ ｉＨＩ　、又匹！、比旦■制限部位の位置を示す。

このアダプターフラグメントを酵素ＮｃｏＩとＢｐｌＩ［によって開裂した。

第５Ｂ図はＦ　ｏｋ　Ｉ　−江Ｉ［フラグメント（ｊ）を示している。

これはｐＢＧ　３９より得られた。これら２つの制限部位の位置は第２図に示す 。

合成オリゴヌクレオチドを使用して、「５ｆｒＪ遺伝子の最初の数コドン、特に 遺伝子の５°末端を再形成した。この５゛末端では最初のＧＴＧコドンがＡＴＧ Ｒ始コドンに置換されていた。

次に合成オリゴヌクレオチドで完結したこのＦｏｋｌ−ｓｏ１ｍフラグメントを ｐＬに５６．２中のアダプターのＮｃｏｌ−Ｂ（ＩＩＩＩフラグメントと置換し た。Ｔ４　ＤＮＡリガ７ゼによる再環化後に、遺伝子の３゛末端もこのようにし て再形成した。得られたプラスミドｐＧＳＲ１はこのようにそのアダプター内に 挿入された完全な「５ｒｒＪ遺伝子を含有していた。

次にブラスミ）−”ｐＧＳＪ　２６０ヲＢａ１ＨＩｒＲ裂ｔ、、（１５０図）、 全「５ｆｒＪ遺伝子を含有するｐＧｓＲｌから得たｌ！ＨｌフラグメントをｐＧ ｓＪ　２６０に挿入した。

得られたプラスミドｐＧＳＲ２（第６Ａ図参照）はｐＢＲ３２２し６プリフン、 細菌のストレプトマイシン耐性遺伝子（ＳＤＭ−３Ｐ−ＡＤ−トランスフェラー ゼ）及び。

−Ｔ−ＤＮＡの境界（ｂｏｒｄｅｒ）　７ラグメント：−植物細胞内で優性選択 可能なマーカーを提供するキメラカナマイシン遺伝子：及び 一キメラ「５ｆｒＪ遺伝子 からなる遺伝子工学で処理したＴ−ＤＮＡを含有していた。

キメラ「５ｆｒＪ遺伝子は −カリフラワーモザイクウィルスのブロモ−ター領域（ｐ３５Ｓ）　ニー第５図 に記載の「５ｆｒＪ遺伝子カセットニーＴ−ＤＮＡ転写体７のポリアデニル化信 号を含む３°の未翻訳領域 からなっていた。

ＤＥＢＬＡＥＲＥ他（文献１０）が記載した手順に従ってｐＧＳＲ２を堕ｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ　ｔｕ＋１ｅｒａｃｔｅｎｓ受容体Ｃ５８Ｃ１’　Ｒ１ｆＲ（ＤＧ Ｖ２２６０）に導入した。

Ｎ、　ｔａｂａｃｕ■　ＳＲ１植物にキメラＪｓｆｒＪ遺伝子を導入するために この株を使用した。

ｐＧＳＲ２由来の２つの変異プラスミド、すなわちＤＧＳＦＲ２８０とｐｃｓＦ Ｒ２８１とを構築した。それらは転写開始部位に続く非翻訳配列が異なっている 。ｐＧＳＲ２ではこのフラグメント番マ次の配ダｊ：ＧＡＧＧＡＣＡＣＧＣＴＧ ＡＡＡＴＣＡＣＣＡＧＴＣＴＣＧＧＡＴＣ’Ｃ匹からなり、一方、ｐＧＳＲなり 、１）ＧＳＦＲ２８１ではＧＡＧＧＡＣＡＣＧＣＴＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＧＴＣ ＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＣコドンである。「５ｆｒＪ遺伝子は又プラスミドｐＧ Ｓ）Ｉ　１５０のＴＲ１°−２°プロモーターに融合すると（第４Ａ図）　、ｐ ＧＳＦＲ１６０とｐＧＳＦＲ１６１となる（第６Ｂ図）。これらのプラスミドは ｐＴＲ２［５ｆｒＪ遺伝子配座で少し差があり、ｐＧＳＦＲ１６１（配ダｊにつ し１ては文献１３参照）では「５ｆｒＪ遺伝子は内因性遺伝子２’Ａ　Ｔ　Ｇに 正確に融合し、一方、ｐＧＳＦＲ１６０では４つの過剰な塩基対（ＡＴＣＣ）が ＡＴＧの直前に存在する。その他の点では、Ｄ６５ＦＲ１６１とｐＧＳＦＲ１６ ０は完全に同じである。

共相込み（ｃｏｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　）により全てのプラスミドをＡｇｒｏ ｂａｔｅｒｉｕｍの７クセブターブラスミドｐＧＶ　２２６０に導入すると、各 々プラスミドｐＧＳＦＲ１２８０，ＤＧＳＦＲ１２８１，ｐＧＳＦＲ１１６０及 びｐＧＳＦＲ１１６１が得られる。

第２の場合：トランジットペプチドをフードするＤＮＡ　］の下流に「５ｆｒＪ 遺伝子を含有し　「ｓｆｒ　伝　産物を次いで植物、細胞の葉緑体内に輸　させ るに　するプラスミドの構築 もう１組の実験では、「ｓ　ｆ　ｒＪ遺伝子を含有するヌクレオチド配列を、ト ランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列に融合し、それを葉緑体へ運搬させ 得るようにした。

「Ｓ　ｆ　ｒＪ遺伝子のフラグメントは上記のアダプターフラグメントから単離 し、トランジットペプチドに融合した。合成オリゴヌクレオチドを使用し、完全 な「５ｆｒＪ遺伝子を再構築し、トランジットペプチドに融合した。

トランジットペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するプラスミド（下 記のプラスミドＥ）ＡＴＳ３　）はそのプロモーター配列も含んでいた。

−゛ン°−ぺ　°　コー°　る　ＮＡ　」に　合したｓｆｒ　−るプラスミ゛Ｄ ＧＳＲ４の構築上１工至上 プラスミドＤＬＫ５７はＢＯＴＴＥＲＨＡＮ（文献１１）からのものである。

プラスミドｐＡＴｓ３は、遺伝子のトランジットペプチドヌクレオチド配列とプ ロモーター領域を含むＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａからの２Ｋ　 ｂ　江ＲＩゲノムＤＮＡフラグメントを含んでいるｐＵＣ１９クローンであり、 その発現はりブロースニリン酸カルボキシラーゼの小さなサブユニット（ＳＳＵ ）である。Ａ、ｔｈａｌｉａｎａの小さいサブユニットを１ｓＯＯｂｐ　Ｌ並Ｒ Ｉ　−Ｓ　ｐｈ　Ｉフラグメントとして単離した。比蝕Ｉ開裂部位は、成熟ＳＳ Ｕ蛋白質のコード領域が正に始まる部位にある。

プラスミド１）ＬＫ５７とｐＡＴｓ３を旦９ＲＩと１蝕Ｉで開環した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼで再環化したのち、トランジットペプチド（Ｔｐ）をコードする配列 とそのプロモーター領域（Ｐｓｓｕ）を含有する組換えプラスミドｐＬＫＡＢ１ を得た。

シグナルペプチドの開裂部位に「５ｆｒＪ遺伝子を正確に融ＡＴＧ開始部位と重 なっているＮｃｏ１部位を得た。新しいプラスミド１）ＧＳＳＦＲ２を得た。こ れは、上記の変異の点だけが１−ＩＨＩフラグメントをトランジットペプチド配 列のＳｐｈ■末端に融合した。同時に、「５ｆｒＪ遺伝子フラグメントをＳＳＵ 遺伝子のＡＴＧイニシエーターに正確に融合したく図示せキメラ遺伝子を含有す る適当なベクターで植物を形質転換したときにそのキメラ遺伝子の発現により植 物中で誘導されたＢ＋ａ＋ａｐｈｏｓ耐性を次のように示した。ＤＥＢＬＡＥＲ Ｅら、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ。

Ｒｅｓ、、　１３．　ｐ１４７７、１９８５に記載の手順に従って、Ａｇｒｏｂ ａｃｔｅｒｉ−ｕｉ株０５８ＣＩ　Ｒｉ　ｆＲ（ｐＧＶ２２６０）内に動態化（ ｍｏｂ’ｉ　ｌ　１ｚａ−ｔｉｏｎ）により「５ｆｒＪ遺伝子を含有する組換え プラスミドを別々に導入した。ハイブリッドＴｉプラスミドを含有する組換え株 を形成した０本質的にＨＯＲ３Ｈら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　ｖｏｌ、　２２７゜ の葉に感染させそれを形質転換した。１例として種々の植物種の形質転換操作を 下記に示す。

１、Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕ−の葉のディスクの形質転換使用培地を 次に示す： ＡｌＨ３塩／２　４１％ｍ１ｌ Ｏ０８ｚ寒天 ｐ）−１５，７ Ａ１ｏＢ５−培地　＋２５０　ｍｇ／ｌ　Ｎ　８４　Ｎ　０３７５０Ｉｌ１ｇ／ ｌＣａＣｌ２２Ｈ２００，５０／ｌ　２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸 （ＨＥＳ） Ａ１１Ｂ５−培地　＋２５０　ｍｇ／Ｉ　Ｎ　８４Ｎ、０３０．５　ｇ／Ｉ　Ｈ ＥＳ　ｐＨ５，７ ２ｚグルコース ０．８ｚ寒天 ’４０　ｍｇ／Ｉアデニン ＋１＋＋ｇ／１６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）０、ｉ　ｎ／Ｉ　インドー ル−３−酢Ｍ　（ＩＡＡ）５００　ｎｏ／Ｉ　クラホラン（Ｃ１ａｆＯｒａｎ） Ａ１２Ｂ５−培地　今２５０　１００／ｌ　Ｎ　Ｈ４Ｎ　０３０．５０／Ｉ　Ｈ ＥＳ　ｐＨ５，７ ２ｘグルコース ０．８ｘ塞天 ４０　ｍｇ／Ｉアデニン ＋１　＋ｎｇ／Ｉ　ＢＡＰ ２００　ｍｇ／Ｉ　クラホラン Ａ１３Ｈ８ｆ：２／２　＋３　ｚ　庶Ｍ０．５　ｇ／ｌ　ＨＥＳ　ｐＨ５，７ ０，７Ｘ寒天 ２００　ｕ／ｉ　クラホラン 細菌培地−ｗｉｎ＾：（Ｍｉｌｌｅｒ　７９７２）　６０　ｍＭＫ２ＨＰ０４． ３Ｈ２ｏ。

３３　ｒａＨＫＨ２ＰＯ４ニ ア、ｓ　１１１８　（ＮＨ４）２Ｓｏ４７．７Ｈクエン酸３ナトリウム： １　ｉＨＭＱＳＯ４： ２Ω／１グルコース； ５０　Ｈ／ｌビタミンＢ１ 培地Ａ１で６〜８週継代培養後に植物を使用する。

−感染： 一菜から中央脈と端を除去する。

−残りの部分を約０．２５ｃｉの切片に切り、憾染培地Ａ１ｏ内に置＜　（１０ ＩｄＡ　１゜を含有する９αのベトリ皿に約１２切片）。

−次にｍｔｎ　Ａ培地中で増殖させたＡＯｒＱｂａＣｔｅ＋”１ｔｏｎ株の後期 対数（ｌａｔｅ　ＩｏＱ）培養物（２５ｄ／ペトリ皿当り）で切片を感染させる 。

−低い光度で２〜３日間日間ジトリインキュベートする。

−２〜３日後に培地を除去し、クラロファン（ｅ　Ｉａｒｏｆａｎ）５００１９ ／１を含有する２０ｄの培地Ａ１０で置き換える。

−１尺亙凡工立旦１ 一遺択試薬： １００＃ｊ／ｊのカナマイシン　及び １０〜７００ａｙ／Ｊｌのホスフィノトリシンを含有する培地Ａ１１上に葉のデ ィスクを置く。

−毎週、葉のディスクを新しい培地に移す。

−３〜４週後に再生カルスが生ずる。それらを分離し、選択に使用したと同じ濃 度の選択試薬を含有する培地Ａ１□上に一２〜３週後にカルスは芽でおおわれ、 これは単離して発根培地Ａ１３に移すことができる（選択なし）。

−発根に１〜２週間かかる −ざらに２〜３週後に、これらの植物を培地Ａ１上で増殖する。

２．５ｏｌａｎｕｉ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ−（じヤが０も）の塊茎ディスクの感 染使用培地を下記に示す二 Ｃ１５Ｓ−培地　４２５０　ａ＋ｇ／Ｉ　Ｎ　Ｈ４Ｎ　０３３００　ｍｇ／ｌ　 （ＣａＣＨ２ｐｏ４）　２０、ｓ　ｇ、’ｌ　ＨＥＳ　ｐＨ５，７０，５ｏ／１ ．ホｌＪコ＝ルヒｏ！Ｊトン（ＰＶＰ）４０　ｏ／ｌ　マンニトール（−０，２ ２Ｍ＞０．８ｚ寒天 ４０　ｉｇ／ｌアデニン ｃ２　ｓｓ−培地　＋２５０１１ＣＩ／Ｉ　Ｎ　Ｓ４Ｎ　０３４００　ｍｇ／ｌ 　グルタミン ０．５　！；ｌ／ｌ　ＨＥＳ　ＤＨ５，７０，５ｏ／ｌ　ＰＶＰ ４０　ｇ／Ｉ　マンニトール ４０　ｍｇ／ｌ　アデニン ０．８ｚ寒天 ＋０．５　ｍｇ／Ｉ　トランスゼアチン＜　ｔｒａｎｓｚｅａ−ｔｉｎｅ） ０．１　ｍｇ／Ｉ　ＩＡＡ ５００　ｍｇ／Ｉ　クラロワアン ０５ＨＳ塩／　２　４３　％置部 ０．７ｚ寒天 ＤＨ５，７ ＣＢＳ−培地　＋２５０　ｔｏ／ｌ　Ｎ　８４Ｎ　０３４００　ｎ／Ｉ　グルタ ミン ０．５　ａ／＋　）ＩＥＳ　ｌ）８５．７０．５　ｐ／Ｉ　ＰＶＰ ２０ｇノー　マンニトール ２０　ｇ／ｌ　グルコース ４０　ｍｇ／ｌアデニン ０．６ｚアガロース ＋０．５　ｎ／Ｉ　トランスゼアチン ０．１　ｍｇ／Ｉ　ＩＡＡ ５００　ｃｏ／ｌ　クラロファン ０６８５−培地　＋２５ｏ　ｎ／Ｉ　Ｎ）：ｌ４Ｎｏ３４００　ｍｇ／Ｉ　グル タミン ０．５　ｇ／Ｉ　ＨＥＳ　ｐＨ５，７ ０，５０／ｌ　ＰＶＰ ２０　ｇ／ｌ　マンニトール ２０　ｇ／ｌ　グルコース ４０　ｍｇ／ｌアデニン ０．６ｘアガロース ＋２００　ｍｇ／ｌ　クワ０フフ２ Ｃ　Ｂ５−培地　＋２５０　ｍｇ／ｌ　Ｎ　８４Ｎ　０３−１ケ月後にディスク から小さいカルスを除去し、カナマイシン５０ａｙ　／　Ｒ含有する培地Ｃ７に カルスを移す。

−さらに２〜３週後に、カナマイシンを５０ａｙ／ｊ含有する培地Ｃ８にカルス を移す。

一小さい芽が発育しはじめたら、カナマイシンを５０ｑ＃含有する伸長培地Ｃ９ にカルスを移す。

−１玉 一伸びた芽を分離して、発根培地Ｃ１１に移す。

−発根した芽を培地Ｃ５上で増殖させる。

３、Ｌｖｃｏ　ｅｒｓｉｃｕｍ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｉ　（トマト〕の葉のディ スクの感染使用培地は次の通りである： Ａ１ＨＳｍ／２　４１　％置部 ０．８ｚ寒天 ｐＨ５，７ ８Ｂ５−培地　＋２５０　ｕ／Ｉ　Ｎ　８４Ｎ　Ｏ３’０．５　ｏ／ｌ　ＨＥＳ 　ｐＨ５，７０，５ａ／ｌ　ＰＶＰ ３００１ｇ／Ｉ　Ｃａ（１１２ＰＯ４）　２２ｚグルコース ４０ｍｇ／ｌアデニン ４００／ｌ　マンニトール ８２ＢＳ−培１ａ　＋２５０ｍｇ／ｌ　Ｎ８４ＮＯ３０，５ａ／、Ｉ　ＨＥＳ　 ｐＨ５，７ ０，５０／Ｉ　ＰＶＰ ４００　ｍｇ／Ｉ　グルタミン ２％グルコース ０．６ｚアガロース ４０　ｍｇ／ｌアデニン ４０１）／ｌ　マンニトール ＋０．５　ｌＩｇ／ｌ　トランスゼアチン０．０１　ｍａ／Ｉ　ＩＡＡ ５００　ｍｇ／Ｉ　クラホラン ８３８５−培地　＋２５０　ｍｇ／　Ｉ　Ｎ　Ｈａ　Ｎ　Ｏ３０，５ｇ／Ｉ　Ｈ ＥＳ　ｐＨ５，７ ０，５ｇ／Ｉ　ＰＶＰ ４００　Ｈ／［グルタミン ０．６ｚアガロース ４０　ｍｇ／ｌアデニン 十０．５　ｍｇ／Ｉ　トランスゼアチン０．０１　ｒＢＱ／Ｉ　ＩＡＡ ２００　ｍｏ／ｌ　クラ０７７ン ８７　ＢＳ−培ｊｅ　＋２５０　ｍｇ／Ｉ　ＮＨ４Ｎｏ３０．５　ｇ／ｌ　）Ｉ Ｅｓ　ｏＨ５，７０，５Ｑ／Ｉ　ＰＶＰ ◆１ｍｇ／！）−ランスゼアチン ２００　ｌ１１ｇ／Ｌ　クラロフ？ン ８８Ｈ３塩／２　＋２：ｆｆｉ糖 ０．５　！Ｊ／ｌ　ＨＥＳ　ＤＨ５，７０，７ｘ寒天 ８ｇ　８５−培地”２５０１０／ｌ　Ｎ　Ｈ４Ｎ　０３０．５　０／Ｉ　ＨＥＳ 　ｐＨ５，７ ０，５（１／Ｉ　ＰＶＰ ＋１　ｉｏ／Ｉ　トランスゼアチン ０．０１１１１ａ／ｌ　ＧＡ３ 細菌培地＝ｍｉｎ　Ａ：（Ｍｉｌｌｅｒ　１９７２）　６０　ｍＷＫ２ＨＰｏ４ ，３Ｈ２０： ３３　ｍＨＫ　ＨＰ　０４　； ７．５　ｍＨ（Ｎ　Ｈ４）　２　Ｓ　０４　：１．７Ｈク工ンＭ３ナトリウム； １　ｍＭ　ＭＱＳＯ４： ２ｇ／ｌグルコース； ５０　ｍｇ／ＩビタミンＢ１ −快ｊ口り料 Ｌｖｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ　ｃｖ、Ｌｕｃｕｌｌｕｓ。

培地Ａ１で６連継代培養後に植物を使用する。

−感染 一中央脈を葉から除去する。

一葉を約０．２５〜１ｃｉの切片に切る（葉の端は傷つけないようにして、最大 限葉片の３つの側のみが傷つり）。

−切片を感染培地Ｂ１に（上下返して）置く。９Ｇのベトリ血中約１０個の切片 である。

一次に１ｉｎＡＩ地中で増殖したＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉＬＩ０１株の後期対数 培養物２０ｐ／ベトリ皿を使って切片を感染させる。

−ベトリ皿を低光度で２日間インキュベートする。

−２日後に培地暮除去し、クラロファン５００η／１１を含有する培地Ｂ１（２ ０ａｅ）で置き換える。

−１１亙１呈亙１ 一培地Ｂ２＋５０又は１００　ＩＩｇ／　１のカナマイシンの中に葉のディスク を置く。

一マンニトールの濃度を低くすることにより、５日毎に培地の浸透圧を下げ、培 地Ｂ３．Ｂ４．Ｂ５及びＢ６に連続的に移す。

−１ケ月後に分裂組織を有するカルスを葉のディスクから分−小さい芽が形成さ れたら、５０〜ｉｏｏ　ａｙ／ｎのカナマイシンを含有する伸長培地Ｂ９にカル スを移す。

−１一旦 一伸長した芽を分離し、発根用培地Ｂ８に移す。

−植物を培地Ａ１上で成長させる。

この寅験では、活性成分としてホスフィノトリシンを含む２つの除草剤を使用す る。

これらの化合物は登録商標ＢＡＳＴＡ　と）ＩＥＩＪＩ　ＨＥＲＢＩＡＣＥＲと しで市販されている。

これらの化合物を蛇口からの水で２ｚまで希釈する。４角からｉ＝の場所にスプ レーする。温宝の温度は、タバコとトマトについては約２２℃、じゃがいもにつ いては１０℃より高＜１５℃まで一タバコのスプレーテスト ａ）　ｐＧ　Ｓ　Ｆ　Ｒ１１６１又は１）ＧＳＦＲ１２８１ニ存在するキメラ［ ５ｆｒＪ遺伝子で形質転換したＮ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ、　 Ｐｅｔｉｔ）１ａｖａｎａ　Ｓ　Ｒ１？ｉ物及び形質転換していない対照植物（ １０〜５０αの高さ）を２０ｊ／ｈａのＢＡＳＴＡＲで処理する。対照ＳＲ１植 物は６日後に枯れたが形質転換した植物は２０７／ｈａのＢＡＳＴＡＲに十分耐 性であり、未処理植物と区別できない程の成長を続ける。

２選毎に処理を繰り返しても目で判断できる程の損傷は検出されない、その後の 開花に対しても該処理の影響はない。農業におけるＢＡＳＴＡＲ除草剤の推奨使 用ｉは２．５〜７．５ｊ／ｈａである。

ｂ）　８！／ｈａのＨＥＩＪＩ　ＨＥＲＢＩＡＣＥＲを使用して同様の実験を実 施する。（上記と同じ）形質転換植物は十分に耐性であり、未処理植物とは区別 できない程の成長を玖ける。目で判断できる程の損傷は検出されえない。

−じゃがいものスプレーテスト １）ＧＳＦＲ１１６１又はｌ）　Ｇ　Ｓ　Ｆ　Ｒ１２８１に存在するキメラ「ｓ ｆｒ」遺伝子で形質転換した及び形質転換していないじゃがいも（Ｓｏｌａｎｕ ｍ　ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ’　ｃｖ、　Ｂｅｒｏｌｉｎａ）　（高さ２０α）をＢ ＡＳＴＡＲ２０１／ｈａで処理する。対照植物は６日後に枯れるのに対し、形質 転換した植物では目で判断できる程の損傷は全く見られず、未処理植物と区別で きない程成長する。

−トマトのスプレーテスト １）　Ｇ　Ｓ　Ｆ　Ｒ１１６１又はＩ）　Ｇ　Ｓ　Ｆ　Ｒ１２８１に存在するキ メラｒｓｆｒｊ遺伝子で形質転換した及び形質転換していないトマト植物（Ｌｙ ｃｏｐｅｒｓｉｕｉ　ｅｓｃｕ！ｅｎｔｕｍ　ｃ、ｖ、Ｉｕｃｕｌｕｓ）　（高 さ２５Ｇ）を２０ｊ！／ｈａのＢＡＳＴＡＲで処理する。対照植物は６日後に枯 れるのに対し、形質転換した植物は十分耐性である。それらは目で判断できる程 の損傷を全く示さず、未処理植物と区別できない程成長している。

一形質転換植物による植物病原菌の増殖の制御もう１組の実験で、ｐＧＳＦＲ１ １６１又はｐＧ　Ｓ　Ｆ　Ｒ１２８１に存在１”るキメラ「５ｆｒＪ遺伝子を発 現するじゃがいも植物を高湿度、２０℃の温＝の部屋の中で成長させる。１ｊｄ 、当り１０６個のＰｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ　ｉ　ｆｅｓｔａｎｓの懸濁１１ｄを スプレーして植物に接種する。成長至＜　２０’Ｃ、湿度９５％、　４０００ル ツクス）内で、菌病の症候が見られるまで（１週間）植物を成長させる。この時 に１組の植物にＢｉａｌａｐｈｏｓを８！／ｈａスプレーする。、２週間後未処 理植物は真菌に完全に汚染される。真菌の増殖はＢｉａｉａｐｈｏｓ処理した植 物では止り、それ以上疾患の症候は表われない、植物はＢｉａｌａｐｈｏｓの殺 真菌作用により有効に保ｒｉされる。

一種子を介するＰＰＴ耐性の伝達 ＤＧＳＦＲ１１６１及びＩ）　Ｇ　Ｓ　Ｆ　Ｒ１２８１に存在するキメラ「５ｆ ｒＪ遺伝子を発現する形質転換したタバコ植物をｆＡ　Ｎ内で開花さぜる。これ らは正常の生殖能を有している。

各植物の約５００個のＦ１種子を土壌にまく。Ｆｌとは第一世代の種子すなわち 最初に形質転換した植物から直接得る種子を表わす、実生の植物が２〜３３の高 さになったときに８１／ｈａのＢＡＳＴＡＲをスプレーする。７日後に、健常な 植物と損傷を受けた植物とは約３：１の比で識別される。このことから、ＰＰＴ 耐性は単一の遺伝子座によりコードされる優性マーカーとじて受シナ継がれるこ とが示される。

１０個の耐性のＦ１実生植物を成熟するまで成長させ、種子を収穫する。Ｆ２の 実生植物を上記のように成長させ、８’／ｈａのＢＡＳＴＡＲをスプレーするこ とによりＰＰＴ−耐性についてのテストをする。ＦＩＩｌｉ物のいくらかは全部 がＰＰＴ−耐性のＦ２の実生植物を産み出し、このことはこれらの植物が耐性遺 伝子について同型接合性であることを示している。本発明は、本発明のＧＳ−阻 害剤不活化遺伝子で本質的に非生物学的に形質転換した植物細胞及び植物にも関 する。

本発明の好ましい実施態様では、植物ｉｔ胞及び植物は上記の「５ｆｒＪｉｉ伝 子で非生物学的に形質転換する。

これらの植物細胞及び植物はそれらのゲノム内に安定に組込まれ、検出しうる】 のホスフィノトリシン−アセチルトランスフェラーゼを産生しうるようにする非 極特異的な特性を有する。

この特性は形質転換した植物細胞及び植物に、ＢｉａｌａｐｈｏｓやＰＰＴのよ うなＧＳ阻害剤を不活化又は中和しうる非極特異的な酵素活性を付与する。

従って、本発明により形質転換した植物細胞及び植物はＢｉａｌａｐｈｏｓヤ関 逼化合物の除草作用に対して耐性となる。

ＢｉａｌａｐｈＯ５は最初に殺真菌剤として記載されたもので、形質転換した植 物は化合物を数回スプレーすることにより真菌疾患に対しても保護されうる。

好ましい実施態様では、Ｂｉａ１３ｐｈＯ３又は関連化合物を特に約２０〜１０ ０日間隔で数回施用する。

本発明は、畑を除草剤で処理するステップからなる、植物種を真菌疾患に対し選 択的に保訝し、畑の雑草を選択的に撲滅する′新しい方法にも関する。ここで植 物種はそのゲノム内にＧＳ阻害剤を中和又は不活化しうる酵素活性を有する蛋白 質をフードするＤＮＡフラグメントを含有しており、使用する除草剤は活性成分 としてＧ５ｆｆ１害剤を含んでいる。

本発明による方法は、植物が真菌に感染していなければ土地の雑草を撲滅するた めのみに、あるいは雑草を撲滅した後に真菌が出現したときには真菌の成長を停 止させるためだけにも同じ有効性で使用することができることは言うまでもない 。

本発明方法の好ましい実流態様では、上記のような「５ｆｒＪ遺伝子を含むＤＮ Ａフラグメントで植物種を形質転換し、使用する除草剤はＰＰＴ又は関連化合物 である。

従って、早い時期及び遅い時期に発芽する雑草を撲滅する茎で、栽培すべき植物 種が出現した後に数回、例えばスブレニによりＰＰＴ又は関連化合物の溶液を畑 に施用する。

窓培すべき植物種の出現前に畑を除草剤組成物で処理して雑草を撲滅することが できるのは全く明らかである。

同様に、蔵培すべきね動程の種子をま（前にさえ畑を処理することができる。

所望の植物種が出現する前に、Ｂｉａｌａｐｈｏｓ型の除草剤を含めた任意の入 手しうる除草剤で畑を処理することができる。

所望の植物種が出現した後に、Ｂｉａｌａｐｈｏｓ又は関連化合物を数回流用す る。

好ｇしい実！ｉ！態様では、約２０〜１００日間隔で除草剤を施用する。

Ｂｉａｌａｐｈｏｓ−型の除草剤の除草作用に耐性を有するように栽培すべき植 物を形質転換するので、栽培した植物の出現後でさえ畑を処理することができる 。

このことは、生産すべき植物に何ら作用することなく早期に及び連用に発芽する 雑草を全体的に撲滅するのに特に有用である。

好ましくは、Ｂｉａｌａｐｈｏｓ又は関連化合物は約０．４〜約１．６にｇ／ｈ ａの投与量で施用し、それを約２〜約８１／ｈａの割合で畑に施用しうるような 濃度に液体キャリアで希釈する。

次に、例示のために種々の植物種での本方洗のいくつかの実施態様を示す実施例 を挙げる。

−てんさい 北欧のてんさいは気候条件、より正確にはｍ；及び平均温度により３月１５日か ら４月１５日にまく、、Ｎ草の問題は多かれ少なかれ各国で同じであり、穀物が ７月半ばにそのキャノピ−（ｃａｎｏｐｙ）を閉じるまでは面倒を引き起こしう る。

雑草の問題を３つの場合に分けることができるニー草のような雑草（ｏｒａｓｓ ｙ　ｗｅｅｄｓ）の早期の発芽、−広葉の雑草の早期発芽、 一広葉の雑草の遅い発芽。

現在までは、出現（出芽）前の除草剤が使用され成功してきた。このような化合 物は例えば登録商標：　ＰＹＲＡＨＩＮＲ。

ＲＲ ＧＯＬＴＩＸ　及びＶＥＮＺＡＲとして市販のものである。しかしながら、これ らの化合物の乾燥した気候条件に対する感受性と、遅く発芽した雑草をコントロ ールし得る残留活性がないことがら、農民は出現前のものに加え出現後の製品も 使用するようになった。

下記第＜Ｉ）表に次の実施例で記載する除草剤組成物に含まれる活性成分を示す 。

第（Ｉ）表 商品名　活　性　成　分　処　方 ＡＶＡＤＥＸＲシフ　レ−ト（Ｄｉａｌｌａｔｅ）　ＥＣ４００Ｑ／ＩＡＶＡＤ ＥＸ　９１　Ｂ　トリアレー）−（Ｔｒｉａｌｌａｔｅ）　ＥＣ４ｏＯｇ／ＩＧ ＯＬＴＩＸＲメタミドロン（）Ｉｅｔａｍｉｔｒｏｎ）　ＷＰ　７０　％ＲＯＮ ＥＥＴＲシクロエート（Ｃｙｃｌｏａｔｅ）　ＥＣ７１８ｇ／ＩＴＲＡＨＡＴＲ エトフメレート（Ｅｔｈｏｆｕｍｅｒａｔｅ）　ＥＣ２００ｇ／ＩＦＥＲＶＩＮ ＡＬＲアロキシダイム（Ａｌｌｏｘｙｄｉｍｅ）−ＳＰ　７５　％ナトリウム ＢＡＳＴＡ　Ｒ＊スフイ／ト！Ｊシン２００　ｇ／ＩＰＶＲＡＭＩＮ　ＦＬ　ク ロリダゾン（Ｃｈｌｏｒｉｄａｚｏｎ）　ｓｃ　４３０ｇ／１本発明によると、 出現後の除草剤はＢｉａｌａｐｈｏｓ又は関連化合物からなり、それらは−竿先 の草（Ｂｒｏｍｕｓ、　Ａｖｅｎａ　ｓｐｐ、。

Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ、　ＰＯＡ　）及び広葉（Ｇａｌｉｕｍ、　Ｐｏｌｙｇｏ ｎｕｍ　、　５ｅｎｅｃｉｏ　。

ｓｏ＋ａｎｕ＋＋＋　、　Ｈｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ　）の成長のコントロールを 良好に行う。

てんさいの生育の種々の時点、即ち子葉期、２葉期又は４葉期に出現後の除草剤 を流用しうる。　・第（Ｉｆ）表は例示のための可能な畑の処理方法を表わす。

それらの例では、種々の出現前の除草剤と共に使用するＢｉａｌａｐｈｏｓ類の 出現後の除草剤はＢＡＳＴＡＲである。濃度は１／ｈａ又は層／ｈａで示す。

第　（ＩＩ）　表 てんさいにおける可能な雑草コントロール。基本的にＢＡＳＴＡ’を使用。

ただし、てんさいはこの化合物に対して耐性にされている（ｉまたはＫＳ／ｈａ ）。

播種前発芽前　子　葉　２　葉　４　葉１、　ＡＶＡＤＥＸＲ−ＢＡＳＴＡＲＢ ＡＳＴＡＲ／ｌｒａｍａｔ　−３，５１３１３１１，５４！ ２、　ＡＶＡＤＥＸ’　ＧＯＬＴＩＸ”３．５１　尉（ ３、ＲＯＮＥＥＴ’　ＧＯＬＴＩＸ” ４Ｉ１５句 ４、　ＲＯＮＥＥＴＲＧＯＬＴＩＸＲＢＡＳＴＡＲ４１２，５に５３１ ５、　Ｔ黒ＴＲＢＡＳＴＡＲＢＡＳＴＡＲ／ＧＯＬＴＩＸＲ５１３１２１２にＳ ６、　−　ＧＯＬＴＩＸＲＢＡＳＴＡＲ２，５＃　３１ ？、−−、ＢＡＳＴＡＲ／ｌｒａｍａｔ　ＢＡＳＴＡＲ／ＧＯＬＴＩＸＲ３ｇ　 １．７４！　３１　２に９ Ｂ、　ＰＹＲＡＨＩＮ　−ＢＡＳＴＡＲＶｅｎｚａｒ６１３ｊ！ＩＫｇ ９、　−　−　−　ＢＡＳＴＡＲＢＡＳＴＡＲ／ＧＯＬＴＩＸＲ３ｊ！３１　２ 八３ １０、ＤＩＡＬＬＡＴＥＲＰＹＲＡＨＴＮＲＢＡＳＴＡＲ／Ｈｅｔａｍｉｔｒｏ ｎ３．５ｊ！　６ｊ！　３ｊ！　ＩＫ！ｌ−じゃがいも じゃがいもはヨーロッパでは豹ＢＸＩＱ６ｈａで栽培されて（翫る。雑草のコン トロールに使用される主要な製品はリヌロン（Ｌｉｎｕｒｏｎ）／モノリヌロン 又は商品名ＨＥＴＲＡＢＵＺＩＮとして市販の化合物である。

これらの製品はほとんどの雑草の種に対し良好に作用する。

しかしながら、Ｇａｌｉｕｍ及び５ｏｌａｎｕＩＩのような雑草や発芽の遅いり １ｅｎＯ且立偏」」−及びＰｏ！ｖｇｏｎｕｍは常に有効にコントロールされる のではなく、−年草のコントロールも時々失敗する。

さらに、遅く発芽する広葉の雑草１よ、ＢＡＳＴＡＲのような除草剤を発芽後に 施用することによってのみコントロールしうる。

次の第（Ｉ［［）表はじゃがいもの場合の畑の処理の６Ｎ＜つかの例を例示とし て示している。

第（Ｉ［［）表 じゃがいもをＢＡＳＴＡＲ耐性とする、ＢＡＳＴＡＲの使用に基くじゃがいもの 雑草コントロールシステムリヌロン中モノリヌロン（３７５ｇ＋３７５！Ｉｔ／ ｈａ）　発芽前ＢＡＳＴＡ　Ｒ３〜４１／ｈａ　発芽後（５〜１５ｃ！１１）Ｂ ＡＳＴＡ　Ｒ／ブチルフルアジホップ　発芽後（５〜１５Ｇ）（ｆｌｕａｚｉｆ ｏｐ−ｂｕｔｙｌ）　３〜４　ｊ！　／ｈａ＋２＋ｊ！　／ｈａリヌロン（Ｌｉ ｎｕｒｏｎ）　ＨＰ　５０　％　（ＡＦＡＬＯＮ”　）モノリヌロン　’ｔ＋？ 　４７．５％（ＡＲε５ＳｌｌｔＲ）ブチルフルアジホップ　ＥＬ　２５０ｐ／ Ｉ（ＦＵＳＩＬＡＤＥＤＥＲ）上記で使用するｐＧｓＪ２ら０及ＴｊｐＢＧ３９ 株はドイツ、ゲッティンゲンの［Ｇｅｒｌｌａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ 　Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓＪ（ｏｅｕｔｓｃｈｅ　５ａｌｌｌｌｔｌｎ ！Ｉｔ　ＶＯｎ　ＨｉｋｒＯＯｒＯａｎｉＳｉｌｅｎ　）に１９８５年１２月１ ２日に寄託し、各々の寄託番号はＤＳＭ３６０６及びＤＳＭ３６０７であった。

本発明の別の態様を図面を参照して以下に説明する。図中、ドｐＪＳ１の制限地 図を示し、 第９図は耐性遺伝子を含有する「５ｆｒｓｖ　Ｊ遺伝子のヌクレオチド換に適し たプラスミドの構築を示す。

もうひとつ別のＢｉａｌａｐｈｏｓ耐性遺伝子は別のＢｉａｌａｐｈｏｓ産生株 、すなわちｓｔｒｅｐｔｏｍｖｃｅｓ　ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓか ら単離した。

この第２の耐性遺伝子は以後ｒｓｆｒｓｖ　Ｊ遺伝子とよぶ。

後に植物細胞を形質転換するための、この第２の好ましい本発明のＤＮＡフラグ メントは、下記配列を有するポリペプチドの少なくとも一部をフードするヌクレ オチド配列から成る。

Ｖ　＄　ＰＥＲＲＰＶＥＩＲＰ　八　τ　入　ＡＤＭ八　八　ＶＣＤｍＶＮＭＹ 　工　ＥＴＳＴＶＮＦＲＴＥＰＱＴＰＱＥＷ　工　ＤＤＬＥＲＬＱＤ　Ｐ、　Ｙ 　Ｐ　Ｗ　Ｌ　Ｖ　Ａ　Ｅ　Ｖ　Ｅ　Ｇ　Ｖ　Ｖ　Ａ　Ｇ　！　ＡＹ　入　Ｇ　 ｐ　Ｗ　ＫＡＲＮＡＹＤＷ？ＶＥＳ　丁ＶＹＶＳＨＲ）ｉＱ！’ＩＬＧＬＧＳ　 テシＹτ！（Ｌ　シ　ＩＣＳ　Ｍ　Ｅ　Ａ　（ｌ　Ｇ　Ｆ　Ｋ　Ｓ　Ｖ　Ｖ　Ａ 　Ｖ　ＸＲＧ’！’ＬＲＡＡＧＹＫＨＧＧＷＨＤＶＧＦＷ（ＩＲＤＦＸ！、ＰＡ ＰＰ１’ｔＰＶＲ１’ＶτＱ工　会 このポリペプチドの上記部分は、植物細胞内に遺伝学的に取入れられて発現され たときにこの植物ａｗ１に、Ｂｉａｌａｐｈｏｓに対する保護、すなわち「植物 保護能」を付与するのに充分な長さである。以後、上記ヌクレオチド配列のＢｉ ａｌａｐｈｏｓに対する「植物保護能」についても言及する。

アミノ酸の一文字表記の意味を次に挙げる。

アラニン　Ａ　ロイシン　Ｌ　。

アルギニン　Ｒリシン　Ｋ アスパラギン　Ｎ　メチオニン　Ｍ アスパラギン酸　Ｄ　フェニルアラニン　Ｆシスティン　Ｃプロリン　Ｐ シスチン　Ｃセリン　Ｓ グリシン　Ｇ　スレオニン　Ｔ グルタミン酸　、Ｅ　トリプトファン　Ｗグルタミン　Ｑ　チロシン　Ｙ ヒスチジン　Ｈバリン　■ イソロイシン　Ｉ この第２の好ましいＤＮＡフラグメントは次のヌクレオチド配列： ＴＡＡＡＧＡＧＧＴＧＣＣＣＧＣＣＡＣＣＣＧＣ：Ｔ”ＴＣＧＣＡＣ；ＡＡＣＡ ＣＣＧＡＡＧＧＡＧＡ（ＣＡＣＡＣτＣλＡＣＴＴＣＣＧτ入ＣＧＧλＧＣＣＧ ＣＡＧλＣτＣＣＧＣＡＧＧ入ＧＴ’ＧＧλＴＣＧλＣＧ入ＣＣ）Ｇまたはその 一部であってＢｉａｌａｐｈｏｓに対する植物保護能を有するポリペプチドを発 現する部分から成る。

以下の説明は、「５ｆｒｓｖ　Ｊ耐性遺伝子の単離と、この耐性遺伝子を含有し 、植物細胞をＧＳ阻害剤に耐性とするために後に植物細胞を形質転換できる発現 ベクターの構築とに関するものである。

Ｓｔｒｅｐｔｏｍ　ｃｅｓ　ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏ　ｅｎｅｓＤ　Ｓ　Ｍ　 ４０７３６株（文献１）を増殖させ、標準法に従ってこの株の全ＤＮＡを調整し た。ＤＮＡのサンプルを、３回の別々の反応でそれぞれＰｓｔＩ、５ＩＩｌａ工 およびＦ、３３　Ａ　Ｉによって消化してアガロースゲル上で分離すると共に、 ｐＧｓＲｌ　（第５Ｂ図）由来のプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩで消化した。こ のＤＮＡを５ｏｕｔｈｅｒｎ解析におイエニトロセルロースフィルター上にプロ ットし、「５ｆｒＪ遺伝子を含有するＤＧＳＲＩ由来の標３９　ｚ２Ｈｌフラグ メントとハイブリダイズした。ゲルの４箇のレーン全てで制限フラグメントはプ ローブとの強いホモＯジーを示していた。約３　ｋｂのＰＳｔＩフラグメント、 約１．２　ｋｂの≦ｍａＩフラグメント、および０．５　ｋｂの１赳３　Ａ　Ｉ フラグメント。この遺伝子をクローニングするために、江工制限フラグメントを Ｅｓｃｈｅｒｉｅｈｉａ　ｅｏｌｉベクターｐＵｃ８に直接クローニングした。

形質転換後得られた３０００１餌のコロニーをニトロセルロースフィルターに移 し、「５ｆｒＪプローブとハイブリダイズした。陽性のものを選んで、３００埒 ／　ｄのＰＰＴを含有する最少培地プレート上で増殖するかどうかをざらに試験 した。ＰＰＴ含有培地で増殖する形質転換体１個をさらに解析した。このプラス ミド１）ＪＳＩのプラスミドマツプと開運の深い制限部位を第８図に示す、ＭＣ １０６１株（ｐＪＳｌ）は、１９８７年３月６日Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌ ｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｈｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｉｅｎ　（［）　３　Ｍ　）に寄託 番号Ｄ　Ｓ　Ｍ　４０２３で寄託されている。、クローンの制限フラグメントを Ｈａｘａｍ−Ｇ１１ｂｅｒｔの方法に従って配列決定し、この遺伝子のコード領 域はホモロジーに基づいて同定できた。

「５ｆｒｓｖ　Ｊ　Ｍ転子の配列を第９図に示し、ヌクレオチドとアミノ酸の配 列レベルにおける［５ｆｒＪｉ伝子とのホモロジーを第１０図に示す。

「５ｆｒｓｖ　ｌ　署転子）ａｍ 後の植物発現ベクター内でのクローニングを可能にするために「５ｆｒｓｖ　’ ：：！伝子カ転子ト」も構築した。ＧＴＧ開始コドンを欠いた「５ｆｒｓｖＪコ ード領域を含有する江Ｉ−，旦」已■フラグメントをｐＪＳｌから単離した。こ のフラグメントを、「５ｆｒＪ遺伝子について記載し第５図に示したものと類似 の合成オリゴヌクレオチド５’−ＣＡＴＧＡＧＣＣ−３°と共に、瓦廿工および ｌ旦■で消化したベクターｐＬ　Ｋ　５６−２中に連結した。ＤＧＳＲＩＳＶの 構築の概略を第１１図に示す。ｐＧＳＲｌどｐＧｓＲｌｓＶにはそれぞれ両遺伝 子の類似のカセットが存在するので、植物中でのｒｓｆ　ｒＪ遺伝子の発現に関 して既に記載したｍ築を繰り返すことができる。

プラスミドＤＧＳＲＩＳＶを有するＥ、　ｃｏｌｉ株の粗抽出物を酵素解析した 結果、ＰＰＴをアセチル化できるアセチラーゼの合成が確認された。これは反応 生成物の薄層クロマトグラフィーによって示された。

次に「５ｆｒｓｖＪ遭伝子を、プラスミドベクターｐＧｓＪ２６０　（第４Ｂ図 ）中にＣａＭＶ３５３プロモーターの制ｍ＋ｉで挿入してプラスミドｐＧＳ２３ Ｖを得た。このプラスミドはｐＧＳＲ２（第６Ａ図）に似ているがｒｓｆｒＪ遺 伝子がｒ　５４ｒｓｖ　Ｊ　遺伝子で置換されている。

上述のタイプの除草剤耐性遺伝子がＰＰＴまたはＰＰＴ誘導体を生産する他の多 イの微生物から得ることができるということは明らかである。除草剤耐性遺伝子 は次に、グルタミン合成酵素阻害剤の作用に対して植物細胞を保護するために植 物細胞中に組込むことができる。たとえば、Ｋｉｔａｓｏｔｏｓｐｏｒｉａ　（ 文献１５）から１３ｉａｌａｐｈｏｓ耐性遺伝子が得られる。

いろいろな植物種を「５ｆｒＪ逼伝子で形質転換する場合について上述したのと 同じＡｇｒｏｂａｃｔｅｒ＋ｕｍ　ｇ介形質転換系を用いて、プラスミドｐＧＳ Ｒ２ＳＶから、「５ｆｒｓｖ　Ｊ耐性遺伝子を含有する形質転換された植物細胞 および植物を得ることができる。

植物は再生されて、上述したのと類似のスプレー試験によってその耐性を試験さ れる。全ての植物が同様な挙動な示し、グルタミン合成酸素阻害剤から成る除草 剤に対する耐性を示す。

最後に、本発明者はまた、上記定義の如きグルタミン合成酵素の阻害剤に対する 植物の耐性と、雑草のない前記植物の栽培物の住産亡嘲！＠”’−□相当するグ ルタミン合成酵素の阻害剤との組合せにも関する。

文　献 １、ＢＡＹＥＲｅｔ　ａｔ、、ＨＥＬＶＥＴＩＣＡ　ＣＨＥＨＩＣＡ　ＡＣＴＡ 、１９７２２、　ＷＡＫＡＢＡＹＡＳＨＩＫ、ａｎｄ　ＨＡＴＳＩＩＮＡにＡ　 Ｓ、、　Ｐｒｏｃ、　１９８２．　Ｂｒ１ｔｉｓｈＣｒｏｐ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉ ｏｎ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、４３９−４５０３、Ｈ，ＨＡＳＯＮ　ｅｔ　ａｌ 、、ＰＨＹＴＯＣＨＥＨＩＳＴＲＹ、１９８２．　ｖｏｌ、２１．　ｎ　４゜ｐ 、８５５−８５７ ４、Ｃ１，ＴＨＯＨＰＳＯＮ　ｅｔ　ａｌ、、ＮＡＴＵＲＥ、Ｊｕｌｙ　３ｔ、 １９８０．　ｖｏｌ、２８６゜ｎ　Ｓ　７７２．　ｐ、５２５−５２７５、Ｃ， Ｊ、ＴＨＯＨＰＳＯＮ　ｅｔ　ａｔ、、ＪＯｌｌＲＮＡＬ　ＯＦ　ＢＡＣＴＥＲ ＩＯＬＯＧＹ、Ａｕｇｕｓｔ１９８２、ｐ、６７８−６８５ ６、Ｃ，Ｊ、ＴＨＯＨＰＳＯＮ　ｅｔ　ａｔ、、ＧＥＮＥ　２０．　１９８２． 　ｐ、５１−６２７、Ｃ，Ｊ、ＴＨＯＨＰＳＯＮ　ｅｔ　ａｔ、、ＨＯＬ、ＧＥ Ｍ、ＧＥＮＥＴ、、１９８４．　１９５．　ｐ。

８、ＴＯＷＢＩＮ　ｅｔ　ａｌ、、ＰＲＯＣ，ＮＡＴＬ、ＡＣＡＤ、ＳＣ１，Ｌ ＩＳＡ、１９７９．７６゜ｐ、　４３５０−４３５４ ９、ＨＥＴＨＯＤＳ　ＯＦ　ＥＮＺＹＨＯＬＯＧＹ、Ｖ、ＸＬＩＩｌ、Ｌ　７３ ７−７５５１０、ＤＥＢＬＡＥＲＥ　Ｈ，ｅｔ　ａｔ、、１９８５．Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、、１３，１４７７１１、ＢＯＴＴＥＲＨＡＮ　Ｊ、、Ｆｅｂ ｒｕａｒｙ　１９８６．　Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈｅｓｉｓ、５ｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓ ｉｔｙ　ｏｆ　Ｇｈｅｎｔ１２、ＤＥＢＬＡＥＲＥ　Ｒ，、Ｆｅｂｒｕａｒｙ　 １９８６．Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈｅｓｉｓ、ＦｒｅｅＩＪｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　 Ｂｒｕｓｓｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ１３、ＶＥＬＴＥＮ　ｅｔ　ａｔ、、Ｅ）４Ｂ ＯＪ、１９８４．ｖｏｌ、３．ｎ　１２．ｐ、２７２３−２７３０１４、ＣＨＡ ＴＥＲｅｔ　ａｔ、、Ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｉｎ　ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙ ｃｅｓ　Ｃｕｒｒ。

Ｔｏｐ、Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、ｌｍ１ｕｎｏ１．．１９８２，９６．ｐ、６９− ７５１５．０ＨＵＲＡ　ｅｔ　ａｔ、、Ｊ、ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、Ｖ ｏｌ、３７，８，９３９−９４０゜１６、ＨＵＲＡＫＡＨＩ　ａｔ　ａｌ、、Ｈ ｏｔ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、２０５．４２−５０．１９８６１７、ＨＡＮＤＥ Ｒ３ＣＨＥＩＤ　ａｎｄ　ＩＩＩＬＤ、Ｊ、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ、、１２３， １３５−１４２゜ＣＣＣＧＣＴ　ＣＡＡ　［ｌＣＴ　ＣＧＣＴＧＴ　ＣＡＴ　Ｔ ’口’　Ｃ［ｉＡ　［ｉＡＣＧＣＣＡＴＣＴＴＴ　ＧＧ皐ＡＧＣＧＧＴ　ＧＧＣ ＣＧＡ　ＡＴＣＣＧＴ　ＡＣＴ　ＧＣＧ、ＣＧＧ　ＡＣＴ　ＣＧＡ　ＣＧＡ　Ｃ ［）ＣＧＴムム八へへＧＡＴＣＧ　ＡＣＣＡｃｔ）　ＴＡＣＡＣＧ　ＡＧＴ　Ｃ ＣＧ　ＣＡＣＡＣＧ　ＧＧＧ　ＣＧＡ　ＧＧＡ　Ｇ［ｉＣＣＣ［ｉ　６ＴＴＣＣ Ｇ　Ｇ０八　ＣＣＧ　ＡＧＧ　ムム０　ムＣＣＧＡＡ　ＣＧＡ　ＡＣム　ＣＣＡ 　ＣＡＣ［ｉＴＳ　Ａ［ｉＣＣＣＡ　６八八ＧＣ［ｉ　ＧＴＣＴＧＣＡＣＣムＴ ＣＧＴＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＴＣＧへＧへＣムΔＧＣＡｃＧ　ＧＴＣムムＣＴ ＴＣＣＧＴ　ムロＣＧＡＧ　ＣＣ［ｉ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＣＣＧ　ＣＡＣＧＡＧ 　Ｔ［ｌＧ　ＡＣε　ＧＡＣＧＡＣＣＴＣＧＴＣＣＧＴ　ＣＴＧ　ＣＧＧ　ＧＡ Ｇ　ＣＧＣＴＡＴ　ＣＣＣＴ［ｉ［ｉ　ＣＴＣＧＴＣＧＣＣＧＡＧ　ＧＴＧＧＡ Ｃ印ＣＧＡＣＣＴＣＧＣＣ［ｉＧＣＡＴＣＧＣＣＴＡＣＧ（Ｇ　ＧＧＣＣＣＣＴ Ｇ［ｉ　ＡＡＧ　ＧＣＡＣＣｉＣムへＣ（）ＣＣＴム［（３ムＣＴＧＧ　ＡＣＧ 　ＧＣＣ［）ΔＧ　ＴＣ［ｉ　ＡｃＣＧＴＧＴΔＣＧＴＣＴＣＣＣＣＣＣＧＣＣ ＡＣＣＡＧ　ＣＧＧ　ＡＣ［ｉ　ＧＧＡ　ＣＴＧ　ＧＧＣＴＣＣＡＣＧ　ＣＴＣ ＴＡＣムＣＣＧＡＣＣＴＣＣＴＧ　ＡＡ［ｉ　ＴＣＣＣＴＧ　Ｇム［１ＧＣＡＣ ムｆｉ　ＧＧＣＴＴＣＡＡＧ　ＡＧＣＧＴＧ　らＴＣ０ＣＴＧＴＣＡＴＣ［ｉＧ ［ｉ　ＣＴＧ　ＣＣＣＡＡＣＧＡＣ［：ＣＧ　ＡＧＣ６ＴＧ　Ｃｌ１ＣＡＴＧ　 ＣＡＣＣＡＧ［ＥＣＧＣＴＣＧＧＡ　ＴＡＴ　ＧＣＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＡＴＧ 　ＣＴＧ　ＣＧ（Ｊ　ＧＣＧ　ＣＣＣＧＧＣＴＴＣΔΔＧＣＡＣＧＧＧ　ＡＡＣ ＴＧＧ　ＣΔＴ６△ＣＧＴＧ　ＧＧＴ　ｎＣＴＧＧ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＣＴ ＴＣＡＧＣＣＴＣ４１口　ＧＡＡ　Ｃ７口　ＡＡＣＴ［ｉ［ｉ　ＣＡＴ　ムＣＣ ＣＧＣＡＡＴ　ＧＧＴ　ＧＡＧ　ＧＴＧ　ＧＡＡ　Ｃ口６特表千１−５０３４３ ４（２Ｂ） ＴＡ△ムＧＡＧＧＴ（３ＣＣＣＧＣＣＡＣＣＣＧＣＴＴＴＣＧＣＡＧＡＡＣＡ口 しＧ△△ＧｊＡＧＡｃｃＡｃ△ＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＧＧＴＣＴＧＣＧＡロΔＴ ＣＧＴロＡ八ＴＣＡＣＴＡＣＡＴ［’［）ＡＧＡＣＧＡＧＣＡＣＯ［）■ロＡＡ へＴＴＣＣＧＴＡロＧＧＡＧロロＧロムＧＡＣＴＣＣ［ＥＣＡ（）（１）ムＧＴ ＧＧＡＴＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＧＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣ［”ＧＣＴＡＣ ＣＣＣＴＧ６ＣＴＣＧＴＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧＴＣ＆ＴＣＧＣＣ ＧＧＣＡＴＣＧＣＣＴＡＣＧＣＣＧＧｃロＣＣＴＧＧＡＡＣｉＧＣＣＣＧロ八八 ＣＧＣＣＴ八ロＧＡＣ丁６らΔ［口１３ＴＣＧＡ（）Ｔロ５ムＣ！１ｘＧＴＧＴ ΔＣ３ＴＣＴロロ０ムＣＣＧＧＣＡｃロＡＧへへ［１ＣＴＣへＩＪＬ）Ａｌ：Ｉ ｌ、）ｂｂＵＩＬＬＡ［ＬＬｌ　いＡＣＡＬ［：［：ＡＣＣＩＧ［１６ＡＡ（ｉ Ｔ　Ｃ［、Δ１６δΔ５６０ＣＣＡＧ５６ＣＴＴＣＡＡＩ３ＡＧＣＧＴＧＧＴｅ ＧＣＣＧＴＣＡＴＣ（）ＯＡＣＴＧＣＣＣＡＡＣ［１ＡＣＣＣＧ八［）ＣＧＧＣ ＣＧＧＣＴΔＣムム５０八ＣＧ［：１ＧＧＧ口ＴＧＧ乙へＣＧＡＣ６ＴＧＧＧＧ ＴＴＣＴＧＧ［、へＧＣ６ＣＧΔｐＬＫ　５６−２　ｐＪｓ］ ＢＱ”ｌＨＩ　５ｆｒｓｖ　ＢａｍＨＩｒｉＧ、ｉｉ 国際調査報告 一四一一幼一一−１とπ／り８７１００１４１−〇１．＾ユ１．−　と＝／ΣＰ 　８７１００１４１−１内−＾、＃□−ＰＣＴ／ＥＰ　８７１００１４１ＡｈＮ ＥＸ　Ｔｏ　”：”’Ｘ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＸＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＥ　ＲＥ？ ＯＲＴ　０Ｎｎｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅ＝、ｔ　Ｏｆ？ｉζｅ　；Ｓ　 ユｎ　ｎｏ　ｗａｉｙ　ｌユａｂｌｅ　ｆｏｒ　Ｌ％ｅｓｅｐａｒ？１ｃｖｌａ ｒｓ　ｗＭｃｈ　ａｒｔ　ｍｅｒｅｌｙ　ｇｉｖｅｎ　ｆＣｒ　ｔｈｅ　ｐｕｒ ｐｏｓｅ　ロｆユｎ！ＯｒπｉＦＺユａｎ。

ｒａｖｅｎ：　ｄｏｅｕｎｅ、−、ｔ　ＰｕｂＬｘｅａ：ｉｏｎ　！’ａｉｔｅ ｒ＋ｔ　？ｘｍｉユｙ　Ｐａ１ｉｅａｔｉｏ＊Ｃユｔｅｄｉｎ　５ｅａｒｃｈ　 ｄａｒｅ　ｍｅｒｂｅｒ（ｓ）　ｒ−ａｔｅｅｐｏｒｔ

Claims (58)

【特許請求の範囲】
1. （１）植物細胞および植物がグルタミン合成酵素阻害剤と接触したときに該植物 細胞および植物内での該阻害剤の作用を制御させるための方法であって、前記植 物細胞および植物内で蛋白質の形態で発現され得る外来性ヌクレオチド配列を含 む異種ＤＮＡを、この異種ＤＮＡが世代を通じて安定して前記植物の細胞内に組 込まれるような条件下で、前記植物に具備させることからなり、前記蛋白質が前 記グルタミン合成酵素阻害剤を不活性化又は中和し得る酵素活性を有する方法。
2. （２）異種ＤＮＡフラグメントがＰＰＴアセチルトランスフェラーゼ活性を有す るポリペブチドをコードする外来性ヌクレオチド配列を含む請求の範囲第１項に 記載の方法。
3. （３）異種ＤＮＡフラグメントがストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ）のゲノムに属する請求の範囲第１項から第２項に記載の方法。
4. （４）異種ＤＮＡフラグメントが次のアミノ酸配列：【配列があります】 ［式中、ＸはＭＥＴ又はＶＡＬを表わす］または前記酵素活性を有し、かつ前記 ＤＮＡフラグメントが植物細胞内で発現されるとグルタミン合成酵素阻害剤の除 草活性に対して植物細胞を保護するに十分な長さのポリペブチドの部分をコード する外来性ヌクレオチド配列を含む請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記 載の方法。
5. （５）異種ＤＮＡフラグメントが次のヌクレオチド配列：【配列があります】 またはその一部でグルタミン合成酵素阻害剤を不活化し得るポリペブチドを発現 する部分を含む請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の方法。
6. （６）請求の範囲第５項で定義した配列のＧＴＧ開始コドンがＡＴＧ開始コドン で置換されている請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載の方法。
7. （７）異種ＤＮＡフラグメントが次のアミノ酸配列：【配列があります】 または前記酵素活性を有し、かつ前記ＤＮＡフラグメントが植物細胞内で発現さ れるとグルタミン合成酵素阻害剤の除草活性に対して植物細胞を保護するに十分 な長さのポリペブチドの部分をコードする外来性ヌクレオチド配列を含む請求の 範囲第１項から第３項のいずれかに記載の方法。
8. （８）異種ＤＮＡフラグメントが次のヌクレオチド配列：【配列があります】 またはその一部で前記グルタミン合成酵素阻害剤を不活化し得るポリペブチドを 発現する部分を含む請求の範囲第７項に記載の方法。
9. （９）植物または生殖物質内で、グルタミン合成酵素阻害剤の活性を不活化また は中和し得る蛋白質の形態で発現され得る、前記植物または生殖物質中に安定に 組込まれた異種遺伝子物質を含む前記植物およびこの植物の生殖物質の製造方法 であって、前記異種遺伝物質を含む植物細胞または植物組織を、前記阻害または 中和活性を発現し得ない出発材料としての植物細胞または植物組織から非生物学 的に製造し、前記遺伝物質を含む前記植物細胞または植物組織から植物またはこ の植物の生殖物質またはこれら両者を再生し、適宜、この植物または生殖物質ま たは両者を生物学的に複製することからなる方法において、前記異種遺伝物質を 含む前記植物細胞または植物組織を製造するための前記ステップが、前記出発材 料としての植物細胞または植物組織を、前記蛋白質をコードするヌクレオチド配 列と共にこのヌクレオチド配列を前記植物細胞または植物組織内で発現させしめ 得ることができるものの中から選択された調節要素を含有するＤＮＡ組換え体で 形質転換して、前記植物細胞および組織内ならびに植物および世代を通じて植物 から植物へ伝えられる生殖物質内に前記ヌクレオチド奇異列を安定に組込ませる ことからなる方法。
10. （１０）異種ＤＮＡと組換えられた請求の範囲第１項から第８項のいずれかに記 載のフラグメントを含有する組換えＤＮＡで出発細胞を形質転換し、前記組換え ＤＮＡは前記フラグメント自体がＢｉａｌａｐｈｏｓの生合成に関与するＤＮＡ 領域を欠いている請求の範囲第９項に記載の方法。
11. （１１）組換えＤＮＡが、細胞宿主の形質転換に好適で、その宿主の中に導入さ れたときにグルタミン合成酵素阻害剤を中和又は阻害するのに適するベクターで ある請求の範囲第１０項に記載の方法。
12. （１２）ベクターが細菌、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換に適したレプ リコン要素の制御下にある前記組換えＤＮＡからなる請求の範囲第１１項に記載 の方法。
13. （１３）ベクターが植物のプロモーター領域の制御下にある前記組換えＤＮＡフ ラグメントからなり、該ベクターは、後に植物細胞を該ベクターで形質転換した ときには該植物細胞内で前記ＤＮＡフラグメントを発現させ得る調節要素を更に 含む請求の範囲第１１項に記載の方法。
14. （１４）形質転換された植物細胞に、Ｂｉａｌａｐｈｏｓ，ＰＰＴ又は関連の誘 導体の除草作用に対する耐性を付与する請求の範囲第１０項から第１３項のいず れかに記載の方法。
15. （１５）ベクターが前記植物のプロモーター領域と前記組換えＤＮＡフラグメン トとの間に挿入されたトランジットペブチドをコードするヌクレオチド配列を含 む請求の範囲第１３項又は第１４項に記載の方法、
16. （１６）トランジットペブチドをリブロース−１，５−ニリン酸カルボキシラー ゼ及びクロロフィルａ／ｂ結合蛋白質から選択する請求の範囲第１５項に記載の 方法。
17. （１７）前記ベクターがＴｉプラスミドである請求の範囲第１１項から第１６項 のいずれかに記載の方法。
18. （１８）グルタミン合成酵素阻害剤を中和又は不活性化しうる非種特異的酵素活 性を有する蛋白質をコードし、ゲノムに安定的に組込まれたＤＮＡフラグメント を有する、非生物学的に形質転換した植物細胞。
19. （１９）種子を作り得る植物を発生しえ、前記種子はグルタミン合成酵素阻害剤 を不活化又は中和しうる非種特異的酵素活性を有している請求の範囲第１８項に 記載の植物細胞。
20. （２０）請求の範囲第９項から第１７項のいずれかに記載の方法で形質転換した 請求の範囲第１８項又は第１９項に記載の植物細胞。
21. （２１）検出可能な量のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼを産生 する請求の範囲第１８項ないし第２０項のいずれかに記載の植物細胞。
22. （２２）グルタミン合成酵素阻害剤を不活化又は中和しうる非種特異的酵素活性 を有する蛋白質をコードするＤＮＡフラグメントをゲノムに安定的に組込まれて 有する非生物学的に形質転換した種子。
23. （２３）グルタミン合成酵素阻害剤を不活化又は中和しうる非種特異的酵素活性 を有する種子を産み出しうる植物に発芽しうる請求の範囲第２２項に記載の種子 。
24. （２４）請求の範囲第９項から第１７項のいずれかに記載の方法で形質転換した 請求の範囲第２２項又は第２３項に記載の種子。
25. （２５）グルタミン合成酵素阻害剤を中和又は不活化しうる非種特異的酵素活性 を有する蛋白質をコードするＤＮＡフラグメントをゲノムに安定に組込まれて有 する非生物学的に形質転換した植物。
26. （２６）グルタミン合成酵素阻害剤を不活化又は中和しうる非種特異的酵素活性 を有する種子を産出しうる請求の範囲第２５項に記載の植物。
27. （２７）請求の範囲第９項から第１７項のいずれかに記載の方法で形質転換した 請求の範囲第２５項又は第２６項に記載の植物。
28. （２８）植物種がそのゲノム内にグルタミン合成酵素阻害剤を中和又は不活化し うる酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡフラグメントを含有し、使用す る除草剤がグルタミン合成酵素阻害剤である、該除草剤で畑を処理するステップ からなる、該植物種を保護し畑の雑草を選択的に撲減する方法。
29. （２９）植物種が請求の範囲第１項から第８項のいずれかに記載のＤＮＡフラグ メントを含有する請求の範囲第２８項に記載の方法。
30. （３０）請求の範囲第９項から第１７項のいずれかに記載の方法で植物種を形質 転換する請求の範囲第２８項又は第２９項に記載の方法。
31. （３１）栽培植物種の発芽後に、早期及び遅期に発芽する雑草が撲減されるまで 数回、特に約２０〜１００日間隔で、グルタミン合成酵素阻害剤の溶液を畑に施 用する請求の範囲第２８項から第３０項のいずれかに記載の方法。
32. （３２）グルタミン合成酵素阻害剤がＢｉａｌａｐｈｏｓ，ホスフィノトリシン 及びそれらの関連化合物からなる請求の範囲第２８項から第３１項のいずれかに 記載の方法。
33. （３３）植物種がそのゲノム内にグルタミン合成酵素阻害剤を中和又は不活化し うる酵素活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡフラグメントを含有し、使用す る除草剤がグルタミン合成酵素阻害剤である、該除草剤で畑を処理するステップ からなる、畑の植物種を菌病から選択的に保護する方法。
34. （３４）植物種が請求の範囲第１項から第８項のいずれかに記載のＤＮＡフラグ メントを含有する請求の範囲第３３項に記載の方法。
35. （３５）植物種を請求の範囲第９項から第１７項のいずれかに記載の方法で形質 転換する請求の範囲第３３項又は第３４項に記載の方法。
36. （３６）栽培植物種の発芽後に、菌類が撲減されるまで数回、特に約２０〜１０ ０日間隔で、グルタミン合成酵素阻害剤の溶液を畑に施用する請求の範囲第３３ 項から第３５項のいずれかに記載の方法。
37. （３７）グルタミン合成酵素阻害剤をＢｉａｌａｐｈｏｓ，ホスフィノトリシン 及びそれらの関連化合物からなる群から選択する請求の範囲第３３項から第３６ 項のいずれかに記載の方法。
38. （３８）Ｂｉａｌａｐｈｏｓ，ＰＰＴ又はそれらの関連化合物を約０．４〜約１ ．６ｋｇ／ｈａの用量で施用する請求の範囲第３２項又は第３７項に記載の方法 。
39. （３９）Ｂｉａｌａｐｈｏｓ，ＰＰＴ又はそれらの関連化合物を約２ｌ／ｈａ〜 約８ｌ／ｈａの割合で畑に施用しうるような濃度に液体キャリアで希釈する請求 の範囲第３８項に記載の方法。
40. （４０）選択的に保護する植物種がてんさい，米，じゃがいも，トマト，とうも ろこし，タバコからなる請求の範囲第３８項又は第３９項に記載の方法。
41. （４１）グルタミン合成酵素阻害剤を不活化しうる酵素活性を有するポリペブチ ドをコードするＤＮＡフラグメントを含有するベクター。
42. （４２）植物細胞及び植物を形質転換するのに適する請求の範囲第４１項に記載 のベクター。
43. （４３）ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のゲノムに属するＤＮ Ａフラグメントを含有する請求の範囲第４１項又は第４２項に記載のベクター。
44. （４４）異種ＤＮＡと組換えられたＤＮＡフラグメントを含有しており、前記組 換えＤＮＡはＢｉａｌａｐｈｏｓの生合成に関与するＤＮＡ領域を欠いている請 求の範囲第４１項から第４３項のいずれかに記載のベクター。
45. （４５）細胞宿主を形質転換するのに適しており、この宿主内に導入されたとき にグルタミン合成酵素阻害剤を不活化し得るポリペブチドを発現せしめるのに適 した請求の範囲第４４項に記載のベクター。
46. （４６）前記ＤＮＡフラグメントが細菌、特に大腸菌、（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質 転換に適したレプリコン要素の制御下にある請求の範囲第４５項に記載のベクタ ー。
47. （４７）前記ＤＮＡフラグメントが、後に植物細胞が前記ベクターで形質転換さ れたときにその植物細胞中で前記ＤＮＡフラグメントを発現せしめ得る調節要素 および植物プロモーター領域の制御下にある請求の範囲第４６項に記載のベクタ ー。
48. （４８）形質転換された植物細胞にｂｉａｌａｐｈｏｓ耐性を付与する請求の範 囲第４７項に記載のベクター。
49. （４９）前記植物プロモーター領域と前記ＤＮＡフラグメントの間にトランジッ トペブチドをコードする配列が挿入されている請求の範囲第４８項に記載のベク ター。
50. （５０）トランジットペブチドがリブロース−１，５−ニリン酸カルボキシラー ゼおよびクロロフィルａ／ｂ結合蛋白質の中から選択される請求の範囲第４９項 に記載のベクター。
51. （５１）前記ベクターが改変されたＴｉブラスミドである請求の範囲第４５項か ら第５０項のいずれかに記載のベクター。
52. （５２）次のヌクレオチド配列： 【配列があります】 を含む請求の範囲第４１項から第５１項のいずれかに記載のベクター。
53. （５３）請求の範囲第５２項に定義した配列のＧＴＧ開始コドンがＡＴＧ開始コ ドンで置換されている請求の範囲第５２項に記載のベクター。
54. （５４）次のヌクレオチド配列： 【配列があります】 を含む請求の範囲第４１項から第５１項のいずれかに記載のベクター。
55. （５５）ホスフィノトリシン−アセチルートランスフェラーゼ活性を有するポリ ペブチドをコードするＤＮＡフラグメントであって、次のアミノ酸配列： 【配列があります】 ［式中、ＸはＭＥＴまたはＶＡＬである］をコードするヌクレオチド配列、また はこのヌクレオチド配列の一部で依然としてホスフィノトリシン−アセチル−ト ランスフェラーゼ活性を有するポリペブチドをコードするのに充分な長さの部分 から成る、植物細胞の以後の形質転換用のＤＮＡフラグメント。
56. （５６）次のヌクレオチド配列： 【配列があります】 またはその一部でホスフィノトリシン−アセチルートランスフエラーゼ活性を有 するポリペブチドを発現する部分を含む請求の範囲第５５項に記載のＤＮＡフラ グメント。
57. （５７）ホスフィノトリシン−アセチルートランスフェラーゼ活性を有するポリ ペブチドをコードするＤＮＡフラグメントであって、次のアミノ酸配列： 【配列があります】 をコードするヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部で依然とし てホスフィノトリシン−アセチル−トランスフェラーゼ活性を有するポリペブチ ドをコードするのに充分な長さの部分から成る、植物細胞の以後の形質転換用の ＤＮＡフラグメント。
58. （５８）次のヌクレオチド配列： 【配列があります】 またはその一部でホスフィノトリシン−アセチル−トランスフェラーゼ活性を有 するポリペブチドを発現する部分を含む請求の範囲第５７項に記載のＤＮＡフラ グメント。