JPS6341426A - 制癌剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、化学的修飾を施した微生物由来のプロテアー
ゼを有効成分とする制癌剤に関する。

本発明者らは、永年にわたる制癌剤の研究の経験にもと
ずき、より副作用の少ない有効なる制癌剤を０指して研
究を行ない、先に、従来の制癌剤とは分子の性状ならび
に作用機構において全く異なる簡明の物質である微生物
由来のプロテアーゼが極めて強い制癌作用を有すること
を見い出した。

そしてさらに研究を進め、本発明において、化学修飾を
施した微生物由来のプロテアーゼを有効成分とする制癌
剤がなお一層すぐれた制癌効果を有する知見を得た。

本発明の制癌剤の有効成分である化学修飾を施した微生
物由来のプロテアーゼの作用も蛋白質の分解と、それに
伴なう癌細胞破壊であり、従来の制癌剤の作用とは全く
異なった簡明の作用をもつ制癌剤である。

そして本発明は化学修飾によって、抗体の発生を防止し
、かつ修飾の物質によっては癌細胞の破壊効果を高める
ものである。

〔従来技術〕

本発明者らは、以前より腫瘍組織においては。

血管とリンパ管の構築が、正常組織とは大きく異なるこ
とを見い出していた。即ち腫瘍組織局所に高分子制癌剤
を投与したときの挙動は、低分子のそれとは全く異なり
、高分子物質は、血行性にもリンパ行性にも回収排泄さ
れることがなく、長期にわたり、その腫瘍局所に停滞す
る現象も見い出したのである。

これは、分子量の大きいことが、その薬剤の拡敗速度を
低下させ、また血管内皮に対する通過を低くするため、
血管内への浸透と、それにつづく回収能率を低下させる
と考えられる。

さらに、本発明者らは、固型腫瘍局所には、リンパ管が
欠如していることも既に見い出していた。

正常組織では、このリンパ系こそが、このような組織内
の高分子ならびに油滴の回収の主たる経路であるが、腫
瘍組織ではこれを欠如しているために、酵素等の高分子
は、腫ＩＮＷＪ所に長期に残存するのである℃イワイ、
ケイ（Ｉｗａｉ、　Ｋ、）らキャンサー・リサーチ（Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）第４４巻２１１５−２１２１頁
１９８４年、マエダ、エッチ（Ｍａｅｄａ　、　）Ｉ　
、　）らジャーナル・オン・プロティン・ケミストリー
（Ｊ、　Ｐｒｏｔ。

Ｃｈｅｍ、）第３巻１８１−１９３頁１９８４年、前田
浩、今野俊光、「癌と化学療法」第１２巻７７３〜７８
２頁１９８５年、及びマエダ・エッチ（Ｍａｅｄａ、　
ｔｌ）ら「プロテインテイラーイングフォアフードエン
ドメディカルユーセズ（ｒ’ｒｏｔｅｉｎ　Ｔａｉｌｏ
ｒｉｎｇ　ｆｏｒ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ
　ｔｌｓｅｓ）３５３〜３８２頁Ｒ９眠フイニーおよび
Ｊ、　Ｒライテーカー編、マーセルデツカ（Ｍａｒｃａ
ｌｄｅｋｋｅｒ）出版１９８６年。」〕 本発明者らは、これらの知見に着目し、その局所に高分
子物質である微生物由来のプロテアーゼを注入すると、
そのいくつかは、癌細胞に強力に、かつ長期間にわたり
作用を発揮するので、顕著な制癌効果が認められるので
はないかとの推考に至った・ 〔解決すべき問題点〕 これまで開発された制癌剤は主として低分子のものであ
り、せっかく優れた薬効をイＩしていても薬剤が拡散し
易く、そのため薬効を持続出来ないという欠点があった
。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは、優れた制癌作用を有し、しかも
薬効が持続し、かつ正常細胞に対する毒性の低いものを
見い出すべく鋭意検討した。

そして微生物由来の数種のプロテアーゼがマウスの実験
腫瘍のすべてに対して顕著な制癌作用を有することを見
い出した。投与したプロテアーゼは、癌局所において長
期間作用を持続し、かつ又正常細胞に対する細胞毒性は
癌細胞よりもかなり少ないことがイン・ビＩ−口（ｉｎ
　ｖｉｔｒｏ）試験で明らかとなり、微生物由来のプロ
テアーゼを有効成分とする制癌剤としてこの知見をまと
め特許出願（特願昭６０−２０１６０７号）を行った。

本発明者らは、その後さらに研究を続けた結果、プロテ
アーゼでは抗体が出現し、その作用によってプロテアー
ゼの作用が中和されてしまうことがあり、これを防止す
るために、微生物由来のプロテアーゼに化学修飾を施す
ことによってその制癌作用が一層増強されることを見出
し、本発明を完成したものである。

即ち、本発明は、化学修飾を施した微生物由来のプロテ
アーゼを有効成分とする制癌剤に関する。

本発明の制癌剤の有効成分である化学修飾を施行した微
生物由来のプロテアーゼを調製するにあたっては、まず
微生物を培養し、培養物からプロテアーゼを採取する。

微生物を培養してプロテアーゼを取？：）するには、セ
ラチア・マルセッセンス（ＳｅｒａＬｉａ　ｍａｒｃｅ
ｓｃｅｎｓ）、バチルス８ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、ストレプ１−“ンイセス・
グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕ
ｓ）、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、
）、ストレプトマイセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ　ｓｐ、）等の微生物を適当な培地で培養し、
培養物よりプロテアーゼを採取し、精製することによっ
て得る。

次いでこれら微生物由来のプロテアーゼに化学修飾を施
すのであるが、その場合、上記のいずれの微生物が生産
したプロテアーゼでも同様に使用し得るのであるが１本
発明では特にセラチア・マルセツセンス（ＳｅｒＢＬＩ
Ｂ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びバチルス・エスピー（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）のプロテアーゼが好適であ
る。

セラチア・マルセッセンス由来のプロテアーゼ（以下５
６にプロテアーゼという）の調製法は以下の調製例１に
て示され、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｐ、）由来のプロテアーゼ（以下ＡＴプロテアーゼとい
う。）の調製法は調製例２にてそれぞれ示される。

次に、プロテアーゼに化学的修飾を施す方法としては種
々の公知の方法〔例えばジェー、マーシャルら（Ｊ、’
　Ｍａｒｓｈａｌ　ｅｔａｌジャーナルオブバオンロジ
カルケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）第
２５１巻１０８１−１０８７頁１９７６年に記載されて
いる。）が用いられる。

即ち、ｌ）糖とのカップリング、２）疎水性高分子基の
導入、３）蛋白表面性電荷の変換、４）低分子制癌剤と
の結合、５）プロテアーゼ分子間の結合による２量体生
成、６）合成高分子ポリカチオンとの結合、７）合成ポ
リアニオンとの結合等の方法がいずれも使用される。

このようにして製造された化学的修飾を施したプロテア
ーゼは液剤、錠剤、注射剤、座剤等に製痢される。

化学的修飾を施したプロテアーゼは大量投与が可能であ
るが、ＩＢ〜５０００ｍｇ／　１日の投与が好まし％’
Ｎ。

次に本発明の調製例、製造例、試験例、実施例について
示す。

調製例１ セラチア、マルセッセンスにｕｍｓ　３９５８　ＦＥＲ
Ｍ−ＰＮ。

８４３６を１−リプトソイ液体培地にて一夜培養し、そ
の２℃ＭＱを同上培地２００−３５０ｍｆｌを含むＩＱ
の坂ロフラスコに入れ、振盪下（１〜２Ｈｚ）　３０℃
にて培養し、プロテアーゼ活性が最大の平衡値になる２
５〜３０時間後に培養液をろ液と菌体に分離し、得ら才
すたろ液を減圧下に３０℃以下で４倍濃縮又は９０％飽
和硫安を加え沈澱物として濃縮し、ついで蒸留水に対し
て、常法により透析（４℃、４８〜７２時間）Ｌ、、Ｄ
ＥＡＥ−セルロースカラムに活性区分を吸着し、次いで
ＮａＣ１の濃度勾配下に溶出し、さらに透析し、凍結乾
燥し、次いでセファデックスＧ−１００（登録商標）処
理してプロテアーゼを精製した。こうして得られたプロ
テアーゼは００１％Ｎａドデシル硫酸存在下。

７．５％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動で単一で
あった。ここに得られたプロテアーゼを５６にプロテア
ーゼと命名した。そして５６にプロテアーゼの酵素化学
的性質については１本発明者らによりジャーナル・オン
・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）第１
５７巻（１）２２５−２３２頁１９８４年に記載されて
いる。

調製剤２ 可溶性デンプン２ぶ、大豆粉１．５％、ペプトン０．４
％、ｕ母Ｘ’ｆス０．２％、　ＫＨ２ＰＯ４０，１％、
に、ＨＰＯ４０，３％。

ＭｇＳＯ４・７Ｈ，００，０１％、ＣａＣ１，−２８，
００，０２％、　ＣａＣ０゜１．０％を含む培地を１２
１’Ｃｌ２Ｏ分加熱殺菌し、バチルス・エスピー（ＦＥ
ＲＭ−Ｐ　Ｎα４７３６）を接種し、４５℃、２４時間
培着を行う、遠心分離により除菌した後アルコール沈降
して粗酵素粉末を得る。粗酵素粉末を２ｍＭ酢酸カルシ
ウムおよび１Ｍ硫酸アンモニウムを含むｐｔ＋ａ、ｏの
２０１１Ｍトリス−塩酸緩衝液に溶解し、あらかじめ同
じ緩衝液で平衡化したトヨパール１１υ５５（東洋ソー
ダー、商標）カラムに流し、プロテアーゼを吸着させる
。２＋ａＭ酢酸カルシウムおよび０．８Ｍ硫酸アンモニ
ウムを含むｐ＋＋ａ、ｏの２０ｍＭ　Ｉ−リス−塩酸緩
衝液で洗浄したのち、２ＩＩＩＭ酢酸カルシウムおよび
０．４Ｍ硫酸アンモニウムを含むｐＨｌ１１．ｏの２０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液で溶出し、２［０Ｍ酢酸カルシ
ウムに対して透析し、凍結乾燥することによって精製標
品を得る。この標品は、アクリルアミド１２．５瓢のゲ
ルを用いたＳＯＳポリアクリルアミド電気泳動によって
単一のバンドを示した。

ここに得られたプロテアーゼをＡＴプロテアーゼと命名
した。

（微生物由来のプロテアーゼの化学的修飾例）製造例１ デキストラン（ファルマシア社製、平均分子量約ｔｏ、
０００）　１　ｇをとり、精製水９ｍ（ｌに溶解させる
。

これに対し１０％メタ過ヨウ素酸ナトリウム１ｍＱを加
え、４℃冷暗所にて１晩放置し、活性化を行ない、その
後３０％重亜硫酸ナトリウムを少しずつ加え、過剰のヨ
ウ素を還元する。ヨウ素の色が消失した後、精製水に対
し、十分透析を行ない塩類を除去し、凍結乾燥して活性
化デキストランを得る。

次に活性化デキストラン粉末２０ｍｇをとり精製ＡＴプ
ロテア―ゼ１０ｍｇとともにＯ，１Ｍホウ酸ａ衝液１０
ｍ１１に溶解し、−夜反応させる。セファクリルＳ−３
００（ファルマシア社装）のカラムによるゲル濾過で未
反応物を分離し、透析、凍結乾燥して最終標品を得た。

プロテアーゼ活性をカゼイン分解能で測定したところ活
性収率は６３％であった。

製造例２ 硫酸デキストラン（シグマ社製、分子量約ｓ、ｏｏｏ）
１００ｍｇをとり、０．４Ｎ　Ｎａ０１１４７ｍ１２　
に溶かし、エピクロロヒドリン３ｔｓＱを加え、攪拌下
４０℃２時間反応させる。反応液をＩＮ　ＩＩｃＩで中
和した後エバポレーターで蒸発乾固させる。次にＡＴプ
ロテアーゼ１１０ｌ１１と共に、２ＩＩＩＭ酢酸カルシ
ウムを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐｌ＋９．０）に溶
解させ４℃１晩反応させる。反応物は分子量−万のカッ
トオフのポアサイズをもつメンブレンフィルターにて濾
過し、未反応の硫酸デキストランを除去する。反応生成
物をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にかけて分子量
をみたところ、ＡＴプロテアーゼ（分子ｆｔ３７，５０
０）のバンドは消失し、それより、大きい範囲（４０，
０００〜４５，０００）のところにバンドが検出された
。生成物は２ＭＭＣｕ２１″に透析したのち凍結乾燥し
た。

製造例３ ２０ｇモノメトキシポリエチレングリコールを１００＠
Ｑベンゼンに溶かし、　３６５ｍ１（塩化シアヌルを加
え、８０℃４４時間反応させ１石油エーテルで沈澱させ
ることにより活性化ポリエチレングリコール（吹下ポリ
エチレングリコールをＰＩＥＧと略す。）を得た。

次に３０ａ＋ｇのＡＴプロテアーゼを０．１Ｍホウ酸緩
衝液（ｐＨ８）　１５ｄに溶かし、活性ＰＥＧ　５００
ｍｇを加え３７℃１時間反応させた。

反応液をセファクリルＳ−２００カラムによるゲル濾過
にかけて分子量５〜１０万の両分を集め、透析後凍結乾
燥し、５ｍｇの標品を得た。プロテアーゼ活性収率は約
１０％であった。

製造例４ ３０ｍｇの５６にプロテアーゼを２ｍｆｌの０．８Ｍ　
Ｎａ１ｌＣ０３に溶解し、１０ｍｇのスチレンマレイン
酸無水物共重合体（以下ＳＭＡと略す。）を加え、４℃
１６時間反応させる。反応液を０．１Ｍホウ酸緩衝液（
ｐｌ＋８．５）に対し透析したのち、セファクリルＳ−
２００カラムにてゲル濾過し１分子量約６万の両分をと
り、透析、凍結乾燥して５Ｂの標品を得た。

製造例５ ＡＴプロテアーゼ２０ｍｇを０．０１　Ｍイミダゾール
緩衝液１０ｍｍに溶かし、コハク酸無水物２５ｍｇを粉
末のまま徐々に加え、ＩＮ　ＮａＯ旧こてｐＨを中性に
保ちつつ２時間反応した０反応物を同じ緩衝液に透析し
たのち、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（
ホワソトマン社）カラムに吸着させ、ついで０〜０．５
ＭＮａＣ１によりリニアグラデイエンド溶出を行ない、
もとのプロテアーゼよりも高塩濃度（０，４Ｍ）で溶出
されてくる両分を集め、透析、凍結乾燥した。なお得ら
れた酵素蛋白質は全体に表面がマイナス荷電を持ってい
た。

製造例６ ５６にプロテアーゼ２０ｍｇをとり、０．０１Ｍ酢酸カ
ルシウム溶液４ｔＱにて溶解させ、そこに２Ｍ　Ｎ、Ｎ
−ジメチルエチレンジアミン水溶液（ｐＨ８）　５　ｔ
ａｆｉを加え。

さらにＩＭの水溶性カルボジイミド溶液ＬｍＱを添加し
、４℃１晩反応させたのち、２ｍＭ酢酸カルシウム溶液
に対し透析し、凍結乾燥した。７．５％ポリアクリルア
ミド電気泳動（ＰＨ４，０）にかけたところもとの５６
にプロテアーゼよりも陰電極側にバンドが移行しており
、塩鵬性の性質をもつことが確認された。

製造例７ ＡＴプロテアーゼ２０＋＊ｇをとり２　＋＊ＭＣｕ”＋
を含む０．０１にトリス緩衝液１０ｍ　Ｑに溶かし、Ｎ
−サクシイミジル−（ピリジルジチオ）プロピオネート
（以下５ｐｏｐと略す、）の５　ｍｇ／ｍｌｌエタノー
ル溶液１７０μΩを少量ずつ添加し、室温下３０分反応
させセファデックスＧ−２５（ファルマシア社製）カラ
ムにて脱塩した。

一方、ポリ−し一リジン（シグマ社分子量約４７，００
０）１３ｍｇをとり同様の操作を行なう、ここでＡτプ
ロテアーゼ溶液にジチオスライトールを０．１Ｍになる
ように加え、ただちに脱塩し、できたチオール基を有す
るＡＴプロテアーゼと５ｐｏｐ化ポリ−し−リジンを混
ぜ、４℃１晩反応させることによってポリーＬ−リジン
とＡＴプロテアーゼがジスルフィド結合で結合したもの
が得られる。未反応物とはセファクリルＳ−３００カラ
ムによって分離を行ない、透析、凍結乾燥した。

製造例８ ５６にプロテアーゼ及び低分子制癌剤メトトレキセード
（以下ＭＴＸと略す、）及び水溶性カルボジイミドをモ
ル比で１：５０：５００とし、０．１Ｍトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）１０ｓ＋Ｑ中で４℃１晩反応させ、
ついで２ｍＭ酢酸カルシウム水溶液に透析して未反応低
分子と塩類を除去し凍結乾燥した。Ｕｖスペクトル分析
よりプロテアーゼ１分子に対しＭＴＸ　４分子が結合し
たものが得られた。

製造例９ 製造例８における低分子制癌剤ＭＴＸの代わりにＤＮＡ
ポリメラーゼインヒビターであるシトシンアラビノシド
（以下ａｒａ−ｃと略す）を用い製造例８と同様に反応
を行ないＡＴプロテア−ゼシトシンアラビノシド結合物
を得た。

製造例ＩＯ 製造例７で述べた５ｐｏｐにより５６にプロテアーゼ同
士をジスルフィド結合により分子間架橋を形成させた０
反応産物はセファクリルＳ−２００カラムで２重体と未
反応モノマーを分離し２重体部分のみをとり透析、凍結
乾燥した。

製造例１１ ５６にプロテアーゼ２０ｍｇを２ｍＭ酢酸カルシウムを
含む０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐ）＋９）９．Ｏｍｆｌ
に溶かし、アセトン１ｎ＋ｆｌを添加する。攪拌しつつ
ＮａＢＩｌ、　４０ｍｇを粉末のまま１時間にわたって
少量ずつ加え、セファデックスＧ−２５カラムによりゲ
ル濾過し、未反応低分子を除去したのち、凍結乾燥した
。この結果プロテアーゼのアミノ基がイソプロピル基で
置換され、疎水性が増すとともに等重点が低くなった（
７５％ポリアクリルアミド電気泳動により等重点の移動
を確認した。）。

なお１本発明で用いたプロテアーゼ活性測定法について
以下に述べる。基質であるミルクカゼイン（１，５％Ｖ
／Ｖ、　０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８，０）　　１　ｍ
（ＩＬ、；、酵素液（同緩衝液で希釈）１ｓＭ・を加え
、３７℃３０分反応させたのち０．４Ｍ　トリクロロ酢
酸２ｍｆｌを加えて反応を停止させ、凝固変性した蛋白
を遠心分離して除き、上清液のＡ＊ａｔ＋ｌｌ−におけ
る吸光度を測定する。

試験例Ｉ Ｃｒｊ　：　ＢＰＦ、　系マウスの側腹部皮下に８−１
６メラノーマ細胞２．５　Ｘ　１０”個／匹接種し、ｔ
ｏ−１２日後腫瘍体積が約２００ｓ＋ｓｍ”に成長する
のを待ち、各化学修飾プロテアーゼを所定の濃度に調製
したものを単回投与した。修飾体の投与量は元のプロテ
アーゼ活性値に換算して行ない、大量投与（ｌｌｉｇｈ
　ｄｏｓｅ　：　３゜３ｍｇ／ｍａ）　、中程度投与（
Ｍｉｄｄｌｅ　ｄｏｓａ　：　１．０１１区／−幻、少
量投与（Ｌｏｗ　ｄｏｓｅ　：　０．３３＋ｍｇ／ｍｆ
ｉ）の３段階の投与量を設けた。またマウスの固型腫瘍
の大きさに合せて各濃度のプロテアーゼ溶液を１５０龍
１腫瘍当り０．１１Ωとした。プロテアーゼの溶解は５
６にプロテアーゼ及びその修飾体が生理食塩水で、　Ａ
Ｔプロテアーゼ及びその修飾体については２ｍＭ酢酸カ
ルシウムを含む生理食塩水によった。

投与口を０日目とし以後１日日、４日目、７日目、ｌＯ
０日目腫瘍サイズを測定した。サイズは長径、短径、高
さをノギスで測定しく単位ａｍ）　（長径／２ｘ［径／
２）ＸＫＸ高さ＝体積単位Ｉａｍ″′として算出した。

その結果は表１に示される。なお効果の判定は４日目及
び７日目における腫瘍サイズをφとして非修飾プロテア
ーゼ投与の際の腫瘍体積の増加率を１としたときの各修
飾プロテアーゼによる腫瘍体積増加率を測定し、その値
により示した。この値が小さいほどもとのプロテアーゼ
に比べて修飾プロテアーゼの抗腫瘍性が増加しているこ
とを示している。

表１　腫瘍体積の増加率 ５６Ｋ　　　　　　　　　　　　　　１．００５６に−
ＰＥＧ　　　　　　　　　　　　Ｏ，８０５６に一５Ｎ
Ａ　　　　　　　　　　　　０．７１５６に一コハク酸
　　　　　　　　　　０．７２５６に一メトトレキセー
ト　　　　　０．６３５６に一ジメチルエチレンジアミ
ン　０．８４５６に一アルキル化　　　　　　　　０．
８２５６に−２重体　　　　　　　　　　０．９２ＡＴ
　　　　　　　　　　　　　　　１．００ＡＴ−硫酸デ
キストラン　　　　　０．７４ＡＴ−ＰＥＧ　　　　　
　　　　　　　　Ｏ，３１ＡＴ−５ＭＡ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，５ｇＡＴ−コハク
酸　　　　　　　　　　０．６３ＡＴ−ジメチルエチレ
ンジアミン　０．８２ＡＴ−メトトレキセート０．５Ｓ ＡＴ−シトシンアラビノシド　　　０．７１ＡＴ−２重
体　　　　　　　　　　　０，７６ＡＴ−デキストラン
　　　　　　　　０．５３対照　　　　　　　　　　　
　　３．８０表１中の５６には５６にプロテアーゼの略
であり、ＡＴはＡＴプロテアーゼの略である。又対照は
プロテアーゼなしの場合である。

表１より明らかのように化学修飾を施した微生物由来の
プロテアーゼは元のプロテアーゼよりも強い抗腫瘍作用
を有することが示される。

試験例２ 各種化学修飾プロテアーゼの急性毒性試験二体重２０〜
２５ｇのｄｄ’／マウスを１群１０匹とし、生理食塩水
又は２ＩＩＩＭ酢酸カルシウムを含む生理食塩水に溶解
した各種化学修飾のプロテアーゼを静脈内又は腹腔内に
それぞれ投与した後、１週間にわたって症状を観察した
が、いずれのプロテアーゼ投与の場合も、何ら異常は認
められなかった。

以上で明らかのように、微生物由来のプロテアーゼを化
学修飾したものは顕著な制癌作用を有することが判明し
た。

従って、これらの化学修飾を施した微生物由来のプロテ
アーゼを有効成分とする制癌剤の実用化は大いに期待さ
れるものである。

これらの化学修飾した微生物由来のプロテアーゼをヒト
に投与するに際しては、直接腫瘍内、腹腔内、あるいは
経口投与によって有効に治療されつる。

これらの化学修飾した微生物由来のプロテアーゼの投与
量は、そのｐａ瘍の大きさ、増殖速度、その他により一
定ではないが、腫瘍内には通常１０μｇより１ｍｇを１
〜数ケ所注入する。また腹腔的腹膜、その他の播種性の
腹腔内腫瘍あるいは腹水癌に対しては、通常希釈した化
学修飾した微生物由来のプロテアーゼ溶液１〜２００ｍ
Ｑを腹腔内に注入する。

さらに経口投与の場合は、通常成人−人当り１ｍｇから
数ｇを一度に又は分割して投与する。

剤型としては、粉末、水溶液、垣粒状、カプセル剤、腸
溶剤、あるいは油剤として油溶化して用いることも出来
、また合剤として、これら化学修飾した微生物由来のプ
ロテアーゼの不活性化をもたらす胃液中のペプシンから
守るために、ペプシンの阻害剤と併用することも可能で
ある。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１ 製造例３で製造したＰＥＧ修飾ＡＴプロテアーゼ１００
ｍｇを１Ｏｎ＋Ｑの２ｍＭ酢酸カルシウムを含む生理食
塩水に溶解し、メンブレンフィルターを用いて無菌的に
濾過し、濾液を滅菌したガラス溶器に充填して凍結乾燥
し、これを密栓して注射用凍結乾燥粉末剤とした。

実施例２ 実施例１に準じて得られたＰＥＧ修飾ＡＴプロテアーゼ
粉末剤１００ｇ、乳＆’ｆ　９７　ｇおよびステアリン
酸マグネシウム３ｇをそれぞれ秤量したのち均一に混合
した後、このものをＮα２のゼラチンカプセルに２００
ｍｇずつ充填したのち、腸溶皮膜を施し、腸溶カプセル
剤とした。

実施例３ 製造例１で製造したデキストラン結合ＡＴプロテアーゼ
２００ｍｇを１０１１ＩＱの生理食塩水に溶解し、メン
ブレンフィルターを用いて無菌的に濾過し濾液を滅菌し
たガラス容器にｌｏｍＲずつ充填して凍結乾燥し、これ
を密栓して注射用凍結乾燥粉末剤とした。

実施例４ 実施例３に準じて得られたデキストラン結合ＡＴプロテ
アーゼ粉末剤１ｇ、結晶セルロース８４．５ｇ。

マニトールｌｏｇ、カルボキシメチルセルロ−スカルシ
ウム び硬化油１．５ｇをそれぞれ秤量したのち、均一に混合
した粉末を押出機にて顆粒化し，内服用顆粒剤を製造し
た。

実施例５ 製造例８で製造されたメトトレキセート結合５６にプロ
テアーゼ５００ｍｇを１０ｍＱの生理食塩水に溶解し、
メンブレンフィルターを用いて無菌的に濾過し。

濾液を滅菌したガラス温潤に１０ｍＲずつ充填して凍結
乾燥し、これに密栓して注射用凍結乾燥粉末剤とした。

実施例６ 実施例５に準じて得られたメトキレキセート結合５６に
プロテアーゼ粉末剤１ｇ、結晶セルロース８４．５ｇ、
乳＆ＨＯｇ、カルボキシメチルセルロースカルシウム２
ｇ、ステアリン酸マグネシウム１ｇ、ステアリン酸１．
５ｇを均一によく混合した粉末を打錠機により重量１０
０ｍｇの素錠を製したのち、このものに腸溶剤皮のコー
ティング剤でコーティングし、腸溶錠剤を製造した。

〔本発明の効果〕

本発明の化学修飾を施した微生物由来のプロテアーゼを
有効成分とする制癌剤は、薬効を持続でき、かつ正常細
胞に対する毒性が低いという特長を有する。さらにまた
、頻回あるいは反復投与時に考えられる免疫学的反応を
回避することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　化学的修飾を施した微生物由来のプロテアーゼを有
   効成分とする制癌剤。 ２　微生物由来のプロテアーゼが中性プロテアーゼであ
   る特許請求の範囲第１項記載の制癌剤。