JPS6363200B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、アグロバクテリウム
（Agrobacterium）属に属する微生物から得られ
る異性化酵素を使用してフルクトースまたはフル
クトースおよびグルコースのシロツプを製造する
方法に係わる。 グルコースのフルクトースへの酵素的異性化反
応では、グルコース溶液（たとえばコーンシロツ
プ）にグルコースイソメラーゼ（Ｄ−キシロース
−ケトールイソメラーゼEC5.3.1.5.）を添加し、
グルコースがフルクトースに変わるように反応条
件を制御している。この場合、フルクトースへ変
わつたグルコースの量は平衡定数（60℃において
1.08）の関数である。 各種の文献によれば、シユードモナス
（Pseudomonas）、ラクトバジルス
（Lactobacillus）、エスシエリチア
（Escherichia）、アエロバクター（Aerobacter）、
アルスロバクター（Arthrobacter）、バシルス
（Bacillus）、ストレプトミセス（Streptomyces）
等の各種の微生物の活性を利用することにより、
グルコースをグルコースおよびフルクトースを含
有するシロツプに変化させる酵素的方法が開示さ
れている。 これに対して、本発明者等は、現在までのとこ
ろ開示されていないアグロバクテリウム属に属す
る微生物も適当な培養基で生育する際に、グルコ
ースを異性化するイソメラーゼ酵素を生産しうる
ことを見出し、本発明に至つた。 農耕土から採取されたこれらの微生物（各々、
1302、1303、1304の符号を付した）は以下の形態
的特性および生化学的特性を有している。 微視的形態 時々対をなす。0.8μ×1.5〜2.0μの桿状。グラム
陰性。きよう膜なし。無包子。４ないし６の周毛
を有して運動性。 巨視的形態 寒天培地（デイフコ）におけるコロニー：降起
形。縁部に破壊なし。クリーム色。透明。外面の
直径0.5〜１mm。平滑。カルシウム、グリセロホ
スフエート、マンニトール、硝酸塩、寒天の培地
では良好に生育し、褐色に変色し暈輪を形成す
る。 生化学的特性 いかなる実験培地おいても、何ら特殊な生育要
因を必要とすることなくかつアミノ酸の非存在下
で、ただし唯一の窒素源としてNH₄ ⁺、NO₃ ^-あ
るいはアミノ酸を使用して、４℃ないし39℃で生
育する。 オキシダーゼ： プラス（N.Kovacs、ネーチヤー（Nature）”
178、703（1956ロンドン） カタラーゼ： プラス（M.Levine、D.Q.Anderson、“ジヤ
ーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bact.）”
23、337〜347（1937）） 硝酸塩からの亜硝酸塩の生成： プラス（C.E.ZoBell、“ジヤーナル・オブ・
バクテリオロジー”24、273（1932）） ツイーン80の加水分解： マイナス（G.Sierra、“Antonie van
Leeuwenhokk”23、15〜22（1957）） ガゼイン、ゼラチン、セルロース、でんぷん、寒
天の加水分解： マイナス（V.B.D.Skermann、“ガイド・ツ
ー・ザ・アイデンテイフイケーシヨン・オブ・
ザ・ジエネラ・バクテリア（Guide to the
Identification of the Genera of Bacteria）
２版、Williams and Wilkins Book社発行、
ボルテイモア、（1967）） ３−ケトグリコシドの生成： プラス（M.J.Bernaerts、J.De Ley、“ネー
チヤー”197、406（1963）） アニリンブルー・マンニトール・寒天： 染料を吸収して生育する（A.A.
Hendrickson、J.L.Baldwin、A.J.Riker，“ジ
ヤーナル・オブ・バクテリオロジー”28、597
〜618（1934）） リトマスミルク：灰褐色 炭水化物の利用： 酸化形（R.Hugh、E.Leifson、“ジヤーナ
ル・オブ・バクテリオロジー”66、24〜26
（1953）） 培養基における炭素源として使用できる化合物
（R.Y.Stanier、等“ジヤーナル・オブ・ジエネラ
ル・ミクロバイオロジー（J.Gen.Microbiol.）
43、159〜271（1966））： Ｄ（＋）グルコース、Ｌ（＋）アラビノース、
Ｄ（＋）キシロース、Ｄ（＋）トレハロース、Ｄ
（−）リボース、Ｌ（＋）ラムノース、ラクトー
ス、セロビオース、マルトース、クエン酸塩、
酢酸塩、乳酸塩、プロピオン酸塩、Ｌ−アルパ
ラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−ヒスチジ
ン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン ニンジン根デイスクおける感染性（J.A.
Lippincott、B.B.Lippincott、“ジヤーナル・オ
ブ・ジエネラル・ミクロバイオロジー”59、(1)、
57〜75（1969））：

【表】 これらの性質を“バージーズ・マニユアル・オ
ブ・デターミネーテイブ・バクテリオロジー
（Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology）”第８版の記載と比較することに
より、本発明に係わる微生物は、リゾビアケー
（Rhizobiaceae）科、アグロバクテリウム属、ツ
メフアシエンス（tumefaciens）種に属するもの
であると決定した（1304）。 符号1302および1304を付した菌株についてはノ
ーザン・リージヨナル・リサーチ・センター
（Northern Regional Research Center）（米国、
イリノイ州）に寄託してあり、それぞれの寄託番
号はNRRL B11291およびNRRL B11394であ
る。 本発明で利用する微生物の培養は常法に従つ
て、たとえば表面培養法あるいは好ましくは撹拌
培養機を使用する液内培養法に従つて、好気的条
件下で実施できる。 培地（固状あるいは液状のいずれであつてもよ
い）は資化性の炭素源、リン源、窒素源および無
機塩を含む。培養は温度20℃ないし40℃、好まし
くは25℃ないし35℃、PH5.5ないし8.5、好ましく
は6.5ないし7.5、培養時間10ないし48時間、好ま
しくは20ないし30時間の条件下で行なわれる。炭
酸源としては、グルコース、キシロース、ラクト
ース、乳酸塩、酢酸塩、コーンスチープリカー、
グリセリンが使用できる。窒素源としては、肉お
よびカゼインの加水分解物、大豆の加水分解物、
アンモニウム塩、硝酸塩および尿素が使用でき
る。 好適な培地としては、たとえば以下の組成を有
するものである。 組 成 グルコース 10（ｇ／） キシロース ５ KH₂PO₄ １ MgSO₄・7H₂O １ NH₄Cl ２ PH 7.0〜7.2 菌体ペーストからのグルコースイソメラーゼの
抽出は、酵素学の分野で利用される常法に従つて
実施できる。 この目的のために、フレンチ・プレツシヤ・セ
ル・プレス、Manton Gaulinホモゲナイザ、ロ
ータリ・デイスインテグレータ等の如き特殊な装
置あるいは超音波装置を使用して菌体を破壊す
る。 酵素はアセトンパウダー法あるいは凍結乾燥法
により同等にかつ良好に抽出される。 このようにして本発明に係る菌株から抽出され
たグルコースイソメラーゼは熱に対して良好な安
定性を有していることを特徴としている。 グルコースの異性化は常法に従つて実施でき
る。すなわち、グルコース溶液を微生物の培養物
（すなわち生菌体）に直接添加してもよく、ある
いは凍結菌体、アセトンパウダー物または凍結乾
燥菌体に添加してもよい。 同様に、抽出物およびその濃縮物の如きイソメ
ラーゼを含有する調製物、粗製または精製イソメ
ラーゼ調製物等を使用することもできる。 さらに、化学結合、イオン結合によつて巨大分
子化合物に結合させることにより酵素を不動化さ
せることあるいは物理的方法により不動化させる
ことによつて技術的かつ経済的に改良できる。 以下の実施例により本発明に係わる他の製法に
ついての詳細が明確になると思われるが、これら
の実施例は本発明を限定するものではない。 実施例 １ 以下の組成をもつ培養基を調製した。 組 成 グルコース ５ｇ／ キシロース ５ 〃 KH₂PO₄ 13 〃 （NH₄）₂SO₄ 〃２ MgSO₄・7H₂O 0.4〃 FeSO₄・7H₂O 10mg／ CaCl₂.6H₂O 40 〃 MgSO₄・5H₂O ５ 〃 ZnSO₄・7H₂O ５ 〃 CuSO₄・5H₂O １ 〃 CoCl₂・6H₂O １ 〃 NaOHによりPHを7.2に調整し、この培養基を
エルレンメーヤーフラスコ（500ml）に100mlずつ
分注した。110℃で30分間殺菌したのち、フラス
コに同じ組成（ただし、寒天（DIFCO）２％を
含有する）の斜面倍地で培養した菌株1304を接種
し、220rpmで振盪しながら30℃で24時間培養し
た。ついで、遠心分離法により菌体を集め、緩衝
液（Na₂SO₃0.1モル、PH７、Co²⁺1×10^-4モルお
よびMg²⁺5×10^-3モル含有）で洗浄した。この培
養基100mlから湿つた菌体２ｇが得られた。これ
らの菌体を上記緩衝液20ml中に入れ、この菌体ス
ラリをフレンチ・プレツシヤ・セル・プレスに送
り、菌体を破壊した。このようにして得られた抽
出物について酵素活性を測定したところ、湿つた
菌体１ｇ当り560酵素単位を含有していた。 酵素活性は以下の如くして測定した。 基質溶液（精製水中にＤ−グルコース3.67モ
ル、Mg²⁺5×10^-3モル、Co²⁺1×10^-4モルおよび
Na₂SO₃0.1モルを含有する。PH7.0）4.5mlでなる
反応液に粗組抽出物0.5mlを添加した。蒸気浴上
において60℃で２時間培養を行なつた。ついで混
合物を０℃に冷却することにより反応を停止し
た。試料の施光度（α₂時間）および元の試料の旋
光度（α₀）を、Perkins Elmer旋光計141（Naラ
イン（549ナノメータ）、セルの光路0.1dｍ）を使
用して測定した。 上記条件下で１時間にフルクトース１mgを生産
する酵素の量を1SNAMPROGETTI単位と定義
すれば、湿つた菌体１ｇ当りの酵素についての単
位は以下の式によつて表わされる。 湿つた菌体１ｇ当りの単位＝（α₀α₂時間）×（使
用したグルコースの量（mg））×10／（αグルコース−
αフルクトース）×0.1×Ｃ×0.5×２ 式中、（αグルコース）＝＋54.16゜ （αフルクトース）＝−98.35゜ Ｃ＝溶液１ml当りのグルコースの濃度（ｇ） 0.1＝光路（ｄｍ） 実施例 ２ 実施例１と同様にして菌株1304の培養物を調製
した。 培養物500mlから湿つた菌体10.2ｇが得られ、
これを緩衝液（Na₂SO₄0.1モルPH７）40ml中に懸
濁し、−10℃で撹拌しながらアセトン200ml中に添
加した。処理15分後、菌体を紙上で集め、アセ
トンで洗浄し、室温で減圧乾燥した。このように
して乾燥した菌体1.9ｇが得られた。 得られたアセトンパウダーの１ｇ当りの活性度
は2200単位であつた。 実施例 ３ 実施例１と同様にして菌株1304の菌体を調製
し、実施例２と同様にしてアセトンで処理した。 ついで、アセトンで処理した菌体を、反応混合
物中における反応時間に対するグルコースの異性
化割合を測定するために使用した。 テスト条件は以下のとおりである。 (a) アセトンで処理した菌体の量 10ｇ (b) 基質の容量 １ (c) 反応温度 60℃ 基質は以下の組成を有するものである。 組 成 グルコース 60％（容量／容量） Mg²⁺ ５ミリモル Co²⁺ 0.1ミリモル Na₂SO₃ 100ミリモル PH 7.0 異性化割合は以下のとおりである。反応時間（時間） 変化率（％） ３ 12.5 ６ 20.8 ９ 27.8 12 32.3 15 37.7 18 40.6 23 44.8 実施例 ４ 菌株1302および1303の培養物および菌体抽出物
を実施例１と同様に調製した。 培養物100mlから、それぞれ湿つた菌体1.72ｇ
および1.85ｇが得られた。 湿つた菌体１ｇ当りの活性度は菌株1302につい
て412単位であり、菌株1303について476単位であ
つた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ グルコースを、アグロバクテリウム属に属す
   る微生物の菌体処理物と接触させることを特徴と
   する、フルクトースまたはフルクトース含有シロ
   ツプの製法。