KR20170093250A - 폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 장기 배양, 및 폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 동결 보존 방법 - Google Patents

폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 장기 배양, 및 폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 동결 보존 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 장기 배양 방법, 세포 배양 장치 및 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 동결 보존 방법 및 키트에 관한 것이다.

Description

폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 장기 배양, 및 폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 동결 보존 방법
본 발명은 세포의 장기 배양 방법, 세포 배양 장치 및 키트에 관한 것이다. 상세하게는, 폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 장기 배양 방법, 세포 배양 장치 및 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세포의 동결 보존 방법 및 키트에 관한 것이다. 상세하게는, 폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 동결 보존 방법 및 키트에 관한 것이다.
세포 배양
세포는 생체 내에서는 일반적으로 삼차원적인 집단으로서 존재하지만, 고전적인 평면 배양에서는, 세포가 용기에 달라붙는 형태로 단층형으로 배양된다. 부착 세포의 배양에 있어서는, 예로부터, 여러 가지 배양법이 샬레 등에 의해 개발되어 있다. 이 샬레 등에 의한 배양을 행한 경우, 배양 세포는 증식을 계속하고, "컨플루언트"라고 불리는 이 이상 증식할 수 없는 상황이 되어, 증식이 정지한다. 세포종에 따라서도 달라지지만, 계대하지 않고 이 컨플루언트한 상태를 계속한 경우, 어느 정도의 기간 후에 자발적으로 박리가 시작되어, 세포가 계대할 수 없게 되는 경우도, 많은 세포에서 발견되고 있다.
재생 의료에 있어서의 세포 이식이나 세포에 의한 물질 산생(産生)이 주목을 모음에 따라, 부착 세포의 배양 방법의 수요가 높아지고 있다. 지금까지, 마이크로 캐리어 등의 담체에 의한 의사 부유 배양이나 가공 표면을 이용한 스페로이드 배양 혹은 중공사를 세포의 배양장으로서 이용하는 중공사 배양 등, 각종의 입체 배양 및 담체 배양 등이 개발되어 있다. 중공사 배양은, 견고한 중공사에 보호받는 환경하에서, 세포를 정상적으로 또한 장기간에 배양하는 방법론으로서 다루어지고 있고, 또한, 마이크로 캐리어 배양에서도, 에어 리프트법이나 연속 배양을 목표로 한 장치적 고안에 의해 장기적 배양이 많이 시도되고 있다.
이들 방법론의 특장은, 담체를 이용한 생육 공간에의 3차원 환경의 부여에 의한 증식 장소의 확대이며, 이 큰 생육 장소에 장치적 고안이나 방법적 고안으로 담체 그 자체를 강고한 환경으로 보호하여, 배양 기간을 장기화시키는 것을 목적으로 하고 있다. 한편, 이들 방법에 이용하는 시스템은, 복잡한 장치나 큰 용적의 장치를 필요로 하는 것이거나, 혹은 일단 배양이 시작되어 버리면, 배양 환경 그것에는 관여하기 어려운 폐쇄계 시스템인 케이스가 많이 보여진다. 그 때문에, 세포를 장기간에 배양하고, 또한, 간편하게 그 시스템을 취급할 수 있는 방법론이 희구(希求)되지만, 적절한 방법론은 개척되어 있지 않다.
한편, 비특허문헌 1 및 2에 나타난 바와 같이, 생체 내 기관을 모방한 장기 세포 배양법에 대해서는, 입체적인 담체를 이용한 연구예가 보고되어 있다. 이들은, 췌장의 랑게르한스섬의 재구축물 생체 포매 실험이나 시험관 내에서의 골수 세포의 장기 배양 등이며, 부위 선택적인 재구축을 목표로 하는 연구 성과 사례이다. 장기 배양이라고 하는 과제에 대해 3차원 입체 환경에서의 세포 배양의 의의나 가치가 보여진 중요한 성과이지만, 각각의 담체는 용도마다의 특이성이 높고, 사용되는 재료는 생체 적합 소재의 섬유성 구조체나 플로팅에 의해 구성된 고차 구조체이기 때문에, 범용성이 부족하고, 취급도 일반성이 부족하다. 보다 간편하고 또한 다양한 상태에 적응하여 사용 가능한 방법론의 개척이 희구되고 있다.
세포는 그 생존 형태의 특징에 따라, 크게는, 부유 세포와 부착성 세포의 2종으로 크게 나뉜다. 어느 쪽의 세포도, 인공적인 배양에 제공하는 경우에는, 세포의 파종·배양·증식·계대 그리고 동결에 의한 보존이라고 하는 사이클을 거친다.
최근, 배양 세포를 이용하는 백신, 효소, 호르몬, 항체, 사이토카인 등 생체 내 단백질 등의 산생이나 혹은 재생 의료에 있어서의 세포 이식 등이 주목을 모음에 따라, 대량의 세포를 효율적이고 또한 간편하게 배양하는 방법의 개발이 진행되고 있다. 특히, 담체를 이용하는 세포 배양 방법은, 그 효율면에서의 매력이나 범용성으로부터 다방면에서 주목을 모아, 다종 다양한 방법이 개발되어 있다. 이들 세포 배양 전반에 있어서, 세포의 동결 보존에 관한 기술에 대해서도, 다방면에서의 검토가 진행되고 있다. 고전적인 동결법을 벗어나, 보다 간편하게 배양 플레이트 그 자체에서 세포의 동결을 시도하는 기술이나(특허문헌 4), 입체적 담체를 이용하여 동결에 있어서의 세포의 생존율 향상을 목표로 하는 방법(특허문헌 5), 혹은, 섬유성 담체를 이용하여, 배양 세포의 동결 보존 특성을 향상시킨 예(특허문헌 6)나, 줄기 세포의 생존 효율을 검증하는 예(비특허문헌 3) 등의 보고가 있다.
그러나 동결 보존 매체로서는, 특이한 구조를 갖는 섬유성 소재에 한정되어 있고, 또한 이 소재는, 동결 보존 매체로서의 기능을 갖지만, 세포 배양 담체로서 그대로 사용될 수 있는 소재가 아니라, 일시적 보존체로서 이용되는 데 그치고 있다. 간편하고 또한 효율적으로, 세포의 동결 보존부터 세포의 해동(세포 깨움), 사용부터 재동결까지를 일관하여 실시할 수 있는, 신규의 방법론의 구축이 희구되고 있다.
폴리이미드 다공질막
폴리이미드란, 반복 단위에 이미드 결합을 포함하는 고분자의 총칭이다. 방향족 폴리이미드는, 방향족 화합물이 직접 이미드 결합으로 연결된 고분자를 의미한다. 방향족 폴리이미드는 방향족과 방향족이 이미드 결합을 통해 공역 구조를 갖기 때문에, 강직하고 강고한 분자 구조를 가지며, 또한, 이미드 결합이 강한 분자간력을 갖기 때문에 매우 높은 레벨의 열적, 기계적, 화학적 성질을 갖는다.
폴리이미드 다공질막은, 본 발명 전부터 필터, 저유전율 필름, 연료 전지용 전해질막 등, 특히 전지 관계를 중심으로 하는 용도를 위해서 이용되어 왔다. 특허문헌 7~9는, 특히, 기체 등의 물질 투과성이 우수하고, 공공률(空孔率)이 높은, 양 표면의 평활성이 우수하고, 상대적으로 강도가 높으며, 높은 공공률임에도 불구하고, 막 두께 방향으로의 압축 응력에 대한 내력이 우수한 매크로 보이드를 다수 갖는 폴리이미드 다공질막을 기재하고 있다.
일본 특허 공개 평성 제5-123168 일본 특허 공개 평성 제10-108673 일본 특허 공고 평성 제6-30570 일본 특허 공개 제2002-34551 일본 특허 제5140155호 일본 특허 공개 제2003-47464 WO2010/038873 일본 특허 공개 제2011-219585 일본 특허 공개 제2011-219586
Mortera-Blanco et al., Biomaterials 32(2011) 9263-9270 Daoud et al., Biomaterials 32(2011) 1536-1542 A. Bissoyi et al./Cryobiology 68(2014) 332-342
본 발명은 필요한 상황이나 형태에 맞춰 간편하고 또한 안정적으로 세포를 장기 배양하는 것이 가능하고, 배양 중의 변화에 대해서도 용이하게 대응할 수 있는 세포의 배양 방법, 및 상기 배양 방법에 사용하기 위한 세포 배양 장치 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 간편하고 또한 효율적으로, 세포의 동결 보존부터 세포의 해동(세포 깨움), 사용부터 재동결까지를 일관하여 실시할 수 있는, 세포의 동결 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 폴리이미드 다공질막을 이용하여 세포 배양을 실시함으로써, 세포를 효율적으로 장기간에 걸쳐 배양할 수 있는 것을 발견하였다.
한정되는 것은 아니지만, 본 발명은 바람직하게는 이하의 양태를 포함한다.
[양태 1]
세포의 장기 배양 방법으로서,
(1) 세포를 폴리이미드 다공질막에 적용하는 것과,
(2) 세포를 적용한 폴리이미드 다공질막을 세포 배양 배지에 적용하여, 30일 이상 세포를 배양하는 것
을 포함하는 방법.
[양태 2]
공정 (2)에 있어서, 60일 이상 세포를 배양하는, 양태 1에 기재된 방법.
[양태 3]
공정 (2)에 있어서, 120일 이상 세포를 배양하는, 양태 1에 기재된 방법.
[양태 4]
2 이상의 폴리이미드 다공질막을, 상하 또는 좌우로 세포 배양 배지 중에 적층하여 이용하는, 양태 1~3 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 5]
폴리이미드 다공질막을
ⅰ) 접어,
ⅱ) 롤형으로 감아,
ⅲ) 시트 혹은 소편을 실형의 구조체로 연결시켜, 혹은,
ⅳ) 새끼줄형으로 묶어
세포 배양 용기 중의 세포 배양 배지 중에서 부유 혹은 고정시켜 이용하는, 양태 1~4 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 6]
공정 (2)에 있어서의 배양에 있어서, 폴리이미드 다공질막의 일부분 또는 전체가, 세포 배양 배지의 액상과 접촉하고 있지 않은, 양태 1~5 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 7]
공정 (2)에 있어서의 배양에 있어서, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리이미드 다공질막 체적의 총합의 10000배 또는 그보다 작은, 양태 1~6 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 8]
공정 (2)에 있어서의 배양에 있어서, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리이미드 다공질막 체적의 총합의 100배 또는 그보다 작은, 양태 1~7 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 9]
공정 (2)에 있어서의 배양이, 세포 배양 용기 밖에 설치된 세포 배양 배지 공급 수단으로부터 연속적 또는 간헐적으로 세포 배양 배지가 세포 배양 용기 중에 공급되는 계에서 행해지는, 양태 1~8 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 10]
세포 배양 배지가 세포 배양 배지 공급 수단과 세포 배양 용기 사이를 순환하는, 양태 9에 기재된 방법.
[양태 11]
양태 9 또는 10에 기재된 방법으로서, 상기 계가, 세포 배양 용기인 배양 유닛과 세포 배양 배지 공급 수단인 배지 공급 유닛을 포함하는 세포 배양 장치이고, 여기서
배양 유닛은 세포를 담지하기 위한 1 또는 복수의 폴리이미드 다공질막을 수용하는 배양 유닛으로서, 배지 공급구 및 배지 배출구를 구비한 배양 유닛이며,
배지 공급 유닛은 배지 수납 용기와, 배지 공급 라인과, 배지 공급 라인을 통해 연속적 또는 간헐적으로 배지를 송액하는 송액 펌프를 구비하고, 여기서 배지 공급 라인의 제1 단부는 배지 수납 용기 내의 배지에 접촉하며, 배지 공급 라인의 제2 단부는 배양 유닛의 배지 공급구를 통해 배양 유닛 내에 연통되어 있는 배지 공급 유닛인
방법.
[양태 12]
배양 유닛이 공기 공급구, 공기 배출구, 및 산소 교환막을 구비하지 않는 배양 유닛인, 양태 13에 기재된 방법.
[양태 13]
배양 유닛이 배지 배출 라인을 더 구비하고, 여기서 배지 배출 라인의 제1 단부는 배지 수납 용기에 접속되며, 배지 배출 라인의 제2 단부는 배양 유닛의 배지 배출구를 통해 배양 유닛 내에 연통되어, 배지가 배지 공급 유닛과 배양 유닛을 순환 가능한, 양태 11 또는 12에 기재된 방법.
[양태 14]
세포가, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 세균으로 이루어지는 군에서 선택되는, 양태 1~13 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 15]
동물 세포가, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포인, 양태 14에 기재된 방법.
[양태 16]
세포가, CHO 세포, CHO-K1 세포주, CHO DP-12 세포주, CHO 세포 관련주, 베로(Vero) 세포, 및 MDCK 세포로 이루어지는 군에서 선택되는, 양태 15에 기재된 방법.
[양태 17]
폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인, 양태 1~16 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 18]
폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막인, 양태 17에 기재된 방법.
[양태 19]
폴리이미드 다공질막을 포함하는, 양태 1~18 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 세포 배양 장치.
[양태 20]
2 이상의 폴리이미드 다공질막이, 상하 또는 좌우로 적층되어 있는, 양태 19에 기재된 세포 배양 장치.
[양태 21]
폴리이미드 다공질막을 포함하는, 양태 1~13 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트.
[양태 22]
세포의 장기 배양 방법을 위한, 폴리이미드 다공질막의 용도.
[양태 23]
세포의 동결 보존 방법으로서,
(1) 세포를 폴리이미드 다공질막에 담지시키는 공정,
(2) 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막을, 세포가 동결하는 조건하에 둠으로써, 폴리이미드 다공질막에 담지된 세포를 동결하는 공정, 및
(3) 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막을, 동결 상태를 유지하는 조건에서 보존하는 공정
을 포함하는 방법.
[양태 24]
공정 (1)에 있어서, 세포를 폴리이미드 다공질막에 파종함으로써, 세포를 폴리이미드 다공질막에 담지시키는, 양태 23에 기재된 방법.
[양태 25]
공정 (1)에 있어서, 세포를 폴리이미드 다공질막에 파종하여 배양함으로써, 세포를 폴리이미드 다공질막에 담지시키는, 양태 23에 기재된 방법.
[양태 26]
공정 (3)에 이어서,
(4) 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막을, 세포가 해동하는 조건하에 둠으로써, 폴리이미드 다공질막에 담지된 세포를 해동하는 공정
을 더 포함하는, 양태 23~25 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 27]
공정 (4)에 이어서,
(5) 세포를 해동한 폴리이미드 다공질막을 세포 배양 배지에 적용하여, 세포를 배양하는 공정
을 더 포함하는, 양태 26에 기재된 방법.
[양태 28]
공정 (5)에 있어서, 배양한 세포가 폴리이미드 다공질막 밖에 있어서도 증식할 때까지 세포를 배양하는, 양태 27에 기재된 방법.
[양태 29]
공정 (5)에 있어서, 세포를 해동한 폴리이미드 다공질막과 함께, 세포를 담지시키고 있지 않은 다른 1 또는 복수의 폴리이미드 다공질막을 세포 배양 배지에 적용하여, 배양함으로써, 다른 1 또는 복수의 폴리이미드 다공질막에 세포를 담지시키는, 양태 27 또는 28에 기재된 방법.
[양태 30]
공정 (5)에 이어서,
(6) 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막의 일부 또는 전부를, 세포가 동결하는 조건하에 둠으로써, 폴리이미드 다공질막에 담지된 세포를 동결하는 공정, 및
(7) 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막을, 동결 상태를 유지하는 조건에서 보존하는 공정
을 더 포함하는, 양태 27~29 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 31]
공정 (1)~(7)을 복수 회 반복하는, 양태 30에 기재된 방법.
[양태 32]
세포가, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 세균으로 이루어지는 군에서 선택되는, 양태 23~31 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 33]
동물 세포가, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포인, 양태 32에 기재된 방법.
[양태 34]
세포가 부착성 세포인, 양태 32 또는 33에 기재된 방법.
[양태 35]
세포가 부유성 세포인, 양태 32 또는 33에 기재된 방법.
[양태 36]
폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인, 양태 23~35 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[양태 37]
폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막인, 양태 36에 기재된 방법.
[양태 38]
폴리이미드 다공질막이, 2개의 상이한 표층면과 매크로 보이드층을 갖는 다층 구조의 폴리이미드 다공질막인, 양태 36 또는 37에 기재된 방법.
[양태 39]
세포의 동결 보존을 위한 폴리이미드 다공질막.
[양태 40]
양태 23~28 중 어느 한 항에 기재된 방법에 이용하기 위한 폴리이미드 다공질막.
[양태 41]
폴리이미드 다공질막을 포함하는, 양태 23~38 중 어느 한 항에 기재된 방법에 이용하기 위한 키트.
[양태 42]
양태 23~38 중 어느 한 항에 기재된 방법을 위한 폴리이미드 다공질막의 용도.
본 발명은 폴리이미드 다공질막을 이용함으로써, 세포를 간편하고 또한 안정적으로 장기간 배양하는 것을 가능하게 한다. 본 발명에서는, 배양 담체가 되는 폴리이미드 다공질막이, 세포가 통과 가능한 대구경 연결 구멍을 갖기 때문에, 매우 대량의 세포가 그 공간에서 생식해도, 최종적으로 3차원적인 공간이 확보되어 있다. 따라서, 고전적인 평면 배양에 있어서 컨플루언트한 상태가 발생한 경우와 같은 배양 기간의 한계가 발생하기 어려워진다. 또한, 본 발명에서는, 세포의 배양 시에, 특히 폴리이미드 다공질막을 콜라겐 등에 의해 전처리할 필요는 없다. 또한, 폴리이미드 다공질막은 플렉시블한 박막 소재이기 때문에, 자유로운 형상으로 구부리거나 접거나 절단하거나 하는 것을 간편하게 할 수 있다. 따라서, 배양을 통해, 필요에 따라 언제나, 세포를 포함하는 폴리이미드 다공질막을 취출하여, 처리나 측정 등에 제공하는 것이 가능하다. 또한, 세포 배양의 자동화 등에도 응용 가능하다. 또한, 폴리이미드 다공질막은 매우 내열성이 우수한 소재이기 때문에, 멸균 등의 조작도 매우 간편하게 실시 가능하다.
폴리이미드 다공질막을 이용하여 세포를 동결함으로써, 효율적으로 대량의 세포를 동결 보존하여, 효율적으로 세포를 운용하는 것이 가능해진다. 동결 상태로부터 해동한 후에는, 그대로 폴리이미드 다공질막 상에서 세포 배양을 계속할 수 있다. 또한, 세포 배양을 계속하고 있는 폴리이미드 다공질막을, 세포가 육성되고 있지 않은 폴리이미드 다공질막 등의 다른 담체와 접촉시키거나, 또는 그 근방에 배치하여, 세포를 이동·증식시킬 수 있다. 세포의 이동 종료 후에는 원래의 폴리이미드 다공질막을 취출해서 재동결하여, 다음번의 사용까지 보존할 수도 있다. 이와 같이 하여, 세포 깨움으로부터 사용·동결까지의 일련의 조작을 동일한 소재로 실시하는 것이 가능해진다. 이들 작업에 있어서, 트립신 등의 세포 박리 작업이나, 콜라겐 코팅 등의 번잡한 작업은 특별히 필요가 없기 때문에, 작업은 간편하고 효율적이며, 신속한 조작이 가능해진다. 또한, 본 발명의 방법은, 자동화된 공정을 포함하는 용도에의 응용에도 적합하다. 효율면에 있어서도, 적어도 25 마이크로미터라고 하는 매우 얇은 막에 대량의 세포를 육성할 수 있기 때문에, 체적당 효율은, 지금까지 유래를 볼 수 없는 높은 것이 된다. 예컨대, 유망한 세포주 등을 이용하여 물질 산생을 행한 경우, 장기간의 사용에 더하여, 그대로 동결해서 세포를 보존하고, 필요한 시기에 재차 이용하는 것이 가능해진다. 유망 세포주의 라이브러리화 등도 용이하게 실행할 수 있다.
도 1은 폴리이미드 다공질막을 이용한 세포 배양의 모델도를 도시한다.
도 2는 세포 배양 장치의 일례를 도시한다.
도 3은 인간 피부 섬유아세포의 폴리이미드 다공질막을 이용하는 장기 배양의 결과를 도시한다.
도 4는 인간 피부 섬유아세포의 폴리이미드 다공질막을 이용하는 장기 배양의 결과를 도시한다.
도 5는 베로 세포의 폴리이미드 다공질막을 이용하는 장기 배양의 결과를 도시한다.
도 6은 폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포 동결 및 융해의 공정 개념도를 도시한다. 세포 현탁액의 동결·융해 프로세스와는 달리, 직접 세포 집합체를 폴리이미드 다공질막으로서 취급하는 것이 가능해지기 때문에, 비약적으로 원심 분리 등의 공정이 생략된다.
도 7은 폴리이미드 다공질막을 이용하는, 부유계 세포의 동결·융해 및 운용에 대해 개념도를 도시한다. 부유계 세포는, 증식의 프로세스에서 폴리이미드 다공질막으로부터 흘러나온다고 하는 특성을 살려, 샘플로서의 반복 사용에 관한 이점을 나타내고 있다.
도 8은 인간 피부 섬유아세포의 폴리이미드 다공질막을 이용하는 장기 배양의 결과를 도시한다.
도 9는 인간 피부 섬유아세포의 폴리이미드 다공질막을 이용하는 장기 배양의 결과를 도시한다.
도 10은 폴리이미드 다공질막을 이용하여 CHO DP-12 세포를 동결 후, 해동하여 배양한 결과를 도시한다.
도 11은 폴리이미드 다공질막을 이용하여 인간 피부 섬유아세포를 동결 후, 해동하여 배양한 결과를 도시한다.
I. 세포의 배양 방법
본 발명은 세포의 장기 배양 방법에 관한 것이다. 한편, 국제 출원 번호 PCT/JP2014/070407의 모든 내용을, 참조에 의해 본 명세서에 원용한다.
본 발명의 세포의 배양 방법은, 세포를 폴리이미드 다공질막에 적용하여, 배양하는 것을 포함한다. 본 발명자들은, 폴리이미드 다공질막이 세포의 접착, 배양에 적합한 것을 발견하고, 본 발명에 상도하였다. 본 발명의 방법은, 폴리이미드 다공질막에 세포를 적용하여, 폴리이미드막의 표면 또는 내부에서 세포를 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.
1. 세포의 폴리이미드 다공질막에의 적용
세포의 폴리이미드 다공질막에의 적용의 구체적인 공정은 특별히 한정되지 않는다. 본 명세서에 기재된 공정, 혹은, 세포를 막 형상의 담체에 적용하기에 적합한 임의의 수법을 채용하는 것이 가능하다. 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 방법에 있어서, 세포의 폴리이미드 다공질막에의 적용은, 예컨대, 이하와 같은 양태를 포함한다.
(A) 세포를 상기 폴리이미드 다공질막의 표면에 파종하는 공정을 포함하는 양태;
(B) 상기 폴리이미드 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 놓고,
방치하거나, 혹은 상기 폴리이미드 다공질막을 이동시켜 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극하여, 세포 현탁액을 상기 막에 흡입시키고, 그리고,
세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하며, 수분은 유출시키는
공정을 포함하는 양태; 및,
(C) 상기 폴리이미드 다공질막의 한쪽 면 또는 양면을, 세포 배양액 또는 멸균된 액체로 습윤하고,
상기 습윤한 폴리이미드 다공질막에 세포 현탁액을 장전하며, 그리고,
세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는
공정을 포함하는 양태.
(A)의 양태는, 폴리이미드 다공질막의 표면에 세포, 세포 덩어리를 직접 파종하는 것을 포함한다. 혹은, 폴리이미드 다공질막을 세포 현탁액 중에 넣고, 막의 표면으로부터 세포 배양액을 침윤시키는 양태도 포함한다.
폴리이미드 다공질막의 표면에 파종된 세포는, 폴리이미드 다공질막에 접착하여, 다공의 내부로 들어간다. 바람직하게는, 특별히 외부로부터 물리적 또는 화학적인 힘을 가하지 않아도, 세포는 폴리이미드 다공질막에 자발적으로 접착한다. 폴리이미드 다공질막의 표면에 파종된 세포는, 막의 표면 및/또는 내부에 있어서 안정적으로 생육·증식하는 것이 가능하다. 세포는 생육·증식하는 막의 위치에 따라, 여러 가지 상이한 형태를 취할 수 있다.
(B)의 양태에 있어서, 폴리이미드 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 놓는다. 폴리이미드 다공질막을 방치하거나, 혹은 상기 폴리이미드 다공질막을 이동시켜 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극하여, 세포 현탁액을 상기 막에 흡입시킴으로써, 세포 현탁액이 막 중에 침투한다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 이것은 폴리이미드 다공질막의 각 표면 형상 등에서 유래하는 성질에 의한 것이라고 생각된다. 본 양태에 의해, 막의 세포 현탁액이 장전된 부위에 세포가 흡입되어 파종된다.
혹은, (C)의 양태와 같이, 상기 폴리이미드 다공질막의 한쪽 면 또는 양면의 부분 또는 전체를, 세포 배양액 또는 멸균된 액체로 습윤하고 나서, 습윤한 폴리이미드 다공질막에 세포 현탁액을 장전해도 좋다. 이 경우, 세포 현탁액의 통과 속도는 크게 향상된다.
예컨대, 막의 비산 방지를 주목적으로 하여 막 극히 일부를 습윤시키는 방법(이후, 이것을 「일점 웨트법」이라고 기재한다)을 이용할 수 있다. 일점 웨트법은, 실질적으로는 막을 습윤시키지 않는 드라이법((B)의 양태)에 거의 가까운 것이다. 단, 습윤시킨 작은 부분에 대해서는, 세포액의 막 투과가 신속해진다고 생각된다. 또한, 폴리이미드 다공질막의 한쪽 면 또는 양면의 전체를 충분히 습윤시킨 것(이후, 이것을 「웨트막」이라고 기재한다)에 세포 현탁액을 장전하는 방법도 이용할 수 있다(이후, 이것을 「웨트막법」이라고 기재한다). 이 경우, 폴리이미드 다공질막 전체에 있어서, 세포 현탁액의 통과 속도가 크게 향상된다.
(B) 및 (C)의 양태에 있어서, 세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시킨다. 이에 의해 세포 현탁액 중의 세포의 농도를 농축시키고, 세포 이외의 불필요한 성분을 수분과 함께 유출시키는 등의 처리도 가능해진다.
(A)의 양태를 「자연 파종」 (B) 및 (C)의 양태를 「흡입 파종」이라고 호칭하는 경우가 있다.
한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는, 폴리이미드 다공질막에는 생세포가 선택적으로 머문다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태에 있어서, 생세포가 상기 폴리이미드 다공질막 내에 머물고, 사세포는 우선적으로 수분과 함께 유출된다.
양태 (C)에 있어서 이용하는 멸균된 액체는 특별히 한정되지 않으나, 멸균된 완충액 또는 멸균수이다. 완충액은, 예컨대, (+) 및 (-) 둘베코 PBS(Dulbecco's PBS), (+) 및 (-) 행크 평형 염류 용액(Hank's Balanced Salt Solution) 등이다. 완충액의 예를 이하의 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
또한, 본 발명의 방법에 있어서, 세포의 폴리이미드 다공질막에의 적용은, 부유 상태에 있는 접착성 세포를 폴리이미드 다공질막과 현탁적으로 공존시킴으로써 세포를 막에 부착시키는 양태(포박)도 포함한다. 예컨대, 본 발명의 세포의 배양 방법에 있어서, 세포를 폴리이미드 다공질막에 적용하기 위해서, 세포 배양 용기 중에, 세포 배양 배지, 세포 및 1 또는 그 이상의 상기 폴리이미드 다공질막을 넣어도 좋다. 세포 배양 배지가 액체인 경우 폴리이미드 다공질막은 세포 배양 배지 중에 부유한 상태이다. 폴리이미드 다공질막의 성질로부터, 세포는 폴리이미드 다공질막에 접착할 수 있다. 따라서, 본디부터 부유 배양에 적합하지 않은 세포여도, 폴리이미드 다공질막은 세포 배양 배지 중에 부유한 상태로 배양하는 것이 가능하다. 바람직하게는, 세포는, 폴리이미드 다공질막에 자발적으로 접착한다. 「자발적으로 접착한다」란, 특별히 외부로부터 물리적 또는 화학적인 힘을 가하지 않아도, 세포가 폴리이미드 다공질막의 표면 또는 내부에 머무는 것을 의미한다.
세포 배양은, 세포 배양에 있어서의 존재 형태에 따라 배양 세포는 접착 배양계 세포와 부유 배양계 세포로 분류할 수 있다. 접착 배양계 세포는 배양 용기에 부착되어 증식하는 배양 세포이며, 계대에는 배지 교환을 행한다. 부유 배양계 세포는 배지 중에 있어서 부유 상태로 증식하는 배양 세포이며, 일반적으로는 계대 시에는 배지 교환은 행하지 않고, 희석 배양을 행한다. 부유 배양은, 부유 상태, 즉 액체 중에서의 배양이 가능하기 때문에, 대량 배양이 가능하고, 배양 용기 표면에만 생육하는 부착 세포와 비교하면, 입체적인 배양이기 때문에, 단위 공간당의 배양 가능 세포수는 많다고 하는 이점이 있다.
본 발명의 장기 배양 방법에 있어서, 폴리이미드 다공질막을 세포 배양 배지 중에 부유한 상태로 이용하는 경우, 2 이상의 상기 폴리이미드 다공질막의 소편을 이용해도 좋다. 폴리이미드 다공질막은 플렉시블한 박막이기 때문에, 예컨대 그 소편을 배양액 중에 부유시켜 이용함으로써, 일정 용량의 세포 배양 배지 중에 많은 표면적을 갖는 폴리이미드 다공질막을 반입하는 것이 가능해진다. 통상 배양의 경우, 용기 바닥 면적이 세포 배양 가능한 면적의 상한이 되지만, 본 발명의 폴리이미드 다공질막을 이용한 세포 배양에서는, 앞서 반입된 폴리이미드 다공질막의 대표면적 전체가 세포 배양 가능한 면적이 된다. 폴리이미드 다공질막은 세포 배양액을 통과시키기 때문에, 예컨대 접혀진 막 내에도 영양이나 산소 등의 공급이 가능해진다.
폴리이미드 다공질막의 소편의 크기, 형상은, 특별히 한정되지 않는다. 형상은, 원, 타원형, 사각, 삼각, 다각형, 끈형 등 임의의 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 폴리이미드 다공질막은 유연성이 있기 때문에 형상을 변화시켜 이용할 수 있다. 폴리이미드 다공질막을 평면형이 아니라, 입체형으로 형상을 가공하여 이용해도 좋다. 예컨대, 폴리이미드 다공질막을, ⅰ) 접어, ⅱ) 롤형으로 감아, ⅲ) 시트 혹은 소편을 실형의 구조체로 연결시켜, 혹은, ⅳ) 새끼줄형으로 묶어, 세포 배양 용기 중의 세포 배양 배지 중에서 부유 혹은 고정시켜도 좋다. ⅰ)~ⅳ)와 같이 형상을 가공함으로써, 소편을 이용하는 경우와 마찬가지로, 일정 용량의 세포 배양 배지 중에 많은 폴리이미드 다공질막을 넣을 수 있다. 또한, 각 소편을 집합체로서 취급할 수 있기 때문에, 세포체를 집합화하여 이동시키는 것이 가능해지며, 종합적인 응용성이 높다.
소편 집합체와 동일한 사고 방식으로서, 2 이상의 폴리이미드 다공질막을, 상하 또는 좌우로 세포 배양 배지 중에 적층하여 이용해도 좋다. 적층이란, 폴리이미드 다공질막이 일부 겹쳐지는 양태도 포함한다. 적층 배양에 의해, 좁은 스페이스에서 고밀도로 세포를 배양하는 것이 가능해진다. 이미 세포가 육성되고 있는 막 상에 또한 막을 적층시켜 설치하여 별종 세포와의 다층계를 형성하는 것도 가능하다. 적층하는 폴리이미드 다공질막의 수는 특별히 한정되지 않는다.
전술한 본 발명의 세포의 배양 방법을, 2종류 또는 그보다 많은 방법을 조합하여 이용해도 좋다. 예컨대, 양태 (A)~(C) 중 어느 하나의 방법을 이용하여 먼저 폴리이미드 다공질막에 세포를 적용하고, 계속해서, 세포가 접착한 폴리이미드 다공질막을 부유 배양해도 좋다. 혹은, 폴리이미드 다공질막에 적용하는 공정으로서, 상기 양태 (A)~(C) 중 어느 방법을 2종류 또는 그보다 많이 조합하여 이용해도 좋다.
본 발명의 장기 배양 방법에 있어서, 바람직하게는, 세포는 폴리이미드 다공질막의 표면 및 내부에 생육하여 증식한다.
본 발명의 장기 배양 방법에 의해, 세포는 종래와 같이 트립신 처리 등을 행하는 계대 조작을 행하지 않고, 30일 이상, 60일 이상, 120일 이상, 200일 이상, 또는 300일 이상의 장기에 걸쳐 배양할 수 있다. 또한, 본 발명의 장기 배양 방법에 의해, 종래의 평면 배양으로 배양할 수 있는 기간 이상, 예컨대, 평면 배양 기간의 1.5배 이상, 2배 이상, 2.5배 이상, 3배 이상, 3.5배 이상, 4배 이상, 4.5배 이상의 기간, 세포를 배양할 수 있다. 본 발명에 의하면, 샬레 등의 평면 배양에서의 장기간의 세포 배양에서 발생하는 세포의 박리나 사멸 등을 발생시키지 않고, 휴지(休止) 상태가 아니라 동적인 생명을 장기간 유지할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 장기 배양한 세포여도 셀 바이어빌리티(cell viability) 또는 세포의 성질(예컨대, 분화 유도 효율, 세포 표면 마커의 발현량 등)이, 장기 배양 전의 세포와 비교하여 거의 변화하지 않는다. 또한, 본 발명에 의하면, 세포가 폴리이미드 다공질막 내에 있어서 3차원적으로 증식하기 때문에, 종래의 평면 배양에서 보여지는 것과 같은 배양 영역의 제한 및 평면 환경에 의해 일어나는 접촉 저지(contact inhibition)가 발생하기 어렵기 때문에, 장기간, 생육시키는 배양이 가능해진다. 또한, 본 발명에 의하면, 세포가 접착한 폴리이미드 다공질막에 다른 폴리이미드 다공질막을 접촉시킴으로써, 세포 배양 가능한 공간을 임의로 증가하는 것이 가능하며, 종래와 같은 트립신 처리를 동반한 계대 조작을 행하지 않고, 접촉 저지가 야기되는 컨플루언트 상태를 회피하면서 장기간, 증식시키는 배양이 가능해진다. 또한, 본 발명에 의하면, 세포를 동결 등 행하지 않고, 산 채로 장기간 보존한다고 하는 새로운 보존 방법까지도 제공하는 것이다.
2. 세포
본 발명의 방법에 이용할 수 있는 세포의 종류는 특별히 한정되지 않고, 임의의 세포의 증식에 이용 가능하다.
예컨대, 세포는, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 세균으로 이루어지는 군에서 선택된다. 동물 세포는, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포와 무척추 동물(척추 동물문에 속하는 동물 이외의 동물) 유래의 세포로 크게 나뉜다. 본 명세서에 있어서의, 동물 세포의 유래는 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포를 의미한다. 척추 동물문은, 무악상강(無顎上綱)과 악구상강(顎口上綱)을 포함하고, 악구상강은, 포유강, 조강, 양서강, 파충강 등을 포함한다. 바람직하게는, 일반적으로, 포유 동물이라고 말해지는 포유강에 속하는 동물 유래의 세포이다. 포유 동물은, 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는, 마우스, 래트, 인간, 원숭이, 돼지, 개, 양, 염소 등을 포함한다.
본 명세서에 있어서의 식물 세포의 유래는 특별히 한정되지 않는다. 이끼 식물, 양치 식물, 종자 식물을 포함하는 식물의 세포가 대상이 된다.
종자 식물 세포가 유래하는 식물은, 단자엽 식물, 쌍자엽 식물의 어느 것이나 포함된다. 한정되는 것은 아니지만, 단자엽 식물에는, 난초과 식물, 벼과 식물(벼, 옥수수, 대맥, 소맥, 수수 등), 사초과 식물 등이 포함된다. 쌍자엽 식물에는, 국화아강, 목련아강, 장미아강 등 대부분의 아강에 속하는 식물이 포함된다.
조류(藻類)도, 세포 유래 생물로서 간주할 수 있다. 진정 세균인 시아노박테리아(남조(藍藻))로부터, 진핵 생물이고 단세포 생물인 것(규조, 황녹조, 와편모조(渦鞭毛藻) 등) 및 다세포 생물인 해조류(홍조, 갈조, 녹조) 등의 상이한 그룹을 포함한다.
본 명세서에 있어서의 고세균(古細菌) 및 세균의 종류도 특별히 한정되지 않는다. 고세균은, 메탄균·고도 호염균·호열 호산균·초호열균 등으로 이루어지는 군으로 구성된다. 세균은, 예컨대, 유산균, 대장균, 고초균 및 시아노박테리아 등으로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 발명의 방법에 이용할 수 있는 동물 세포 또는 식물 세포의 종류는, 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는, 다능성 줄기 세포, 조직 줄기 세포, 체세포, 및 생식 세포로 이루어지는 군에서 선택된다.
본 발명에 있어서 「다능성 줄기 세포」란, 모든 조직의 세포로 분화하는 능력(분화 다능성)을 갖는 줄기 세포를 총칭하는 것을 의도한다. 한정되는 것은 아니지만, 다능성 줄기 세포는, 배아 줄기 세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 배아 생식 줄기 세포(EG 세포), 생식 줄기 세포(GS 세포) 등을 포함한다. 바람직하게는, ES 세포 또는 iPS 세포이다. iPS 세포는 윤리적인 문제도 없는 등의 이유에 의해 특히 바람직하다. 다능성 줄기 세포로서는 공지된 임의의 것을 사용 가능하지만, 예컨대, 국제 공개 WO2009/123349(PCT/JP2009/057041)에 기재된 다능성 줄기 세포를 사용 가능하다.
「조직 줄기 세포」란, 분화 가능한 세포 계열이 특정한 조직에 한정되어 있으나, 다양한 세포종으로 분화 가능한 능력(분화 다능성)을 갖는 줄기 세포를 의미한다. 예컨대 골수 중의 조혈 줄기 세포는 혈구의 기초가 되고, 신경 줄기 세포는 신경 세포로 분화한다. 그 외에도 간장을 만드는 간 줄기 세포, 피부 조직이 되는 피부 줄기 세포 등 여러 가지 종류가 있다. 바람직하게는, 조직 줄기 세포는, 간엽계 줄기 세포, 간 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 또는 조혈 줄기 세포에서 선택된다.
「체세포」란, 다세포 생물을 구성하는 세포 중 생식 세포 이외의 세포를 말한다. 유성 생식에 있어서는 차세대에는 계승되지 않는다. 바람직하게는, 체세포는, 간 세포, 췌장 세포, 근세포, 골세포, 골아 세포, 파골 세포, 연골 세포, 지방 세포, 피부 세포, 섬유아세포, 췌장 세포, 신장 세포, 폐 세포, 또는, 림프구, 적혈구, 백혈구, 단구(單球), 매크로파지 또는 거핵구의 혈구 세포에서 선택된다.
「생식 세포」는, 생식에 있어서 유전 정보를 차세대에 전달하는 역할을 갖는 세포를 의미한다. 예컨대, 유성 생식을 위한 배우자, 즉 난자, 난세포, 정자, 정세포, 무성 생식을 위한 포자 등을 포함한다.
세포는, 육종(肉腫) 세포, 주화 세포 및 형질 전환 세포로 이루어지는 군에서 선택해도 좋다. 「육종」이란, 뼈, 연골, 지방, 근육, 혈액 등의 비상피성 세포 유래의 결합 조직 세포에 발생하는 암으로, 연부육종, 악성 골종양 등을 포함한다. 육종 세포는, 육종에서 유래하는 세포이다. 「주화 세포」란, 장기간에 걸쳐 체외에서 유지되고, 일정한 안정된 성질을 갖기에 이르며, 반영구적인 계대 배양이 가능해진 배양 세포를 의미한다. PC12 세포(래트 부신수질 유래), CHO 세포(차이니스 햄스터 난소 유래), HEK293 세포(인간 태아 신장 유래), HL-60 세포(인간 백혈구 세포 유래), HeLa 세포(인간 자궁 경부암 유래), 베로 세포(아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 세포 유래), MDCK 세포(개 신장 세뇨관 상피 세포 유래), HepG2 세포(인간 간암 유래) 등 인간을 포함하는 여러 가지 생물종의 여러 가지 조직에서 유래하는 세포주가 존재한다. 「형질 전환 세포」는, 세포 외부로부터 핵산(DNA 등)을 도입하여, 유전적 성질을 변화시킨 세포를 의미한다. 동물 세포, 식물 세포, 세균의 형질 전환에 대해서는, 각각 적합한 방법이 공지되어 있다.
3. 폴리이미드 다공질막
폴리이미드란, 반복 단위에 이미드 결합을 포함하는 고분자의 총칭이며, 통상은, 방향족 화합물이 직접 이미드 결합으로 연결된 방향족 폴리이미드를 의미한다. 방향족 폴리이미드는 방향족과 방향족이 이미드 결합을 통해 공역 구조를 갖기 때문에, 강직하고 강고한 분자 구조를 가지며, 또한, 이미드 결합이 강한 분자간력을 갖기 때문에 매우 높은 레벨의 열적, 기계적, 화학적 성질을 갖는다.
본 발명에 있어서 이용하는 폴리이미드 다공질막은, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 (주된 성분으로서) 포함하는 폴리이미드 다공질막이며, 보다 바람직하게는 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드로 이루어지는 폴리이미드 다공질막이다. 「주된 성분으로서 포함한다」란, 폴리이미드 다공질막의 구성 성분으로서, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드 이외의 성분은, 본질적으로 포함하지 않거나, 혹은 포함되어 있어도 좋으나, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드의 성질에 영향을 주지 않는 부가적인 성분인 것을 의미한다.
테트라카르복실산 성분과 디아민 성분으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막도 포함된다.
폴리아믹산
폴리아믹산은, 테트라카르복실산 성분과 디아민 성분을 중합하여 얻어진다. 폴리아믹산은, 열 이미드화 또는 화학 이미드화함으로써 폐환(閉環)되어 폴리이미드로 할 수 있는 폴리이미드 전구체이다.
폴리아믹산은, 아믹산의 일부가 이미드화되어 있어도, 본 발명에 영향을 미치지 않는 범위이면 그것을 이용할 수 있다. 즉, 폴리아믹산은, 부분적으로 열 이미드화 또는 화학 이미드화되어 있어도 좋다.
폴리아믹산을 열 이미드화하는 경우에는, 필요에 따라, 이미드화 촉매, 유기 인 함유 화합물, 무기 미립자, 유기 미립자 등의 미립자 등을 폴리아믹산 용액에 첨가할 수 있다. 또한, 폴리아믹산을 화학 이미드화하는 경우에는, 필요에 따라, 화학 이미드화제, 탈수제, 무기 미립자, 유기 미립자 등의 미립자 등을 폴리아믹산 용액에 첨가할 수 있다. 폴리아믹산 용액에 상기 성분을 배합해도, 착색 전구체가 석출되지 않는 조건에서 행하는 것이 바람직하다.
착색 전구체
본 발명에 있어서 착색 전구체란, 250℃ 이상의 열처리에 의해 일부 또는 전부가 탄화하여 착색화물을 생성하는 전구체를 의미한다.
본 발명에서 이용되는 착색 전구체로서는, 폴리아믹산 용액 또는 폴리이미드 용액에 균일하게 용해 또는 분산되고, 250℃ 이상, 바람직하게는 260℃ 이상, 더욱 바람직하게는 280℃ 이상, 보다 바람직하게는 300℃ 이상의 열처리, 바람직하게는 공기 등의 산소 존재하에서의 250℃ 이상, 바람직하게는 260℃ 이상, 더욱 바람직하게는 280℃ 이상, 보다 바람직하게는 300℃ 이상의 열처리에 의해 열분해하며, 탄화하여 착색화물을 생성하는 것이 바람직하고, 흑색계의 착색화물을 생성하는 것이 보다 바람직하며, 탄소계 착색 전구체가 보다 바람직하다.
착색 전구체는, 가열해 가면 언뜻 보아 탄소화물로 보이는 것이 되지만, 조직적으로는 탄소 이외의 이원소(異元素)를 포함하며, 층 구조, 방향족 가교 구조, 사면체 탄소를 포함하는 무질서 구조의 것을 포함한다.
탄소계 착색 전구체는 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 석유 타르, 석유 피치, 석탄 타르, 석탄 피치 등의 타르 또는 피치, 코크스, 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체, 페로센 화합물(페로센 및 페로센 유도체) 등을 들 수 있다. 이들 중에서는, 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체 및/또는 페로센 화합물이 바람직하고, 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체로서는 폴리아크릴로니트릴이 바람직하다.
테트라카르복실산 이무수물은, 임의의 테트라카르복실산 이무수물을 이용할 수 있고, 원하는 특성 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 테트라카르복실산 이무수물의 구체예로서, 피로멜리트산 이무수물, 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산 이무수물(s-BPDA), 2,3,3',4'-비페닐테트라카르복실산 이무수물(a-BPDA) 등의 비페닐테트라카르복실산 이무수물, 옥시디프탈산 이무수물, 디페닐술폰-3,4,3',4'-테트라카르복실산 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)술피드 이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판 이무수물, 2,3,3',4'-벤조페논테트라카르복실산 이무수물, 3,3',4,4'-벤조페논테트라카르복실산 이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)메탄 이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)프로판 이무수물, p-페닐렌비스(트리멜리트산모노에스테르산 무수물), p-비페닐렌비스(트리멜리트산모노에스테르산 무수물), m-터페닐-3,4,3',4'-테트라카르복실산 이무수물, p-터페닐-3,4,3',4'-테트라카르복실산 이무수물, 1,3-비스(3,4-디카르복시페녹시)벤젠 이무수물, 1,4-비스(3,4-디카르복시페녹시)벤젠 이무수물, 1,4-비스(3,4-디카르복시페녹시)비페닐 이무수물, 2,2-비스〔(3,4-디카르복시페녹시)페닐〕프로판 이무수물, 2,3,6,7-나프탈렌테트라카르복실산 이무수물, 1,4,5,8-나프탈렌테트라카르복실산 이무수물, 4,4'-(2,2-헥사플루오로이소프로필리덴)디프탈산 이무수물 등을 들 수 있다. 또한, 2,3,3',4'-디페닐술폰테트라카르복실산 등의 방향족 테트라카르복실산을 이용하는 것도 바람직하다. 이들은 단독으로도, 2종 이상을 조합하여 이용할 수도 있다.
이들 중에서도, 특히, 비페닐테트라카르복실산 이무수물 및 피로멜리트산 이무수물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 일종의 방향족 테트라카르복실산 이무수물이 바람직하다. 비페닐테트라카르복실산 이무수물로서는, 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산 이무수물을 적합하게 이용할 수 있다.
디아민은, 임의의 디아민을 이용할 수 있다. 디아민의 구체예로서, 이하의 것을 들 수 있다.
1) 1,4-디아미노벤젠(파라페닐렌디아민), 1,3-디아미노벤젠, 2,4-디아미노톨루엔, 2,6-디아미노톨루엔 등의 벤젠핵 1개의 벤젠디아민;
2) 4,4'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르 등의 디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3'-디메틸-4,4'-디아미노비페닐, 2,2'-디메틸-4,4'-디아미노비페닐, 2,2'-비스(트리플루오로메틸)-4,4'-디아미노비페닐, 3,3'-디메틸-4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3'-디카르복시-4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3',5,5'-테트라메틸-4,4'-디아미노디페닐메탄, 비스(4-아미노페닐)술피드, 4,4'-디아미노벤즈아닐리드, 3,3'-디클로로벤지딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 2,2'-디메틸벤지딘, 3,3'-디메톡시벤지딘, 2,2'-디메톡시벤지딘, 3,3'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐에테르, 3,3'-디아미노디페닐술피드, 3,4'-디아미노디페닐술피드, 4,4'-디아미노디페닐술피드, 3,3'-디아미노디페닐술폰, 3,4'-디아미노디페닐술폰, 4,4'-디아미노디페닐술폰, 3,3'-디아미노벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디클로로벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디메톡시벤조페논, 3,3'-디아미노디페닐메탄, 3,4'-디아미노디페닐메탄, 4,4'-디아미노디페닐메탄, 2,2-비스(3-아미노페닐)프로판, 2,2-비스(4-아미노페닐)프로판, 2,2-비스(3-아미노페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스(4-아미노페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 3,3'-디아미노디페닐술폭시드, 3,4'-디아미노디페닐술폭시드, 4,4'-디아미노디페닐술폭시드 등의 벤젠핵 2개의 디아민;
3) 1,3-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,3-비스(3-아미노페녹시)-4-트리플루오로메틸벤젠, 3,3'-디아미노-4-(4-페닐)페녹시벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디(4-페닐페녹시)벤조페논, 1,3-비스(3-아미노페닐술피드)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐술피드)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐술피드)벤젠, 1,3-비스(3-아미노페닐술폰)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐술폰)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐술폰)벤젠, 1,3-비스〔2-(4-아미노페닐)이소프로필〕벤젠, 1,4-비스〔2-(3-아미노페닐)이소프로필〕벤젠, 1,4-비스〔2-(4-아미노페닐)이소프로필〕벤젠 등의 벤젠핵 3개의 디아민;
4) 3,3'-비스(3-아미노페녹시)비페닐, 3,3'-비스(4-아미노페녹시)비페닐, 4,4'-비스(3-아미노페녹시)비페닐, 4,4'-비스(4-아미노페녹시)비페닐, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕메탄, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕메탄, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕메탄, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕메탄, 2,2-비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판 등의 벤젠핵 4개의 디아민.
이들은 단독으로도, 2종 이상을 혼합하여 이용할 수도 있다. 이용하는 디아민은, 원하는 특성 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
이들 중에서도, 방향족 디아민 화합물이 바람직하고, 3,3'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐에테르 및 파라페닐렌디아민, 1,3-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페녹시)벤젠을 적합하게 이용할 수 있다. 특히, 벤젠디아민, 디아미노디페닐에테르 및 비스(아미노페녹시)페닐로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 일종의 디아민이 바람직하다.
폴리이미드 다공질막은, 내열성, 고온하에서의 치수 안정성의 관점에서, 유리 전이 온도가 240℃ 이상이거나, 또는 300℃ 이상에서 명확한 전이점이 없는 테트라카르복실산 이무수물과 디아민을 조합하여 얻어지는 폴리이미드로 형성되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 폴리이미드 다공질막은, 내열성, 고온하에서의 치수 안정성의 관점에서, 이하의 방향족 폴리이미드로 이루어지는 폴리이미드 다공질막인 것이 바람직하다.
(ⅰ) 비페닐테트라카르복실산 단위 및 피로멜리트산 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 일종의 테트라카르복실산 단위와, 방향족 디아민 단위로 이루어지는 방향족 폴리이미드,
(ⅱ) 테트라카르복실산 단위와, 벤젠디아민 단위, 디아미노디페닐에테르 단위 및 비스(아미노페녹시)페닐 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 일종의 방향족 디아민 단위로 이루어지는 방향족 폴리이미드,
및/또는,
(ⅲ) 비페닐테트라카르복실산 단위 및 피로멜리트산 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 일종의 테트라카르복실산 단위와, 벤젠디아민 단위, 디아미노디페닐에테르 단위 및 비스(아미노페녹시)페닐 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 일종의 방향족 디아민 단위로 이루어지는 방향족 폴리이미드.
한정되는 것은 아니지만, 폴리이미드 다공질막으로서, 적어도, 2개의 표면층(A면 및 B면)과, 상기 2개의 표면층 사이에 끼워진 매크로 보이드층을 갖는 다층 구조의 폴리이미드 다공질막을, 본 발명의 방법에 사용하는 것이 가능하다. 바람직하게는, 폴리이미드 다공질막은, 상기 매크로 보이드층이, 상기 표면층(A면 및 B면)에 결합한 격벽과, 상기 격벽 및 상기 표면층(A면 및 B면)에 둘러싸인, 막 평면 방향의 평균 공경이 10~500 ㎛인 복수의 매크로 보이드를 갖고, 상기한 매크로 보이드층의 격벽, 및 상기 표면층(A면 및 B면)은 각각, 두께가 0.01~20 ㎛이며, 평균 공경 0.01~100 ㎛의 복수의 구멍을 갖고, 상기 세공(細孔)끼리가 연통되어도 좋으며, 또한 상기 매크로 보이드에 연통되어 부분적 혹은 전면적으로 다층 구조를 갖고 있고, 그리고, 총 막 두께가 5~500 ㎛이며, 공공률이 40% 이상 95% 미만인 폴리이미드 다공질막이다.
본 발명에 있어서 이용되는 폴리이미드 다공질막의 총 막 두께는, 한정되는 것은 아니지만, 일 양태로서 20~75 ㎛로 해도 좋다. 막 두께의 차이에 의해, 세포의 증식 속도, 세포의 형태, 면 내에 있어서의 세포의 포화도 등에 차이가 관찰될 수 있다.
본 발명에 있어서, 2개의 상이한 표면층(A면 및 B면)과, 상기 2개의 표면층 사이에 끼워진 매크로 보이드층을 갖는 폴리이미드 다공질막이 사용되는 경우, A면에 존재하는 구멍의 평균 공경은, B면에 존재하는 구멍의 평균 공경과 차이가 있어도 좋다. 바람직하게는, A면에 존재하는 구멍의 평균 공경은, B면에 존재하는 구멍의 평균 공경보다 작다. 보다 바람직하게는, A면에 존재하는 구멍의 평균 공경이 B면에 존재하는 구멍의 평균 공경보다 작고, A면에 존재하는 구멍의 평균 공경이 0.01 ㎛~50 ㎛, 0.01 ㎛~40 ㎛, 0.01 ㎛~30 ㎛, 0.01 ㎛~20 ㎛, 또는 0.01 ㎛~15 ㎛이며, B면에 존재하는 구멍의 평균 공경이 20 ㎛~100 ㎛, 30 ㎛~100 ㎛, 40 ㎛~100 ㎛, 50 ㎛~100 ㎛, 또는 60 ㎛~100 ㎛이다. 특히 바람직하게는, 폴리이미드 다공질막의 A면이 평균 공경 15 ㎛ 이하, 예컨대 0.01 ㎛~15 ㎛의 작은 구멍을 갖는 메시 구조이고, B면이 평균 공경 20 ㎛ 이상, 예컨대 20 ㎛~100 ㎛의 큰 구멍 구조이다.
본 발명에 있어서 이용되는 폴리이미드 다공질막의 총 막 두께의 측정은, 접촉식의 두께계로 행할 수 있다.
폴리이미드 다공질막 표면의 평균 공경은, 다공질막 표면의 주사형 전자 현미경 사진으로부터, 200점 이상의 개공부에 대해 구멍 면적을 측정하고, 상기 구멍 면적의 평균값으로부터 하기 식 (1)에 따라 구멍의 형상이 둥근 원이라고 했을 때의 평균 직경을 계산으로부터 구할 수 있다.
Figure pct00002
(식 중, Sa는 구멍 면적의 평균값을 의미한다.)
본 발명에 있어서 이용되는 폴리이미드 다공질막의 공공률은, 소정의 크기로 잘라낸 다공질 필름의 막 두께 및 질량을 측정하고, 단위 중량 질량으로부터 하기 식 (2)에 따라 구할 수 있다.
Figure pct00003
(식 중, S는 다공질 필름의 면적, d는 총 막 두께, w는 측정한 질량, D는 폴리이미드의 밀도를 각각 의미한다. 폴리이미드의 밀도는 1.34 g/㎤로 한다.)
예컨대, 국제 공개 WO2010/038873, 일본 특허 공개 제2011-219585, 또는 일본 특허 공개 제2011-219586에 기재되어 있는 폴리이미드 다공질막도, 본 발명의 방법에 사용 가능하다.
폴리이미드 다공질막의 표면에 파종된 세포는, 막의 표면 및/또는 내부에 있어서 안정적으로 생육·증식하는 것이 가능하다. 세포는 막 중의 생육·증식하는 위치에 따라, 여러 가지 상이한 형태를 취할 수 있다. 본 발명의 일 양태에 있어서, 세포의 종류에 따라, 폴리이미드 다공질막의 표면 및 내부를 이동하면서, 형상을 변화시키면서 증식하는 경우도 있다.
본 발명의 방법에 있어서 세포를 적용하는 폴리이미드 다공질막은, 당연히, 적용하는 것 이외의 세포를 포함하지 않는 상태, 즉, 멸균되어 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법은, 바람직하게는, 폴리이미드 다공질막을 미리 멸균하는 공정을 포함한다. 폴리이미드 다공질막은, 내열성이 매우 우수하고, 경량이며, 형태·크기도 자유롭게 선택 가능하고, 멸균 처리가 용이하다. 건열 멸균, 증기 멸균, 에탄올 등 소독제에 의한 멸균, 자외선이나 감마선 등의 전자파 멸균 등 임의의 멸균 처리가 가능하다.
4. 세포 배양과 배양 체적
폴리이미드 다공질막을 이용한 세포 배양의 모델도를 도 1에 도시한다. 본 발명의 방법에서는, 세포 배양에 이용하는 배지의 양을 종래의 방법보다 대폭 줄이면서, 대량의 세포를 배양하는 것이 가능해진다. 예컨대, 폴리이미드 다공질막의 일부분 또는 전체가, 세포 배양 배지의 액상과 접촉하고 있지 않은 상태여도, 대량의 세포를 장기에 걸쳐 배양할 수 있다. 또한, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리이미드 다공질막 체적의 총합에 대해, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적을 현저히 줄이는 것도 가능해진다.
본 명세서에 있어서, 세포를 포함하지 않는 폴리이미드 다공질막이 그 내부 간극의 체적도 포함하여 공간 중에 차지하는 체적을 「외관상 폴리이미드 다공질막 체적」이라고 호칭한다(도 1의 좌측의 상태). 그리고, 폴리이미드 다공질막에 세포를 적용하여, 폴리이미드 다공질막의 표면 및 내부에 세포가 담지된 상태에 있어서, 폴리이미드 다공질막, 세포, 및 폴리이미드 다공질막 내부에 침윤한 배지가 전체로서 공간 중에 차지하는 체적을 「세포 생존 영역을 포함하는 폴리이미드 다공질막 체적」이라고 호칭한다(도 1의 우측의 상태). 막 두께 25 ㎛의 폴리이미드 다공질막의 경우, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리이미드 다공질막 체적은, 외관상 폴리이미드 다공질막 체적보다, 최대로 50% 정도 큰 값이 된다. 본 발명의 방법에서는, 하나의 세포 배양 용기 중에 복수의 폴리이미드 다공질막을 수용하여 배양할 수 있으나, 그 경우, 세포를 담지한 복수의 폴리이미드 다공질막의 각각에 대한 세포 생존 영역을 포함하는 폴리이미드 다공질막 체적의 총합을, 간단히 「세포 생존 영역을 포함하는 폴리이미드 다공질막 체적의 총합」이라고 기재하는 경우가 있다.
본 발명의 방법을 이용함으로써, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리이미드 다공질막 체적의 총합의 10000배 또는 그보다 작은 조건에서도, 세포를 장기에 걸쳐 양호하게 배양하는 것이 가능해진다. 또한, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리이미드 다공질막 체적의 총합의 1000배 또는 그보다 작은 조건에서도, 세포를 장기에 걸쳐 양호하게 배양할 수 있다. 또한, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리이미드 다공질막 체적의 총합의 100배 또는 그보다 작은 조건에서도, 세포를 장기에 걸쳐 양호하게 배양할 수 있다. 그리고, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리이미드 다공질막 체적의 총합의 10배 또는 그보다 작은 조건에서도, 세포를 장기에 걸쳐 양호하게 배양할 수 있다.
즉, 본 발명에 의하면, 세포를 배양하는 공간(용기)을 종래의 이차원 배양을 행하는 세포 배양 장치에 비해 극한까지 소형화 가능해진다. 또한, 배양하는 세포의 수를 늘리고 싶은 경우에는, 적층하는 폴리이미드 다공질막의 매수를 늘리는 등의 간편한 조작에 의해, 유연하게 세포 배양하는 체적을 늘리는 것이 가능해진다. 본 발명에 이용되는 폴리이미드 다공질막을 구비한 세포 배양 장치이면, 세포를 배양하는 공간(용기)과 세포 배양 배지를 저장하는 공간(용기)을 분리하는 것이 가능해지고, 배양하는 세포수에 따라, 필요해지는 양의 세포 배양 배지를 준비하는 것이 가능해진다. 세포 배양 배지를 저장하는 공간(용기)은, 목적에 따라 대형화 또는 소형화해도 좋고, 혹은 교체 가능한 용기여도 좋으며, 특별히 한정되지 않는다. 이 집적화의 개념은, 동결에 있어서도 중요하며, 극소 공간에 대량의 세포를 동결시켜 보존하는 것이 가능해진다.
한편, 배양 중 또는 배양 후의 세포수를 계측하는 방법으로서는, 여러 가지 공지된 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 폴리이미드 다공질막을 이용한 배양 후에 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포의 수를, 세포가 모두 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지에 균일하게 분산되어 있는 것으로 하여 계측하는 방법으로서는, 공지된 방법을 적절히 이용할 수 있다. 예컨대, 실시예 1에서 이용한 방법과 같이, CCK8을 이용한 세포수 계측법을 적합하게 이용할 수 있다. 구체적으로는, Cell Counting Kit 8; 도진 가가쿠 겐큐쇼 제조 용액 시약(이하, 「CCK8」이라고 기재한다.)을 이용하여, 폴리이미드 다공질막을 이용하지 않는 통상의 배양에 있어서의 세포수를 계측하고, 흡광도와 실제의 세포수와의 상관 계수를 구한다. 그 후, 세포를 적용하여, 배양한 폴리이미드 다공질막을, CCK8을 포함하는 배지로 옮기고, 1~3시간 인큐베이터 내에서 보존하며, 상청을 발출하여 480 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하고, 앞서 구한 상관 계수로부터 세포수를 계산한다.
3. 세포의 배양 시스템 및 배양 조건
본 발명의 방법에 있어서, 세포의 배양 시스템 및 배양 조건은, 세포의 종류 등에 따라 적절히 결정할 수 있다. 동물 세포, 식물 세포, 및 세균의 각 세포에 적합한 배양 방법이 공지이며, 당업자는 임의의 공지된 방법을 이용하여 폴리이미드 다공질막에 적용한 세포를 배양할 수 있다. 세포 배양 배지도 세포의 종류에 따라 적절히 조제할 수 있다.
동물 세포의 세포 배양 방법, 세포 배양 배지는, 예컨대, 론자사의 세포 배양 배지 카탈로그에 기재되어 있다. 식물 세포의 세포 배양 방법, 세포 배양 배지는, 예컨대, WAKO사의 식물 조직 배지 시리즈 등에 기재되어 있다. 세균의 세포 배양 방법, 세포 배양 배지는, 예컨대, BD사의 일반 세균용 배지 카탈로그에 기재되어 있다. 본 발명의 방법에 이용할 수 있는 세포 배양 배지는, 액체 배지, 반고형 배지, 고형 배지 등의 어느 형태여도 좋다. 또한, 액적형으로 한 액체 배지를 세포 배양 용기 중에 분무함으로써, 세포를 담지한 폴리이미드 다공질막에 배지가 접촉하도록 해도 좋다.
폴리이미드 다공질막을 이용하는 세포의 배양에 대해, 마이크로 캐리어나 셀룰로오스 스펀지 등, 다른 부유형 배양 담체와 공존시킬 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양에 이용하는 시스템의 형상, 규모 등은 특별히 한정되지 않고, 세포 배양용의 샬레, 플라스크, 플라스틱 백, 시험관으로부터 대형의 탱크까지 적절히 이용 가능하다. 예컨대, BD Falcon사 제조의 셀 컬쳐 디쉬나 서모사이언티픽사 제조의 Nunc 셀 팩토리 등이 포함된다. 한편, 본 발명에 있어서 폴리이미드 다공질막을 이용함으로써, 본디부터 부유 배양이 가능하지 않았던 세포에 대해서도 부유 배양용 장치로, 부유 배양 유사 상태에서의 배양을 행하는 것이 가능해졌다. 부유 배양용의 장치로서는, 예컨대, 코닝사 제조의 스피너 플라스크나 회전 배양 등이 사용 가능하다. 또한, 동일한 기능을 실현할 수 있는 환경으로서, VERITAS사의 FiberCell(등록 상표) System과 같은 중공사 배양도 사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 방법에 있어서의 배양은, 폴리이미드 다공질막 상에 연속적으로 배지를 첨가하여 회수하는 것과 같은 연속 순환 혹은 개방형의 장치를 이용하여, 공기 중에 폴리이미드 다공질막 시트를 노출시키는 것과 같은 형식으로 실행하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 세포의 배양은, 세포 배양 용기 밖에 설치된 세포 배양 배지 공급 수단으로부터 연속적 또는 간헐적으로 세포 배양 배지가 세포 배양 용기 중에 공급되는 계에서 행해도 좋다. 그때, 세포 배양 배지가 세포 배양 배지 공급 수단과 세포 배양 용기 사이를 순환하는 계일 수 있다.
세포의 배양을, 세포 배양 용기 밖에 설치된 세포 배양 배지 공급 수단으로부터 연속적 또는 간헐적으로 세포 배양 배지가 세포 배양 용기 중에 공급되는 계에서 행하는 경우, 그 계는, 세포 배양 용기인 배양 유닛과 세포 배양 배지 공급 수단인 배지 공급 유닛을 포함하는 세포 배양 장치여도 좋고, 여기서
배양 유닛은 세포를 담지하기 위한 1 또는 복수의 폴리이미드 다공질막을 수용하는 배양 유닛으로서, 배지 공급구 및 배지 배출구를 구비한 배양 유닛이며,
배지 공급 유닛은 배지 수납 용기와, 배지 공급 라인과, 배지 공급 라인을 통해 연속적 또는 간헐적으로 배지를 송액하는 송액 펌프를 구비하고, 여기서 배지 공급 라인의 제1 단부는 배지 수납 용기 내의 배지에 접촉하며, 배지 공급 라인의 제2 단부는 배양 유닛의 배지 공급구를 통해 배양 유닛 내에 연통되어 있는 배지 공급 유닛인
세포 배양 장치여도 좋다.
또한, 상기 세포 배양 장치에 있어서, 배양 유닛은 공기 공급구, 공기 배출구, 및 산소 교환막을 구비하지 않는 배양 유닛이어도 좋고, 또한, 공기 공급구 및 공기 배출구, 또는 산소 교환막을 구비한 배양 유닛이어도 좋다. 배양 유닛은 공기 공급구 및 공기 배출구, 및 산소 교환막을 구비하지 않는 것이어도, 세포의 배양에 필요한 산소 등이 배지를 통해 충분히 세포에 공급된다. 또한, 상기 세포 배양 장치에 있어서, 배양 유닛이 배지 배출 라인을 더 구비하고, 여기서 배지 배출 라인의 제1 단부는 배지 수납 용기에 접속되며, 배지 배출 라인의 제2 단부는 배양 유닛의 배지 배출구를 통해 배양 유닛 내에 연통되어, 배지가 배지 공급 유닛과 배양 유닛을 순환 가능해도 좋다.
상기 세포의 배양 시스템의 일례인 세포 배양 장치의 예를 도 2에 도시하지만, 본 발명의 목적을 위해서 이용할 수 있는 세포의 배양 시스템은 이것에 한정되는 것이 아니다.
II. 세포 배양 장치
본 발명은 또한, 폴리이미드 다공질막을 포함하는, 본 발명의 배양 방법에 사용하기 위한 세포 배양 장치에 관한 것이다. 본 발명의 세포 배양 장치에 있어서, 폴리이미드 다공질막은 고정되어 이용되어도 좋고, 혹은 세포 배양 배지 중에 부유하여 이용되어도 좋으며, 배지 중에 놓여져도, 배지로부터 노출되어도 좋다. 세포 배양 장치에 있어서, 2 이상의 폴리이미드 다공질막이, 상하 또는 좌우로 적층되어도 좋다. 적층된 집합체나 집적체는, 배지 중에 놓여져도 배지로부터 노출되어 있어도 상관없다.
본 발명의 세포 배양 장치로서는, 폴리이미드 다공질막을 포함하는 것이면 임의의 형태를 취해도 좋다. 예컨대, 전술한 본 발명의 장기 배양 방법에 있어서 이용하는 세포의 배양 시스템은, 모두 본 발명의 세포 배양 장치로서 이용할 수 있다.
III. 세포의 배양 방법에 사용하기 위한 키트
본 발명은 또한, 폴리이미드 다공질막을 포함하는, 세포의 배양 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는, 폴리이미드 다공질막 외에, 세포 배양에 필요한 구성 요소를 적절히 포함할 수 있다. 예컨대, 폴리이미드 다공질막에 적용하는 세포, 세포 배양 배지, 연속적 배지 공급 장치, 연속적 배지 순환 장치, 폴리이미드 다공질막을 지지하는 기반 혹은 모듈, 세포 배양 장치, 키트의 취급 설명서 등이 포함된다.
한정되는 것은 아니지만, 일 양태로서, 투명한 파우치 내에 멸균된 폴리이미드 다공질막이 단독으로 또는 복수 매 보존되고, 그대로 세포 배양에 사용 가능한 형태를 포함하는 패키지나, 혹은, 동 파우치 내에 폴리이미드 다공질막과 함께 멸균 액체가 봉입되어 있으며, 효율적 흡입 파종이 가능하게 되어 있는 막·액체의 일체형 형태의 키트를 포함한다.
IV. 용도
본 발명은 세포의 장기 배양 방법을 위한, 폴리이미드 다공질막의 용도에도 관한 것이다. 또한, 세포의 장기 배양 방법을 위한, 전술한 세포 배양 장치의 용도에도 관한 것이다.
V. 세포의 동결 보존 방법
본 발명은 세포의 동결 보존 방법으로서,
(1) 세포를 폴리이미드 다공질막에 담지시키는 공정,
(2) 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막을, 세포가 동결하는 조건하에 둠으로써, 폴리이미드 다공질막에 담지된 세포를 동결하는 공정, 및
(3) 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막을, 동결 상태를 유지하는 조건에서 보존하는 공정
을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 고밀도로 배양된 세포를 담지한 상태로 폴리이미드 다공질막을 동결하는 것이 가능하며, 종래의 비접착 상태로 동결시키는 세포의 동결 방법과 비교하여, 압도적으로 고밀도의 상태로 세포를 동결하는 것이 가능해진다.
1. 세포
본 발명의 방법에 이용할 수 있는 세포의 종류는 특별히 한정되지 않고, 전술한 임의의 세포가 이용 가능하다.
2. 세포를 폴리이미드 다공질막에 담지시키는 공정
본 발명의 방법은, 세포를 폴리이미드 다공질막에 담지시키는 공정을 포함한다.
폴리이미드 다공질막에 세포를 담지시키는 방법으로서는 임의의 방법을 이용할 수 있으나, 예컨대 이하와 같은 방법을 이용할 수 있다.
(A) 세포를 상기 폴리이미드 다공질막의 표면에 파종하는 공정을 포함하는 양태;
(B) 상기 폴리이미드 다공질막의 건조한 표면에 세포 현탁액을 놓고,
방치하거나, 혹은 상기 폴리이미드 다공질막을 이동시켜 액의 유출을 촉진하거나, 혹은 표면의 일부를 자극하여, 세포 현탁액을 상기 막에 흡입시키고, 그리고,
세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하며, 수분은 유출시키는
공정을 포함하는 양태; 및,
(C) 상기 폴리이미드 다공질막의 한쪽 면 또는 양면을, 세포 배양액 또는 멸균된 액체로 습윤하고,
상기 습윤한 폴리이미드 다공질막에 세포 현탁액을 장전하며, 그리고,
세포 현탁액 중의 세포를 상기 막 내에 머물게 하고, 수분은 유출시키는
공정을 포함하는 양태.
폴리이미드 다공질막의 표면에 파종된 세포는, 폴리이미드 다공질막에 접착하여, 다공의 내부로 들어간다. 바람직하게는, 특별히 외부로부터 물리적 또는 화학적인 힘을 가하지 않아도, 세포는 폴리이미드 다공질막에 자발적으로 접착한다. 폴리이미드 다공질막의 표면에 파종된 세포는, 막의 표면 및/또는 내부에 있어서 안정적으로 생육·증식하는 것이 가능하다. 세포는 생육·증식하는 막의 위치에 따라, 여러 가지 상이한 형태를 취할 수 있다.
한편, 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막과 함께, 세포를 담지시키고 있지 않은 다른 1 또는 복수의 폴리이미드 다공질막을 동일한 세포 배양 배지에 적용하여, 배양함으로써, 다른 1 또는 복수의 폴리이미드 다공질막에 세포를 담지시켜도 좋다. 그때, 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막과, 세포를 담지시키고 있지 않은 다른 1 또는 복수의 폴리이미드 다공질막은, 적층 등에 의해 서로 접촉시켜도 좋고, 단순히 동일한 세포 배양 배지 내에 설치해도 좋다.
3. 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막을, 세포가 동결하는 조건하에 둠으로써, 폴리이미드 다공질막에 담지된 세포를 동결하는 공정
세포가 동결하는 조건으로서는, 폴리이미드 다공질막에 담지된 세포의 일부 또는 전부가, 동결 후에 해동되었을 때에 생명 기능을 유지하고 있는 것과 같은 조건이면, 적절히 설정할 수 있다. 또한, 폴리이미드 다공질막을 넣기 위한 동결용 튜브나 동결용 캔 등도, 시판되어 있는 제품을 사용할 수 있다.
예컨대, 폴리이미드 다공질막을 세포 동결 보존액 중에 침지하고, 그것을 제1 저온 조건하에 있어서 동결시킨 후, 제1 저온 조건보다 낮은 제2 저온 조건하로 옮겨 동결시킬 수 있다. 제1 저온 조건으로서는, 예컨대 마이너스 20~25℃ 정도의 조건을 이용할 수 있고, 제2 저온 조건으로서는, 마이너스 80~90℃ 정도의 조건을 이용할 수 있다.
제1 저온 조건하에 두는 공정은 생략해도 좋다. 제1 저온 조건보다 낮은 제2 저온 조건하로의 이행은, 직선적, 단계적, 곡선적, 또는 즉시 중 어느 형태를 취해도 좋다.
제1 저온 조건을 제공하는 장치와, 제2 저온 조건을 제공하는 장치는 별개의 것이어도 좋고, 동일해도 좋다. 제1 저온 조건을 제공하는 장치와, 제2 저온 조건을 제공하는 장치가 별개의 것인 경우로서는, 예컨대 제1 저온 조건을 제공하는 장치가 통상의 프리저(freezer)이고, 제2 저온 조건을 제공하는 장치가 딥 프리저인 경우를 들 수 있으나, 이것에 한정되지 않는다. 또한, 제1 저온 조건을 제공하는 장치와, 제2 저온 조건을 제공하는 장치가 동일한 경우로서는, 일정한 속도로 온도를 저하시킬 수 있는 프로그램 프리저(예컨대 네파진 가부시키가이샤 제조 프로그램 프리저 등)를 이용하는 경우를 들 수 있으나, 이것에 한정되지 않는다.
세포 동결 보존액으로서는, 공지된 것을 적절히 사용할 수 있다. 예컨대, 세포 배양액에 DMSO를 5%~20% 정도가 되도록 첨가한 것, 세포 배양액에 글리세롤을 5%~20% 정도가 되도록 첨가한 것, ZENOAQ사 제조의 카탈로그에 기재되어 있는 각종 셀 뱅커와 같은 시판의 세포 동결 보존액을 적합하게 이용할 수 있다.
4. 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막을, 동결 상태를 유지하는 조건에서 보존하는 공정
본 발명의 방법은, 전술한 바와 같이 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막을, 동결 상태를 유지하는 조건에서 보존하는 공정을 포함한다. 동결 상태를 유지하는 조건으로서는, 상기 제2 저온 조건하에서 그대로 보존하는 조건이나, 제2 저온 조건보다 더 저온인 제3 저온 조건하에서 보존하는 조건을 들 수 있다. 제3 저온 조건의 예로서는, 예컨대 액체 질소 중에 두는 경우를 들 수 있으나, 이것에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 의하면, 부유성 세포여도 부착성 세포여도, 세포의 종류를 불문하고, 양호하게 동결 보존할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 부유성 세포를 동결 보존한 경우에는, 구형을 유지한 채로, 폴리이미드 다공질막의 입체 구조 내에 세포가 수용되어 보존된다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 부착성 세포를 동결 보존한 경우에는, 폴리이미드 다공질막 내에서 생육·증식하고 있었을 때와 동일한 비구형 상태를 유지한 채로, 폴리이미드 다공질막의 입체 구조 내에 세포가 수용되어 보존된다.
본 발명의 방법에 있어서 세포를 담지시키는 폴리이미드 다공질막은, 당연히, 담지시키는 것 이외의 세포를 포함하지 않는 상태, 즉, 멸균되어 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법은, 바람직하게는, 폴리이미드 다공질막을 미리 멸균하는 공정을 포함한다. 폴리이미드 다공질막은, 내열성이 매우 우수하고, 경량이며, 형태·크기도 자유롭게 선택 가능하고, 멸균 처리가 용이하다. 건열 멸균, 증기 멸균, 에탄올 등 소독제에 의한 멸균, 자외선이나 감마선 등의 전자파 멸균 등 임의의 멸균 처리가 가능하다.
5. 폴리이미드 다공질막에 담지된 세포를 해동하는 공정
본 발명의 방법에서는, 세포를 담지한 폴리이미드 다공질막을 동결 보존 후에 해동할 수 있다. 폴리이미드 다공질막에 담지된 세포를 해동하는 방법으로서는, 동결 보존된 폴리이미드 다공질막을 보존 용기의 외부로부터 가온하여, 해동하는 방법을 들 수 있다. 가온의 방법으로서는, 37℃ 정도의 항온의 온탕에 용기를 담그는 등의 방법을 적절히 이용할 수 있다.
6. 세포를 해동한 폴리이미드 다공질막을 세포 배양 배지에 적용하여, 세포를 배양하는 공정
본 발명의 방법에서는, 세포를 해동한 폴리이미드 다공질막을 그대로 세포 배양 배지에 적용함으로써, 해동된 세포를 동일한 폴리이미드 다공질막 상에서 배양할 수 있다.
그때, 배양한 세포가 폴리이미드 다공질막 밖에 있어서도 증식할 때까지 세포를 배양해도 좋다. 부유성 세포의 경우, 폴리이미드 다공질막 내로부터 세포 배양 배지 중으로 이행한 것은, 그대로 배지 중에서 증식할 수 있다. 부착성 세포의 경우, 폴리이미드 다공질막 내 또는 표면에 머무는 것이 많으나, 일부의 세포는 폴리이미드 다공질막에 접한 배양 용기나, 세포를 담지하고 있지 않은 다른 배양 담체로 이행할 수 있다.
따라서, 세포를 해동한 폴리이미드 다공질막과 함께, 세포를 담지시키고 있지 않은 다른 1 또는 복수의 폴리이미드 다공질막을 세포 배양 배지에 적용하여, 배양함으로써, 다른 1 또는 복수의 폴리이미드 다공질막에 세포를 담지시키고, 필요하다면 배양을 계속하는 것도 가능해진다.
이 경우, 세포를 해동한 폴리이미드 다공질막, 및 새롭게 세포를 담지시킨 다른 폴리이미드 다공질막 중의 일부 또는 전부를 세포가 동결하는 조건하에 둠으로써, 폴리이미드 다공질막에 담지된 세포를 동결시켜, 보존하는 것이 가능해진다.
전술한 바와 같은 동결, 보존, 해동, 및 배양의 공정은 복수 회 반복할 수 있다. 본 발명에 의하면, 세포를 대량으로 담지한 상태로 폴리이미드 다공질막을 동결, 보존하는 것이 가능하고, 임의 시에 해동하여, 프리 배양 공정을 거치지 않고, 원하는 용도(예컨대, 단백질의 산생 등)에 사용 가능하다. 종래, 해동한 세포를 사용하기 위해서는, 해동한 세포를 프리 배양하여, 생존하고 있는 세포를 원하는 기재(基材) 또는 담체에 담지시켜 배양할 필요가 있었다. 그러나, 본 발명에 의하면, 종래 필요한 해동 후의 프리 배양 공정을 거치지 않고, 폴리이미드 다공질막에 세포를 접착시킨 채로 배양, 동결, 보존, 해동, 그리고 재배양이 가능하다. 그 때문에, 예컨대, 세포를 담지한 상태로 동결한 폴리이미드 다공질이 대량으로 준비되어 있으면, 확대 배양 공정을 거치지 않고, 원할 때에 대량의 세포를 사용하는 것이 가능하다.
VI. 세포의 동결 보존을 위한 폴리이미드 다공질막
본 발명은 세포의 동결 보존을 위한 폴리이미드 다공질막에도 관한 것이다. 본 발명의, 세포의 동결 보존을 위한 폴리이미드 다공질막은, 전술한 세포의 동결 보존 방법을 위한 폴리이미드 다공질막이어도 좋다.
VII. 키트
본 발명은 폴리이미드 다공질막을 포함하는, 세포의 동결 보존을 위한 키트에도 관한 것이다.
본 발명의 키트는, 폴리이미드 다공질막 외에, 세포 배양에 필요한 구성 요소를 적절히 포함할 수 있다. 예컨대, 폴리이미드 다공질막, 세포 동결 보존액, 동결용 튜브, 동결용 캔 및 키트의 취급 설명서 등이 포함된다.
한정되는 것은 아니지만, 일 양태로서, 투명한 파우치 내에 멸균된 폴리이미드 다공질막이 단독으로 또는 복수 매 보존되고, 그대로 세포 동결에 사용 가능한 형태를 포함하는 패키지나, 혹은, 동 파우치 내에 폴리이미드 다공질막과 함께 세포 동결 보존액이 봉입되어 있으며, 신속 사용이 가능하게 되어 있는 막·액체의 일체형 형태의 키트를 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여, 보다 구체적으로 설명한다. 한편 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것이 아니다. 당업자는 본 명세서의 기재에 기초하여 용이하게 본 발명에 수식·변경을 가할 수 있고, 이들은 본 발명의 기술적 범위에 포함된다. 이후, 특별히 기술하지 않는 경우에는, 「폴리이미드 다공질막」은 총 막 두께 25 ㎛, 공공률 73%의 폴리이미드 다공질막을 말하는 것으로 한다. 상기 폴리이미드 다공질막은, 2개의 상이한 표면층(A면 및 B면)과, 상기 2개의 표면층 사이에 끼워진 매크로 보이드층을 가졌다. A면에 존재하는 구멍의 평균 공경은 6 ㎛이고, B면에 존재하는 구멍의 평균 공경은 46 ㎛였다.
한편, 이하의 실시예에서 사용된 폴리이미드 다공질막은, 테트라카르복실산 성분인 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산 이무수물(s-BPDA)과 디아민 성분인 4,4'-디아미노디페닐에테르(ODA)로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과, 착색 전구체인 폴리아크릴아미드를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써, 조제되었다.
<사용한 세포, 재료 등>
·인간 섬유아세포(LONZA사 product code CC-2511)
·베로 세포(DS 파머 바이오메디컬사, cat. DSIU002)
·CHO-K1(퍼블릭 헬스 잉글랜드 cat. 85051005)
·CHO DP-12(Summit Pharmaceuticals Intl CRL-12445)
·인간 섬유아세포용 배지(LONZA사 product code CC-3132)
·베로 세포용 배지(와코 쥰야쿠 고교 가부시키가이샤 E-MEM 051-07615)
·CHO-K1용 배지(와코 쥰야쿠 고교 가부시키가이샤 Ham's F-12 087-08335)
·CHO DP-12용 배지(와코 쥰야쿠 고교 가부시키가이샤 IMDM, -06465)
·3.5 cm 샬레(Falcon사 cat. 353001)
·Cell Counting Kit 8(가부시키가이샤 도진 가가쿠 겐큐쇼 CCK8 CK04)
·크라이오 튜브(Thermo Fisher Scientific사 1.8 ㎖ cat. 377267)
·2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기(Thermo Fisher Scientific사 cat. 103)
·셀 뱅커(닛폰 젠야쿠 고교 가부시키가이샤 CEllBANKER 1 Plus cat. CB021)
·현미경명, 사용한 화상 소프트웨어명(Carl Zeiss사 제조 LSM 700 사용 소프트웨어 ZEN)
실시예 1
인간 피부 섬유아세포의 폴리이미드 다공질막을 이용하는 장기 배양
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지 0.5 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막을 메시 구조의 A면 혹은 큰 구멍 구조의 B면을 위로 하여 각각 침지시켰다. 1장의 시트당 5×104개의 인간 피부 섬유아세포 및 1장의 시트당 3×105개의 인간 피부 섬유아세포 현탁액을 각각 첨가하고, 1주일에 2회의 비율로 배지 교환하며, 세포 배양을 계속적으로 실시하였다. 이들 시트를 각 5장씩 준비하고, 20 ㎠ 샬레로 이동시키며, 4 ㎖의 배지를 첨가하여 배양을 계속하였다. 4일간, 7일간, 13일간, 31일간, 56일간, 84일간 후에 CCK8을 이용하여 세포수를 계측하고, 증식 거동을 관찰하였다. 결과를 도 3에 도시한다. 참조예로서, 평면 배양(파종 밀도: 3.5×103개/㎠)으로 14일까지의 경과도 병기한다.
실시예 2
인간 피부 섬유아세포의 폴리이미드 다공질막을 이용하는 장기 배양
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지 0.5 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막을 메시 구조의 A면 혹은 큰 구멍 구조의 B면을 위로 하여 침지시켰다. 1장의 시트당 4×104개의 세포를 파종하고, CO2 인큐베이터 내에서 배양을 계속적으로 행하였다. 주 2회 배지(1 ㎖)를 교환하였다. 배양 개시 후, 89일간, 118일간, 127일간, 139일간 후에 CCK8을 이용하여 세포수를 계측하고, 세포 생육 거동을 관찰하였다. 관측 기간을 통해, 1 ㎠당 1.5×105개 이상의 세포수가 관측되었다. 결과를 도 4에 도시한다.
실시예 3
베로 세포의 폴리이미드 다공질막을 이용하는 장기 배양
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지 1 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막을 메시 구조의 A면 혹은 큰 구멍 구조의 B면을 위로 하여 침지시켰다. 1장의 시트당 4×104개 및 1×105개의 세포를 파종하고, CO2 인큐베이터 내에서 배양을 계속적으로 행하였다. 이때, 통상 사용의 두께 25 ㎛의 폴리이미드 다공질막에 더하여, 75 ㎛의 폴리이미드 다공질막을 사용하였다. 또한, FBS량도, 배지에 대해 10% 혹은 5%의 양을 사용하였다. 주 2회 배지(1 ㎖)를 교환하여, 배양을 계속하였다. 140일의 기간에서, CCK8을 이용하여 간헐적으로 세포수를 계측하고, 세포 생육 거동을 관찰하였다. 안정된 세포의 생육이 관찰되었다. 도 5에 결과를 도시한다.
실시예 4
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지 1 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막을 메시 구조의 A면을 위로 하여 침지시켰다. 1장의 시트당 4×104개의 CHO-K1 세포주를 첨가하고, 20일간 세포 배양한 후, CCK8을 이용하여 세포수를 측정한 결과, 시트 상의 세포수는 7.7×106개였다.
이 세포가 생육하고 있는 시트를 3장의 세로로 긴 시트로 자르고, 배지에 넣은 채로 5℃로 20시간 보존 후, 폴리이미드 다공질막을 취출하여 셀 뱅커 1 ㎖를 첨가한 크라이오 튜브에 넣고, -20℃에서 24시간 보존 후 또한 -80℃에서 24시간 보존하며, 액체 질소 중으로 이동시켰다. 20일 후, 튜브를 37℃로 가온하여 내용물을 융해하고, 인큐베이터 내에 16시간 방치하였다. CCK8을 이용하여 세포수를 측정한 결과, 시트 상의 세포수는 4.6×106개였다.
실시예 5
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지 1 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막을 메시 구조의 A면을 위로 하여 침지시켰다. 1장의 시트당 4×104개의 인간 피부 섬유아세포를 첨가하고, 5일간 세포 배양한 후, CCK8을 이용하여 세포수를 측정한 결과, 시트 상의 세포수는 7.7×106개였다.
이 세포가 생육하고 있는 시트를 3장의 세로로 긴 시트로 자르고, 배지에 넣은 채로 5℃로 8시간 보존 후, 폴리이미드 다공질막을 취출하여 셀 뱅커 1 ㎖를 첨가한 크라이오 튜브에 넣고, -80℃에서 24시간 보존하며, 액체 질소 중으로 이동시켰다. 2일 후, 튜브를 37℃로 가온하여 내용물을 융해하고, 인큐베이터 내의 배양 조건하로 이동시켰다. 3일 후와 5일 후에 CCK8을 이용하여 흡광도에 의한 비활성을 측정한 결과, 3일째, 5일째의 비활성은, 36% 및 64%였다.
실시예 6
인간 피부 섬유아세포 장기 배양
인간 피부 섬유아세포의 폴리이미드 다공질막을 이용하는 장기 배양
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 2% FBS가 들어간 세포 배양 배지 0.5 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막을 메시 구조의 A면을 위로 하여 각각 침지시켰다. 1장의 시트당 4×104개의 인간 피부 섬유아세포 현탁액을 각각 첨가하고, 1주일에 2회의 비율로 배지 교환하며, 세포 배양을 계속적으로 실시하였다. 231일간, 261일간, 294일간, 324일간, 365일간, 401일간, 471일간 후에 CCK8을 이용하여 세포수를 계측하고, 증식 거동을 관찰하였다. 결과를 도 8에 도시한다. 배양 기간을 통해, 안정된 생세포수가 확인되었다.
실시예 7
인간 피부 섬유아세포 장기 배양 시의 기상 계대에 의한 증식 확인
직경 6 cm의 샬레에 2 ㎖의 2% FBS가 들어간 배지를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막의 메시 구조의 A면에 1장의 시트당 4×104개의 인간 피부 섬유아세포를 파종하여, 1개월 배양하였다. 그 후, 시트를 4분의 1로 절단하고, 또한 배양을 계속하여 합계 230일 배양하였다. 그 후, 3.5 cm 디쉬 중앙에, 가로 세로 1.4 cm의 스테인리스 메시를 3장 겹쳐 설치하고, 그 위에, 상기 폴리이미드 다공질막을 놓으며, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 빈 폴리이미드 다공질막 2장 사이에 끼웠다. 그 상태에서 배지 1 ㎖를 첨가하면, 배지는, 시트와 동일한 높이가 되었다. 이 상태에서 CO2 인큐베이터 내로 이동시키고, 1주일에 2회의 비율로 배지 교환하여 세포 배양을 계속적으로 실시하였다. 배양 7일 후, 각 시트를 1장씩으로 나누고, 단일의 시트로서 배양을 계속하였다. 7일, 10일, 16일, 21일, 28일, 42일, 56일 후에 CCK8을 이용하여 세포수를 계측하고, 원래의 시트와 나중에 접지시킨 빈 폴리이미드 다공질막에 대해, 세포의 증식 거동을 CCK8에서의 염색법을 이용하여 관찰하였다. 인간 피부 섬유아세포를 장기간 배양한 폴리이미드 다공질막으로부터, 효율적으로 세포가 빈 폴리이미드 다공질막으로 이동하여, 계속적으로 증식해 가는 거동이 관찰되었다. 결과를 도 9에 도시한다.
실시예 8
CHO DP-12 세포를 이용하는 세포 배양과 동결 및 물질 산생
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지(2% FBS, IMDM, 와코 쥰야쿠 고교 가부시키가이샤) 0.5 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막을 메시 구조의 A면을 위로 하여 각각 침지시켰다. 1장의 시트당 4×104개의 인간 항(抗) IL-8 산생 CHO DP-12 세포 현탁액을 각각 배지 내 시트 상에 첨가하고, 1주일에 2회의 비율로 배지 교환하며, 세포 배양을 계속적으로 실시하였다. 78일간 세포 배양한 후, CCK8을 이용하여 세포수를 측정하였다.
이 시트 4장을 멸균 조건하에서 동결 보존 백 4장에 1백 1시트가 되도록 이송하고, 각 백에 셀 뱅커 3 ㎖씩을 첨가하였다. 프로그램 프리저로 2조건(1분마다 1℃, 혹은, 10분마다 1℃)으로 -80℃로 동결 후, -80℃에서 24시간 보존하고, 액체 질소 중으로 이동시켰다. 3일 후, 백을 37℃로 가온하여 내용물을 융해하고, 사전에 준비한 배지 2 ㎖를 채운 10 ㎠ 샬레 4장으로 각각의 시트를 이동시켜 인큐베이터 내에 24시간 방치하였다. 그 후, 2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기로 시트를 옮기고, 세포 배양 배지 1 ㎖를 첨가하여 또한 3일간 배양하였다. 24시간 후, 2일 후, 3일 후, 4일 후에 CCK8을 이용하여 세포수를 측정하였다. 결과를 도 10에 도시한다.
상기에서 세포 배양한 동결 시트 4장과 마찬가지로 상기에서 동시에 파종·배양을 계속한 비동결 시트 2장을 1장씩 10 ㎠ 샬레에 넣고, 세포 배양 배지를 각각 2 ㎖ 첨가하며, 5%의 CO2, 37℃에서 24시간 인큐베이트하고, 배지 상청을 회수하였다. 회수한 상청에 포함되는 항 인간 IL-8 항체량을 ELISA법에 의해 정량하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 동결에 의한 항 IL-8 산생량 변화는 보여지지 않았다. 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00004
실시예 9
인간 피부 섬유아세포의 동결 및 물질 산생
2 cm×2 cm의 멸균된 정사각형 용기에 세포 배양 배지 0.5 ㎖를 첨가하고, 멸균한 가로 세로 1.4 cm의 정사각형의 폴리이미드 다공질막을 메시 구조의 A면을 위로 하여 각각 침지시켰다. 1장의 시트당 4×104개의 인간 피부 섬유아세포 현탁액을 배지 내 시트 상에 각각 첨가하고, CO2 인큐베이터 내에서 배양을 개시하였다. 1주일에 2회의 비율로 배지 교환하여 세포 배양을 계속적으로 실시하고, 49일간 세포 배양한 후에, CCK8을 이용하여 세포수를 측정한 결과, 9.1×104개였다.
이러한 세포가 생육하고 있는 시트를 배지로부터 취출하여, 미리 준비한, 셀 뱅커 3 ㎖를 첨가한 동결 보존 백으로 이동시키고, 프로그램 프리저로 10분마다 1℃ 낮춰 -80℃로 동결 후, -80℃에서 24시간 보존하며, 액체 질소 중에서 보존하였다. 5일 후, 백을 37℃로 가온하여 내용물을 융해하고, 사전에 준비한, 배지 2 ㎖를 채운 10 ㎠ 샬레로 시트만을 이동시키며, CO2 인큐베이터 내에서 배양을 계속하였다. 배지 교환은, 주 2회의 페이스로 행하였다. 24시간 후, 5일 후, 8일 후, 13일 후, 21일 후, 29일 후 및 35일 후에 CCK8을 이용하여 시트에 생식하는 세포수를 측정하였다. 결과를 도 11에 도시한다. 24시간 후, 8일 후, 21일 후 및 35일 후의 비활성은, 34%, 91%, 105% 및 152%였다. 35일 배양 후에, 동 시트에 생육하는 인간 피부 섬유아세포의 피브로넥틴 산생량을 ELISA법에 의해 측정하였다. 결과를 이하의 표에 나타낸다. 동결에 의한 손상을 받지 않고, 물질 산생이 계속되는 것을 확인하였다. 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure pct00005

Claims (42)

  1. 세포의 장기 배양 방법으로서,
    (1) 세포를 폴리이미드 다공질막에 적용하는 것과,
    (2) 세포를 적용한 폴리이미드 다공질막을 세포 배양 배지에 적용하여, 30일 이상 세포를 배양하는 것
    을 포함하는, 세포의 장기 배양 방법.
  2. 제1항에 있어서, 공정 (2)에 있어서, 60일 이상 세포를 배양하는 것인 배양 방법.
  3. 제1항에 있어서, 공정 (2)에 있어서, 120일 이상 세포를 배양하는 것인 배양 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 2 이상의 폴리이미드 다공질막을, 상하 또는 좌우로 세포 배양 배지 중에 적층하여 이용하는 것인 배양 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리이미드 다공질막을
    ⅰ) 접어,
    ⅱ) 롤형으로 감아,
    ⅲ) 시트 혹은 소편을 실형의 구조체로 연결시켜, 혹은,
    ⅳ) 새끼줄형으로 묶어
    세포 배양 용기 중의 세포 배양 배지 중에서 부유 혹은 고정시켜 이용하는 것인 배양 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (2)에 있어서의 배양에 있어서, 폴리이미드 다공질막의 일부분 또는 전체가, 세포 배양 배지의 액상과 접촉하고 있지 않은 것인 배양 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (2)에 있어서의 배양에 있어서, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리이미드 다공질막 체적의 총합의 10000배 또는 그보다 작은 것인 배양 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (2)에 있어서의 배양에 있어서, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이, 세포 생존 영역을 포함하는 폴리이미드 다공질막 체적의 총합의 100배 또는 그보다 작은 것인 배양 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (2)에 있어서의 배양이, 세포 배양 용기 밖에 설치된 세포 배양 배지 공급 수단으로부터 연속적 또는 간헐적으로 세포 배양 배지가 세포 배양 용기 중에 공급되는 계에서 행해지는 것인 배양 방법.
  10. 제9항에 있어서, 세포 배양 배지가 세포 배양 배지 공급 수단과 세포 배양 용기 사이를 순환하는 것인 배양 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 계가, 세포 배양 용기인 배양 유닛과 세포 배양 배지 공급 수단인 배지 공급 유닛을 포함하는 세포 배양 장치이고, 여기서
    배양 유닛은 세포를 담지하기 위한 1 또는 복수의 폴리이미드 다공질막을 수용하는 배양 유닛으로서, 배지 공급구 및 배지 배출구를 구비한 배양 유닛이며,
    배지 공급 유닛은 배지 수납 용기와, 배지 공급 라인과, 배지 공급 라인을 통해 연속적 또는 간헐적으로 배지를 송액하는 송액 펌프를 구비하고, 여기서 배지 공급 라인의 제1 단부는 배지 수납 용기 내의 배지에 접촉하며, 배지 공급 라인의 제2 단부는 배양 유닛의 배지 공급구를 통해 배양 유닛 내에 연통되어 있는 배지 공급 유닛인 배양 방법.
  12. 제13항에 있어서, 배양 유닛이 공기 공급구, 공기 배출구, 및 산소 교환막을 구비하지 않는 배양 유닛인 배양 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 배양 유닛이 배지 배출 라인을 더 구비하고, 여기서 배지 배출 라인의 제1 단부는 배지 수납 용기에 접속되며, 배지 배출 라인의 제2 단부는 배양 유닛의 배지 배출구를 통해 배양 유닛 내에 연통되어, 배지가 배지 공급 유닛과 배양 유닛을 순환 가능한 것인 배양 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 세균으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 배양 방법.
  15. 제14항에 있어서, 동물 세포가, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포인 배양 방법.
  16. 제15항에 있어서, 세포가 CHO 세포, CHO-K1 세포주, CHO DP-12 세포주, CHO 세포 관련주, 베로(Vero) 세포, 및 MDCK 세포로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 배양 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인 배양 방법.
  18. 제17항에 있어서, 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막인 배양 방법.
  19. 폴리이미드 다공질막을 포함하는, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 세포 배양 장치.
  20. 제19항에 있어서, 2 이상의 폴리이미드 다공질막이, 상하 또는 좌우로 적층되어 있는 것인 세포 배양 장치.
  21. 폴리이미드 다공질막을 포함하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트.
  22. 세포의 장기 배양 방법을 위한, 폴리이미드 다공질막의 용도.
  23. 세포의 동결 보존 방법으로서,
    (1) 세포를 폴리이미드 다공질막에 담지시키는 공정,
    (2) 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막을, 세포가 동결하는 조건하에 둠으로써, 폴리이미드 다공질막에 담지된 세포를 동결하는 공정, 및
    (3) 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막을, 동결 상태를 유지하는 조건에서 보존하는 공정
    을 포함하는, 세포의 동결 보존 방법.
  24. 제23항에 있어서, 공정 (1)에 있어서, 세포를 폴리이미드 다공질막에 파종함으로써, 세포를 폴리이미드 다공질막에 담지시키는 것인 보존 방법.
  25. 제23항에 있어서, 공정 (1)에 있어서, 세포를 폴리이미드 다공질막에 파종하여 배양함으로써, 세포를 폴리이미드 다공질막에 담지시키는 것인 보존 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (3)에 이어서,
    (4) 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막을, 세포가 해동하는 조건하에 둠으로써, 폴리이미드 다공질막에 담지된 세포를 해동하는 공정
    을 더 포함하는 보존 방법.
  27. 제26항에 있어서, 공정 (4)에 이어서,
    (5) 세포를 해동한 폴리이미드 다공질막을 세포 배양 배지에 적용하여, 세포를 배양하는 공정
    을 더 포함하는 보존 방법.
  28. 제27항에 있어서, 공정 (5)에 있어서, 배양한 세포가 폴리이미드 다공질막 밖에 있어서도 증식할 때까지 세포를 배양하는 것인 보존 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 공정 (5)에 있어서, 세포를 해동한 폴리이미드 다공질막과 함께, 세포를 담지시키고 있지 않은 다른 1 또는 복수의 폴리이미드 다공질막을 세포 배양 배지에 적용하여, 배양함으로써, 다른 1 또는 복수의 폴리이미드 다공질막에 세포를 담지시키는 것인 보존 방법.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (5)에 이어서,
    (6) 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막의 일부 또는 전부를, 세포가 동결하는 조건하에 둠으로써, 폴리이미드 다공질막에 담지된 세포를 동결하는 공정, 및
    (7) 세포를 담지시킨 폴리이미드 다공질막을, 동결 상태를 유지하는 조건에서 보존하는 공정
    을 더 포함하는 보존 방법.
  31. 제30항에 있어서, 공정 (1)~(7)을 복수 회 반복하는 것인 보존 방법.
  32. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모균 및 세균으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 보존 방법.
  33. 제32항에 있어서, 동물 세포가, 척추 동물문에 속하는 동물 유래의 세포인 보존 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 세포가 부착성 세포인 보존 방법.
  35. 제32항 또는 제33항에 있어서, 세포가 부유성 세포인 보존 방법.
  36. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인 보존 방법.
  37. 제36항에 있어서, 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산 이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색된 폴리이미드 다공질막인 보존 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 폴리이미드 다공질막이, 2개의 상이한 표층면과 매크로 보이드층을 갖는 다층 구조의 폴리이미드 다공질막인 보존 방법.
  39. 세포의 동결 보존을 위한 폴리이미드 다공질막.
  40. 제23항 내지 제38항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 이용하기 위한 폴리이미드 다공질막.
  41. 폴리이미드 다공질막을 포함하는, 제23항 내지 제38항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 이용하기 위한 키트.
  42. 제23항 내지 제38항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 위한 폴리이미드 다공질막의 용도.
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112940940B (zh) 2015-01-26 2024-03-15 Ｕｂｅ株式会社 细胞的培养方法及试剂盒
CN107208058B (zh) * 2015-01-26 2021-06-25 宇部兴产株式会社 利用骨髓类似结构的细胞培养方法、和用于骨损伤部位的治疗的聚酰亚胺多孔膜
WO2016121767A1 (ja) 2015-01-26 2016-08-04 宇部興産株式会社 ポリイミド多孔質膜を用いる細胞の長期培養、及びポリイミド多孔質膜を用いる細胞の凍結保存方法
SG11201900674XA (en) 2016-07-25 2019-02-27 Ube Industries Cell culture module
WO2018231993A1 (en) * 2017-06-14 2018-12-20 New York University System and method for paper-based cryopreservation
WO2020067434A1 (ja) * 2018-09-27 2020-04-02 テルモ株式会社 細胞の凍結保存方法
EP3989716A1 (en) * 2019-06-27 2022-05-04 W.L. Gore & Associates, Inc. Biointerfaces for growing seaweed
JP7490668B2 (ja) * 2019-10-25 2024-05-27 富士フイルム株式会社 細胞培養用基材及び細胞付き細胞培養用基材
CN113248748A (zh) * 2020-02-12 2021-08-13 精拓生技股份有限公司 用于体外扩增循环肿瘤细胞的培养容器的复合材料薄膜的制备方法
KR20240038096A (ko) 2021-08-05 2024-03-22 더블유. 엘. 고어 앤드 어소시에이트스, 인코포레이티드 해조류 부착근의 포획 및 부착을 촉진하는 복합 재료
CN114081995B (zh) * 2021-11-30 2022-09-27 广东工业大学 一种以聚酰亚胺为基体的硬组织修复材料及其制备方法和应用
WO2024257852A1 (ja) 2023-06-15 2024-12-19 Ｕｂｅ株式会社 細胞の凍結保存方法、細胞培養方法および凍結保存基材

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5140155A (ja) 1974-10-02 1976-04-03 Tokyo Electric Power Co Randamudeetajushinhoshiki
JPS63196286A (ja) * 1987-02-12 1988-08-15 Sumitomo Electric Ind Ltd 細胞培養用基材
JPH05123168A (ja) 1991-10-30 1993-05-21 Green Cross Corp:The 細胞長期培養方法
JPH0630570A (ja) 1991-06-07 1994-02-04 Alps Electric Co Ltd 圧電モータ
JPH10108673A (ja) 1996-10-04 1998-04-28 Asahi Medical Co Ltd 中空糸型培養器を用いた動物細胞の培養方法
JP2002034551A (ja) 2000-07-18 2002-02-05 Sumitomo Bakelite Co Ltd 細胞付細胞培養器の製造方法および使用方法
JP2003047464A (ja) 2001-08-02 2003-02-18 Institute Of Tsukuba Liaison Co Ltd 動物細胞の保存方法
JP2004173563A (ja) * 2002-11-26 2004-06-24 Applied Cell Biotechnologies Inc ヒト細胞培養に関する方法
WO2010038873A1 (ja) 2008-10-02 2010-04-08 宇部興産株式会社 多孔質ポリイミド膜及びその製造方法
JP2011219585A (ja) 2010-04-07 2011-11-04 Ube Industries Ltd 多孔質ポリイミド膜及びその製造方法
JP2011219586A (ja) 2010-04-07 2011-11-04 Ube Industries Ltd 多孔質ポリイミド膜及びその製造方法

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT293313B (de) 1970-06-01 1971-10-11 Jungbunzlauer Spiritus Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch submerse Gärung
US4228243A (en) * 1978-07-13 1980-10-14 Toray Industries, Inc. Cell culture propagation apparatus
JPH0630570B2 (ja) 1985-09-18 1994-04-27 株式会社ミドリ十字 付着性細胞の連続大量培養法
JPS63196271A (ja) * 1987-02-10 1988-08-15 Sumitomo Electric Ind Ltd 細胞培養用基材
JPS63196274A (ja) * 1987-02-10 1988-08-15 Sumitomo Electric Ind Ltd 細胞培養用基材
JPS63196272A (ja) * 1987-02-10 1988-08-15 Sumitomo Electric Ind Ltd 細胞培養用基材
JPS63198975A (ja) * 1987-02-13 1988-08-17 Sumitomo Electric Ind Ltd 細胞培養用基材
JPS63198978A (ja) 1987-02-13 1988-08-17 Sumitomo Electric Ind Ltd 細胞培養用基材
EP1054055A1 (en) * 1999-05-19 2000-11-22 Sony International (Europe) GmbH Method for providing a substrate structure for oriented neuron growth, substrate structure, and device for monitoring neurons
US20040058437A1 (en) 2001-04-10 2004-03-25 Rodgers Seth T. Materials and reactor systems having humidity and gas control
AU2003272223A1 (en) * 2002-08-19 2004-03-03 Bioprocessors Corporation Determination and/or control of reactor environmental conditions
US20050265980A1 (en) 2004-05-14 2005-12-01 Becton, Dickinson And Company Cell culture environments for the serum-free expansion of mesenchymal stem cells
TW200708304A (en) 2005-03-25 2007-03-01 Nipro Corp Package of freeze storage container and process for producing the same
GB0512214D0 (en) * 2005-06-15 2005-07-27 Capsant Neurotechnologies Ltd Method
JP5464443B2 (ja) 2008-03-31 2014-04-09 オリエンタル酵母工業株式会社 多能性幹細胞を増殖させる方法
JP5140155B2 (ja) 2008-06-24 2013-02-06 独立行政法人海洋研究開発機構 動物細胞の凍結保存用担体、それを用いた凍結保存用バイオデバイス及び凍結保存方法
JP5720574B2 (ja) * 2009-10-09 2015-05-20 宇部興産株式会社 着色ポリイミド成形体及びその製造方法
JP2011172533A (ja) * 2010-02-25 2011-09-08 Fusao Komada マイクロ空間構造体を用いた高密度三次元細胞培養法
WO2011125988A1 (ja) * 2010-04-07 2011-10-13 宇部興産株式会社 多孔質ポリイミド膜及びその製造方法
US8366804B2 (en) * 2010-05-28 2013-02-05 Uop Llc High permeance polyimide membranes for air separation
CN103710263B (zh) * 2012-09-28 2015-05-27 江苏吉锐生物技术有限公司 细胞培养装置
JP6343492B2 (ja) * 2013-07-09 2018-06-13 豊田合成株式会社 細胞培養用および癌細胞増殖抑制用の少なくとも一方の用途に用いるポリウレタン多孔質膜の製造方法
WO2015012415A1 (ja) 2013-07-26 2015-01-29 宇部興産株式会社 細胞の培養方法、細胞培養装置及びキット
CN204079987U (zh) * 2014-07-04 2015-01-07 赫柏慧康生物科技无锡有限公司 一种新型细胞片层培养皿
WO2016121767A1 (ja) 2015-01-26 2016-08-04 宇部興産株式会社 ポリイミド多孔質膜を用いる細胞の長期培養、及びポリイミド多孔質膜を用いる細胞の凍結保存方法

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5140155A (ja) 1974-10-02 1976-04-03 Tokyo Electric Power Co Randamudeetajushinhoshiki
JPS63196286A (ja) * 1987-02-12 1988-08-15 Sumitomo Electric Ind Ltd 細胞培養用基材
JPH0630570A (ja) 1991-06-07 1994-02-04 Alps Electric Co Ltd 圧電モータ
JPH05123168A (ja) 1991-10-30 1993-05-21 Green Cross Corp:The 細胞長期培養方法
JPH10108673A (ja) 1996-10-04 1998-04-28 Asahi Medical Co Ltd 中空糸型培養器を用いた動物細胞の培養方法
JP2002034551A (ja) 2000-07-18 2002-02-05 Sumitomo Bakelite Co Ltd 細胞付細胞培養器の製造方法および使用方法
JP2003047464A (ja) 2001-08-02 2003-02-18 Institute Of Tsukuba Liaison Co Ltd 動物細胞の保存方法
JP2004173563A (ja) * 2002-11-26 2004-06-24 Applied Cell Biotechnologies Inc ヒト細胞培養に関する方法
WO2010038873A1 (ja) 2008-10-02 2010-04-08 宇部興産株式会社 多孔質ポリイミド膜及びその製造方法
JP2011219585A (ja) 2010-04-07 2011-11-04 Ube Industries Ltd 多孔質ポリイミド膜及びその製造方法
JP2011219586A (ja) 2010-04-07 2011-11-04 Ube Industries Ltd 多孔質ポリイミド膜及びその製造方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. Bissoyi et al./Cryobiology 68(2014) 332-342
Daoud et al., Biomaterials 32(2011) 1536-1542
Mortera-Blanco et al., Biomaterials 32(2011) 9263-9270

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