KR20200035267A

KR20200035267A - 이메텔스타트를 제조하기 위한 향상된 공정

Info

Publication number: KR20200035267A
Application number: KR1020207003199A
Authority: KR
Inventors: 잘레 무슬레히디노글루; 디네쉬 갈라; 제니퍼 엘리자베스 알바네제-워커
Original assignee: 제론 코포레이션
Priority date: 2017-07-10
Filing date: 2018-07-09
Publication date: 2020-04-02
Anticipated expiration: 2038-07-09
Also published as: US20240199672A1; DK3652187T3; HUE056722T2; JP2020526524A; KR102709587B1; PL3652187T3; ES2901099T3; US11332489B2; EA038579B1; TWI775895B; EA202090006A1; ZA201908452B; UA125185C2; CN110891961B; JP7199410B2; US20230070069A1; TW201920228A; WO2019011829A1; CA3195922A1; HRP20211940T1

Abstract

본 발명은, 지지 결합된 올리고뉴클레오티드의 3'-아미노기의 탈보호 단계, 5'-포스포르아미다이트와의 결합 단계, 및 아실 디설파이드를 이용한 황화 단계를 포함하는 사이클 당 3 단계의 고상 지지체 결합 공정을 이용하여 텔로머라제 억제제 이메텔스타트를 제조하는 방법에 있어서, 미반응 3'-아미노 올리고뉴클레오티드기가 후속 사이클 동안 반응하는 것을 방지하기 위해 사용되는 추가적인 캡핑 단계가 각 사이클에 없는 것을 특징으로 하는, 텔로머라제 억제제 이메텔스타트를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이메텔스타트는 하기 화학식을 갖는다.

Description

이메텔스타트를 제조하기 위한 향상된 공정

본 발명은, 지지 결합된 올리고뉴클레오티드의 3'-아미노기의 탈보호 단계, 5'-포스포르아미다이트와의 결합 단계, 및 아실 디설파이드를 이용한 황화 단계를 포함하는 사이클 당 3 단계의 고상 지지체 결합 공정을 이용하여 텔로머라제 억제제 이메텔스타트(imetelstat)를 제조하는 방법에 있어서, 미반응 3'-아미노 올리고뉴클레오티드기가 후속 사이클 동안 반응하는 것을 방지하기 위해 사용되는 추가적인 캡핑 단계가 각 사이클에 없는 것을 특징으로 하는, 텔로머라제 억제제 이메텔스타트를 제조하는 방법에 관한 것이다.

이메텔스타트[서열 번호(SEQ ID NO) 1]는 팔미토일 지질 부분(palmitoyl lipid moiety)에 공유 결합된 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 올리고뉴클레오티드이며, 국제 공개 WO-2005/023994호에 화합물(1F)로서 기술되어 있다. 이메텔스타트의 나트륨 염은 효능 있고 특이적인 텔로머라제 억제제로 작용하며, 텔로머라제-매개 장애, 예를 들어, 골수섬유증(MF), 골수이형성 증후군(MDS), 및 급성 골수성 백혈병(AML)과 같은 장애를 포함하여 암을 치료하는 데 사용될 수 있다.

이메텔스타트 나트륨의 구조는 아래에 나타낸 바와 같다:

또한, 이메텔스타트의 구조는 아래에 나타낸 바와 같이 표시될 수 있다:

LPT기는 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 올리고뉴클레오티드에 공유 결합된 팔미토일 지질을 나타낸다. 13개의 뉴클레오티드의 염기 서열은 TAGGGTTAGACAA이고, 염기 B₁ 내지 B₁₃으로 표시된다. 상기 구조식의 -NH-P(=S)(OH)-기 및 -O-P(=S)(OH)-기는 염 형태로 발생할 수 있다. 주제의 화합물의 염 형태는 구체적으로 나타내지 않더라도 본원에 도시된 구조식에 의해 포함되는 것으로 이해된다.

이메텔스타트 나트륨은 또한 다음과 표시될 수 있다:

-NH-P(=S)(OH)-기와, 티민, 아데닌, 구아닌, 및 시토신 염기는 본 설명의 도면에 사용된 그 밖의 다른 상호변이성 배열(tautomeric arrangement)에서 발생할 수 있다. 주제의 화합물의 모든 상호변이성 형태는 구체적으로 나타내지 않더라도 화합물의 하나의 가능한 상호변이성 형태가 기재된 구조에 의해 포함되는 것으로 이해된다.

종래기술

이미텔스타트를 화합물(1F)로서 제조하기 위해 국제 공개 WO-2005/023994호에서 사용된 합성 도식은 하기의 도식 1 및 도식 2에 기재되어 있다. 이 올리고뉴클레오티드의 합성은 모든 반응이 고상(solid-phase) 지지체에서 일어나는 고상 포스포르아미다이트 방법을 사용하여 달성된다. 이메텔스타트의 합성은 3-팔미토일아미도-1-O-(4, 4'-디메톡시트리틸)-2-O-숙시닐 프로판디올이 담지된 제어된 공극 유리(LCAA-CPG)에서 수행된다. 올리고뉴클레오티드는 활성화제의 도움으로 보호된 뉴클레오시드 5'-포스포르아미다이트의 첨가에 의해 5'로부터 3'말단으로 조립된다. 각각의 신장 사이클은 탈보호, 아미다이트 결합, 황화, 및 캡핑 단계의 4가지 개별적이고 고도로 제어된 단계로 구성된다.

도식 1: 이메텔스타트 합성 도식 사이클 1

도식 1에서, 고상 지지된 합성은 고상 지지체에 연결된 팔미토일아미도프로판디올로부터 산-불안정 4,4-디메톡시-트리틸(DMT) 보호기를 제거하는 것으로 시작된다. 제1 포스포르아미다이트 뉴클레오티드를 지지체에 결합시킨 후, 아세토니트릴과 2,6-루티딘의 혼합물(1:1의 비) 중 0.1 M 페닐아세틸 디설파이드(PADS) 용액을 사용하여 형광체를 황화시킨다. 그 다음, 다음의 반응 사이클들에서 임의의 미반응 고상 지지체 출발 물질이 포스포르아미다이트 뉴클레오티드와 결합되는 것을 방지하기 위해 캡핑 단계가 적용된다. 캡핑은 THF/이소부티르산 무수물/2,6-루티딘의 18:1:1 혼합물을 사용하여 수행된다.

고상 지지체의 첫 번째 사이클 후, 사슬 신장은, 도식 2에 도시된 바와 같이, 서열에서 다음에 필요한 뉴클레오티드에 상응하는 보호된 뉴클레오티드 포스포르아미다이트 단량체의 과량의 용액과, 지지체-결합 올리고뉴클레오티드의 3'-아미노기의 반응에 의해 달성된다.

도식 2: 이메텔스타트 합성 도식 사이클 2-13

도식 2에서, 첫 번째 사이클은 사슬 신장 과정을 도시하는데, 이는 지지체-결합 올리고뉴클레오티드의 3'-아미노기의 탈보호(a), 이에 이어지는, 이메텔스타트의 서열에서 다음에 필요한 뉴클레오티드에 해당하는 5'-포스포르아미다이트 단량체의 과량의 용액과의 지지체-결합 올리고뉴클레오티드의 3'-아미노기의 결합 반응(b)에 의해 달성된다. 상기 결합 반응 후, 지지체 결합된 올리고뉴클레오티드의 형광체의 황화(c), 및 다음의 반응 사이클들에서 임의의 미반응 고상 지지체 출발 물질(b)이 5'-포스포르아미다이트 뉴클레오티드와 결합되는 것을 방지하기 위한 캡핑 단계(도식 3 참조)가 이어진다. 도식 2의 반응 사이클을 12회 반복한 후에 고상 지지체-결합 올리고뉴클레오티드를 에탄올와 농축 암모니아의 1:1 혼합물로 처리한 다음, HPLC 정제하여 이미텔스타트를 수득한다.

THF/이소부티르산 무수물/2,6-루티딘의 18:1:1 혼합물을 사용하는 캡핑 단계가 행해짐으로써, 상기 결합 단계 후에, 1차 3'-아미노기를 갖는 임의의 잔류 고상 지지체 결합된 올리고뉴클레오티드(b)를 보호된(또는 '캡핑된') 3'-아미노기를 갖는 올리고뉴클레오티드(e)로 전환시켜서, 다음 반응 사이클들에서 상기 1차 3'-아미노기가 포스포르아미다이트 뉴클레오티드와 결합되는 것이 방지되도록 한다.

국제 공개 WO-01/18015호는 서열 번호 2를 갖는 실시예 3에서 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 올리고뉴클레오티드와, 캡핑 단계를 포함하는 이 올리고뉴클레오티드의 제조 방법을 개시한다.

허버트 비-에스(Herbert B-S) 등은 GRN163의 지질 변형을 논의했다(문헌[Oncogene (2005) 24, 5262-5268] 참조). 마키코 호리에(Makiko Horie) 등은 인간 텔로머라제 RNA 서브유닛을 표적으로 하는 2'-O,4'-C-에틸렌-가교된 핵산 올리고뉴클레오티드의 합성 및 특성을 논의했다(문헌[Nucleic Acids Symposium Series (2005) 49, 171-172] 참조).

국제 공개 WO-01/18015호 및 국제 공개 WO-2005/023994호에 개시된 고상 지지체 결합 공정에서의 결합 반응은 지지체-결합 올리고뉴클레오티드 상의 임의의 미반응 1차 3' 아미노기가 후속 사이클 동안 반응하는 것을 방지하는 캡핑 단계를 포함한다.

지금에 이르러 놀랍게 발견한 것은, 종래 기술에서 설명된 캡핑 단계의 사용이 불필요 하다는 것과, 이메텔스타트가 추가 캡핑 단계 없는 3 단계 사이클을 사용하여 특정 캡핑 단계를 사용하는 종래 기술의 4 단계 사이클과 비교하여 거의 동일한 수율 및 순도로 제조될 수 있다는 것이다. 각 사이클에서 캡핑 단계를 제거하게 되면 사이클 단계 수가 22%(54 단계에서 42 단계로) 감소되고 결과적으로 공정 시간이 단축됨으로써 전체 공정에 이롭다. 또한, 사이클 단계 수의 감소로 인해 용매 소비가 감소되어 보다 친환경적인 공정이 이루어진다.

이 본문 전체에 걸쳐 "캡핑 단계"라는 용어가 사용되는 경우에는 어느 경우든지 간에 추가적인 화학 공정 단계를 정의하려는 것이며, 이 경우, 고상 지지체 결합된 올리고 뉴클레오티드 상의 1차 유리 3'-아미노기는 치환된 2차 또는 3차 3'-아미노기로 변환되며, 이는 후속하는 결합 단계에서의 보호된 3'-아미노뉴클레오시드-5'-O-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노-포스포르아미다이트 단량체와의 결합 반응에 참여할 수 없다.

일 실시형태에서, 본 발명은 하기 화학식의 올리고뉴클레오티드 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트를 합성하는 방법에 관한 것으로서,

이 방법은,

a) PG가 산-불안정성 보호기인 화학식(A)의 고상 지지체에 부착된 제1 3'-아미노 보호된 뉴클레오티드를 제공하는 단계;

b) 상기 보호된 3'-아미노기를 탈보호하여 유리 3'-아미노기를 형성하는 단계;

c) 상기 유리 3'-아미노기를 하기 화학식(B'_n)의, 여기서 n = 2임, 보호된 3'-아미노뉴클레오시드-5'-O-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노포스포르아미다이트 단량체와 반응시켜서 뉴클레오시드 간의 N3'→P5' 포스포르아미다이트 연관(linkage)을 형성하는 단계;

d) 아실 디설파이드를 사용한 뉴클레오시드 간의 포스포르아미다이트기의 황화로 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트를 형성하는 단계;

e) 상기 탈보호 단계 b), 화학식(B'_n)의 보호된 3'-아미노뉴클레오시드-5'-O-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노-포스포르아미다이트 단량체와 결합시키는 단계 c), 및 상기 황화 단계 d)를 연속적인 순서로 11회 반복하는 단계로서, 여기서 단량체(B'_n)의 보호된 뉴클레오시드 염기 B'은 각각의 11회의 결합 단계에서 연속적으로 보호된 핵 염기 B₃ 내지 B₁₃인, 단계;

f) 산-불안정성 보호기 PG를 제거하는 단계; 및

g) 상기 고상 지지체로부터 이메텔스타트를 절단 및 탈보호하는 단계를 포함하되,

상기 반응 단계 a) 내지 단계 e) 중 어느 단계에서도 추가의 캡핑 단계가 수행되지 않는 것을 특징으로 한다.

일 실시형태에서, 본 발명은 하기 화학식의 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 올리고뉴클레오티드 이메텔스타트를 합성하는 방법에 관한 것으로서,

이 방법은,

c) 상기 유리 3'-아미노기를 화학식(B'_n)의, 여기서 n = 2인 경우 B'_n은 보호된 A임, 보호된 3'-아미노뉴클레오시드-5'-O-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노포스포르아미다이트 단량체와 반응시켜서 뉴클레오시드 간의 N3'→P5'-포스포르아미다이트 연관을 형성하는 단계;

e) 상기 탈보호 단계 b), 화학식(B'_n)의 보호된 3'-아미노뉴클레오시드-5'-O-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노-포스포르아미다이트 단량체와 결합시키는 단계 c), 및 상기 황화 단계 d)를 연속적인 순서로 11회 반복하는 단계로서, 여기서 단량체(B'_n)의 뉴클레오시드 염기 B'은 B가 티민인 경우를 제외하고는 보호된 B이고, B_n은 각각의 11회의 결합 단계에서 연속적으로 핵 염기 B₃ 내지 B₁₃임, 단계;

f) 산-불안정성 보호기 PG를 제거하는 단계; 및

g) 상기 고상 지지체로부터 이메텔스타트를 탈보호 및 절단하는 단계를 포함하되,

이 방법은,

a) PG가 산-불안정성 보호기인 화학식(A)의 고상 지지체에 부착된 제1 보호된 3'-아미노 뉴클레오티드를 제공하는 단계;

b) 상기 PG-보호된 3'-아미노기를 탈보호하여 하기 화학식(A')의 유리 3'-아미노 뉴클레오티드를 형성하는 단계;

c) 상기 유리 3'-아미노기를 보호된 3'-아미노뉴클레오시드-5'-O-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노포스포르아미다이트 단량체(B'_n)와 결합시켜서, 여기서 n = 2인 경우 B'_n은 보호된 A임, 뉴클레오시드 간의 N3'→P5'-포스포르아미다이트 연관을 형성하는 단계;

d) 아실 디설파이드를 사용하여 상기 N3'→P5'-포스포르아미다이트 연관을 황화시켜서 뉴클레오시드 간의 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 결합을 형성하는 단계;

e) 상기 탈보호 단계 b), 보호된 3'-아미노뉴클레오시드-5'-O-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노-포스포르아미다이트 단량체(B'_n)와 결합시키는 단계 c), 및 상기 황화 단계 d)를 연속적인 순서로 11회 반복하는 단계로서, 여기서 단량체(B'_n)의 뉴클레오시드 염기 B'은 B가 티민인 경우를 제외하고는 보호된 B이고, B_n은 각각의 11회의 결합 단계에서 연속적으로 핵 염기 B₃ 내지 B₁₃인, 단계;

f) 상기 보호된 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 올리고뉴클레오티드 이메텔스타트로부터 3'-말단 산-불안정성 보호기 PG를 제거하는 단계; 및

g) 상기 고상 지지체로부터 상기 보호된 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 올리고뉴클레오티드 이메텔스타트를 탈보호 및 절단하는 단계를 포함하되,

다양한 고상 지지체가 본 발명에 사용될 수 있으며, 예컨대 제어된 공극 유리(CPG)로 제조된 미세 입자, 고도로 가교된 폴리스티렌, 가교된 폴리스티렌 지지체가 담지된 하이브리드 제어된 공극 유리, 아크릴 공중 합체, 셀룰로오스, 나일론, 덱스트란, 라텍스, 폴리아크롤레인 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

하기 화학식(A)의 고상 지지체에 부착된 3'-아미노 보호된 뉴클레오티드가

국제 공개 WO-2005/023994호에 개시된 바와 같이 제조될 수 있고, 여기서 3-팔미토일아미도-1-O-(4, 4'-디메톡시트리틸)-2-O-숙시닐 프로판디올이 담지된 제어된 기공 유리 지지체가 하기 화학식(B'₁)의 보호된 3'-아미노뉴클레오시드-5'-O-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노포스포르아미다이트 단량체와 결합하며,

여기서 PG는 산-불안정성 보호기이다. 적합한 산-불안정성 3'-아미노 보호기 PG는 예를 들면 트리페닐메틸(즉, 트리틸 또는 Tr), P-아니실디페닐메틸(즉, 모노-메톡시트리틸 또는 MMT), 및 디-p-아니실페닐메틸(즉, 디메메톡시트리틸 또는 DMT)이지만, 이에 한정되지 않는다.

화학식(B'_n)의 보호된 3'-아미노뉴클레오시드-5'-O-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노 포스포르아미다이트 단량체는 산-불안성정 보호기인 3'-아미노 보호기 PG, 예컨대 트리페닐메틸(즉, 트리틸 또는 Tr), p-아니실디페닐메틸(즉, 모노메톡시트리틸 또는 MMT), 또는 디-p-아니실페닐메틸(즉, 디메톡시트리틸 또는 DMT)를 갖는다. 또한, 뉴클레오시드 염기 B'은 염기-불안정성 보호기로 보호된다(티민 제외).

뉴클레오티드 단량체 B'₁ 및 B'₂ 내지 B'₁₃은, 3-팔미토일아미도-1-O-(4, 4'-디메톡시트리틸)-2-O-숙시닐 프로판디올이 담지되고 뉴클레오티드 단량체 B'₁에 결합된 고상 지지체를 제공하는 것에서부터 시작해서 이어서 뉴클레오티드 단량체 B'₂ 내지 B'₁₃이 사용되는 12회의 탈보호, 결합, 및 황화 반응의 사이클이 이어지는 13회의 결합 단계에서 연속적으로 사용된다.

3'-아미노 보호기 PG는 산성 용액, 예컨대 디클로로메탄 또는 톨루엔 중의 디클로로아세트산으로 처리함으로써 제거될 수 있다.

화학식(B'_n)의 보호된 3'-아미노뉴클레오시드-5'-O-시아노에틸-N,N-디이소프로필-아미노포스포르아미다이트 단량체 중의 뉴클레오시드 염기 B'은 염기-불안정성 보호기로 보호되며, 이는 단계 f)에서 제거된다. 뉴클레오시드 염기 아데닌, 시토신, 또는 구아닌에 적합한 염기-불안정성 보호기는, 예를 들면, 아세틸, 벤조일, 이소부티릴, 디메틸-포름아미디닐, 또는 디벤질포름아미디닐과 같은 아실기이다. 올리고뉴클레오티드 합성에 사용된 반응 조건 하에서는, 티민 뉴클레오시드 염기는 보호가 필요하지 않다. 산-불안정성기로 보호된 3'-아미노 보호기 PG 및 염기 불안정성 보호기로 보호된 뉴클레오시드 염기 B'을 갖는 화학식(B'_n)의 이러한 보호된 3'-아미노-뉴클레오시드-5'-O-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노포스포르아미다이트 단량체는 상업적으로 입수할 수 있거나 또는 국제 공개 WO-2006/014387호에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.

결합 단계 c)는 화학식(B_n)의 보호된 3'-아미노-뉴클레오시드-5'-O-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노포스포르아미다이트 단량체 용액 및 활성화제 용액(또는 포스포르아미다이트 단량체(B_n) 및 활성화제를 함유하는 용액)을, 고형 지지체에 공유 부착된 (올리고)뉴클레오티드의 유리 아미노기를 함유하는 반응 용기에 첨가함으로써 수행된다. 이어서, 혼합물을 기계식 볼텍싱, 불활성 기체 살포 등의 방법으로 혼합한다. 대안적으로, 단량체 및 활성화제의 용액(들)을, 유리 3'-아미노기를 갖는 고상 지지된 (올리고)뉴클레오티드를 함유하는 반응 용기(또는 컬럼)를 통해, 흐르게 할 수 있다. 단량체와 활성화제를 사전에 혼합하거나, 적합한 합성기의 밸브-블록에서 혼합하거나, 예비 활성화 용기에서 혼합하여 원하는 경우 예비 평형화시키거나, 또는 반응 용기에 개별적으로 첨가할 수 있다.

본 발명에 사용하기 위한 활성화제의 예는 테트라졸, 5-(에틸티오)-1H-테트라졸, 5-(4-니트로-페닐)테트라졸, 5-(2-티에닐)-1H-테트라졸, 트리아졸, 피리디늄 클로라이드 등이 있지만, 이에 한정되지 않는다. 적합한 용매는 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란, 디클로로메탄 등이다. 실제로, 아세토니트릴은 올리고뉴클레오티드 합성에 일반적으로 사용되는 용매이다.

단계 d)에 사용하기 위한 황화제는 용매에 용해된 아실 디설파이드이다. 아실 디설파이드는 예를 들면 디벤조일 디설파이드, 비스(페닐아세틸) 디설파이드(PADS), 비스(4-메톡시벤조일) 디설파이드, 비스(4-메틸벤조일) 디설파이드, 비스(4-니트로벤조일) 디설파이드, 및 비스(4-클로로벤조일) 디설파이드이다.

페닐아세틸 디설파이드(PADS)는 최적의 황화 활성을 얻기 위해서 염기성 용액에서 가장 잘 '숙성'되는 황화 반응에 일반적으로 사용되는 작용제이다(문헌[Scotson J.L. et al., Org. Biomol. Chem., vol. 14, 10840-10847, 2016] 참조). PADS에 적합한 용매는 예를 들면 3-피콜린 또는 2,6-루티딘과 같은 염기성 용매와 아세토니트릴, 톨루엔, 1-메틸-피롤리디논, 또는 테트라하이드로푸란과 같은 공용매의 혼합물이다. 염기성 용매의 양 대 공용매의 양은 1:1의 비를 포함한 임의의 비일 수 있다. 포스파이트 에스테르가 상응하는 티오포스페이트로 전환되는 것 여하에 따라, PADS는 '신선한' 것과 '숙성된' 것 모두가 사용될 수 있지만, '숙성된' PADS가 황화 속도 및 효율을 개선시키는 것으로 나타났다. '숙성된' PADS 용액은 황화 반응에 사용하기 전에 일정 시간 유지된 새로 제조된 PADS 용액이다. 숙성 시간은 수 시간에서 48시간까지 다양할 수 있으며, 당업자는 황화 반응을 수율 및 순도에 대해서 분석함으로써 최적의 숙성 시간을 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 이메텔스타트 제조를 위해, 숙성 시간을 4시간 내지 14시간으로 유지한 아세토니트릴과 2,6-루티딘의 바람직하게는 1:1 비의 혼합물 중의 PADS 용액이 사용된다. 2,6-루티딘이 사용될 때 2,3,5-콜리딘(2,6-루티딘에서 종종 불순물로 발견됨)의 양을 0.1% 아래로 제한하면 황화 효율이 개선되고 덜 바람직하지 않은 형광체 산화가 관찰된다는 것이 밝혀졌다.

단계 g)에서, 이메텔스타트는 탈보호되고 고상 지지체로부터 절단된다. 탈보호는 뉴클레오티드 염기 상의 β-시아노에틸기 및 염기-불안정성 보호기의 제거를 포함한다. 이는 아세토니트릴 중의 디에틸아민(DEA) 용액과 같은 염기성 용액으로 처리한 후 에탄올과 같은 알코올에 용해된 암모니아수로 처리함으로써 행해질 수 있다.

본 발명의 반응 단계 a) 내지 단계 f)는 10℃ 내지 40℃의 온도 범위에서 실행된다. 보다 바람직하게는, 이들 반응은 15℃ 내지 30℃ 범위의 제어된 온도에서 실행된다. 특히, 본 발명의 반응 단계 b)는 15℃ 내지 30℃의 온도 범위, 보다 특히 17℃ 내지 27℃의 온도 범위에서 수행된다. 특히, 본 발명의 반응 단계 d)는 17℃ 내지 25℃의 온도 범위, 보다 특히 18℃ 내지 22℃의 온도 범위, 훨씬 더 특히 19℃의 온도 범위에서 수행된다. 이메텔스타트가 탈보호되고 고상 지지체로부터 절단되는 단계 g)는 30℃ 내지 60℃ 범위의 온도에서 실행된다. 사용된 장비 및 특정 반응 조건에 따라, 상기 언급된 범위 내의 각 단계 a) 내지 단계 g)를 위한 최적 반응 온도는 당업자에 의해 결정될 수 있다.

신장 사이클의 각 단계 후에, 고상 지지체는 다음 반응을 준비하기 위해 용매, 예를 들어 아세토니트릴로 세정된다.

단계 g) 후에, 원료 이미텔스타트가 암모늄 염 형태로 수득되고, 이는 이어서 고분자 수지 또는 실리카계 수지를 사용하여 예비 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 정제됨으로써 트리에틸 아민 형태의 정제된 이미텔스타트가 얻어진다. 과량의 나트륨 염을 첨가한 다음 용액을 정용 여과에 의해 탈염시킴으로써 이미텔스타트 나트륨이 수득되고, 이는 이어서 물을 제거하기 위해 동결 건조된다.

실험 부분

'실온' 또는 '주위 온도'는 일반적으로 21℃ 내지 25℃ 범위이다.

실험 1(캡핑 단계 없음)

톨루엔 중 3% 디클로로아세트산(DCA), 아세토니트릴 중 0.5 M 5-(에틸티오)-1H-테트라졸, 아세토니트릴 중 화학식(B'_n)의 4개의 뉴클레오티드 단량체 모두의 0.15 M, 아세토니트릴과 2,6-루티딘의 1:1 혼합물 중 0.2 M 페닐 아세틸 디설파이드(PADS), 및 아세토니트릴 중 20% DEA(디에틸아민)을 포함한 출발 물질 용액들과 모든 시약을 준비했다.

올리고뉴클레오티드 합성은 탈트리틸화 및 이에 후속한 결합과 주위 온도에서 수행된 황화로 이루어진 반복적 합성 사이클을 이용하여 5'에서 3' 방향으로 수행되었다.

뉴클레오티드 단량체 B'₁과 결합된 3-팔미토일아미도-1-O-(4, 4'-디메톡시트리틸)-2-O-숙시닐 프로판디올(400 μmol/g 용량을 기준으로 3.5 mmol)이 담지된 고형 지지체로 컬럼(직경: 3.5 cm)을 패킹했다. 톨루엔 중 3% 디클로로아세트산(DCA)을 사용하여 탈트리틸화를 달성하고(양은 각 탈트리틸화 단계에서 6.5 내지 13.4 컬럼 부피), 고형-지지체 결합된 뉴클레오티드를 아세토니트릴로 세척했다(양은 5 컬럼 부피). 화학식(B'_n)의 뉴클레오티드 단량체와의 결합은, 아세토니트릴 중 0.5 M 5-(에틸티오)-1H-테트라졸 용액과 화학식(B'_n) 중의 0.15 M의 다음 뉴클레오티드 단량체를 컬럼을 통해 순서대로 펌핑함으로써, 달성되었다. 컬럼을 아세토니트릴(양은 2 컬럼 부피)로 세척했다. 그 다음, 아세토니트릴과 2,6-루티딘 혼합물의 1:1 혼합물 중의 0.2 M 페닐 아세틸 디설파이드(PADS) 용액을 컬럼을 통해 펌핑함으로써 황화가 수행되었고, 이어서 컬럼을 아세토니트릴(양은 5 컬럼 부피)로 세척했다.

탈트리틸화, 화학식(B'_n)의 뉴클레오티드 단량체와의 결합, 및 황화로 이루어진 합성 사이클을 12회 반복한 후, 톨루엔 중 3% 디클로로아세트산(DCA)을 사용하여(양은 6.5 내지 13.4 컬럼 부피) 탈트리틸화했다.

합성 사이클이 완료된 때, 고형 지지체의 지지체 상의 원료 올리고뉴클레오티드를 디에틸아민(DEA) 용액으로 처리한 다음, 55℃의 온도에서 암모늄 하이드록사이드 용액:에탄올(3:1 부피비)로 처리했다. 반응 혼합물을 55℃에서 4 내지 24시간 동안 숙성시키고, 실온으로 냉각시키고, 슬러리를 여과시켜 중합체 지지체를 제거했다. 암모늄 형태의 이메텔스타트를 포함하는 용액에 대해 실험 3의 HPLC 분석 절차를 거쳤다.

실험 2(캡핑 단계 포함)

톨루엔 중 3% 디클로로아세트산(DCA), 아세토니트릴 중 0.5 M 5-(에틸티오)-1H-테트라졸, 아세토니트릴 중 화학식(B'_n)의 4개의 뉴클레오티드 단량체 모두의 0.15 M, 아세토니트릴과 2,6-루티딘 혼합물의 1:1 혼합물 중 0.2 M 페닐 아세틸 디설파이드(PADS), 캡핑제 A로서의 아세토니트릴 중 20% N-메틸이미다졸(NMI), 캡핑제 B로서의 아세토니트릴과 2,6-루티딘 혼합물의 1:1 혼합물 중 이소부티르산 무수물, 및 아세토니트릴 중 20% DEA를 포함한 출발 물질 용액들과 모든 시약을 준비했다.

황화 후에 캡핑 단계가 이어졌다. 주어진 사이클에서의 각각의 캡핑에 37 내지 47 당량(eq.)의 캡핑제 NMI와, 9 내지 11 당량의 및 캡핑제 B 이소부트리 무수물(IBA)과, 1.4 내지 1.8 당량의 2,6 루티딘을 사용했다. 캡핑제 A와 캡핑제 B를 별도의 펌프로 상이한 비율, 예컨대 50:50, 35:65, 65:35로 컬럼을 통해 펌핑했다.

탈트리틸화, 화학식(B'_n)의 뉴클레오티드 단량체와의 결합, 및 황화와, 그리고 캡핑 단계로 이루어진 합성 사이클을 12회 반복한 후, 톨루엔 중 3% 디클로로아세트산(DCA)을 사용하여(양은 6.5 내지 13.4 컬럼 부피) 탈트리틸화했다.

실험 3: 무캡핑과 캡핑의 비교

실험 1 및 실험 2에서 수득한 이메텔스타트를 HPLC로 분석했다. 13개의 뉴클레오티드를 갖는 바람직한 전장 올리고 뉴클레오티드의 양을 측정하여, 실험 1 및 실험 2에 대해 하기 표에 목록화했다. 또한, 쇼트머(shortmer)의 총량, 구체적으로는 12머(12mer)의 총량을 측정하여, 실험 1 및 실험 2에 대해 하기 표에 목록화했다.

HPLC 분석 방법:

컬럼 유형: 크로마실(Kromasil) C18, 3.5 μm 입자 크기, 4.6 X 150 mm

용리액:

A: 물 중에 14.4mM TEA/386mM HFIP(헥사플루오로이소프로판올)/100ppm(w/v) Na₂EDTA

B: 50% MeOH, 5% IPA를 함유한 50% EtOH

구배:

실험 1 및 실험 2의 HPLC 분석은 수율 및 순도가 무캡핑 실험 대 캡핑 실험에서 비교된다는 것을 입증하고 있다.

메인 피크 %는 전장 올리고뉴클레오티드 + PO 불순물 + 탈퓨린화 불순물을 포함한다. PO 불순물은 티오포스포르아미데이트 뉴클레오시드 간 결합 대신에 하나 이상의 옥소포스포르아미데이트 뉴클레오시드 간 결합을 포함하는 불순물이다.

용매 사용 및 반응 시간

0.45 L의 아세토니트릴/mmol은 시약 제조 동안의 전체 아세토니트릴 사용의 대략 25%에 해당하는 캡핑제 A와 캡핑제 B 시약을 제조하는 데 사용된다. 각각의 화학 반응 단계 후에 용매 세척이 이어지기 때문에, 각각의 캡핑 단계 후에도, 약 40 컬럼 부피의 용매에 상당하는 용매 세척이 일어난다. 주어진 합성 실행에 대해 약 212 컬럼 부피의 용매 세척이 수행되는 것을 고려하면, 세척 용매의 약 19%가 캡핑 단계에 사용된다. 각 캡핑 단계는 3 내지 6분 소요된다. 이는 13회 사이클과 DEA 처리를 포함한 전체 합성 시간의 약 8%에 해당한다.

실험 4(탈트리틸화 온도)

탈트리틸화 온도는 n-1 및 탈퓨린화 불순물 제어에 영향을 미친다. 합성기의 입구에서의 탈블로킹 용액의 온도는 17.5℃에서 27℃까지 사이에서 선택되었고(3.5 mmol 스케일에서), 그 선택된 온도는 모든 탈트리틸화 단계에서 동일하게 유지되었다. 아세토니트릴 세척도 또한 탈블로킹 용액과 동일한 온도로 유지되었다. 탈퓨린화 불순물 %는 온도에 따라 선형적으로 증가한 반면 n-1은 온도가 낮을수록 더 높았다.

실험 5(황화 단계 온도)

아래 실험에서, 황화 반응에 사용된 PADS 용액의 온도(RT는 실온을 의미함)는 덜 바람직한 PO 불순물(이는 황화 대신에 형광체 산화가 발생한 경우의 불순물임)의 %에 대해 시험되었다. 온도가 낮을수록 PO %가 낮아지는 결과를 보인다.

서열 번호 1 - 이메텔스타트 및 이메텔스타트 나트륨

5'-R-TAGGGTTAGACAA-NH₂-3'

여기서, R은 팔미토일[(CH₂)₁₄CH₃] 아미드가 아미노글리세롤 링커를 거쳐서 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 (NPS) -결합 올리고뉴클레오타이드의 5'-티오포스페이트기로 접합된다는 것을 나타낸다.

SEQUENCE LISTING <110> Janssen Pharmaceutica NV <120> IMPROVED PROCESS FOR PREPARING IMETELSTAT <130> JAB6114EPEPA <160> 1 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEQ ID NO 1 <400> 1 tagggttaga caa 13

Claims

하기 화학식의 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트 올리고뉴클레오티드 이미텔스타트를 합성하는 방법으로서,

a) PG가 산-불안정성 보호기인 화학식(A)의 고상 지지체에 부착된 제1 3'-아미노 보호된 뉴클레오티드를 제공하는 단계;

b) 상기 보호된 3'-아미노기를 탈보호하여 유리 3'-아미노기를 형성하는 단계;

c) 상기 유리 3'-아미노기를 화학식(B'_n)의, 여기서 n = 2인 경우 B'_n은 보호된 A임, 보호된 3'-아미노뉴클레오시드-5'-O-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노포스포르아미다이트 단량체와 반응시켜서 뉴클레오시드 간의 N3'→P5' 포스포르아미다이트 연관을 형성하는 단계;

d) 아실 디설파이드를 사용한 뉴클레오시드 간의 포스포르아미다이트기의 황화로 N3'→P5' 티오포스포르아미데이트를 형성하는 단계;
e) 상기 탈보호 단계 b), 화학식(B'_n)의 보호된 3'-아미노뉴클레오시드-5'-O-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노-포스포르아미다이트 단량체와 결합시키는 단계 c), 및 상기 황화 단계 d)를 연속적인 순서로 11회 반복하는 단계로서, 여기서 단량체(B'_n)의 뉴클레오시드 염기 B'은 B가 티민인 경우를 제외하고는 보호된 B이고, B_n은 각각의 11회의 결합 단계에서 연속적으로 핵 염기 B₃ 내지 B₁₃인, 단계;
f) 산-불안정성 보호기 PG를 제거하는 단계; 및
g) 상기 고상 지지체로부터 이메텔스타트를 탈보호 및 절단하는 단계를 포함하는 방법에 있어서,
상기 반응 단계 a) 내지 단계 e) 중 어느 단계에서도 추가의 캡핑 단계가 수행되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 이미텔스타트가 나트륨 염으로 추가로 전환되는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아실 디설파이드가 디벤조일 디설파이드, 비스(페닐아세틸) 디설파이드(PADS), 비스(4-메톡시벤조일) 디설파이드, 비스(4-메틸벤조일) 디설파이드, 비스(4-니트로벤조일) 디설파이드, 및 비스(4-클로로벤조일) 디설파이드로부터 선택되는, 방법.
제3항에 있어서, 상기 아실 디설파이드가 PADS인, 방법.
제4항에 있어서, PADS가 아세토니트릴, 톨루엔, 1-메틸 피롤리디논, 및 테트라하이드로푸란으로부터 선택된 공용매와 3-피콜린 또는 2,6-루티딘의 혼합물에 용해되는, 방법.
제5항에 있어서, PADS가 아세토니트릴과 2,6-루티딘의 혼합물에 용해되는, 방법.
제6항에 있어서, 상기 PADS 용액이 사용 전 4시간 내지 14시간 동안 숙성되는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산-불안정성 보호기 PG가 트리페닐메틸, p-아니실디페닐메틸, 및 디-p-아니실페닐메틸로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산-불안정성 보호기 PG가 산성 용액 처리에 의해 제거되는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식(B'_n)의 단량체의 아데닌, 시토신, 및 구아닌 염기 상의 염기-불안정성 보호기가 아세틸, 벤조일, 이소부티릴, 디메틸포름아미디닐, 및 디벤질포름아미디닐로부터 선택되는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단계 c)는 테트라졸, 5-(에틸티오)-1H-테트라졸, 5-(4-니트로-페닐)테트라졸, 5-(2-티에닐)-1H-테트라졸, 트리아졸, 및 피리디늄 클로라이드로부터 선택된 활성화제를 사용하여 수행되는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 f)는 염기성 용액으로 처리함으로써 수행되는, 방법.
제12항에 있어서, 상기 염기성 용액이 아세토니트릴에 용해된 디에틸아민, 또는 알코올에 용해된 암모니아 수용액, 또는 이들 둘의 조합인, 방법.