JP7199410B2 - 改善されたイメテルスタットの調製方法 - Google Patents

Description

本発明は、支持体結合オリゴヌクレオチドの３´－アミノ基の脱保護工程と、５´－ホスホルアミダイトとのカップリング工程と、およびアシルジスルフィドによる硫化工程とを含む、サイクル毎に３工程の固相支持体結合プロセスを使用するテロメラーゼ阻害剤イメテルスタットの調製方法に関し、これは、後続のサイクル中に未反応の３´－アミノオリゴヌクレオチド基が反応するのを防ぐために使用される追加のキャッピング工程が各サイクルにないことを特徴とする。

イメテルスタット（配列番号１）は、パルミトイル脂質部分に共有結合したＮ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドであり、ＷＯ２００５／０２３９９４に、化合物（１Ｆ）として記載されている。イメテルスタットのナトリウム塩は、強力で特異的なテロメラーゼ阻害剤として作用し、骨髄線維症（ＭＦ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの障害を含むテロメラーゼ媒介障害、例えば癌の治療に使用され得る。

イメテルスタットナトリウムの構造を以下に示す。

イメテルスタットの構造は、以下に示すように表され得る。

ＬＰＴ基は、Ｎ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドに共有結合しているパルミトイル脂質を表す。１３個のヌクレオチドの塩基配列は以下の通り、すなわち、ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡであり、塩基Ｂ_１～Ｂ_１３で表される。構造の－ＮＨ－Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）－および－ＯＰ（＝Ｓ）（ＯＨ）－基は、塩形態で生じ得る。対象化合物の塩形態は、具体的に示されていない場合であっても、本明細書に示されている構造に含まれることが理解される。

イメテルスタットナトリウムは、また、次のように表され得る。

－ＮＨ－Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）－基とチミン、アデニン、グアニン、およびシトシン塩基は、次の説明の図で使用される他の互変異性の配置において生じ得る。対象化合物のすべての互変異性型は、具体的に示されていない場合であっても、化合物の１つの可能な互変異性型が記載されている構造に包含されることが理解される。

先行技術
化合物（１Ｆ）としてイメテルスタットを調製するためにＷＯ２００５／０２３９９４において使用される合成スキームは、スキーム１およびスキーム２に記載されている。このオリゴヌクレオチドの合成は、固相ホスホルアミダイト法を使用して達成され、すべての反応は固相支持体上で行われる。イメテルスタットの合成は、３－パルミトイルアミド－１－Ｏ－（４，４´－ジメトキシトリチル）－２－Ｏ－スクシニルプロパンジオールを充填した細孔制御ガラス（ＬＣＡＡ－ＣＰＧ）で行われる。オリゴヌクレオチドは、保護されたヌクレオシド５´－ホスホル－アミダイトを活性化剤の助けを借りて付加することにより、５´末端から３´末端へと組み立てられる。各伸長サイクルは、４つの異なる高度に制御された工程：脱保護、アミダイトカップリング、硫化およびキャッピング工程からなる。
スキーム１：イメテルスタット合成スキームサイクル１

スキーム１では、固相支持合成は、固相支持体に結合したパルミトイルアミドプロパンジオールから酸不安定性４，４－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基を除去することから始まる。最初のホスホルアミダイトヌクレオチドを支持体にカップリングし、続いてアセトニトリルと２，６－ルチジンの混合物（１：１比）中のフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）の０．１Ｍ溶液を使用して蛍光体を硫化する。次に、キャッピング工程が、次の反応サイクルで未反応の固相支持体出発物質がホスホルアミダイトヌクレオチドとカップリングするのを防ぐために、適用される。キャッピングは、ＴＨＦ／無水イソ酪酸／２，６－ルチジンの１８：１：１混合物を使用して行われる。

固相支持体での最初のサイクルの後、支持体に結合したオリゴヌクレオチドの３´－アミノ基と、スキーム２に示されるシーケンス中の次に必要なヌクレオチドに対応する保護ヌクレオチドホスホルアミダイトモノマーの過剰溶液との反応により、鎖延長が達成される。
スキーム２：イメテルスタット合成スキームサイクル２－１３

スキーム２では、支持体結合オリゴヌクレオチドの３´－アミノ基の脱保護（ａ）、続いて、イメテルスタットの配列中の次に必要なヌクレオチドに対応する保護ヌクレオチドホスホルアミダイトモノマーの過剰溶液を含む支持体結合オリゴヌクレオチドの３´－アミノ基のカップリング反応（ｂ）によって達成される、鎖延長プロセスの最初のサイクルが示される。カップリング反応に続いて、支持体結合オリゴヌクレオチドの蛍光体の硫化（ｃ）および任意の未反応の固相支持体出発物質（ｂ）が次の反応サイクルで５´－ホスホルアミダイトヌクレオチドとカップリングするのを防ぐためのキャッピング工程（スキーム３を参照）を行う。スキーム２の反応サイクルを１２回繰り返した後、固相支持体結合オリゴヌクレオチドを、エタノールと濃アンモニアの１：１の混合物で処理した後、ＨＰＬＣ精製して、イメテルスタットを取得する。

ＴＨＦ／無水イソ酪酸／２，６－ルチジンの１８：１：１混合物を使用するキャッピング工程は、カップリング工程の後、一次３´－アミノ基を有する任意の残りの固相支持体結合オリゴヌクレオチド（ｂ）を、保護された（または「キャップされた」）３´－アミノ基を有するオリゴヌクレオチド（ｅ）に変換するために行われ、次の反応サイクルで一次３´－アミノ基がホスホルアミダイトヌクレオチドとカップリングするのを防ぐ。

ＷＯ０１／１８０１５は、実施例３において、配列番号２と共にＮ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドおよびキャッピング工程を包含するこのオリゴヌクレオチドの調製方法を開示している。
Ｈｅｒｂｅｒｔ ＢＳらは、ＧＲＮ１６３の脂質修飾について議論している（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００５）２４，５２６２－５２６８）。
Ｍａｋｉｋｏ Ｈｏｒｉｅらは、ヒトテロメラーゼＲＮＡサブユニットを標的とする２´－Ｏ、４´－ｃ－エチレン架橋核酸オリゴヌクレオチドの合成および特性について議論している（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ（２００５）４９，１７１－１７２）。

国際公開第２００５／０２３９９４号 国際公開第０１／０１８０１５号

Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００５）２４，５２６２－５２６８ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ（２００５）４９，１７１－１７２

ＷＯ０１／１８０１５およびＷＯ２００５／０２３９９４に開示されている固相支持体結合プロセスにおけるカップリング反応は、支持体結合オリゴヌクレオチド上の未反応の一次３´アミノ基が後続のサイクル中に反応するのを防ぐキャッピング工程を含む。

驚くべきことに、先行技術に記載されているキャッピング工程の使用は不要であり、イメテルスタットは、追加のキャッピング工程なしで、３工程サイクルを使用して調製され、特定のキャッピング工程を使用する先行技術の４工程サイクルと比較して、ほぼ同一の収率と純度を有することが、見出された。各サイクルからキャッピング工程を削除すると、サイクル工程の数が２２％（５４から４２工程に）削減され、結果としてプロセス時間が短縮されるため、プロセス全体にメリットがある。また、溶媒消費量が、よりグリーンなプロセスを実現するサイクル工程の削減により、削減される。

本文中で用語「キャッピング工程」が使用されている場合は、常に、固相支持体結合オリゴヌクレオチド上の一次遊離３´－アミノ基が、続くカップリング工程で保護された３´－アミノヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ－ホスホルアミダイトモノマーとのカップリング反応に参加できない置換二次または三次３´－アミノ基に変換される付加的な化学プロセス工程を定義することが意図されている。

一実施形態では、本発明は、次式のオリゴヌクレオチドＮ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデートの合成方法に関する。

この方法は、
ａ）式（Ａ）（式中、ＰＧは酸不安定性保護基である）の固相支持体に付着した最初の３´－アミノ保護ヌクレオチドを提供することと、

ｂ）保護された３´－アミノ基を脱保護して、遊離３´－アミノ基を形成することと、

ｃ）遊離３´－アミノ基を、式（Ｂ´_ｎ）（式中、ｎ＝２）の保護された３´アミノヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマーと反応させて、ヌクレオシド間Ｎ３´→Ｐ５´－ホスホルアミダイト結合を形成することと、

ｄ）アシルジスルフィドを用いてヌクレオシド間ホスホルアミダイト基を硫化して、Ｎ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデートを形成することと、
ｅ）連続した順序で１１回、脱保護工程ｂ）と、式（Ｂ´_ｎ）の保護された３´－アミノヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ－ホスホルアミダイトモノマーを用いたカップリング工程ｃ）であって、モノマー（Ｂ´_ｎ）中の保護されたヌクレオシド塩基Ｂ´が、それぞれ１１回のカップリング工程で順次保護された核酸塩基Ｂ_３～Ｂ_１３である、カップリング工程ｃ）と、硫化工程ｄ）とを繰り返すことと、
ｆ）酸不安定性保護基ＰＧを除去することと、
ｇ）固相支持体からイメテルスタットを脱保護および切断することと、を含み、
付加的なキャッピング工程が、反応工程ａ）～ｅ）のいずれにおいても実施されないことを特徴とする。

一実施形態では、本発明は、次式のＮ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットの合成方法に関する。

この方法は、
ａ）式（Ａ）（式中、ＰＧは酸不安定性保護基である）の固相支持体に付着した最初の３´－アミノ保護ヌクレオチドを提供することと、

ｂ）保護された３´－アミノ基を脱保護して、遊離３´－アミノ基を形成することと、

ｃ）遊離３´－アミノ基を、式（Ｂ´_ｎ）の保護された３´アミノヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマー（ｎ＝２のＢ´_ｎは、保護されたＡである）と反応させて、ヌクレオシド間Ｎ３´→Ｐ５´－ホスホルアミダイト結合を形成することと、

ｄ）アシルジスルフィドを用いてヌクレオシド間ホスホルアミダイト基を硫化して、Ｎ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデートを形成することと、
ｅ）連続した順序で１１回、脱保護工程ｂ）と、式（Ｂ´_ｎ）の保護された３´－アミノヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ－ホスホルアミダイトモノマーを用いたカップリング工程ｃ）であって、モノマー（Ｂ´_ｎ）のヌクレオシド塩基Ｂ´が、Ｂがチミンである場合を除いて保護されたＢであり、Ｂ_ｎが、それぞれ１１回のカップリング工程で順次核酸塩基Ｂ_３～Ｂ_１３である、カップリング工程ｃ）と、硫化工程ｄ）とを繰り返すことと、
ｆ）酸不安定性保護基ＰＧを除去することと、
ｇ）固相支持体からイメテルスタットを脱保護および切断することと、を含み、
付加的なキャッピング工程が、反応工程ａ）～ｅ）のいずれにおいても実施されないことを特徴とする。

一実施形態では、本発明は、次式のＮ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットの合成方法に関する。

この方法は、
ａ）式（Ａ）（式中、ＰＧは酸不安定性保護基である）の固相支持体に付着した最初の３´－アミノ保護ヌクレオチドを提供することと、

ｂ）ＰＧで保護された３´－アミノヌクレオチドを脱保護して、式（Ａ´）の遊離３´－アミノヌクレオチドを形成することと、

ｃ）遊離３´－アミノヌクレオチドを、保護された３´－アミノヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマー（Ｂ´_ｎ）（ｎ＝２のＢ´ｎは保護されたＡである）とカップリングさせて、ヌクレオシド間Ｎ３´→Ｐ５´－ホスホルアミダイト結合を形成することと、

ｄ）アシルジスルフィドを用いてＮ３´→Ｐ５´ホスホルアミダイト結合を硫化して、ヌクレオシド間Ｎ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデート結合を形成することと、
ｅ）連続した順序で１１回、
脱保護工程ｂ）と、
式（Ｂ´_ｎ）の保護された３´－アミノヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ－ホスホルアミダイトモノマーを用いたカップリング工程ｃ）であって、モノマー（Ｂ´ｎ）のヌクレオシド塩基Ｂ´が、Ｂがチミンである場合をいて保護されたＢであり、Ｂ_ｎは、それぞれ１１回のカップリング工程で順次、核酸塩基Ｂ_３～Ｂ_１３である、カップリング工程ｃ）と、
硫化工程ｄ）と、を繰り返して、
固相支持体に付着した保護されたＮ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットを生成することと、
ｆ）保護されたＮ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットから、３´末端酸不安定性保護基ＰＧを除去することと、
ｇ）固相支持体から、保護されたＮ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットを脱保護して切断し、イメテルスタットを生成することと、を含み、
付加的なキャッピング工程が、反応工程ａ）～ｅ）のいずれにおいても実施されないことを特徴とする。

制御された細孔ガラス（ＣＰＧ）、高度に架橋されたポリスチレン、架橋ポリスチレン支持体を充填されたハイブリッド制御された細孔ガラス、アクリル共重合体、セルロース、ナイロン、デキストラン、ラテックス、ポリアクロレインなどで作成された微粒子などを含むがこれらに限定されない、多種多様な固相担体が、本発明で使用され得る。

式（Ａ）の固相支持体に付着した３´－アミノ保護ヌクレオチドは、

３－パルミトイルアミド－１－Ｏ－（４，４´－ジメトキシトリチル）－２－Ｏ－スクシニルプロパンジオールが充填された制御細孔ガラス支持体が、式（Ｂ´_１）の保護された３´－アミノヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマーとカップリングされているＷＯ２００５／０２３９９４に開示されているように、調製することができる。

式中、ＰＧは酸不安定性保護基である。適切な酸不安定性３´－アミノ保護基ＰＧは、例えば、トリフェニルメチル（すなわち、トリチルまたはＴｒ）、ｐ－アニシルジフェニルメチル（すなわち、モノメトキシトリチルまたはＭＭＴ）、およびジ－ｐ－アニシルフェニルメチル（すなわち、ジメトキシトリチルまたはＤＭＴ）であるが、これらに限定されない。

式（Ｂ´_ｎ ）の保護された３´－アミノヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマーは、例えば、トリフェニルメチル（すなわち、トリチルまたはＴｒ）、ｐ－アニシルジフェニルメチル（すなわち、モノメトキシトリチルまたはＭＭＴ）、およびジ－ｐ－アニシルフェニルメチル（すなわち、ジメトキシトリチルまたはＤＭＴ）などの酸不安定性基である３´－アミノ保護基ＰＧを有する。さらに、ヌクレオシド塩基Ｂ´は、塩基不安定性保護基（チミンを除く）で保護されている。

ヌクレオチドモノマーＢ´_１およびＢ´_２～Ｂ´_１３は、３－パルミトイルアミド－１－Ｏ－（４，４´－ジメトキシトリチル）２－Ｏ－スクシニルプロパンジオールを装填し、ヌクレオチドモノマーＢ´_１にカップリングされた固相支持体の提供から開始する１３回のカップリング工程およびヌクレオチドモノマーＢ´_２～Ｂ´_１３が使用される、１２の脱保護、カップリング、および硫化反応の次のサイクルで、連続的に使用される。

３´－アミノ保護基ＰＧは、例えば、ジクロロメタンまたはトルエン中のジクロロ酢酸などの酸性溶液で処理することにより除去することができる。

式（Ｂ´_ｎ）の保護された３´－アミノヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－アミノホスホルアミダイトモノマーのヌクレオシド塩基Ｂ´は、工程ｇ）で除去される塩基不安定性保護基で保護されている。ヌクレオシド塩基アデニン、シトシンまたはグアニンに適した塩基不安定性保護基は、例えば、アセチル、ベンゾイル、イソブチリル、ジメチルホルムアミジニル、またはジベンジルホルムアミジニルなどのアシル基である。オリゴヌクレオチド合成で使用される反応条件下では、チミンヌクレオシド塩基は保護を必要としません。酸不安定性基保護基ＰＧで保護された３´－アミノおよび塩基不安定性保護基で保護されたヌクレオシド塩基Ｂ´を有する式（Ｂ´_ｎ）のそのような保護された３´－アミノ－ヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマーは、市販されているか、ＷＯ２００６／０１４３８７に記載されているように、調製することができる。

カップリング工程ｃ）は、固体支持体に共有結合した（オリゴ）ヌクレオチドの遊離アミノ基を含む反応容器に、式（Ｂ_ｎ）の保護された３´－アミノ－ヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマーの溶液および活性化剤の溶液（またはホスホルアミダイトモノマー（Ｂ_ｎ）および活性化剤を含有する溶液）を添加することにより実施される。次に、混合物を機械的ボルテックス、不活性ガスの散布などの方法で混合する。あるいは、モノマーおよび活性化剤の溶液を、遊離３´－アミノ基を持つ固相支持された（オリゴ）ヌクレオチドを含む反応容器（またはカラム）を通して流すことができる。モノマーおよび活性化剤は、事前に混合するか、適切な合成装置のバルブブロックで混合するか、事前活性化容器で混合し、必要に応じて事前に平衡化するか、または反応容器に別々に加えることができる。

本発明における使用のための活性化剤の例は、テトラゾール、５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール、５－（４－ニトロ－フェニル）テトラゾール、５－（２－チエニル）－１Ｈ－テトラゾール、トリアゾール、ピリジニウムクロリドなどであるが、これらに限定されない。適切な溶媒は、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタンなどである。実際、アセトニトリルは、オリゴヌクレオチド合成に一般的に使用される溶媒である。

工程ｄ）で使用するための硫化剤は、溶媒に溶解されたアシルジスルフィドである。アシルジスルフィドは、例えば、ジベンゾイルジスルフィド、ビス（フェニルアセチル）ジスルフィド（ＰＡＤＳ）、ビス（４－メトキシベンゾイル）ジスルフィド、ビス（４－メチルベンゾイル）ジスルフィド、ビス（４－ニトロベンゾイル）ジスルフィドおよびビス（４－クロロベンゾイル）ジスルフィドである。

フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）は、硫化反応に一般的に使用される薬剤であり、最適な硫化活性を得るために塩基性溶液で「熟成」するのが最適である（Ｓｃｏｔｓｏｎ Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１４，１０８４０－１０８４７，２０１６）。ＰＡＤＳに適した溶媒は、例えば、３－ピコリンまたは２，６－ルチジンなどの塩基性溶媒と、アセトニトリル、トルエン、１－メチルピロリジノンまたはテトラヒドロフランなどの共溶媒との混合物である。共溶媒の量に対する塩基性溶媒の量は、１：１の比率を含む任意の比率であり得る。その対応するチオリン酸塩に変換される亜リン酸エステルに応じて、「新鮮な」ＰＡＤＳおよび「熟成した」ＰＡＤＳの両方が使用され得るが、「熟成した」ＰＡＤＳは、硫化の速度および効率を改善することが示されている。「熟成した」ＰＡＤＳ溶液は、硫化反応で使用する前にしばらく維持された、新しく調製されたＰＡＤＳ溶液である。熟成時間は、数時間から４８時間まで変化する可能性があり、当業者は、硫化反応の収率と純度を分析することで最適な熟成時間を決定できます。

本発明によるイメテルスタットの調製のために、アセトニトリルと２，６－ルチジンの混合物中の、好ましくは１：１の比率の、４～１４時間の熟成時間のＰＡＤＳ溶液が、使用される。２，６－ルチジンが使用される場合、２，３，５－コリジン（２，６－ルチジンの不純物としてよく見られる）の量を０．１％未満に制限すると、硫化の効率が向上し、望ましくない蛍光体酸化が観察されることが少ない。

工程ｇ）で、イメテルスタットが脱保護され、固相支持体から切断される。脱保護には、β－シアノエチル基およびヌクレオチド塩基上の塩基不安定性保護基の除去が含まれる。これは、アセトニトリル中のジエチルアミン（ＤＥＡ）溶液などの塩基性溶液で処理した後、エタノールなどのアルコールに溶解されたアンモニア水で処理することで、実行され得る。

本発明の反応工程ａ）～ｆ）は、１０℃～４０℃の温度範囲で実施される。より好ましくは、これらの反応は、１５℃～３０℃の制御された温度範囲で実施される。特に、本発明の反応工程ｂ）は、１５℃～３０℃、特に１７℃～２７℃の温度範囲で実施される。特に、本発明の反応工程ｄ）は、１７℃～２５℃、特に１８℃～２２℃、さらに特に１９℃の温度範囲で実施される。イメテルスタットが脱保護され、固相支持体から切断される工程ｇ）は、３０℃～６０℃の温度範囲で実施される。使用される装置および特定の反応条件に応じて、上記の範囲内の各工程ａ）～ｇ）の最適な反応温度は、当業者によって決定され得る。

伸長サイクルの各工程の後、固相支持体は、次の反応に備えて、溶媒、例えば、アセトニトリルで洗浄される。

工程ｇ）の後、粗イメテルスタットが、そのアンモニウム塩の形態で得られ、次に、ポリマーまたはシリカベースの樹脂を使用して分取逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）で精製し、トリエチルアミンの形態で精製されたイメテルスタットを取得する。過剰のナトリウム塩を加えた後、溶液をダイアフィルトレーションにより脱塩し、それによりイメテルスタットナトリウムを得て、これを凍結乾燥して水を除去する。

実験部
「室温」または「周囲温度」は、通常２１～２５℃である。

実験１（キャッピング工程なし）
トルエン中の３％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）、アセトニトリル中の０．５Ｍの５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール、アセトニトリル中の式（Ｂ´_ｎ）の０．１５Ｍのすべての４ヌクレオチドモノマー、アセトニトリルと２，６－ルチジンの１：１混合物中の０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）およびアセトニトリル中の２０％ＤＥＡ（ジエチルアミン）を含む、すべての試薬および出発物質溶液を調製した。

オリゴヌクレオチド合成は、脱トリチル化とそれに続くカップリング、および周囲温度での硫化からなる反復合成サイクルを利用して、５´から３´の方向で実施された。

カラム（直径：３．５ｃｍ）に、ヌクレオチドモノマーＢ´_１とカップリングした３－パルミトイルアミド－１－Ｏ－（４，４´－ジメトキシトリチル）－２－Ｏ－スクシニルプロパンジオール（容量４００μｍｏｌ／ｇに基づいて３．５ｍｍｏｌ）を充填した固体支持体を充填した。トルエン中の３％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を使用して脱トリチル化を達成し（量は各脱トリチル化工程で６．５～１３．４カラム体積の間である）、固体支持体結合ヌクレオチドを、アセトニトリル（量：５カラム体積）で洗浄した。式（Ｂ´_ｎ）の次のヌクレオチドモノマーとのカップリングを、アセトニトリル中の０．５Ｍの５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾールの溶液と、順にアセトニトリルに溶解し、カラムを通過した、式（Ｂ´_ｎ）の０．１５Ｍの次のヌクレオチドモノマーを、ポンプで送ることにより達成した。カラムをアセトニトリルで洗浄した（量：２カラム容量）。次に、アセトニトリルと２，６－ルチジンの１：１混合物中の０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）の溶液をカラムにポンプで送り、続いてカラムをアセトニトリル（量：５カラム容量）で洗浄することにより、硫化を実施した。

脱トリチル化、式（Ｂ´_ｎ）の次のヌクレオチドモノマーとのカップリング、および硫化の合成サイクルを１２回繰り返した後、トルエン中の３％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を使用した脱トリチル化（量は６．５～１３．４カラム容量の間）を行った。

合成サイクルが完了したら、固体支持体支持体上の粗オリゴヌクレオチドを、ジエチルアミン（ＤＥＡ）溶液で処理し、続いて５５℃の温度で水酸化アンモニウム溶液：エタノール（体積比３：１）で処理した。反応混合物を５５℃で４～２４時間熟成させ、室温まで冷却し、スラリーを濾過してポリマー支持体を除去した。アンモニウム形態のイメテルスタットを含む溶液を、実験３のＨＰＬＣ分析手順にかけた。

実験２（キャッピング工程あり）
トルエン中の３％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）、アセトニトリル中の０．５Ｍの５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール、アセトニトリル中の０．１５Ｍの式（Ｂ´_ｎ）のすべての４ヌクレオチドモノマー、アセトニトリルと２，６－ルチジン混合物の１：１混合物中の０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、キャッピング剤Ａとしてのアセトニトリル中の２０％Ｎ－メチルイミダゾール（ＮＭＩ）、アセトニトリルとキャッピング剤Ｂとしての２，６－ルチジン混合物の１：１混合物中の無水イソ酪酸およびアセトニトリル中の２０％ＤＥＡを含む、すべての試薬および出発物質溶液を調製した。

オリゴヌクレオチド合成を、脱トリチル化とそれに続くカップリング、および周囲温度で実施した硫化からなる反復合成サイクルを利用して、５´から３´の方向で実施した。

カラム（直径：３．５ｃｍ）に、ヌクレオチドモノマーＢ´_１とカップリングした３－パルミトイルアミド－１－Ｏ－（４，４´－ジメトキシトリチル）－２－Ｏ－スクシニルプロパンジオール（容量４００μｍｏｌ／ｇに基づいて３．５ｍｍｏｌ）を充填した固体支持体を充填した。トルエン中の３％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を使用して脱トリチル化を達成し（量は各脱トリチル化工程で６．５～１３．４カラム体積の間である）、固体支持体結合ヌクレオチドを、アセトニトリル（量：５カラム体積）で洗浄した。式（Ｂ´_ｎ）の次のヌクレオチドモノマーとのカップリングを、アセトニトリル中の０．５Ｍの５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾールの溶液と、順にアセトニトリルに溶解し、カラムを通過した、式（Ｂ´_ｎ）の０．１５Ｍの次のヌクレオチドモノマーを、ポンプで送ることにより達成した。カラムをアセトニトリルで洗浄した（量：２カラム容量）。次に、アセトニトリルと２，６－ルチジンの１：１混合物中の０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）の溶液をカラムにポンプで送り、続いてカラムをアセトニトリル（量：５カラム容量）で洗浄することにより、硫化を実施した。

硫化に続いてキャッピング工程を行った。所定のサイクルの各キャッピングでは、キャッピング剤ＮＭＩの３７～４７等量（ｅｑ．）、キャッピング剤Ｂイソ酪酸無水物（ＩＢＡ）の９～１１等量、および２，６ルチジンの１．４～１．８等量を使用した。キャッピング剤ＡとＢは、５０：５０、３５：６５、６５：３５などの異なる比率の別々のポンプを用いて、カラムにポンプで送った。

脱トリチル化、式（Ｂ´_ｎ）の次のヌクレオチドモノマーとのカップリングおよび硫化、キャッピングの合成サイクルを１２回繰り返した後、トルエン中の参％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）を使用した脱トリチル化（量は６．５～１３．４カラム容量の間）を行った。

合成サイクルが完了したら、固体支持体支持体上の粗オリゴヌクレオチドを、ジエチルアミン（ＤＥＡ）溶液で処理し、続いて５５℃の温度で水酸化アンモニウム溶液：エタノール（体積比３：１）で処理した。反応混合物を５５℃で４～２４時間熟成させ、室温まで冷却し、スラリーを濾過してポリマー支持体を除去した。アンモニウム形態のイメテルスタットを含む溶液を、実験３のＨＰＬＣ分析手順にかけた。

実験参：キャッピングなしとキャッピングの比較
実験１および実験２で得られたイメテルスタットを、ＨＰＬＣで分析した。１３個のヌクレオチドを有する所望の完全長オリゴヌクレオチドの量を決定し、実験１および実験２について、以下の表にリストした。また、ショートマーの総量を、具体的には１２マーを、実験１および実験２について、以下の表に測定し、列挙した。
ＨＰＬＣ分析法：
カラムタイプ：Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８、粒子サイズ３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ
溶離液：
Ａ：１４．４ｍＭ ＴＥＡ／３８６ｍＭ ＨＦＩＰ（ヘキサフルオロイソプロパノール）／１００ｐｐｍ（ｗ／ｖ）水中のＮａ_２ＥＤＴＡ
Ｂ：５％ＩＰＡを含む５０％ＭｅＯＨ、５０％ＥｔＯＨ
勾配：

表：キャッピングとキャッピングなしの実験（実験１は２回実行され、結果は実験１ａおよび１ｂとしてリストされている）。

実験１および実験２のＨＰＬＣ分析は、キャッピングなしの実験とキャッピングの実験とで、収量と純度が同等であることを示している。
メインピーク％には、完全長オリゴヌクレオチド＋ＰＯ不純物＋脱プリン不純物が含まれる。
ＰＯ不純物は、チオホスホルアミデートヌクレオシド間結合の代わりに、１つ以上のオキソホスホルアミデートヌクレオシド間結合を含む不純物である。

溶媒の使用と反応時間
アセトニトリル０．４５Ｌ／ｍｍｏｌを使用して、試薬の調製中のアセトニトリル使用全体の約２５％に相当するキャッピング剤Ａおよびキャッピング剤Ｂの試薬を調製した。各化学反応工程の後に溶媒洗浄が続くため、各キャッピング工程の後も、溶媒の約４０カラム容量に相当する溶媒洗浄が行われる。所定の合成実行で約２１２カラム容量の溶媒洗浄が行われることを考慮すると、キャッピング工程には洗浄溶媒の約１９％が使用される。各キャッピング工程には３～６分かかる。これは、１３サイクルとＤＥＡ処理とを含む全体の合成時間の約８％に相当する。

実験４（脱トリチル化温度）
脱トリチル化温度は、ｎ－１および脱プリン不純物の制御に関して影響を及ぼす。シンセサイザーの入口のデブロッキング溶液の温度は１７．５～２７℃（３．５ｍｍｏｌスケール）の間で選択され、選択された温度はすべての脱トリチル化工程で同等に保たれた。アセトニトリル洗浄も、脱ブロッキング溶液と同じ温度に保たれた。脱プリンされた不純物の割合は、温度とともに直線的に増加し、ｎ－１はより低温でより高くなった。

実験５（硫化工程温度）
以下の実験では、硫化反応に使用されるＰＡＤＳ溶液の温度（ＲＴは室温を意味する）を、ＰＯ不純物（硫化の代わりにリン酸化が発生した不純物）の割合についてテストした。温度が低いと、ＰＯ％が低くなる。

配列番号：１－イメテルスタットおよびイメテルスタットナトリウム
５´－Ｒ－ＴＡＧＧＧＴＴＡＧＡＣＡＡ－ＮＨ_２－３´
式中、Ｒはパルミトイル［（ＣＨ_２）_１４ＣＨ_３］アミドを表し、アミノグリセロールリンカーを介してＮ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデート（ＮＰＳ）結合オリゴヌクレオチドの５´－チオリン酸基に結合する。
本発明の好ましい実施形態によれば、例えば、以下が提供される。
（項１）
次式のＮ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットの合成方法であって、

前記方法は、
ａ）式（Ａ）（式中、ＰＧは酸不安定性保護基である）の固相支持体に付着した最初の３´－アミノ保護ヌクレオチドを提供することと、

ｂ）前記保護された３´－アミノ基を脱保護して、遊離３´－アミノ基を形成することと、

ｃ）前記遊離３´－アミノ基を、式（Ｂ´ _ｎ ）の保護された３´－アミノヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマー（ｎ＝２のＢ´ _ｎ は、保護されたＡである）と反応させて、ヌクレオシド間Ｎ３´→Ｐ５´－ホスホルアミダイト結合を形成することと、

ｄ）アシルジスルフィドを用いて前記ヌクレオシド間ホスホルアミダイト基を硫化して、Ｎ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデートを形成することと、
ｅ）連続した順序で１１回、前記脱保護工程ｂ）と、式（Ｂ´ _ｎ ）の保護された３´－アミノヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ－ホスホルアミダイトモノマーを用いたカップリング工程ｃ）であって、モノマー（Ｂ´ _ｎ ）のヌクレオシド塩基Ｂ´が、Ｂがチミンである場合を除いて保護されたＢであり、Ｂ _ｎ が、それぞれ１１回のカップリング工程で順次核酸塩基Ｂ _３ ～Ｂ _１３ である、カップリング工程ｃ）と、前記硫化工程ｄ）とを繰り返すことと、
ｆ）前記酸不安定性保護基ＰＧを除去することと、
ｇ）前記固相支持体からイメテルスタットを脱保護および切断することと、を含み、
付加的なキャッピング工程が、反応工程ａ）～ｅ）のいずれにおいても実施されないことを特徴とする、方法。
（項２）
イメテルスタットが、そのナトリウム塩にさらに変換される、上記項１に記載の方法。
（項３）
前記アシルジスルフィドが、ジベンゾイルジスルフィド、ビス（フェニルアセチル）ジスルフィド（ＰＡＤＳ）、ビス（４－メトキシベンゾイル）ジスルフィド、ビス（４－メチルベンゾイル）ジスルフィド、ビス（４－ニトロベンゾイル）ジスルフィドおよびビス（４－クロロベンゾイル）ジスルフィドから選択される、上記項１または２に記載の方法。
（項４）
前記アシルジスルフィドがＰＡＤＳである、上記項３に記載の方法。
（項５）
ＰＡＤＳが、３－ピコリンまたは２，６－ルチジンと、アセトニトリル、トルエン、１－メチルピロリジノンおよびテトラヒドロフランから選択される共溶媒との混合物中に溶解される、上記項４に記載の方法。
（項６）
ＰＡＤＳが、２，６－ルチジンとアセトニトリルとの混合物に溶解される、上記項５に記載の方法。
（項７）
前記ＰＡＤＳ溶液が使用の４時間～１４時間前に熟成される、上記項６に記載の方法。
（項８）
前記酸不安定性基ＰＧが、トリフェニルメチル、ｐ－アニシルジフェニルメチル、およびジ－ｐ－アニシルフェニルメチルから選択される、上記項１～７のいずれか一項に記載の方法。
（項９）
前記酸不安定性保護基ＰＧが、酸性溶液での処理により除去される、上記項１～８のいずれか一項に記載の方法。
（項１０）
前記式（Ｂ´ _ｎ ）のモノマー中のアデニン、シトシンおよびグアニン塩基上の塩基不安定性保護基が、アセチル、ベンゾイル、イソブチリル、ジメチルホルムアミジニル、およびジベンジルホルムアミジニルから選択される、上記項１～９のいずれか一項に記載の方法。
（項１１）
前記カップリング工程ｃ）が、テトラゾール、５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール、５－（４－ニトロ－フェニル）テトラゾール、５－（２－チエニル）－１Ｈ－テトラゾール、トリアゾール、およびピリジニウムクロリドから選択される活性化剤を用いて実施される、上記項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（項１２）
工程ｇ）が塩基性溶液での処理により実施される、上記項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
（項１３）
前記塩基性溶液が、アセトニトリルに溶解したジエチルアミンまたはアルコールに溶解したアンモニア水、または両方の組み合わせである、上記項１２に記載の方法。

Claims (13)

1. 次式のＮ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデートオリゴヌクレオチドイメテルスタットの合成方法であって、
   

   

   前記方法は、
   ａ）式（Ａ）（式中、ＰＧは酸不安定性保護基である）の固相支持体に付着した最初の３´－アミノ保護ヌクレオチドを提供することと、
   

   

   ｂ）保護された３´－アミノ基を脱保護して、遊離３´－アミノ基を形成することと、
   

   

   ｃ）前記遊離３´－アミノ基を、式（Ｂ´_ｎ）の保護された３´－アミノヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマー（ｎ＝２のＢ´_ｎは、保護されたＡである）と反応させて、ヌクレオシド間Ｎ３´→Ｐ５´－ホスホルアミダイト結合を形成することと、
   

   

   ｄ）アシルジスルフィドを用いて前記ヌクレオシド間ホスホルアミダイト基を硫化して、Ｎ３´→Ｐ５´チオホスホルアミデートを形成することと、
   ｅ）連続した順序で１１回、前記脱保護工程ｂ）と、式（Ｂ´_ｎ）の保護された３´－アミノヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ－ホスホルアミダイトモノマーを用いたカップリング工程ｃ）であって、モノマー（Ｂ´_ｎ）のヌクレオシド塩基Ｂ´が、Ｂがチミンである場合を除いて保護されたＢであり、Ｂ_ｎが、それぞれ１１回のカップリング工程で順次核酸塩基Ｂ_３～Ｂ_１３である、カップリング工程ｃ）と、前記硫化工程ｄ）とを繰り返すことと、
   ｆ）前記酸不安定性保護基ＰＧを除去することと、
   ｇ）前記固相支持体からイメテルスタットを脱保護および切断することと、を含み、
   付加的なキャッピング工程が、反応工程ａ）～ｅ）のいずれにおいても実施されないことを特徴とする、方法。
2. イメテルスタットが、そのナトリウム塩にさらに変換される、請求項１に記載の方法。
3. 前記アシルジスルフィドが、ジベンゾイルジスルフィド、ビス（フェニルアセチル）ジスルフィド（ＰＡＤＳ）、ビス（４－メトキシベンゾイル）ジスルフィド、ビス（４－メチルベンゾイル）ジスルフィド、ビス（４－ニトロベンゾイル）ジスルフィドおよびビス（４－クロロベンゾイル）ジスルフィドから選択される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記アシルジスルフィドがＰＡＤＳである、請求項３に記載の方法。
5. ＰＡＤＳが、３－ピコリンまたは２，６－ルチジンと、アセトニトリル、トルエン、１－メチルピロリジノンおよびテトラヒドロフランから選択される共溶媒との混合物中に溶解される、請求項４に記載の方法。
6. ＰＡＤＳが、２，６－ルチジンとアセトニトリルとの混合物に溶解される、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＰＡＤＳ溶液が使用の４時間～１４時間前に熟成される、請求項６に記載の方法。
8. 前記酸不安定性基ＰＧが、トリフェニルメチル、ｐ－アニシルジフェニルメチル、およびジ－ｐ－アニシルフェニルメチルから選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記酸不安定性保護基ＰＧが、酸性溶液での処理により除去される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記式（Ｂ´_ｎ）の保護された３´－アミノヌクレオシド－５´－Ｏ－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスホルアミダイトモノマー中のアデニン、シトシンおよびグアニン塩基上の塩基不安定性保護基が、アセチル、ベンゾイル、イソブチリル、ジメチルホルムアミジニル、およびジベンジルホルムアミジニルから選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記カップリング工程ｃ）が、テトラゾール、５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール、５－（４－ニトロ－フェニル）テトラゾール、５－（２－チエニル）－１Ｈ－テトラゾール、トリアゾール、およびピリジニウムクロリドから選択される活性化剤を用いて実施される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 工程ｇ）が塩基性溶液での処理により実施される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記塩基性溶液が、アセトニトリルに溶解したジエチルアミンまたはアルコールに溶解したアンモニア水、または両方の組み合わせである、請求項１２に記載の方法。