RS62705B1 - Poboljšani postupak za pripremanje imetelstata - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za pripremanje inhibitora telomeraze, imetelstata, pomoću postupka sa nosačem u čvrstoj fazi i sa 3 koraka po ciklusu, koji obuhvata korake deprotekcije 3’-amino grupe oligonukleotida vezanog za nosač, kuplovanje sa 5’-fosforamiditom, i sulfonaciju acil disulfidom, koji se odlikuje odsustvom dodatnog koraka terminalne obrade u svakom ciklusu, koja se koristi kako bi bilo sprečeno da neizreagovane 3’-amino oligonukleotidne grupe reaguju tokom narednih ciklusa.

Osnov pronalaska

[0002] Imetelstat (SEQ ID NO:1) je N3’→P5’ tiofosforamidatni oligonukleotid koji je kovalentno vezan sa palmitoilnom lipidnom komponentom i opisan u WO-2005/023994 kao jedinjenje (1F). Natrijumova so imetelstata deluje kao potentni i specifični inhibitor telomeraze i može da se koristi za lečenje poremećaja povezanih sa telomerazama, npr. kancera, uključujući poremećaje kao što su mijelofibroza (MF), mijelodisplastični sindromi (MDS) i akutna mijelogena leukemija (AML).

[0003] Struktura imetelstat natrijuma je prikazana u nastavku teksta:

[0004] Struktura imetelstata takođe može da se predstavi kao što je dato u nastavku

[0005] LPT grupa predstavlja palmitoil lipid koji je kovalentno vezan sa N3’→P5’ tiofosforamidatnim nukleotidom. Redosled baza u ovih trinaest nukleotida je sledeći: TAGGGTTAGACAA i predstavljen je bazama B1 do B13. Grupe -NH-P(=S)(OH)- i -O-P(=S)(OH)- u ovoj strukturi mogu da se javljaju u obliku soli. Podrazumeva se da su oblici soli predmetnog jedinjenja obuhvaćeni ovde prikazanim stukturama, čak i kada to nije specifično navedeno.

[0006] Imetelstat natrijum takođe može da se predstavi i na sledeći način:

[0007] -NH-P(=S)(OH)- grupa i baze timina, adenina, guanina i citozina mogu da se javljaju u drugim tautomernim aranžmanima koji se u tom slučaju koriste na slikama u opisu. Podrazumeva se da su svi tautomerni oblici predmetnog jedinjenja obuhvaćeni strukturom u kojoj je opisan jedan mogući tautomerni oblik jedinjenja, čak i kada to nije specifično navedeno.

Stanje tehnike

[0008] Sintetička šema koja se koristi u WO-2005/023994 kako bi se pripremio imetelstat u vidu jedinjenja (1F) opisana je Šemom 1 i Šemom 2. Sinteza ovog nukleotida se postiže upotrebom metodologijom fosforamidita u čvrstoj fazi, gde se sve reakcije odvijaju na nosaču koji je u čvrstoj fazi. Sinteza imetelstata se izvodi na staklu sa kontrolisanim porama (LCAA-CPG) koje nosi 3-palmitoilamido-1-O-(4,4’-dimetoksitritil)-2-O-sukcinil propandiol. Oligonukleotid se sastavlja polazeći od 5’ ka 3’ kraju, tako što se dodaju zaštićeni nukleozid 5’-fosforamiditi uz pomoć aktivatora. Svaki ciklus elongacije se sastoji od 4 različita, strogo kontrolisana koraka: deprotekcije, amiditnog kuplovanja, sulfonacije i koraka terminalne obrade.

[0009] U Šemi 1, sinteza na nosaču u čvrstoj fazi počinje uklanjanjem zaštitne grupe 4,4-dimetoksitritila (DMT) osetljivog na kiselinu iz palmitoilamidopropandiola povezanog sa nosačem u čvrstoj fazi. Prvi fosforamiditni nukleotid se spaja sa nosačem, a zatim sledi sulfonizacija fosfora pomoću 0.1 M rastvora fenilacetil disulfida (PADS) u smeši acetonitrila i 2,6-lutidina (odnos 1:1). Zatim se primenjuje korak terminalne obrade kako bi se sprečilo spajanje bilo kakvog neizreagovanog polaznog materijala čvrste faze sa fosforamiditnim nukleotidom u sledećim reakcionim ciklusima. Terminalna obrada se obavlja pomoću 18:1:1 smeše THF / izobuternog anhidrida / 2,6-lutidina.

[0010] Posle prvog ciklusa na nosaču u čvrstoj fazi, elongacija lanca se postiže reakcijom 3'-amino grupe oligonukleotida vezanog za nosač sa viškom rastvora zaštićenog nukleotidnog fosforamiditnog monomera koji odgovara sledećem potrebnom nukleotidu u sekvenci kao što je prikazano na Šemi 2.

[0011] U Šemi 2 prikazan je prvi ciklus procesa elongacije lanca koji se postiže uklanjanjem zaštite 3'-amino grupe oligonukleotida (a) vezanog za nosač, nakon čega sledi reakcija kuplovanja 3'-amino grupe oligonukleotida (b) vezanog za nosač sa viškom rastvora 5'-fosforamiditnog monomera koji odgovara sledećem potrebnom nukleotidu u nizu imetelstata. Reakcija kuplovanja je praćena sulfonizacijom fosfora u oligonukleotidu (c) vezanom za nosač i korakom terminalne obrade (videti Šemu 3) kako bi se sprečilo kuplovanje bilo kakvog neizreagovanog polaznog materijala (b) na nosaču u čvrstoj fazi sa 5'-fosforamiditnim nukleotidom u sledećim reakcionim ciklusima. Reakcioni ciklus Šeme 2 se ponavlja 12 puta pre nego što se oligonukleotid vezan za čvrstu fazu tretira sa 1:1 smešom etanola i koncentrovanog amonijaka, nakon čega sledi HPLC prečišćavanje da bi se dobio imetelstat.

[0012] Korak terminalne obrade pomoću 18:1:1 smeše THF / izobuternog anhidrida / 2,6-lutidina se vrši da bi se posle koraka kuplovanja bilo koji preostali oligonukleotid vezan na čvrstu fazu (b) sa primarnom 3'-amino grupom preveo u oligonukleotid (e) sa zaštićenom (ili 'zatvorenom') 3'-amino grupom kako bi se sprečilo spajanje primarne 3'-amino grupe sa fosforamiditnim nukleotidom u narednim reakcionim ciklusima.

[0013] WO-01/18015 prikazuje u Primeru 3, sa sekvencom SEQ ID No. 2, N3’→P5’ tiofosforamidatni oligonukleotid i postupak za pripremanje ovog oligonukleotida koji obuhvata korak terminalne obrade.

[0014] Herbert B-S et al. razmatraju lipidne modifikacije za GRN163 (Oncogene (2005) 24, 5262-5268)

[0015] Makiko Horie et al. razmatraju sintezu i svojstva oligonukleotida nukleinskih kiselina sa 2’-O,4’-C-etilenskim mostom koji su ciljni molekuli za subjedinicu humane RNK telomeraze (Nucleic Acids Symposium Series (2005) 49, 171-172).

Opis pronalaska

[0016] Reakcija kuplovanja u procesu vezivanja nosača u čvrstoj fazi prikazana u WO-01/18015 i WO-2005/023994, uključuje korak terminalne obrade kako bi tokom naredih ciklusa bila sprečena reakcija bilo koje od neizreagovanih primarnih 3’ amino grupa na oligonukeotidu vezanom za nosač.

[0017] Sada je iznenađujuće utvrđeno da je upotreba koraka terminalne obrade kao što je opisano u prethodnoj tehnici suvišna i da imetelstat može da se priprema putem ciklusa od 3 koraka bez dodatnog koraka terminalne obrade sa skoro identičnim prinosom i čistoćom u poređenju sa ciklusom od 4 koraka prethodnog stanja tehnike koji koristi određeni korak za terminalnu obradu. Eliminisanje koraka terminalne obrade iz svakog ciklusa koristi celokupnom procesu tako što smanjuje broj koraka ciklusa za 22% (sa 54 na 42 koraka) i posledično smanjuje vreme trajanja postupka. Takođe, potrošnja rastvarača je smanjena zbog smanjenja broja koraka u ciklusu čime je postupak ekološki povoljan.

[0018] Gde god se termin „korak terminalne obrade“ koristi u ovom tekstu, on ima za cilj da definiše dodatni korak hemijskog procesa u kome se primarna slobodna 3'-amino grupa na oligonukleotidu vezanom za čvrstu fazu konvertuje u supstituisani sekundarnu ili tercijarnu 3'-amino grupa koja nije u stanju da učestvuje u reakciji kuplovanja sa zaštićenim 3' aminonukleozid-5'-O-cijanoetil-N,N-diizopropilamino-fosforamiditnim monomerom u sledećem koraku kuplovanja.

[0019] U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za sintezu oligonukleotid N3’ →P5’ tiofosforamidata formule

pri čemu postupak obuhvata

a) obezbeđivanje prvog 3’-amino zaštićenog nukleotida vezanog za nosač u čvrstoj fazi, formule (A), gde je PG protektivna grupa osetljiva na kiselinu;

b) deprotektovanje zaštićene 3’-amino grupe kako bi se obrazovala slobodna 3’-amino grupa;

c) reakciju slobodne 3’-amino grupe sa zaštićenim 3’-aminonukleozid-5’-O-cijanoetil-N,N-diizopropilaminofosforamiditnim monomerom formule (B’n), pri čemu je n = 2, kako bi se obrazovala internukleozidna N3’→P5’-fosforamiditna veza;

d) sulfonaciju internukleozidne fosforamiditne grupe pomoću acil disulfida kako bi se obrazovao N3’→P5’ tiofosforamidat;

e) ponavljanje 11 puta, jednog za drugim, koraka b) deprotekcije, koraka c) kuplovanja sa zaštićenim 3’-aminonukleozid-5’-O-cijanoetil-N,N-diizopropilamino-fosforamiditnim monomerom formule (B’n), gde je zaštićena nukleozidna baza B’ u monomeru (B’n), sukcesivno, zaštićena nukleobaza B3do B13, u odgovarajućih 11 koraka kuplovanja, i koraku d) sulfonacije

f) uklanjanje protektivne grupe PG osetljive na kiselinu; i

g) odvajanje i deprotektovanje imetelstata sa nosača u čvrstoj fazi;

koji se karakteriše time što se ni u jednom od reakcionih koraka a) do e) ne izvodi dodatni korak terminalne obrade.

[0020] U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za sintezu N3’ →P5’ tiofosforamidatnog oligonukleotida imetelstata, formule

pri čemu postupak obuhvata

a) obezbeđivanje prvog 3’-amino zaštićenog nukleotida vezanog za nosač u čvrstoj fazi, formule (A), gde je PG protektivna grupa osetljiva na kiselinu;

b) deprotektovanje zaštićene 3’-amino grupe kako bi se obrazovala slobodna 3’-amino grupa;

c) reakciju slobodne 3’-amino grupe sa zaštićenim 3’-aminonukleozid-5’-O-cijanoetil-N,N-diizopropilamino-fosforamiditnim monomerom formule (B’n), pri čemu je B’nsa n = 2 zaštićeni A, kako bi se obrazovala internukleozidna N3’→P5’-fosforamiditna veza;

d) sulfonaciju internukleozidne fosforamiditne grupe pomoću acil disulfida kako bi se obrazovao N3’→P5’ tiofosforamidat;

e) ponavljanje 11 puta, jednog za drugim, koraka b) deprotekcije, koraka c) kuplovanja sa zaštićenim 3’-aminonukleozid-5’-O-cijanoetil-N,N-diizopropilamino-fosforamiditnim monomerom formule (B’n), gde je nukleozidna baza B’ u monomeru (B’n) zaštićeni B, osim kada je B timin, i gde je Bn, sukcesivno, zaštićena nukleobaza B3do B13, u odgovarajućih 11 koraka kuplovanja, i koraku d) sulfonacije

f) uklanjanje protektivne grupe PG osetljive na kiselinu; i

g) deprotektovanje i odvajanje imetelstata sa nosača u čvrstoj fazi;

koji se karakteriše time što se ni u jednom od reakcionih koraka a) do e) ne izvodi dodatni korak terminalne obrade.

[0021] U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za sintezu N3’ →P5’ tiofosforamidatnog oligonukleotida imetelstata formule

pri čemu postupak obuhvata

a) obezbeđivanje prvog 3’-amino zaštićenog nukleotida vezanog za nosač u čvrstoj fazi, formule (A), gde je PG protektivna grupa osetljiva na kiselinu;

1

b) deprotektovanje PG-zaštićenog 3’-amino nukleotida kako bi se obrazovao slobodan 3’-amino nukleotid formule (A');

c) kuplovanje slobodnog 3’-amino nukleotida sa zaštićenim 3’-aminonukleozid-5’-O-cijanoetil-N,N-diizopropilamino-fosforamiditnim monomerom formule (B’n), pri čemu je B’nsa n = 2 zaštićeni A, kako bi se obrazovala internukleozidna N3’→P5’-fosforamiditna veza;

d) sulfonaciju N3’→P5’-fosforamiditne veze pomoću acil disulfida kako bi se obrazovala N3’→P5’ tiofosforamidatna veza;

e) ponavljanje 11 puta, jednog za drugim:

koraka b) deprotekcije;

koraka c) kuplovanja sa zaštićenim 3’-aminonukleozid-5’-O-cijanoetil-N,N-diizopropilamino-fosforamiditnim monomerom (B’n), gde je nukleozidna baza B’ u monomeru (B’n) zaštićeni B, osim kada je B timin, i gde je Bn, sukcesivno, nukleobaza B3do B13, u odgovarajućih 11 koraka kuplovanja,

i koraka d) sulfonacije;

kako bi se dobio zaštićeni N3’→P5’tiofosforamidatni oligonukleotid imetelstat vezan za nosač u čvrstoj fazi;

f) uklanjanje 3'-terminalne protektivne grupe PG osetljive na kiselinu sa zaštićenog N3’→P5’tiofosforamidatnog oligonukleotida imetelstata; i

g) deprotektovanje i odvajanje zaštićenog N3’→P5’tiofosforamidatnog oligonukleotida imetelstata sa nosača u čvrstoj fazi, kako bi se dobio imetelstat;

koji se karakteriše time što se ni u jednom od reakcionih koraka a) do e) ne izvodi dodatni korak terminalne obrade.

[0022] Sa pronalaskom može da se koristi niz različitih nosača u čvrstoj fazi, uključujući, ali ne i ograničeno na, mikročestice napravljene od stakla sa kontrolisanim porama (CPG), visoko umreženog polistirena, hibridnog stakla sa kontrolisanim porama napunjenog nosačima od umreženog polistirena, akrilni kopolimeri, celuloza, najlon, dekstran, lateks, poliakrolein i slično.

[0023] 3'-amino zaštićeni nukleotid vezan za nosač u čvrstoj fazi, formule (A)

može da se priprema kao što je prikazano u WO-2005/023994 pri čemu je nosač od stakla sa kontrolisanim porama napunjen sa 3-palmitoilamido-1-O-(4,4'-dimetoksitritil)-2-O-sukcinil propandiolom, kuplovan sa zaštićenim 3'-aminonukleozid-5'-O-cijanoetil-N,N-diizopropilaminofosforamiditnim monomerom formule (B'1)

pri čemu je PG zaštitna grupa osetljiva na kiselinu. Pogodne 3'-amino PG zaštitne grupe osetljive na kiselinu su, ali ne i ograničeno na, npr. trifenilmetil (tj. tritil ili Tr), p-anisildifenilmetil (tj. monometoksitritil ili MMT) i di-p-anisilfenilmetil (tj. dimetoksitritil ili DMT).

[0024] Zaštićeni 3'-aminonukleozid-5'-O-cijanoetil-N,N-diizopropilaminofosforamiditni monomeri formule (B'n) imaju 3'-amino protektivnu grupu PG koja je grupa osetljiva na kiseline, kao što je trifenilmetil (tj. tritil ili Tr), p-anisildifenilmetil (tj. monometoksitritil ili MMT) ili dip-anisilfenilmetil (tj. dimetoksitritil ili DMT). Štaviše, nukleozidna baza B’ je zaštićena protektivnom grupom koja je osetljiva na baze (osim timina).

[0025] Nukleotidni monomeri B'1i B'2do B'13se sukcesivno koriste u 13 koraka kuplovanja počevši od obezbeđivanja nosača u čvrstoj fazi napunjenog 3-palmitoilamido-1-O (4,4'-dimetoksitritilom)-2-O-sukcinil propandiolom i kuplovanog sa nukleotidnim monomerom B'1i u sledećem ciklusu od 12 reakcija deprotekcije, kuplovanja i sulfonacije u kojima se koriste nukleotidni monomeri B'2do B'13.

[0026] 3'-amino zaštitna grupa PG može da se ukloni tretmanom sa kiselim rastvorom kao što je npr. dihlorosirćetne kiseline u dihlorometanu ili toluenu.

[0027] Nukleozidna baza B' u zaštićenim monomerima 3'-aminonukleozid-5'-O-cijanoetil-N,N diizopropilaminofosforamidita formule (B'n) je zaštićena protektivnom grupom koja je osetljiva na baze i koja se uklanja u koraku g). Pogodne zaštitne grupe osetljive na bazu za nukleozidnu bazu adenin, citozin ili guanin su npr. acil grupe kao što su acetil, benzoil, izobutiril,

1

dimetilformamidinil ili dibenzilformamidinil. U reakcionim uslovima koji se koriste u sintezi oligonukleotida, baza timin nukleozida ne zahteva zaštitu. Takvi zaštićeni 3'-amino-nukleozid-5'-O-cijanoetil-N,N-diizopropilaminofosforamiditni monomeri formule (B'n) koji imaju 3'-amino zaštićenu grupu koja je zaštićena grupom PG osetljivom na kiselinu, kao i nukleozidnu bazu B' zaštićenu zaštitnom grupom osetljivom na bazu, komercijalno su dostupni ili mogu da se pripremaju kao što je opisano u WO-2006/014387.

[0028] Korak c) kuplovanja se izvodi dodavanjem rastvora zaštićenog 3'-aminonukleozid-5'-O-cijanoetil-N,Ndiizopropilaminofosforamiditnog monomera formule (Bn) i rastvora aktivatora (ili rastvora koji sadrži fosforamiditni monomer (Bn) i aktivator) u reakcioni sud koji sadrži slobodnu amino grupu (oligo)nukleotida kovalentno vezanog za čvrsti nosač. Smeša se zatim meša takvim metodama kao što su mehaničko vrtložno mešanje, prskanje inertnim gasom, itd. Alternativno, rastvor(i) monomera i aktivatora može da teče kroz reakcioni sud (ili kolonu) koji sadrži čvrstu fazu na bazi (oligo)nukleotid sa slobodnom 3'-amino grupom. Monomer i aktivator mogu da se prethodno pomešaju, pomešaju u bloku ventila odgovarajućeg aparata za sintezu, pomešaju u posudi za preaktivaciju i prethodno uravnoteže ako se to želi, ili mogu da se dodaju odvojeno u reakcioni sud.

[0029] Primeri aktivatora za upotrebu u pronalasku su, ali ne ograničeno na, tetrazol, 5(etiltio)-1H-tetrazol, 5-(4-nitro-fenil)tetrazol, 5-(2-tienil)-1H-tetrazol, triazol, piridinijum hlorid i slično. Pogodni rastvarači su acetonitril, tetrahidrofuran, dihlorometan i slično. U praksi je acetonitril uobičajeni rastvarač za sintezu oligonukleotida.

[0030] Sredstvo za sulfonaciju za upotrebu u koraku d) je acil disulfid rastvoren u rastvaraču. Acil disulfidi poznati u stanju tehnike su npr. dibenzoil disulfid, bis(fenilacetil) disulfid (PADS), bis(4-metoksibenzoil) disulfid, bis(4-metilbenzoil) disulfid, bis(4-nitrobenzoil) disulfid i bis(4-hlorobenzoil) disulfid.

[0031] Fenilacetil disulfid (PADS) je uobičajeno sredstvo koje se koristi za reakcije sulfonacije koje je najbolje ako se podvrgne 'sazrevanju' u baznom rastvoru kako bi se postigla optimalna aktivnost sulfonacije (Scotson JL et al., Org. Biomol. Chem., vol. 14, 10840 - 10847 , 2016). Pogodan rastvarač za PADS je npr. smeša baznog rastvarača kao što je npr. 3-pikolin ili 2,6-lutidin sa korastvaračem kao što je acetonitril, toluen, 1-metil-pirolidinon ili tetrahidrofuran. Količina baznog rastvarača prema količini ko-rastvarača može da bude bilo koji odnos uključujući i odnos 1:1. U zavisnosti od fosfitnog estra koji treba da se konvertuje u odgovarajući tiofosfat, mogu da se koriste i „sveži“ i „zreli“ PADS, međutim pokazalo se da „zreli“ PADS poboljšava brzinu i efikasnost sulfonacije. 'Zreli' PADS rastvori su sveže pripremljeni PADS rastvori koji su održavani neko vreme pre upotrebe u reakciji sulfonizacije.

Vreme sazrevanja može da varira od nekoliko sati do 48 sati i stručnjak može da odredi optimalno vreme starenja analizom reakcije sulfonacije na prinos i čistoću.

[0032] Za pripremu imetelstata u skladu sa ovim pronalaskom, koristi se rastvor PADS u smeši acetonitrila i 2,6-lutidina, poželjno u odnosu 1:1, sa vremenom sazrevanja od 4 do 14 sati. Utvrđeno je da kada se koristi 2,6-lutidin, ograničavanje količine 2,3,5-kolidina (koji se često nalazi kao nečistoća u 2,6-lutidinu) ispod 0.1% poboljšava efikasnost sulfonacije i manje se uočava nepoželjna oksidacija fosfora.

[0033] U koraku g) imetelstat je deprotektovan i odvojen od podloge u čvrstoj fazi. Deprotektovanje uključuje uklanjanje β-cijanoetil grupa i protektivnih grupa koje osetljivih na baze sa nukleotidnih baza. Ovo može da se postigne putem tretmana baznim rastvorom kao što je rastvor dietilamina (DEA) u acetonitrilu, nakon čega sledi tretman vodenim rastvorom amonijaka rastvorenog u alkoholu kao što je etanol.

[0034] Reakcioni koraci a) do f) prema predmetnom pronalasku se izvode u temperaturnom opsegu od 10°C do 40°C. Poželjnije, ove reakcije se izvode na kontrolisanoj temperaturi u opsegu od 15°C do 30°C. Konkretno, reakcioni korak b) prema predmetnom pronalasku se izvodi u temperaturnom opsegu od 15°C do 30°C; tačnije 17°C do 27°C. Konkretno, reakcioni korak d) prema predmetnom pronalasku se izvodi u temperaturnom opsegu od 17°C do 25°C; tačnije 18°C do 22°C; konkretno, 19°C. Korak g) u kome se imetelstata deprotektuje i odvaja od nosača u čvrstoj fazi, izvodi se na temperaturi u opsegu od 30°C do 60°C. U zavisnosti od opreme i specifičnih reakcionih uslova koji se koriste, optimalnu temperaturu reakcije za svaki korak a) do g) u okviru gore navedenih opsega može da odrediti stručnjak u oblasti.

[0035] Posle svakog koraka u ciklusu elongacije, nosač u čvrstoj fazi se ispira rastvaračem, na primer acetonitrilom, u pripremi za sledeću reakciju.

[0036] Nakon koraka g), sirovi imetelstat se dobija u obliku amonijumove soli koji se zatim prečišćava reverzno-faznom preparativnom tečnom hromatografijom visokih performansi (RP-HPLC) pomoću, bilo polimernih smola, bilo smola na bazi silicijum dioksida, kako bi se dobio prečišćeni imetelstat u obliku trietil amina. Dodaje se višak natrijumove soli, a zatim se rastvor odsoljava dijafiltracijom čime se dobija imetelstat natrijum koji se zatim liofilizuje kako bi se uklonila voda.

Eksperimentalni deo

[0037] ’Sobna temperatura’ ili ’temperatura sredine’ je tipično između 21-25 °C.

Eksperiment 1 (bez koraka terminalne obrade)

1

[0038] Svi rastvori reagenasa i polaznog materijala pripremani su sa 3% dihlorosirćetnom kiselinom (DCA) u toluenu, 0.5 M 5-(etiltio)-1H-tetrazol u acetonitrilu, 0.15 M sva 4 nukleotidna monomera formule (B’n) u acetonitrilu, 0.2 M fenil acetil disulfid (PADS) u 1:1 smeši acetonitrila i 2,6-lutidina i 20% DEA (dietilamina) u acetonitrilu.

1

[0039] Sinteza oligonukleotida je izvedena u pravcu od 5’ do 3’ putem ciklusa sinteze koji se ponavlja i koji se sastoji od detritilacije praćene kuplovanjem i sulfonacijom na sobnoj temperaturi.

[0040] Kolona (prečnik: 3.5 cm) je napunjena čvrstim nosačem napunjenim sa 3 palmitoilamido-1-O-(4,4'-dimetoksitritil)-2-O-sukcinil propandiol (3,5 mmol na osnovu kapaciteta od 400 μmol/g) koji je kuplovan sa nukleotidnim monomerom B'1. Detritilacija je postignuta pomoću 3% dihlorsirćetne kiseline (DCA) u toluenu (količina je između 6.5 i 13.4 zapremine kolone u svakom koraku detritilacije) i nukleotid vezan za čvrsti nosač je ispran acetonitrilom (količina: 5 zapremina kolone). Kuplovanje sa sledećim nukleotidnim monomerom formule (B'n) je postignuto pumpanjem rastvora 0.5 M 5-(etiltio)-1H-tetrazola u acetonitrilu i 0.15 M sledećeg nukleotidnog monomera formule (B'n) u sekvenci, rastvorenog u acetonitrilu, kroz kolonu. Kolona je isprana acetonitrilom (količina: 2 zapremine kolone). Zatim je izvršena sulfonizacija pumpanjem rastvora 0.2 M fenil acetil disulfida (PADS) u smeši acetonitrila i 2,6-lutidina 1:1 kroz kolonu, nakon čega je kolona isprana acetonitrilom (količina: 5 zapremina kolone).

[0041] Ciklus sinteze koj se sastoji od detritilacije, kuplovanja sa sledećim nukleotidnim monomerom formule (B'n) i sulfonacije je ponovljen 12 puta, nakon čega je usledila detritilacija

1

pomoću 3% dihlorosirćetne kiseline (DCA) u toluenu (količina je između 6.5 i 13.4 zapremina kolone).

[0042] Po završetku ciklusa sinteze, sirovi oligonukleotid na čvrstom nosaču je tretiran sa rastvorom dietilamina (DEA), nakon čega je usledio tretman rastvorom amonijum hidroksid: etanol (3:1 zapreminski odnos) na temperaturi od 55° C. Reakciona smeša je ostavljena da odstoji 4 do 24 sata na 55°C, ohlađena do sobne temperature i suspenzija je filtrirana da bi se uklonio polimerni nosač. Rastvor koji sadrži imetelstat u obliku amonijuma je podvrgnut postupku HPLC analize iz Eksperimenta 3.

Eksperiment 2 (sa korakom terminalne obrade)

[0043] Svi rastvori reagenasa i polaznih materijala su pripremljeni uključujući 3% dihlorosirćetnu kiselinu (DCA) u toluenu, 0.5 M 5-(etiltio)-1H-tetrazol u acetonitrilu, 0.15 M sva 4 nukleotidna monomera formule (B'n) u acetonitrilu , 0.2 M fenil acetil disulfida (PADS) u smeši 1:1 smeše acetonitrila i 2,6-lutidina, 20% N-metilimidazola (NMI) u acetonitrilu kao agensa za terminalnu obradu A, izobuternog anhidrida u smeši acetonitrila 1:1 i smeša 2,6 lutidina kao agensa za terminalnu obradu B i 20% DEA u acetonitrilu.

[0044] Sinteza oligonukleotida je izvedena u pravcu od 5’ do 3’ putem ciklusa sinteze koji se ponavlja u koji se sastoji od detritilacije praćene kuplovanjem i sulfatacijom na sobnoj temperaturi.

[0045] Kolona (prečnik: 3.5 cm) je napunjena čvrstim nosačem napunjenim 3-palmitoilamido-1-O-(4,4'-dimetoksitritil)-2-O-sukcinil propandiolom (3.5 mmol na osnovu kapaciteta od 400 μmol/g) koji je kuplovan sa nukleotidnim monomerom B'1. Detritilacija je postignuta pomoću 3% dihlorsirćetne kiseline (DCA) u toluenu (količina je između 6.5 i 13.4 zapremine kolone u svakom koraku detritilacije) i nukleotid vezan za čvrsti nosač je ispran acetonitrilom (količina: 5 zapremina kolone). Kuplovanje sa sledećim nukleotidnim monomerom formule (B'n) je postignuto pumpanjem rastvora 0.5 M 5-(etiltio)-1H-tetrazola u acetonitrilu i 0.15 M sledećeg nukleotidnog monomera formule (B'n) u sekvenci, rastvorenog u acetonitrilu, kroz kolonu. Kolona je isprana acetonitrilom (količina: 2 zapremine kolone). Zatim je izvršena sulfonizacija pumpanjem rastvora 0.2 M fenil acetil disulfida (PADS) u smeši acetonitrila i 2,6-lutidina 1:1 kroz kolonu, nakon čega je kolona isprana acetonitrilom (količina: 5 zapremina kolone).

[0046] Nakon sulfonacije je usledio korak terminalne obrade. Svaka terminalna obrada u datom ciklusu koristila je 37-47 ekvivalenata (ekv.) agensa za terminalnu obradu NMI i 9-11 ekvivalenata agensa za terminalnu obradu B izobuternog anhidrida IBA) i 1.4-1.8 ekvivalenata

1

2,6 lutidina. Sredstva za terminalnu obradu A i B su pumpana kroz kolonu sa odvojenim pumpama u različitim odnosima kao što su 50:50, 35:65, 65:35.

[0047] Ciklus sinteze koji se satoji od detritilacije, kuplovanja sa sledećim nukleotidnim monomerom formule (B'n) i sulfonacije i koraka terminalne obrade, ponovljen je 12 puta, nakon čega je usledila detritilacija pomoću 3% dihlorosirćetne kiseline (DCA) u toluenu (količina je između 6.5 i 13.4). zapremine kolone).

[0048] Po završetku ciklusa sinteze, sirovi oligonukleotid na čvrstoj podlozi je tretiran rastvorom dietilamina (DEA), nakon čega je usledio tretman rastvorom amonijum hidroksid: etanol (3:1 zapreminski odnos) na temperaturi od 55°C. Reakciona smeša je stajala 4 do 24 sata na 55°C, ohlađena je do sobne temperature i suspenzija je filtrirana kako bi se uklonio polimerni nosač. Rastvor koji sadrži imetelstat u obliku amonijuma je podvrgnut postupku HPLC analize eksperimenta 3.

Eksperiment 3 : poređenje prisustva i odsustva terminalne obrade

[0049] Imetelstat dobijen u Eksperimentu 1 i Eksperimentu 2 je analiziran pomoću HPLC. Količina željenog oligonukleotida pune dužine koji ima 13 nukleotida je određena i navedena za Eksperiment 1 i Eksperiment 2 u Tabeli datoj u nastavku teksta. Takođe, ukupna količina kraćeg oligonukleotida, konkretno 12-tomera, je određena i navedena u Tabeli koja sledi, za Eksperiment 1 i Eksperiment 2.

HPLC metoda analize:

[0050]

Tip kolone: Kromasil C18, veličina čestica 3.5 μm, 4.6 X 150 mm

eluens:

A: 14.4 mM TEA/386 mM HFIP (heksafluoroizopropanol) /100 ppm(tež./zap.) Na2EDTA u vodi

B: 50% MeOH, 50% EtOH koji sadrži 5% IPA

Gradijent:

1

Tabela: eksperimenti sa i bez terminalne obrade (Eksperiment 1 je ponovljen dva puta, i rezultati su navedeni kao Eksperiment 1a i 1b).

[0051] HPLC analiza Eksperimenta 1 i Eksperimenta 2 pokazuje da su prinos i čistoća uporedivi za eksperiment bez terminalne obrade u odnosu na eksperiment sa terminalnu obradom. Glavni pik % uključuje punu dužinu oligonukleotida PO nečistoće prečišćene nečistoće. PO nečistoće su nečistoće koje uključuju jednu ili više oksofosforamidatnih internukleozidnih veza umesto tiofosforamidatnih internukleozidnih veza.

Upotreba rastvarača i vreme reakcije

[0052] 0.45 L acetonitrila/mmol se koristi za pripremu reagensa za terminalnu obradu A i reagensa za terminalnu obradu B, što odgovara približno 25% ukupne upotrebe acetonitrila tokom pripreme reagenasa. Pošto svaki korak hemijske reakcije prati ispiranje rastvaračem, posle svakog koraka terminalne obrade takođe se odvija ispiranje rastvaračem koje je ekvivalentno zapremini rastvarača od oko 40 zapremina kolone. Uzimajući u obzir da se ispiranje rastvaračem vrši sa oko 212 zapremina kolone za dati ciklus sinteze, oko 19% rastvarača za ispiranje se koristi za korake terminalne obrade. Svaki korak terminalne obrade traje između 3-6 minuta. Ovo odgovara vremenu od oko 8% ukupnog vremena sinteze uključujući 13 ciklusa i DEA tretman.

Eksperiment 4 (temperatura detritilacije)

2

[0053] Temperatura detritilacije ima uticaja u smislu kontrole n-1 i prečišćenih nečistoća. Temperatura rastvora za deblokiranje na ulazu u aparat za sintezu je izabrana tako da bude između 17.5 i 27 °C (na skali od 3.5 mmol) i izabrana temperatura je ostala ista za sve korake detritilacije. Ispiranje acetonitrilom je takođe održavano na istoj temperaturi rastvora za za deblokiranje. % prečišćenih nečistoća raste linearno sa temperaturom, dok je n-1 veći na nižim temperaturama.

Eksperiment 5 (temperatura u koraku sulfatacije)

[0054] U eksperimentima koji su dati u nastavku teksta, temperatura (RT znači sobna temperatura) rastvora PADS koji se koristi u reakcijama sulfonacije je testirana na procenat manje povoljnih PO nečistoća (ovo su nečistoće kod kojih je došlo do oksidacije fosfora umesto sulfonacije). Niža temperatura rezultira nižim PO %.

SEQ ID NO:1 - imetelstat i imetelstat natrijum

[0055] 5’-R-TAGGGTTAGACAA-NH2-3’

gde R predstavlja palmitoil [(CH2)14CH3] amid je konjugovan preko aminoglicerol linkera sa 5’-tiofosfatnom grupom N3’ →P5’ tiofosforamidat (NPS)-vezanog oligonukleotida.

Claims (13)

1. Patentni zahtevi 1. Postupak za sintezu N3’ → P5’ tiofosforamidatnog oligonukleotida imetelstata formule

   pri čemu postupak obuhvata a) obezbeđivanje prvog 3’-amino zaštićenog nukleotida vezanog za nosač u čvrstoj fazi, formule (A), gde je PG protektivna grupa osetljiva na kiselinu;

   b) deprotektovanje zaštićene 3’-amino grupe kako bi se obrazovala slobodna 3’-amino grupa;

   2 c) reakciju slobodne 3’-amino grupe sa zaštićenim 3’-aminonukleozid-5’-O-cijanoetil-N,N-diizopropilaminofosforamiditnim monomerom formule (B’n), pri čemu B’nsa n = 2 predstavlja zaštićeni A, kako bi se obrazovala internukleozidna N3’→P5’-fosforamiditna veza;

   d) sulfataciju internukleozidne fosforamiditne grupe pomoću acil disulfida kako bi se obrazovao N3’→P5’ tiofosforamidat; e) ponavljanje 11 puta, jednog za drugim, koraka b) deprotekcije, koraka c) kuplovanja sa zaštićenim 3’-aminonukleozid-5’-O-cijanoetil-N,N-diizopropilamino-fosforamiditnim monomerom formule (B’n), gde je nukleozidna baza B’ monomera (B’n) zaštićeni B, osim kada je B timin, i gde je Bnsukcesivno nukleobaza B3do B13u odgovarajućih 11 koraka kuplovanja, i koraka d) sulfatacije; f) uklanjanje protektivne grupe PG osetljive na kiselinu; i g) deprotektovanje i odvajanja imetelstata sa nosača u čvrstoj fazi; naznačen time što se ni u jednom od reakcionih koraka a) do e) ne izvodi dodatni korak terminalne modifikacije.
2. 2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, pri čemu se imetelstat dalje konvertuje u svoju so natrijuma.
3. 3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, pri čemu je acil disulfid izabran od dibenzoil disulfida, bis(fenilacetil) disulfida (PADS), bis(4-metoksibenzoil) disulfida, bis(4-metilbenzoil) disulfida, bis(4-nitrobenzoil) disulfida i bis(4-hlorobenzoil) disulfida.
4. 4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, gde je acil disulfid PADS.
5. 5. Postupak prema patentnom zahtevu 4, gde se PADS rastvara u smeši 3-pikolina ili 2,6-lutidina sa ko-rastvaračem izabranim od acetonitrila, toluena, 1-metilpirolidinona i tetrahidrofurana.
6. 6. Postupak prema patentnom zahtevu 5, gde se PADS rastvara u smeši 2,6-lutidina sa acetonitrilom.
7. 7. Postupak prema patentnom zahtevu 6, gde PADS rastvor sazreva između 4 sata i 14 sati pre upotrebe.
8. 8. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je grupa PG osetljiva na kiselinu izabrana od trifenilmetila, p-anisildifenilmetila, and di-p-anisilfenilmetila.
9. 9. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se protektivna grupa PG osetljiva na kiselinu uklanja putem tretmana kiselim rastvorom.
10. 10. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je protektivna grupa osetljiva na bazu na adeninskoj, citozinskoj i guaninskoj bazi u monomeru formule (B’n) izabrana od acetila, benzoila, izobutirila, dimetilformamidinila i dibenzilformamidinila.
11. 11. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu se korak c) kuplovanja izvodi pomoću aktivatora koji je izabran od tetrazola, 5-(etiltio)-1H-tetrazola, 5-(4-nitrofenil)tetrazola, 5-(2-tienil)-1H-tetrazola, triazola i piridinijum hlorida.
12. 12. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se korak g) izvodi putem tretmana baznim rastvorom.
13. 13. Postupak prema patentnom zahtevu 12, gde je bazni rastvor dietilamin rastvoren u acetonitrilu ili vodeni amonijak rastvoren u alkoholu, ili kombinacija ova dva. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5 2