KR20200057112A - 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 - Google Patents

인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 Download PDF

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Abstract

본 발명은 췌장 내배엽 세포의 췌장 내분비 풍부 클러스터로의 분화를 촉진하고 호르몬-발현 세포 내에서 인슐린 발현을 향상시키는 방법을 제공한다.

Description

인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 세포로의 분화 {DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS INTO PANCREATIC ENDOCRINE CELLS}
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 모든 목적을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는, 2012년 6월 8일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/657,160호의 이익을 주장한다.
본 발명은 세포 분화 분야이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 만능 줄기 세포의 내분비 세포로의 분화의 조절자로서의 에프린 리간드 및 스핑고신-1-포스페이트의 용도를 개시한다.
제I형 진성 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포-대체 치료법에서의 진전에서는 생착(engraftment)에 적절한 인슐린-생산 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는 데 관심이 집중되었다. 한 가지 접근법은 예를 들어 배아 줄기 세포와 같은 만능 줄기 세포로부터의 작용성 β 세포의 생성이다.
척추동물 배아 발생에서, 만능성 세포는 낭배형성(gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층(외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 시기를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽(definitive endoderm)의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 HNF3베타, GATA4, MIXL1, CXCR4 및 SOX17과 같은 많은 마커를 발현한다.
낭배형성 마지막까지, 내배엽은 내배엽의 전방, 중간 및 후방 영역을 독특하게 표시하는 인자들의 패널의 발현에 의해 인식될 수 있는 전방-후방 도메인(anterior-posterior domain)으로 나누어진다. 예를 들어, Hhex, 및 Sox2는 전방 영역을 확인해 주는 반면, Cdx1, 2, 및 4는 후방의 절반의 내배엽을 확인해 준다.
내배엽 조직의 이주는, 내배엽이 상이한 중배엽 조직들과 아주 근접해지게 하며 이는 장관의 국지화를 돕는다. 이는 많은 분비형 인자들, 예를 들어 FGF, Wnt, TGF-B, 레틴산(RA), 및 BMP 리간드(ligand) 및 그 길항제에 의해 달성된다. 예를 들어, FGF4 및 BMP는 추정 후장 내배엽에서의 Cdx2 발현을 촉진하며 전방 유전자 Hhex 및 SOX2의 발현을 억제한다(문헌[2000 Development, 127:1563―1567]). 또한 WNT 신호전달(signaling)은 후장 발생을 촉진하고 전장 운명을 저해하도록 FGF 신호전달과 병행하여 작동하는 것으로 밝혀졌다(문헌[2007 Development, 134:2207―2217]). 마지막으로, 중간엽에 의해 분비된 레틴산은 전장-후장 경계부를 조절한다(문헌[2002 Curr Biol, 12:1215―1220]).
특정 전사 인자들의 발현 수준을 이용하여 조직의 아이덴티티(identity)를 표기할 수 있다. 완성 내배엽의 원시 장관으로의 형질전환 동안, 장관은 제한된 유전자 발현 패턴에 의해 분자 수준에서 관찰될 수 있는 넓은 도메인들 내로 국지화되게 된다. 예를 들어, 장관 내의 국지화된 췌장 도메인은 PDX-1의 매우 높은 발현 및 CDX2 및 SOX2의 매우 낮은 발현을 나타낸다. 이와 유사하게, 높은 수준의 Foxe1의 존재는 식도 조직을 나타내며; NKX2.1은 폐 조직에서 고도로 발현되며; SOX2/Odd1(OSR1)은 위 조직에서 고도로 발현되며; PROX1/Hhex/AFP의 발현은 간 조직에서 높으며; SOX17은 담도 구조 조직에서 고도로 발현되며; PDX1, NKX6.1/PTf1a, 및 NKX2.2는 췌장 조직에서 고도로 발현되며; CDX2의 발현은 장 조직에서 높다. 상기 요약은 문헌[Dev Dyn 2009, 238:29―42] 및 문헌[Annu Rev Cell Dev Biol 2009, 25:221-251]으로부터 수정된다.
췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화에서 일어난다(문헌[2009 Annu Rev Cell Dev Biol, 25:221-251]; 문헌[2009 Dev Dyn, 238:29-42]). 배측(dorsal) 및 복측(ventra) 췌장 도메인은 전장 상피에서 생긴다. 또한 전장은 식도, 기관, 폐, 갑상선, 위, 간, 췌장 및 담관계가 생기게 한다.
췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자 PDX1을 발현한다. Pdx1의 부재 하에서는, 췌장은 복측 원기(ventral bud) 및 배측 원기(dorsal bud)의 형성 이상으로는 발달하지 못한다. 따라서, Pdx1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 특징짓는다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.
드'아무르(D'Amour) 등은 고농도의 액티빈과 저 혈청의 존재 하에서 인간 배아 줄기(ES: embryonic stem) 세포-유래 완성 내배엽의 강화된 배양물의 생성을 기재한다(문헌[Nature Biotechnol 2005, 23:1534-1541]; 미국 특허 제7,704,738호). 마우스의 신장 피막 하에 이들 세포를 이식하면 내배엽 조직의 특성을 갖는 더욱 성숙한 세포로 분화되었다(미국 특허 제7,704,738호). 인간 배아 줄기 세포-유래된 완성 내배엽 세포는 FGF-10 및 레틴산의 첨가 후에 PDX1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다(미국 특허 공개 제2005/0266554A1호). 면역 결핍 마우스의 지방 패드 내에 이들 췌장 전구 세포를 후속적으로 이식하면 3 내지 4개월의 성숙기 후에 작용성 췌장 내분비 세포의 형성이 유발되었다(미국 특허 제7,993,920호 및 미국 특허 제7,534,608호).
피스크(Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터의 췌도 세포의 생성 시스템을 보고한다(미국 특허 제7,033,831호). 이 경우에, 분화 경로를 세 단계로 나누었다. 먼저 인간 배아 줄기 세포를 부티르산나트륨과 액티빈 A의 배합물을 이용하여 내배엽으로 분화시켰다(미국 특허 제7,326,572호). 이어서 당해 세포를 EGF 또는 베타셀룰린과 배합된 노긴(Noggin)과 같은 BMP 길항제를 이용하여 배양하여 PDX1 양성 세포를 생성하였다. 마지막 분화는 니코틴아미드에 의해 유도되었다.
또한 소분자형 저해제(inhibitor)는 췌장 내분비 전구 세포의 유도에 사용되었다. 예를 들어, TGF-B 수용체 및 BMP 수용체들의 소분자형 저해제(문헌[Development 2011, 138:861-871]; 문헌[Diabetes 2011, 60:239-247])가 췌장 내분비 세포의 수를 유의하게 향상시키기 위하여 사용되었다. 게다가, 소분자형 활성화제가 완성 내배엽 세포 또는 췌장 전구 세포의 생성에 또한 사용되었다(문헌[Curr Opin Cell Biol 2009, 21:727-732]; 문헌[Nature Chem Biol 2009, 5:258-265]).
인간 만능 줄기 세포로부터 췌장 세포를 생성시키기 위한 프로토콜의 개선에 있어서 장족의 발전이 이루어졌음에도 불구하고, 작용성 내분비 세포 및 특정 베타 세포를 유발하는 프로토콜을 생성시킬 필요성이 여전히 존재한다. 본 명세서에서, 본 발명자들은 일 부류의 에프린 리간드 및 스핑고신-1-포스페이트 또는 스핑고신 수용체의 작용제가 내분비 세포의 생성을 향상시키고 내분비 호르몬 및 내분비 전구 세포의 클러스터링을 가속시킴을 입증한다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 에프린 A4 또는 에프린 A3을 포함하는 배지 내에서 췌장 내배엽 세포의 개체군을 배양함으로써 인슐린 및 NKX6.1의 발현을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포의 개체군은 실질적으로 CDX2 또는 SOX2를 발현시키지 않는다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포의 개체군은 만능 세포의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 만능 세포는 인간 배아 만능 세포이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 액티빈 A 또는 액티빈 C를 포함하는 배지 내에서 췌장 내배엽 세포를 배양함으로써 인슐린, 글루카곤, 및 그렐린의 발현을 억제하는 중에 소마토스타틴의 발현을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리된 췌장 내배엽 세포의 개체군은 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포의 개체군보다 더 많은 소마토스타틴을 발현시킨다. 일부 실시 형태에서는, 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포의 개체군에서의 인슐린의 발현에 비교하여 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리된 췌장 내배엽 세포의 개체군에서 인슐린의 발현이 억제된다. 일부 실시 형태에서는, 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포의 개체군에서의 글루카곤의 발현에 비교하여 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리된 췌장 내배엽 세포의 개체군에서 글루카곤의 발현이 억제된다. 일부 실시 형태에서는, 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포의 개체군에서의 그렐린의 발현에 비교하여 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리된 췌장 내배엽 세포의 개체군에서 그렐린의 발현이 억제된다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포는 실질적으로 CDX2 또는 SOX2를 발현시키지 않는다. 일부 실시 형태에서, 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리된 췌장 내배엽 세포는 만능 세포의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포가 유래되는 만능 세포는 인간 배아 만능 세포이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 세마포린 3a 또는 에피겐을 포함하는 배지 내에서 췌장 내배엽 세포를 처리함으로써 NKX6.1의 발현을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 세마포린 3a 또는 에피겐을 포함하는 배지로 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포에 비교하여, 세마포린 3a 또는 에피겐을 포함하는 배지로 처리된 췌장 내배엽 세포의 개체군은 향상된 양의 NKX6.1을 발현시킨다. 일부 실시 형태에서, 세마포린 3a 또는 에피겐을 포함하는 배지로 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포에 비교하여, 세마포린 3a 또는 에피겐을 포함하는 배지로 처리된 췌장 내배엽 세포 내에서 인슐린, 글루카곤, 및 그렐린과 같은 호르몬의 발현 수준은 영향을 받지 않는다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포는 실질적으로 CDX2 또는 SOX2를 발현시키지 않는다. 일부 실시 형태에서, 세마포린 3a 또는 에피겐을 포함하는 배지로 처리된 췌장 내배엽 세포는 만능 세포의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포가 유래되는 만능 세포는 인간 배아 만능 세포이다.
일부 실시 형태에서 본 발명은, 에프린 A4, 에프린 A3, 액티빈 A, 액티빈 C, 세마포린 3a, 또는 에피겐을 포함하는 배지 내에서 췌장 내배엽 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 만능 세포를 분화시키는 단계적 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포는 에프린 A4 또는 에프린 A3을 포함하는 배지 내에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포는 액티빈 A 또는 액티빈 C를 포함하는 배지 내에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포는 세마포린 3a, 또는 에피겐을 포함하는 배지 내에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포가 유래되는 만능 줄기 세포는 인간 배아 만능 줄기 세포이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 췌장 내분비 세포를 스핑고신-1 수용체 작용제로 처리함으로써 내분비 클러스터의 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포를 처리하기 위해 사용되는 스핑고신-1 수용체 작용제는 스핑고신-1-포스페이트(S1P)이다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 세포, 및 본 발명의 세포를 사용하는 방법 또한 본 발명의 실시 형태로서 고찰된다.
도 1a 내지 도 1g는, 실시예 1에 기재된 바와 같이 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 내에서 하기 유전자의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 나타낸다: 인슐린(도 1a), 소마토스타틴(도 1b), 그렐린(도 1c), 글루카곤(도 1d), PDX-1(도 1e), NKX6.1(도 1f), 및 NGN3(도 1g).
도 2a 내지 도 2c는, 인슐린에 대해 면역 염색된 세포의 영상을 나타낸다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, 도 2a, 대조군; 도 2B, 50 ng/mL 에프린-A3으로 처리된 세포; 및 도 2c, 100 ng/mL 에프린-A3으로 처리된 세포.
도 3a 내지 도 3c는, 인슐린에 대해 면역 염색된 세포의 영상을 나타낸다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, 도 3a, 대조군; 도 3b, 50 ng/mL 에프린-A4로 처리된 세포; 및 도 3c, 100 ng/mL 에프린-A4로 처리된 세포.
도 4a 내지 도 4d는, 스핑고신-1-포스페이트(S1P)로 처리하고 제1일(도 4a), 제7일(도 4b), 및 2가지의 상이한 배율로 제10일(도 4c 및 도 4d)에 영상화한 세포의 S6 배양물의 위상차 영상을 도시한다. 상기 영상들은, 제7일에 내분비 세포의 클러스터링의 명확한 증거가 있었고, 제10일에 췌장 내배엽 상피의 박층에 의해 클러스터들이 서로 분리되었음을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d는, S1P로 처리하고 Hb9(도 5a), NKX6.1(도 5b)에 대해 면역염색하거나, 인슐린(도 5c) 및 Hb9(도 5d)에 대해 면역염색한 세포의 영상을 도시한다.
도 6a 및 도 6b는, 10 μM의 S1P로 처리하고 제6기의 시작으로부터 3일 후에 수확한 세포의 상이한 배율에서의 위상차 영상을 도시한다. 도 6c 및 도 6d는, NKX2.2에 대해 면역염색한 세포의 영상을 도시한다. 도 6c, 대조군 세포; 도 6d, S1P로 처리된 세포.
개시내용을 분명하게 하고 제한되지 않기 위해, 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특정 특색, 실시 형태 또는 출원을 기술 또는 예시하는 하기 부문으로 구분된다.
정의
줄기 세포는 단일 세포 수준에서 그의 자기-재생 및 분화 능력 둘 모두에 의해 규정되는 미분화된 세포이다. 줄기 세포는 자기-재생 선구체, 비-재생 선구체, 및 최종 분화된 세포를 포함하는 자손 세포를 생성할 수 있다. 또한 줄기 세포는 시험관 내에서 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 작용성 세포로 분화하는 그의 능력을 특징으로 한다. 또한 줄기 세포는 이식 후 다수의 배엽층의 조직이 생기게 하며, 배반포 내로의 주입 이후, 비록 전부는 아니더라도, 사실상 대부분의 조직에 기여한다.
줄기 세포는 그들의 발생 능력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배자외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위집단이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위집단이 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 선구체 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다능 줄기 세포보다 더 제한된 하위집단의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통(예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.
분화는 특화되지 않은("미결된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 세포 또는 분화-유도된 세포는 세포 계통 내에서 더욱 특화된(결정된(committed)) 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 정상 환경 하에서 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 하위세트로 계속 분화할 것이며 정상 환경 하에서 다른 세포 유형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. "탈분화"(de-differentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된(또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 관심있는 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결정 세포가 관심있는 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이러한 맥락에서, 차등 발현(differential expression)은 미분화 세포에 비교하여 양성 마커에 대한 증가된 수준 및 음성 마커에 대한 감소된 수준을 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 레벨은 다른 세포에 비하여 대상 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 대상 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포는 특정 마커가 그 세포에서 검출될 때 특정 마커에 "대하여 양성"이거나 또는 "양성"이다. 이와 유사하게, 세포는 특정 마커가 그 세포에서 검출되지 않을 때 특정 마커에 "대하여 음성"이거나 또는 "음성"이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "세포 밀도" 및 "접종 밀도"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며 고체 또는 반고체 평면 또는 곡면 기재의 단위 면적당 접종된 세포의 수를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "제1기" 및 "S1"은 완성 내배엽(DE)의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 확인하도록 상호교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "완성 내배엽"은 낭배의 외피(epiblast)로 인한 세포의 특징을 갖고 위장관로 및 그의 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들 중 하나 이상을 발현한다: HNF3 베타, GATA4, SOX17, CXCR4, 세르베루스(Cerberus), OTX2, 구스코이드(goosecoid), C-Kit, CD99, 및 MIXL1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "장관"은 하기 마커들 중 하나 이상을 발현하는, 완성 내배엽으로부터 유래된 세포를 말한다: HNF3-베타, HNF1-베타, 또는 HNF4-알파. 장관 세포는 모든 내배엽 기관, 예를 들어 폐, 간, 췌장, 위 및 장이 생기게 할 수 있다.
원시 장관의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 확인해 주는 "제2기" 및 "S2"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.
"전장 내배엽"은 식도, 폐, 위, 간, 췌장, 담낭, 및 일부분의 십이지장이 생기게 하는 내배엽 세포를 말한다.
"후방 전장"은 후방 위, 췌장, 간, 및 일부분의 십이지장이 생기게 할 수 있는 내배엽 세포를 말한다.
"중장 내배엽"은 장들, 십이지장, 맹장 및 상행 결장의 부분들이 생기게 할 수 있는 내배엽 세포를 말한다.
"후장 내배엽"은 원위 1/3의 횡행 결장, 하행 결장, S상 결장 및 직장이 생기게 할 수 있는 내배엽 세포를 말한다.
"제3기" 및 "S3" 둘 모두는 전장 내배엽의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 확인하도록 상호교환가능하게 사용된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "전장 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: PDX-1, FOXA2, CDX2, SOX2, 및 HNF4 알파.
췌장 전장 전구체의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 확인하기 위하여 "제4기" 및 "S4"가 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 "췌장 전장 전구체 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: PDX-1, NKX6.1, HNF6, FOXA2, PTF1a, Prox1 및 HNF4 알파.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "제5기" 및 "S5"는 췌장 내배엽 및 췌장 내분비 전구 세포의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 확인하도록 상호교환가능하게 사용된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 또는 PROX1. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 CDX2 또는 SOX2를 사실상 발현하지 않는다.
"췌장 내분비 세포", 또는 "췌장 호르몬 발현 세포", 또는 "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현시키는 세포", 또는 "제6기 세포", 또는 "S6 세포"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 하기 호르몬 중 하나 이상을 발현시킬 수 있는 세포를 지칭한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 그렐린, 및 췌장 폴리펩티드.
"췌장 인슐린 양성 세포"는 인슐린, HB9, NKX2.2, 및 NKX6.1을 발현시키는 내분비 개체군을 지칭한다.
"췌장 내분비 전구 세포" 또는 "췌장 내분비 선구 세포"는 췌장 호르몬 발현 세포가 될 수 있는 췌장 내배엽 세포를 말한다. 이러한 세포는 하기 마커들 중 하나 이상을 발현할 수 있다: NGN3, NKX2.2, 뉴로D, ISL-1, Pax4, Pax6, 또는 ARX.
"d1", "d 1", 및 "1일"; "d2", "d 2", 및 "2일"; "d3", "d 3", 및 "3일" 등은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 이들 수와 문자의 조합은 본 출원의 단계적 분화 프로토콜 중의 상이한 단계에서의 인큐베이션의 특정 일을 지칭한다.
"글루코스" 및 "D-글루코스"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 자연에서 일반적으로 발견되는 당인 덱스트로스를 말한다.
췌장 내분비 선구 세포에서 발현되는 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 확인하는 "뉴로D" 및 "뉴로D1"은 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.
미국 캘리포니아주 소재의 스템젠트(Stemgent)로부터 입수가능한 BMP 수용체 저해제를 나타내기 위하여 "LDN" 및 "LDN-193189"가 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.
만능 줄기 세포의 단리, 팽창 및 배양
만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(SSEA: stage-specific embryonic antigen) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 사용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현시킬 수 있다(문헌[Thomson et al. 1998, Science 282:1145-1147]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현의 손실로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼리 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조업자(미국 캘리포니아주 소재의 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드(Vector Red)를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때, OCT4 및 TERT를 발현한다.
번식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 SCID 마우스 내에 주사하고, 형성된 기형종을 4% 파라포름알데히드를 사용하여 고정시킨 다음에, 삼배엽층으로부터의 세포형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 다능성은 배양체(embryoid body)를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정될 수 있다.
번식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다. 다양한 지지 세포 층을 사용하는 배양 중에, 또는 기질 단백질 코팅된 용기를 사용함으로써, 만능 세포를 용이하게 증폭할 수 있다. 대안적으로, 세포의 일상적 증폭을 위해, mTeSR(등록상표)1 배지(캐나다 밴쿠버 소재의 스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies))와 같은 한정 배지와 조합하여 화학적으로 한정된 표면을 사용할 수 있다. EDTA(에틸렌다이아민테트라아세트산)와 같은 다양한 칼슘 킬레이터의 사용, 효소적 방법, 또는 기계적 방법을 사용하여 배양 평판으로부터 만능 세포를 용이하게 제거할 수 있다. 대안적으로, 임의의 기질 단백질 또는 지지 세포 층의 부재 하에 현탁액 중에서 만능 세포를 증폭할 수 있다.
만능 줄기 세포의 공급원
사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 임신 후 형성된 조직으로부터 유도되는 확립된 만능 세포주를 포함하고, 이러한 조직에는 전-배아 조직(예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 동안 임의의 시점에, 전형적으로 대략 10 내지 12주의 임신 전에(그러나 반드시 그러한 것은 아님) 취해진 태아 조직이 포함된다. 비제한적인 예로는 예를 들어 인간 배아 줄기 세포주들 H1, H7, 및 H9(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 와이셀 리서치 인스티튜트(WiCell Research Institute))와 같은 인간 배아 줄기 세포(hESC) 또는 인간 배아 생식 세포의 확립된 주가 있다. 영양 세포의 부재 하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 다수의 만능성 관련 전사 인자들, 예를 들어 OCT4, NANOG, Sox2, KLF4, 및 ZFP42의 강제 발현을 사용하여 성체 체세포로부터 유래될 수 있는 유도성 만능 세포(IPS: inducible pluripotent cell) 또는 재프로그래밍된 만능 세포 또한 적합하다(문헌[Annu Rev Genomics Hum Genet 2011, 12:165-185]). 본 발명의 방법에서 사용되는 인간 배아 줄기 세포는 또한 톰슨(Thomson) 등에 의해 기재된 바와 같이 제조될 수 있다(미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science, 1998, 282:1145-1147]; 문헌[Curr Top Dev Biol 1998, 38:133-165]; 문헌[Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1995, 92:7844-7848]).
만능 줄기 세포로부터의 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성
만능 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능 줄기 세포의 추가의 특징은 계속 확인되고 있다. 만능 줄기 세포 마커는 예를 들어, ABCG2, 크립토(cripto), FOXD3, 커넥신(CONNEXIN)43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81 중 하나 이상의 발현을 포함한다.
본 발명에 사용하기에 적절한 만능 줄기 세포는 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H9(NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H1(NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H7(NIH 코드: WA07) 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002(스웨덴 소재의 셀라르티스(Cellartis))를 포함한다. 또한, 만능 세포의 특징적인 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적절하다: ABCG2, 크립토, CD9, FOXD3, 커넥신43, 커넥신45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, 및 Tra 1-81.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질, FGF4, CD48, 에오메소더민(EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 다른 측면에서, 완성 내배엽 계통의 특징을 나타내는 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이며, 여기서 PDX-1 및 NKX6.1의 발현은 CDX2 및 SOX2의 발현보다 사실상 더 높다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN3, 뉴로D, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2, 및 PAX6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 하나 이상을 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.
본 발명의 췌장 내분비 세포는 세포 계통의 특징적인 마커를 발현시키는 세포이다. 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 PDX1 및 하기 전사 인자 중 하나 이상을 발현시킨다: NKX2.2, NKX6.1, 뉴로D, ISL1, HNF3 베타, MAFA, PAX4, 및 PAX6. 본 발명의 일 태양에서, 세포 계통의 특징적인 마커를 발현시키는 세포는 세포이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 에프린 A4 또는 에프린 A3을 포함하는 배지 내에서 제5기 세포의 개체군을 배양함으로써 인슐린 및 NKX6.1의 발현을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서는, 세포의 개체군에서 인슐린 및 NKX6.1의 발현이, 처리되지 않은 세포의 개체군에서의 인슐린 및 NKX6.1의 발현의 2배 이상으로 향상된다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포의 개체군은 실질적으로 CDX2 또는 SOX2를 발현시키지 않는다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포의 개체군은 만능 세포의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 만능 세포는 인간 배아 만능 세포이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 액티빈 A 또는 액티빈 C를 포함하는 배지 내에서 제5기 세포를 배양하는 단계에 의해 인슐린, 글루카곤, 및 그렐린의 발현을 억제하는 중에 소마토스타틴의 발현을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 처리된 세포의 개체군은 처리되지 않은 배양물의 2배 이상의 소마토스타틴을 발현시킨다. 일부 실시 형태에서, 인슐린의 발현은 처리되지 않은 배양물에서의 인슐린의 발현의 약 절반으로 억제된다. 일부 실시 형태에서, 글루카곤의 발현은 처리되지 않은 배양물에서의 글루카곤의 발현의 약 1/10로 억제된다. 일부 실시 형태에서, 그렐린의 발현은 처리되지 않은 배양물에서의 그렐린의 발현의 약 1/3로 억제된다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포는 실질적으로 CDX2 또는 SOX2를 발현시키지 않는다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포는 만능 세포의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 만능 세포는 인간 배아 만능 세포이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 세마포린 3a 또는 에피겐을 포함하는 배지 내에서 제5기 세포를 처리함으로써 NKX6.1의 발현을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 처리된 세포의 개체군은 처리되지 않은 배양물의 2배 이상의 NKX6.1을 발현시킨다. 일부 실시 형태에서, 처리되지 않은 배양물에 비교하여, 처리된 배양물에서 호르몬의 발현 수준은 영향을 받지 않는다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포는 실질적으로 CDX2 또는 SOX2를 발현시키지 않는다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포는 만능 세포의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 만능 세포는 인간 배아 만능 세포이다.
일부 실시 형태에서 본 발명은, 에프린 A4, 에프린 A3, 액티빈 A, 액티빈 C, 세마포린 3a, 또는 에피겐을 포함하는 배지 내에서 제5기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 만능 세포를 분화시키는 단계적 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포는 에프린 A4 또는 에프린 A3을 포함하는 배지 내에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포는 액티빈 A 또는 액티빈 C를 포함하는 배지 내에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 제5기 세포는 세마포린 3a, 또는 에피겐을 포함하는 배지 내에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 인간 배아 만능 줄기 세포이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 췌장 내배엽 세포를 에프린 리간드와 함께 배양하는 단계를 포함하는, 인슐린 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 에프린 리간드는 에프린 A3 및 에프린 A4로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포를 에프린 리간드와 함께 배양하는 단계는 인슐린 및 NKX6.1의 발현을 향상시킨다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포를 에프린 리간드와 함께 배양하는 단계는 췌장 내배엽 세포에서의 인슐린 및 NKX6.1의 발현을 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포에서의 인슐린 및 NKX6.1의 발현의 2배 이상으로 향상시킨다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포는 실질적으로 CDX2 또는 SOX2를 발현시키지 않는다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포는 만능 줄기 세포의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 만능 줄기 세포는 인간 배아 만능 줄기 세포이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 본 발명의 방법에 의해 제조된 인슐린 및 NKX6.1-발현 세포에 관한 것이다.
일 실시 형태에서 본 발명은, 췌장 내배엽 세포를 스핑고신-1 수용체 작용제와 함께 배양하는 단계를 포함하는, 내분비 클러스터 형성을 유도하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 췌장 내배엽 세포는 만능 줄기 세포의 단계적 분화에 의해 얻어진다. 일부 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 인간 배아 만능 줄기 세포이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명을 하기 실시예에 의해 추가로 예시하지만 하기 실시예에 의해 한정되지는 않는다.
실시예
실시예 1
인슐린 발현의 강력한 유도자로서의 에프린A4의 동정
인간 ES 세포의 분화로부터의 췌장 내배엽/내분비 배양물의 생성에 대한 다양한 단백질의 역할을 이해하기 위하여 본 실시예를 실행하였다.
인간 배아 줄기 세포주 H1(hESC H1, 계대 40)의 세포를 10 μM의 Y27632(록 저해제(Rock inhibitor), 카탈로그 번호 Y0503, 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마알드리치(SigmaAldrich))로 보충된 mTeSR(등록상표)1 배지(캐나다 밴쿠버 소재의 스템셀 테크놀로지스) 중에 단일 세포로서 1 × 105 세포/㎠로 마트리겔(MATRIGEL)(상표)(1:30 희석액; 뉴저지주 소재의 BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))-코팅된 접시 상에 접종하였다. 접종 후 48시간에, 배양물을 불완전 PBS(Mg 또는 Ca가 없는 포스페이트 완충 식염수) 중에 세척하였다. 배양물을 하기와 같이 췌장 내배엽/내분비 계통으로 분화시켰다:
a) 제1기(완성 내배엽(DE) - 3일): 세포를 하기의 제1기용 배지에서 1일 동안 배양하였다: 0.1%의 무지방산 BSA(카탈로그 번호 68700, 아이오와주 엔케니 소재의 프롤리언트(Proliant)), 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨(카탈로그 번호 S3187, 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마알드리치), 1X 글루타맥스(GlutaMax)(상표)(인비트로젠(Invitrogen) 카탈로그 번호 35050-079), 4.5 mM의 D-글루코스(시그마알드리치 카탈로그 번호 G8769), 100 ng/mL의 GDF8(미네소타주 미니애폴리스 소재의 R&D 시스템즈(R&D Systems)), 및 1 μM의 MCX 화합물(GSK3B 저해제, 14-프로프-2-엔-1-일-3,5,7,14,17,23,27-헵타아자테트라사이클로 [19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]헵타코사-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-노나엔-16-온, 미국 특허 출원 공개 제2010-0015711호; 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨)로 보충된 MCDB-131 배지(카탈로그 번호 10372-019, 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 인비트로젠). 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스(상표), 4.5 mM의 D-글루코스, 100 ng/mL의 GDF8, 및 0.1 μM의 MCX 화합물로 보충된 MCDB-131 배지 내에서 추가로 1일 동안 세포를 배양하였다. 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스(상표), 4.5 mM의 D-글루코스, 및 100 ng/mL의 GDF8로 보충된 MCDB-131 배지 내에서 추가로 1일 동안 세포를 배양하였다.
b) 제2기(원시 장관 - 2일): 0.1%의 무지방산 BSA; 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨; 1X 글루타맥스(상표); 4.5 mM의 D-글루코스; 0.25 mM의 아스코르브산(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마(Sigma)), 및 25 ng/mL의 FGF7(미네소타주 미니애폴리스 소재의 R & D 시스템즈)로 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 세포를 처리하였다.
c) 제3기(전장 - 2일): ITS-X(인비트로젠)의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0017 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1(미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마); 10 ng/mL의 액티빈-A(R & D 시스템즈); 1 μM의 레틴산(RA; 시그마); 25 ng/mL의 FGF7; 0.25 mM의 아스코르브산; 200 nM의 TPB(PKC 활성화제; 카탈로그 번호 565740; 뉴저지주 깁스타운 소재의 EMD 케미칼스(EMD Chemicals)); 10 μM의 포르스콜린(FSK, 시그마), 및 100 nM의 LDN(BMP 수용체 저해제; 카탈로그 번호 04-0019; 캘리포니아주 샌디에고 소재의 스템젠트)로 보충된 MCDB-131 배지로 제1일 동안 세포를 처리하였다. 제2일에, ITS-X의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0017 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 10 ng/mL의 액티빈 A; 1 μM의 RA; 25 ng/mL의 FGF7; 0.25 mM의 아스코르브산, 200 nM의 TPB, 10 μM의 포르스콜린, 및 10 nM의 LDN으로 보충된 MCDB-131 배지로 세포를 처리하였다.
d) 제4기(췌장 전장 전구체 - 2일); ITS-X의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 50 nM의 RA; 50 nM의 LDN-193189; 10 μM의 포르스콜린; 0.25 mM의 아스코르브산; 및 100 nM의 TPB로 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 세포를 처리하였다.
e) 제5기(췌장 내배엽/내분비 - 3일): ITS-X의 1:200 희석액; 20 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 50 nM의 RA; 10 μM의 포르스콜린; 0.25 mM의 아스코르브산으로 보충된 MCDB-131 배지로 3일 동안 제4기 세포를 처리하였으며, 제2일 내지 제3일에만 100 nM의 ALk5 저해제 SD-208(문헌[Molecular Pharmacology 2007, 72:152-161]에 개시됨)을 첨가하였다.
제5기의 제1일에, 하기 표 I에 열거된 인자를 배지 내에 스파이킹(spiking)하고, S5의 완료시에(제5기의 제3일) 관련 췌장 내배엽/내분비 유전자의 PCR 분석을 위해 mRNA를 수집하였다. 대조군으로서, 상기 열거된 S5 배지로만 배양물을 처리하였다. RNeasy 미니 키트(RNeasy Mini Kit)(캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠(Qiagen))로 총 RNA를 추출하고; 제조자의 지침에 따라 고용량 cDNA 역전사 키트(High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit)(캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 사용하여 역전사하였다. 커스텀 택맨 어레이(custom Taqman Array)(어플라이드 바이오시스템즈) 상에 사전-로딩된 택맨 유니버설 마스터 믹스(Taqman Universal Master Mix) 및 택맨 유전자 발현 어세이(Taqman Gene Expression Assay)를 사용하여 cDNA를 증폭하였다. 서열 검출 소프트웨어(Sequence Detection Software)(어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 데이터를 분석하고 ΔΔCt 방법을 사용하여 미분화 인간 배아 줄기(hES) 세포에 대해 표준화하였다. 모든 프라이머는 어플라이드 바이오시스템즈로부터 구매하였다.
[표 I]
Figure pat00001
Figure pat00002
도 1a 내지 도 1g는, 실시예 1에 약술된 바와 같이, 그리고 표 I에 열거된 인자들의 존재 하에, 제5기로 분화된 인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포 내에서의 하기 유전자의 발현의 실시간 PCR 분석으로부터의 데이터를 도시한다: 인슐린(도 1a), 소마토스타틴(도 1b), 그렐린(도 1c), 글루카곤(도 1d), PDX-1(도 1e), NKX6.1(도 1f), 및 NGN3(도 1g).
도 1에 나타낸 바와 같이, 에프린-A4는 대조군 배양물에 비교하여 NKX6.1 및 인슐린의 mRNA 발현을 향상시킨 반면에(도 1f) PDX-1(도 1e) 및 NGN3 발현(도 1g)에 대해서는 최소의 영향을 나타냈다. 액티빈-A 및 액티빈―C와 같은 인자는 소마토스타틴(도 1b)의 발현을 유의하게 향상시킨 반면에 인슐린(도 1a), 글루카곤(도 1d), 및 그렐린(도 1c)의 발현은 억제했다. 더욱이, 처리되지 않은 배양물에 비교하여 세마포린 3a 및 에피겐과 같은 인자는 NKX6.1 발현을 향상시킨 반면에 호르몬의 발현에는 영향을 미치지 않았다. 도 1에서, 대조군 배양물 내의 상이한 마커의 평균 발현 수준은 그래프 상의 점선에 의해 나타낸다.
실시예 2
S5에서의 인슐린 발현에 대한 에프린의 효과의 확인
본 실시예는 실시예 1에서 동정된 성과(hit)의 확인을 기재한다. 특히, 하기 열거된 프로토콜에서 S5에서의 에프린-A3 또는 에프린-A4의 첨가의 효과이다.
인간 배아 줄기 세포주 H1(hESC H1, 계대 40)의 세포를 10 μM의 Y27632로 보충된 mTeSR(등록상표)1 배지 중에 단일 세포로서 1 × 105 세포/㎠로 마트리겔(상표)(1:30 희석액; 뉴저지주 소재의 BD 바이오사이언시즈)-코팅된 접시 상에 접종하였다. 접종 후 48시간에, 배양물을 불완전 PBS(Mg 또는 Ca가 없는 포스페이트 완충 식염수) 중에 세척하였다. 배양물을 하기와 같이 췌장 내배엽/내분비 계통으로 분화시켰다:
a) 제1기(완성 내배엽(DE) - 3일): 제1기 배지(상기 실시예 1 참조) 내에서 1 일 동안 세포를 배양하였다. 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스(상표), 4.5 mM의 D-글루코스, 100 ng/mL의 GDF8, 및 0.1 μM의 MCX 화합물로 보충된 MCDB-131 배지 내에서 추가로 1일 동안 세포를 배양하였다. 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스(상표), 4.5 mM의 D-글루코스, 및 100 ng/mL의 GDF8로 보충된 MCDB-131 배지 내에서 추가로 1일 동안 세포를 배양하였다.
b) 제2기(원시 장관 - 2일): 0.1%의 무지방산 BSA; 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨; 1X 글루타맥스(상표); 4.5 mM의 D-글루코스; 0.25 mM의 아스코르브산(미주리주 소재의 시그마) 및 25 ng/mL의 FGF7(미네소타주 소재의 R & D 시스템즈)로 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 세포를 처리하였다.
c) 제3기(전장 - 2일): ITS-X(캘리포니아주 소재의 인비트로젠)의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0017 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1(미주리주 소재의 시그마); 10 ng/mL의 액티빈-A(미네소타주 소재의 R& D 시스템즈); 1 μM의 RA(미주리주 소재의 시그마); 25 ng/mL의 FGF7; 0.25 mM의 아스코르브산; 200 nM의 TPB(PKC 활성화제; 카탈로그 번호 565740; 뉴저지주 깁스타운 소재의 EMD 케미칼스); 10 μM의 포르스콜린 및 100 nM의 LDN(BMP 수용체 저해제; 카탈로그 번호 04-0019; 스템젠트)으로 보충된 MCDB-131 배지로 제1일 동안 세포를 처리하였다. 제2일에, ITS-X의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0017 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 10 ng/mL의 액티빈-A; 1 μM의 RA; 25 ng/mL의 FGF7; 0.25 mM의 아스코르브산, 200 nM의 TPB, 10 μM의 포르스콜린, 및 10 nM의 LDN으로 보충된 MCDB-131 배지로 세포를 처리하였다.
d) 제4기(췌장 전장 전구체 - 2일): ITS-X의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 50 nM의 RA; 50 nM의 LDN-193189; 10 μM의 포르스콜린; 0.25 mM의 아스코르브산; 및 100 nM의 TPB로 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 세포를 처리하였다.
e) 제5기(췌장 내배엽/내분비 - 3일): ITS-X의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 50 nM의 RA; 10 μM의 포르스콜린; 0.25 mM의 아스코르브산; 100 nM의 ALk5 저해제(제2일 내지 제3일에만)(문헌[Molecular Pharmacology 2007, 72:152-161]에 개시된 SD-208) 및 +/- 0-100 ng/mL의 에프린-A3 또는 에프린-A4(미네소타주 소재의 R & D 시스템즈)로 보충된 MCDB-131 배지로 3일 동안 제4기 세포를 처리하였다.
제5기의 종료점에, 대조군 및 에프린-처리 배양물을 고정시키고 인슐린 단백질 발현에 대해 염색하였다(메사추세츠주 캠브리지 소재의 밀리포어(Millipore)로부터의 기니아 피그 항-인슐린 항체를 사용함). 도 2는 인슐린에 대해 면역염색한 세포의 영상을 도시한다. 도 2a, 대조군 세포; 도 2b, 50 ng/mL 에프린 A3으로 처리된 세포; 도 2c, 100 ng/mL 에프린 A3으로 처리된 세포. 도 3은 인슐린에 대해 면역염색한 세포의 영상을 도시한다. 도 3a, 대조군 세포; 도 3b, 50 ng/mL 에프린 A4로 처리된 세포; 도 3c, 100 ng/mL 에프린 A4로 처리된 세포. 이들 데이터는, 실시예 1로부터의 데이터와 일관되게, 제5기에서의 에프린-A3 및 에프린―A4 양자 모두의 첨가가 인슐린의 단백질 발현을 유의하게 향상시켰음을 나타낸다.
실시예 3
S6에서의 스핑고신-1-포스페이트의 첨가는 내분비 호르몬을 함유하는 세포 클러스터의 형성을 유의하게 가속시킨다.
본 실시예는, 제6기에서의 내분비 클러스터 형성의 진행, 및 내분비 풍부 클러스터(endocrine rich cluster)의 형성을 가속시킴에 있어서 스핑고신-1-포스페이트의 효과를 기재한다.
인간 배아 줄기 세포주 H1(hESC H1, 계대 40)의 세포를 10 μM의 Y27632로 보충된 mTeSR(등록상표)1 배지(캐나다 밴쿠버 소재의 스템셀 테크놀로지스) 중에 단일 세포로서 1 × 105 세포/㎠로 마트리겔(상표)(1:30 희석액; 뉴저지주 소재의 BD 바이오사이언시즈) 코팅된 접시 상에 접종하였다. 접종 후 48시간에, 배양물을 불완전 PBS(Mg 또는 Ca가 없는 포스페이트 완충 식염수) 중에 세척하였다. 배양물을 하기와 같이 췌장 내배엽/내분비 계통으로 분화시켰다:
a) 제1기(완성 내배엽(DE) - 3일): 제1기 배지(상기 실시예 1 참조) 내에서 1 일 동안 세포를 배양하였다. 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스(상표), 4.5 mM의 D-글루코스, 100 ng/mL의 GDF8, 및 0.1 μM의 MCX 화합물로 보충된 MCDB-131 배지 내에서 추가로 1일 동안 세포를 배양하였다. 이어서, 0.1%의 무지방산 BSA, 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨, 1X 글루타맥스(상표), 4.5 mM의 D-글루코스, 및 100 ng/mL의 GDF8로 보충된 MCDB-131 배지 내에서 추가로 1일 동안 세포를 배양하였다.
b) 제2기(원시 장관 - 2일): 0.1%의 무지방산 BSA; 0.0012 g/mL의 중탄산나트륨; 1X 글루타맥스(상표); 4.5 mM의 D-글루코스; 0.25 mM의 아스코르브산(미주리주 소재의 시그마) 및 25 ng/mL의 FGF7(미네소타주 소재의 R & D 시스템즈)로 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 세포를 처리하였다.
c) 제3기(전장 - 2일): ITS-X(캘리포니아주 소재의 인비트로젠)의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0017 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1(미주리주 소재의 시그마); 10 ng/mL의 액티빈-A(미네소타주 소재의 R& D 시스템즈); 1 μM의 RA(미주리주 소재의 시그마); 25 ng/mL의 FGF7; 0.25 mM의 아스코르브산; 200 nM의 TPB(PKC 활성화제; 카탈로그 번호 565740; 뉴저지주 깁스타운 소재의 EMD 케미칼스); 10 μM 포르스콜린(FSK, 미주리주 소재의 시그마), 및 100 nM의 LDN(BMP 수용체 저해제; 카탈로그 번호 04-0019; 캘리포니아주 소재의 스템젠트)으로 보충된 MCDB-131 배지로 제1일 동안 세포를 처리하였다. 제2일에, ITS-X의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0017 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 10 ng/mL의 액티빈-A; 1 μM의 RA; 25 ng/mL의 FGF7; 0.25 mM의 아스코르브산, 200 nM의 TPB, 및 10 nM의 LDN으로 보충된 MCDB-131 배지로 세포를 처리하였다.
d) 제4기(췌장 전장 전구체 - 2일); ITS-X의 1:200 희석액; 4.5 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 50 nM의 RA; 50 nM의 LDN-193189; 10 μM의 포르스콜린; 0.25 mM의 아스코르브산; 2 ng/mL의 FGF7; 1 ng/mL의 AA; 및 100 nM의 TPB로 보충된 MCDB-131 배지로 2일 동안 세포를 처리하였다.
e) 제5기(췌장 내배엽/내분비 - 3일): ITS-X의 1:200 희석액; 15 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 50 nM의 RA; 10 μM의 포르스콜린; 0.25 mM의 아스코르브산; 및 1 ng/mL의 FGF7로 보충된 MCDB-131 배지로 3일 동안 제4기 세포를 처리하였으며; 제2일 내지 제3일에만 100 nM의 ALK5 저해제 SD-208을 첨가하였다.
f) 제6기(췌장 내분비 - 3 내지 10일): ITS-X의 1:200 희석액; 15 mM의 글루코스; 1X 글루타맥스(상표); 0.0015 g/mL의 중탄산나트륨; 2%의 무지방산 BSA; 0.25 μM의 SANT-1; 50 nM의 RA; 0.25 mM의 아스코르브산으로 보충된 MCDB-131 배지로 3 내지 10일 동안 제5기 세포를 처리하였다. 일부 배양에서는 10 μM의 스핑고신-1-포스페이트(미주리주 소재의 시그마)를 3일 동안 첨가하였다.
도 4a 내지 도 4d는, 스핑고신-1-포스페이트(S1P)로 처리하고 제1일(도 4a), 제7일(도 4b), 및 2가지의 상이한 배율로 제10일(도 4c 및 도 4d)에 영상화한 세포의 S6 배양물의 위상차 영상을 도시한다. 상기 영상들은, 제7일에 내분비 세포의 클러스터링의 명확한 증거가 있었고, 제10일에 췌장 내배엽 상피의 박층에 의해 클러스터들이 서로 분리되었음을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d는, Hb9(도 5a) 및 NKX6.1(도 5b)에 대해 면역염색하거나, 인슐린(도 5c) 및 Hb9(도 5d)에 대해 면역염색한 세포의 영상을 도시한다. 도 5a 및 도 5b는, 내분비 클러스터에는 Hb9가 강화된 반면에 클러스터를 둘러싸는 췌장 상피에는 NKX6.1이 강화되었음을 나타낸다. Hb9-강화 클러스터 내의 세포 중 일부는 또한 NKX6.1에 대해서 양성이었다. 도 5c 및 도 5d에 나타낸 바와 같이 클러스터는 인슐린 및 Hb9에 대해 강화되었다. 이러한 형태학적 변화는, NKX6.1+ PDX-1+ 풍부 상피가 내분비 클러스터를 생기게 하는 췌장 발생과 매우 유사하다. 각각의 경우에, 세포의 동일한 시야(field)로부터 상이한 필터를 사용하여 영상의 쌍을 얻었다.
도 6a 및 도 6b는, 10 μM의 스핑고신-1-포스페이트(S1P)로 처리하고 제6기의 시작으로부터 3일 후에 수확한 세포의 상이한 배율에서의 위상차 영상을 도시한다. 이들 영상은, 제6기의 시작으로부터 단 3일 후에 내분비 클러스터가 생겼음을 나타낸다. 이는 대조군 배양물 내의 클러스터의 형성보다 약 7일 더 이르다.
도 6c 및 도 6d는, NKX2.2에 대해 면역염색한 대조군 세포(도 6c) 및 S1P로 처리된 세포(도 6d)의 영상을 도시한다. NKX2.2+ 세포가 배양물 전체에 걸쳐 균일하게 분포된 대조군 배양물(도 6d)에 비교하여, S1P-처리 배양물에서 내분비 클러스터는 또한 NKX2.2+ 세포에 대해 강화되었다(도 6c).

Claims (13)

  1. 액티빈 A 또는 액티빈 C를 포함하는 배지에서 췌장 내배엽 세포를 배양함으로써 소마토스타틴의 발현이 향상된 췌장 내분비 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 췌장 내분비 세포에서 소마토스타틴의 발현을 향상시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 췌장 내분비 세포에서 인슐린, 글루카곤 및 그렐린(ghrelin)의 발현은 억제되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 췌장 내분비 세포가 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포로부터 생성된 췌장 내분비 세포와 비교하여 더 많은 소마토스타틴을 발현하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포로부터 생성된 췌장 내분비 세포에서의 인슐린의 발현과 비교하여 액티빈 A 또는 액티빈 C로 배양된 췌장 내배엽 세포로부터 생성된 췌장 내분비 세포에서 인슐린의 발현이 억제되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포로부터 생성된 췌장 내분비 세포에서의 글루카곤의 발현과 비교하여 액티빈 A 또는 액티빈 C로 배양된 췌장 내배엽 세포로부터 생성된 췌장 내분비 세포에서 글루카곤의 발현이 억제되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 액티빈 A 또는 액티빈 C로 처리되지 않은 췌장 내배엽 세포로부터 생성된 췌장 내분비 세포에서의 그렐린의 발현과 비교하여 액티빈 A 또는 액티빈 C로 배양된 췌장 내배엽 세포로부터 생성된 췌장 내분비 세포에서 그렐린의 발현이 억제되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 췌장 내배엽 세포가 실질적으로 CDX2 또는 SOX2를 발현하지 않는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 액티빈 A 또는 액티빈 C로 배양되는 췌장 내배엽 세포가 만능 세포의 단계적 분화에 의해 수득된 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 만능 세포가 인간 배아 만능 세포로부터 유래된 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 췌장 내배엽 세포가 인간 췌장 내배엽 세포인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 액티빈 A를 포함하는 배지에서 췌장 내배엽 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 액티빈 C를 포함하는 배지에서 췌장 내배엽 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    만능 줄기 세포를 완성 내배엽 세포로 분화시키는 단계;
    완성 내배엽 세포를 원시 장관(guttube) 세포로 분화시키는 단계;
    원시 장관 세포를 전장(foregut) 세포로 분화시키는 단계;
    전장 세포를 췌장 전장 전구체 세포로 분화시키는 단계; 및
    췌장 전장 전구체 세포를 췌장 내배엽 세포로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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WO (1) WO2013184888A1 (ko)
ZA (3) ZA201802253B (ko)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
DK2185693T3 (da) 2007-07-31 2019-09-23 Lifescan Inc Differentiering af humane embryoniske stamceller
CA2954431C (en) 2007-11-27 2021-08-24 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic cells
JP5733986B2 (ja) 2008-02-21 2015-06-10 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 細胞の付着、培養、及び剥離のための方法、表面改質されたプレート、並びに組成物
EP2942392B1 (en) 2008-06-30 2018-10-03 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
US9234178B2 (en) 2008-10-31 2016-01-12 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human pluripotent stem cells
KR101774546B1 (ko) 2008-11-20 2017-09-04 얀센 바이오테크 인코포레이티드 마이크로-캐리어 상의 만능 줄기 세포 배양
KR101687344B1 (ko) 2008-11-20 2016-12-16 얀센 바이오테크 인코포레이티드 평면 기재상의 세포 부착 및 배양을 위한 방법 및 조성물
CN102482643B (zh) 2009-07-20 2016-06-29 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
SG10201408552YA (en) 2009-12-23 2015-02-27 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
PH12012501686A1 (en) 2010-03-01 2020-10-19 Janssen Biotech Inc Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells
US9719068B2 (en) 2010-05-06 2017-08-01 Children's Hospital Medical Center Methods and systems for converting precursor cells into intestinal tissues through directed differentiation
RU2587634C2 (ru) 2010-05-12 2016-06-20 Янссен Байотек, Инк. Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека
EP3372672A1 (en) 2010-08-31 2018-09-12 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
FI2794857T3 (fi) 2011-12-22 2026-03-25 Janssen Biotech Inc Ihmisen alkion kantasolujen erilaistaminen yksittäisiksi hormonaalisiksi insuliinipositiivisiksi soluiksi
CA2866590A1 (en) 2012-03-07 2013-09-12 Janssen Biotech, Inc. Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells
EP3450544A1 (en) * 2012-06-08 2019-03-06 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endodrine cells
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
ES2837763T3 (es) * 2012-12-31 2021-07-01 Janssen Biotech Inc Cultivo de células madre embrionarias humanas en la interconexión aire-líquido para la diferenciación en células endocrinas pancreáticas
DK2938723T3 (da) 2012-12-31 2023-02-20 Janssen Biotech Inc Differentiering af humane embryonale stamceller til pancreatiske endokrine celler under anvendelse af hb9-regulatorer
BR112015015714A2 (pt) 2012-12-31 2017-07-11 Janssen Biotech Inc suspensão e aglomeração de células pluripotentes humanas para diferenciação em célu-las endócrinas pancreáticas
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
CN120796168A (zh) 2013-06-11 2025-10-17 哈佛学院校长同事会 SC-β细胞以及用于产生其的组合物和方法
WO2015175307A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Janssen Biotech, Inc. Use of small molecules to enhance mafa expression in pancreatic endocrine cells
EP3147353B1 (en) * 2014-05-21 2022-03-30 Kyoto University Method for producing pancreatic blast cells and pancreatic disease treatment agent containing pancreatic blast cells
SG10201801654RA (en) 2014-05-28 2018-04-27 Childrens Hospital Med Ct Methods and systems for converting precursor cells into gastric tissues through directed differentiation
CN107614678B (zh) 2014-12-18 2021-04-30 哈佛学院校长同事会 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法
EP3234110B1 (en) 2014-12-18 2024-02-28 President and Fellows of Harvard College METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED ß CELLS AND USES THEREOF
WO2016100898A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived b cells and uses thereof
EP3411471B1 (en) * 2016-02-04 2021-01-06 Société des Produits Nestlé S.A. In vitro production of pancreatic beta cells
US10420803B2 (en) 2016-04-14 2019-09-24 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to intestinal midgut endoderm cells
MD4194548T2 (ro) * 2016-06-21 2026-02-28 Janssen Biotech Inc Generarea de celule beta funcționale derivate din celule stem pluripotente umane care posedă respirație mitocondrială dependentă - de glucoză și răspuns la secreția de insulină în două faze
EP4553082A3 (en) 2016-11-04 2025-08-20 Children's Hospital Medical Center Liver organoid compositions and methods of making and using same
CA3042495A1 (en) 2016-11-10 2018-05-17 Viacyte, Inc. Pdx1 pancreatic endoderm cells in cell delivery devices and methods thereof
JP7248586B2 (ja) 2017-04-14 2023-03-29 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター 複数ドナー幹細胞組成物およびそれを作製する方法
CN111094547B (zh) * 2017-06-14 2024-02-09 德国亥姆霍兹慕尼黑中心健康与环境研究中心（有限公司） 用于纯化源自人胚胎干细胞的内胚层和胰腺内胚层细胞的方法
US10391156B2 (en) 2017-07-12 2019-08-27 Viacyte, Inc. University donor cells and related methods
EP3694603B1 (en) 2017-10-10 2026-04-08 Children's Hospital Medical Center Esophageal tissue and/or organoid compositions and methods of making same
EP3710021A4 (en) 2017-11-15 2021-08-11 Semma Therapeutics, Inc. ISLAND CELL MANUFACTURING COMPOSITIONS AND METHOD OF USE
EP3727394A4 (en) 2017-12-21 2021-09-08 Children's Hospital Medical Center DIGITALIZED HUMAN ORGANOIDS AND METHOD OF USING THEREOF
JP7646182B2 (ja) * 2018-05-16 2025-03-17 ワシントン・ユニバーシティ 内胚葉系統の細胞およびベータ細胞を生成するための方法および組成物、ならびにそれらの使用
EP4678727A3 (en) 2018-07-26 2026-03-11 Children's Hospital Medical Center Hepato-biliary-pancreatic tissues and methods of making same
WO2020033879A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Semma Therapeutics, Inc. Stem cell derived islet differentiation
CN109053866B (zh) * 2018-09-03 2020-12-15 北京中京高科生物科技有限公司 表皮干细胞向胰腺细胞分化的改进方法
US12378572B2 (en) 2018-09-07 2025-08-05 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
CA3112026A1 (en) 2018-09-12 2020-03-19 Children's Hospital Medical Center Organoid compositions for the production of hematopoietic stem cells and derivatives thereof
US11014940B1 (en) 2018-10-16 2021-05-25 Celgene Corporation Thiazolidinone and oxazolidinone compounds and formulations
US11014897B1 (en) 2018-10-16 2021-05-25 Celgene Corporation Solid forms comprising a thiazolidinone compound, compositions and methods of use thereof
US11186556B1 (en) 2018-10-16 2021-11-30 Celgene Corporation Salts of a thiazolidinone compound, solid forms, compositions and methods of use thereof
US11013723B1 (en) 2018-10-16 2021-05-25 Celgene Corporation Solid forms of a thiazolidinone compound, compositions and methods of use thereof
US12600943B2 (en) 2019-02-01 2026-04-14 The University Of Hong Kong Innervated organoid compositions and methods of making same
US20220411759A1 (en) * 2019-05-21 2022-12-29 President And Fellows Of Harvard College Endocrine differentiation-inducing molecule
AU2020283048A1 (en) 2019-05-31 2021-12-23 Children's Hospital Medical Center Shaped organoid compositions and methods of making same
EP3975926A1 (en) 2019-05-31 2022-04-06 W.L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
EP3976236A1 (en) 2019-05-31 2022-04-06 W.L. Gore & Associates Inc. A biocompatible membrane composite
CN114173837A (zh) 2019-05-31 2022-03-11 W.L.戈尔及同仁股份有限公司 生物相容性膜复合材料
US12497597B2 (en) 2019-05-31 2025-12-16 Children's Hospital Medical Center Methods of generating and expanding hematopoietic stem cells
CA3139292C (en) 2019-05-31 2025-06-10 Viacyte, Inc. CELL ENCAPSULATION DEVICES WITH REGULATED OXYGEN DIFFUSION DISTANCES
PH12022550542A1 (en) 2019-09-05 2023-03-20 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
CA3150235A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Alireza Rezania Universal donor cells
CA3158631A1 (en) 2019-10-21 2021-04-29 Orizuru Therapeutics, Inc. Growth inhibitor
WO2022144855A1 (en) 2020-12-31 2022-07-07 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
CN114634904B (zh) * 2022-05-17 2022-09-13 天津外泌体科技有限公司 高纯度胰腺祖细胞的产生方法
CN116162587B (zh) * 2023-02-20 2025-07-25 杭州瑞普晨创科技有限公司 Hippo-Yap通路调控剂在促进诱导性多能干细胞向胰腺前体细胞定向分化中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006500003A (ja) * 2001-12-07 2006-01-05 ジェロン・コーポレーション ヒト胚幹細胞由来の膵島細胞
JP2009528066A (ja) * 2006-03-02 2009-08-06 サイセラ，インコーポレイテッド 内分泌前駆細胞、膵臓ホルモン発現細胞及びそれらの製造方法
KR20100042649A (ko) * 2007-07-18 2010-04-26 라이프스캔, 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
JP2012507289A (ja) * 2008-10-31 2012-03-29 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の膵内分泌系への分化
JP2012507292A (ja) * 2008-10-31 2012-03-29 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の膵内分泌系への分化

Family Cites Families (268)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3209652A (en) 1961-03-30 1965-10-05 Burgsmueller Karl Thread whirling method
AT326803B (de) 1968-08-26 1975-12-29 Binder Fa G Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben
US3935067A (en) 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
CA1201400A (en) 1982-04-16 1986-03-04 Joel L. Williams Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture
US4499802A (en) 1982-09-29 1985-02-19 Container Graphics Corporation Rotary cutting die with scrap ejection
US4537773A (en) 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4557264A (en) 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5215893A (en) 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5089396A (en) 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
US5567612A (en) 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
CA1340581C (en) 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
US5804178A (en) 1986-11-20 1998-09-08 Massachusetts Institute Of Technology Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue
NZ229354A (en) 1988-07-01 1990-09-26 Becton Dickinson Co Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
SU1767433A1 (ru) 1989-11-27 1992-10-07 Пермский государственный медицинский институт Способ определени инсулинорезистентности имунного генеза у больных сахарным диабетом I типа
US5837539A (en) 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
US5795965A (en) 1991-04-25 1998-08-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reshaped human to human interleukin-6 receptor
US5449383A (en) 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
CA2114282A1 (en) 1993-01-28 1994-07-29 Lothar Schilder Multi-layered implant
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
AU687386B2 (en) 1993-04-08 1998-02-26 Human Cell Cultures, Inc. Cell culturing method and medium
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
TW257671B (ko) 1993-11-19 1995-09-21 Ciba Geigy
US5834308A (en) 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6703017B1 (en) 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
EP0800829B2 (en) 1994-12-29 2012-07-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Use of a pm-1 antibody or of a mh 166 antibody for enhancing the anti-tumor effect of cisplatin or carboplatin
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5718922A (en) 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
US5681561A (en) 1995-06-07 1997-10-28 Life Medical Sciences, Inc. Compositions and methods for improving autologous fat grafting
CA2277278A1 (en) 1997-01-10 1998-07-16 Life Technologies, Inc. Embryonic stem cell serum replacement
US5965583A (en) 1997-04-24 1999-10-12 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory disease
DE69837491T2 (de) 1997-07-03 2008-01-17 Osiris Therapeutics, Inc. Menschliche mesenchymale stammzellen aus peripherem blut
PT1015576E (pt) 1997-09-16 2005-09-30 Egea Biosciences Llc Metodo para a sintese quimica completa e montagem de genes e de genomas
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
CA2307807C (en) 1997-10-23 2008-09-02 Andrea G. Bodnar Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
US6372779B1 (en) 1997-12-29 2002-04-16 Ortho Pharmaceutical Corporation Anti-inflammatory compounds
US6328960B1 (en) 1998-03-18 2001-12-11 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation
MY132496A (en) 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US6413773B1 (en) 1998-06-01 2002-07-02 The Regents Of The University Of California Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
US6413556B1 (en) 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
EP1144597A2 (en) 1999-01-21 2001-10-17 Vitro Diagnostics, Inc. Immortalized cell lines and methods of making the same
US6815203B1 (en) 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6333029B1 (en) 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
US6306424B1 (en) 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
AU7719300A (en) 1999-09-27 2001-04-30 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6685936B2 (en) 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US20030082155A1 (en) 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
AU778155B2 (en) 1999-12-13 2004-11-18 Scripps Research Institute, The Markers for identification and isolation of pancreatic islet alpha and beta cell progenitors
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US7439064B2 (en) 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
EP1302534A4 (en) 2000-06-26 2004-06-16 Renomedix Inst Inc CELL FRACTION WITH CELLS WHICH ARE ABLE TO DIFFERENTIATE IN NERVOUS CELLS
CN100525768C (zh) 2000-10-23 2009-08-12 史密丝克莱恩比彻姆公司 新化合物
ATE301661T1 (de) 2000-12-08 2005-08-15 Ortho Mcneil Pharm Inc Makroheterocyclische verbindungen als kinase inhibitoren
BR0116468A (pt) 2000-12-08 2004-06-29 Ortho Mcneil Pharm Inc Compostos de pirrolina substituìda por indazolila como inibidores de cinase
US6599323B2 (en) 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
EP1366148A2 (en) 2001-01-24 2003-12-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells
ES2571219T3 (es) 2001-01-25 2024-09-23 The United States Of America Represented By The Sec Dep Of Health And Human Services Formulación de compuestos de ácido borónico
US6656488B2 (en) 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
WO2002086107A2 (en) 2001-04-19 2002-10-31 DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung A method for differentiating stem cells into insulin-producing cells
CN100516204C (zh) 2001-04-24 2009-07-22 味之素株式会社 干细胞及其分离方法
EP1393066A4 (en) 2001-05-15 2006-01-25 Rappaport Family Inst For Res INSULIN-PRODUCING CELLS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS
US6626950B2 (en) 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
WO2003014313A2 (en) 2001-08-06 2003-02-20 Bresagen, Ltd. Alternative compositions and methods for the culture of stem cells
US6617152B2 (en) 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
EP1298201A1 (en) 2001-09-27 2003-04-02 Cardion AG Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state
CA2463914A1 (en) 2001-10-18 2003-04-24 Ixion Biotechnology, Inc. Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells
EP1442115B9 (en) 2001-11-15 2009-12-16 Children's Medical Center Corporation Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof
KR100930139B1 (ko) 2001-12-07 2009-12-07 사이토리 테라퓨틱스, 인크. 처리된 리포애스퍼레이트 세포로 환자를 치료하기 위한시스템 및 방법
AU2002218893A1 (en) 2001-12-21 2003-07-09 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
JP2005512593A (ja) 2001-12-28 2005-05-12 セルアーティス アーベー 多能性のヒト胚盤胞由来幹細胞株の樹立方法
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
US20030180268A1 (en) 2002-02-05 2003-09-25 Anthony Atala Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ
GB0207440D0 (en) * 2002-03-28 2002-05-08 Ppl Therapeutics Scotland Ltd Tolerogenic antigen-presenting cells
US20050208029A1 (en) 2002-04-17 2005-09-22 Akihiro Umezawa Method of forming pancreatic beta cells from mesenchymal cells
US20040161419A1 (en) 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
WO2003095452A1 (en) 2002-05-08 2003-11-20 Janssen Pharmaceutica N.V. Substituted pyrroline kinase inhibitors
US20060003446A1 (en) 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
WO2003102171A1 (en) 2002-05-28 2003-12-11 Becton, Dickinson And Company Expansion and transdifferentiation of human acinar cells
EP1513830A1 (en) 2002-06-05 2005-03-16 Janssen Pharmaceutica N.V. Bisindolyl-maleimid derivatives as kinase inhibitors
GB0212976D0 (en) 2002-06-06 2002-07-17 Tonejet Corp Pty Ltd Ejection method and apparatus
CN1171991C (zh) 2002-07-08 2004-10-20 徐如祥 人神经干细胞的培养方法
US6877147B2 (en) 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
JP2005534345A (ja) 2002-07-29 2005-11-17 エス セル インターナショナル ピーティーイー リミテッド インスリン陽性、グルコース応答性細胞の分化のための多段階方法
WO2004016747A2 (en) 2002-08-14 2004-02-26 University Of Florida Bone marrow cell differentiation
JP2005537803A (ja) 2002-09-06 2005-12-15 アムサイト インコーポレーティッド Ｃｄ５６陽性ヒト成体膵臓内分泌前駆細胞
US9969977B2 (en) 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
WO2004044158A2 (en) 2002-11-08 2004-05-27 The Johns Hopkins University Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
US20060040385A1 (en) 2002-12-05 2006-02-23 Technion Research & Development Foundation Ltd. Cultured human pancreatic islets, and uses thereof
AU2003303071B2 (en) 2002-12-16 2009-04-23 Technion Research & Development Foundation Ltd. Methods of preparing feeder cells-free, xeno-free human embryonic stem cells and stem cell cultures prepared using same
US20050118148A1 (en) 2002-12-20 2005-06-02 Roland Stein Compositions and methods related to mammalian Maf-A
RU2359671C2 (ru) 2003-01-29 2009-06-27 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Способ получения препарата с покрытием
EP1588708A4 (en) 2003-01-29 2006-03-01 Takeda Pharmaceutical METHOD FOR PRODUCING COATED PREPARATION
US20070154981A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
US20070155661A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
WO2004087885A2 (en) 2003-03-27 2004-10-14 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
US20060194315A1 (en) 2003-03-31 2006-08-31 Condie Brian G Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
KR20060021908A (ko) * 2003-06-23 2006-03-08 프라운호퍼-게젤샤프트 추르 푀르데룽 데어 안제반텐 포르슝 에 파우 췌장 호르몬을 생산하는 세포로 줄기세포를 분화시키는방법
WO2005001080A2 (en) 2003-06-27 2005-01-06 Ethicon, Incorporated Postpartum-derived cells for use in treatment of disease of the heart and circulatory system
IL161903A0 (en) 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
US7569385B2 (en) 2003-08-14 2009-08-04 The Regents Of The University Of California Multipotent amniotic fetal stem cells
US7157275B2 (en) 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
CA2536067A1 (en) 2003-08-27 2005-03-10 Stemcells California, Inc. Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations
WO2005058301A1 (en) 2003-12-17 2005-06-30 Allergan, Inc. Methods for treating retinoid responsive disorders using selective inhibitors of cyp26a and cyp26b
US20060030042A1 (en) 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
CN109628371B (zh) 2003-12-23 2021-02-19 维亚希特公司 定形内胚层
US7541185B2 (en) 2003-12-23 2009-06-02 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
US20050266554A1 (en) 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
CN103898047B (zh) 2003-12-23 2020-03-03 维亚希特公司 定形内胚层
US7625753B2 (en) 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
WO2005065354A2 (en) 2003-12-31 2005-07-21 The Burnham Institute Defined media for pluripotent stem cell culture
TWI334443B (en) 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
US20080241107A1 (en) 2004-01-23 2008-10-02 Copland Iii John A Methods and Compositions For Preparing Pancreatic Insulin Secreting Cells
GB2441530B (en) 2004-02-12 2009-09-23 Univ Newcastle Stem Cells
JP4901471B2 (ja) 2004-02-19 2012-03-21 国立大学法人京都大学 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
CA2581424A1 (en) * 2004-03-09 2005-09-22 Gang Xu Methods for generating insulin-producing cells
JP2007528226A (ja) 2004-03-10 2007-10-11 リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ カリフォルニア 胚幹細胞の増殖用組成物および方法
KR101178786B1 (ko) 2004-03-23 2012-09-07 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 다능성 줄기세포의 증식 방법
WO2005097980A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Geron Corporation New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells
AU2005230832B2 (en) 2004-04-01 2010-11-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage
CN103103158B (zh) 2004-04-27 2016-08-03 韦尔赛特公司 细胞培养基
AU2005272078B2 (en) 2004-07-09 2011-04-14 Viacyte, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
US8187878B2 (en) 2004-08-13 2012-05-29 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods for increasing definitive endoderm differentiation of pluripotent human embryonic stem cells with PI-3 kinase inhibitors
WO2006026473A2 (en) 2004-08-25 2006-03-09 University Of Georgia Research Foundation, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS UTILIZING MYC AND GSK3ß TO MANIPULATE THE PLURIPOTENCY OF EMBRYONIC STEM CELLS
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
AU2005282414C1 (en) 2004-09-08 2011-04-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Culturing human embryonic stem cells
ATE549395T1 (de) 2004-09-08 2012-03-15 Wisconsin Alumni Res Found Medium und kultur von embryonalen stammzellen
JP2008538276A (ja) 2005-01-28 2008-10-23 ノヴァセラ・リミテッド 胚幹細胞培養のための方法
WO2006083782A2 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Es Cell International Pte Ltd. Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
WO2006088867A2 (en) 2005-02-15 2006-08-24 Medistem Laboratories, Incorporated Method for expansion of stem cells
AU2006218359A1 (en) 2005-03-04 2006-09-08 John O'neil Adult pancreatic derived stromal cells
US20060212476A1 (en) 2005-03-18 2006-09-21 Bogle Phillip L Method and apparatus for tracking candidate referrers
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
WO2006113470A2 (en) 2005-04-15 2006-10-26 Geron Corporation Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities
CN100425694C (zh) 2005-04-15 2008-10-15 北京大学 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法
WO2006114098A2 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Aarhus Universitet Biocompatible material for surgical implants and cell guiding tissue culture surfaces
JP5092124B2 (ja) 2005-05-24 2012-12-05 国立大学法人 熊本大学 Ｅｓ細胞の分化誘導方法
AU2006202209B2 (en) 2005-05-27 2011-04-14 Lifescan, Inc. Amniotic fluid derived cells
EP1899344A1 (en) 2005-06-10 2008-03-19 Irm, Llc Compounds that maintain pluripotency of embryonic stem cells
EP1893746A2 (en) * 2005-06-13 2008-03-05 Novo Nordisk A/S Modulation of cells
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
US20080199959A1 (en) 2005-06-21 2008-08-21 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method For Cell Culture
JP5560391B2 (ja) 2005-06-22 2014-07-23 アステリアス バイオセラピューティクス インコーポレイテッド ヒト胚性幹細胞の懸濁培養法
US8778919B2 (en) 2005-06-30 2014-07-15 Janssen Pharmaceutica Nv Cyclic anilino—pyridinotriazines
US20080194021A1 (en) 2005-07-29 2008-08-14 Mays Robert W Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells
GB2443370A (en) 2005-07-29 2008-04-30 Australian Stem Cell Ct Ltd Compositions and methods for growth of pluripotent cells
WO2007025234A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes
EP1962719A4 (en) 2005-08-29 2011-05-04 Technion Res And Dev Of Foundation Ltd MEDIA FOR BREEDING STEM CELLS
EP1937801A1 (en) 2005-09-02 2008-07-02 Agency for Science, Technology and Research Method of deriving mesenchymal stem cells
GB2444686B (en) 2005-09-12 2010-08-25 Es Cell Int Pte Ltd Differentiation of pluripotent stem cells using p38 MAPK inhibitors or prostaglandins
CA2663749A1 (en) * 2005-09-21 2007-03-29 Dask Technologies, Llc Methods and compositions for organ and tissue functionality
US7807459B2 (en) * 2005-09-27 2010-10-05 Reneuron, Inc. EphA4-positive human adult pancreatic endocrine progenitor cells
CN101310012B (zh) 2005-10-14 2012-05-09 明尼苏达大学董事会 非胚胎干细胞分化成具有胰腺表型的细胞
US7732202B2 (en) 2005-10-21 2010-06-08 International Stem Cell Corporation Oxygen tension for the parthenogenic activation of human oocytes for the production of human embryonic stem cells
WO2007051038A2 (en) 2005-10-27 2007-05-03 Cythera, Inc. Pdx1-expressing dorsal and ventral foregut endoderm
UA96139C2 (uk) * 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1)
US8048999B2 (en) 2005-12-13 2011-11-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
SG170021A1 (en) 2006-02-23 2011-04-29 Novocell Inc Compositions and methods useful for culturing differentiable cells
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
AU2007244675A1 (en) 2006-04-28 2007-11-08 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
SE534150C2 (sv) 2006-05-02 2011-05-10 Wisconsin Alumni Res Found Förfarande för differentiering av stamceller till celler av den endodermala och pankreatiska utvecklingslinjen
US8685730B2 (en) 2006-05-02 2014-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage
US9598673B2 (en) 2006-05-19 2017-03-21 Creative Medical Health Treatment of disc degenerative disease
US7964402B2 (en) 2006-05-25 2011-06-21 Sanford-Burnham Medical Research Institute Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
CN101541953A (zh) 2006-06-02 2009-09-23 佐治亚大学研究基金会 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织
US20090298169A1 (en) 2006-06-02 2009-12-03 The University Of Georgia Research Foundation Pancreatic and Liver Endoderm Cells and Tissue by Differentiation of Definitive Endoderm Cells Obtained from Human Embryonic Stems
US8415153B2 (en) 2006-06-19 2013-04-09 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
CN100494359C (zh) 2006-06-23 2009-06-03 中日友好医院 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
CA2893679C (en) 2006-06-26 2018-10-30 Lifescan, Inc. Conditioned medium for pluripotent stem cell culture
WO2008004990A2 (en) 2006-07-06 2008-01-10 Es Cell International Pte Ltd Method for stem cell culture and cells derived therefrom
AU2007277364B2 (en) 2006-07-26 2010-08-12 Viacyte, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
DK3441459T3 (da) 2006-08-02 2021-06-07 Technion Res & Dev Foundation Fremgangsmåder til ekspansion af embryonale stamceller i en suspensionskultur
KR101331510B1 (ko) 2006-08-30 2013-11-20 재단법인서울대학교산학협력재단 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
US20080091234A1 (en) 2006-09-26 2008-04-17 Kladakis Stephanie M Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
BRPI0718310A2 (pt) 2006-10-17 2013-11-19 Stiefel Laboratories Metabólitos de talarozol
WO2008048647A1 (en) 2006-10-17 2008-04-24 Cythera, Inc. Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
CA2666789C (en) 2006-10-18 2016-11-22 Yong Zhao Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
EP2088190A4 (en) 2006-11-09 2011-01-05 Japan Government METHOD FOR THE CULTURE AND PASSING OF AN EMBRYONAL PRIMATIVE STEM CELL AND METHOD FOR INDUCING THE DIFFERENTIATION OF THE EMBRYONAL STEM CELL
WO2008086005A1 (en) 2007-01-09 2008-07-17 University Of South Florida Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof
EP1947193A1 (en) * 2007-01-17 2008-07-23 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Screening method for anti-diabetic compounds
CA2676044C (en) 2007-01-30 2019-10-22 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Early mesoderm cells, a stable population of mesendoderm cells that has utility for generation of endoderm and mesoderm lineages and multipotent migratory cells (mmc)
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
US20090053182A1 (en) 2007-05-25 2009-02-26 Medistem Laboratories, Inc. Endometrial stem cells and methods of making and using same
WO2009006422A1 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Stem Cell Products, Inc. Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture
EP2584034B8 (en) 2007-07-31 2017-12-06 Lifescan, Inc. Pluripotent stem cell differentiation by using human feeder cells
DK2185693T3 (da) 2007-07-31 2019-09-23 Lifescan Inc Differentiering af humane embryoniske stamceller
MX2010002179A (es) 2007-08-24 2010-04-27 Stichting Het Nl Kanker I Composicion para el tratamiento de enfermedades neoplasicas.
WO2009061442A1 (en) 2007-11-06 2009-05-14 Children's Medical Center Corporation Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells form non-embryonic human cells
CA2954431C (en) 2007-11-27 2021-08-24 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to pancreatic cells
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
WO2009096049A1 (ja) 2008-02-01 2009-08-06 Kyoto University 人工多能性幹細胞由来分化細胞
US20100330677A1 (en) 2008-02-11 2010-12-30 Cambridge Enterprise Limited Improved Reprogramming of Mammalian Cells, and Cells Obtained
JP5733986B2 (ja) 2008-02-21 2015-06-10 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 細胞の付着、培養、及び剥離のための方法、表面改質されたプレート、並びに組成物
WO2009110215A1 (ja) 2008-03-03 2009-09-11 独立行政法人 科学技術振興機構 繊毛細胞の分化誘導方法
JP2011514169A (ja) 2008-03-17 2011-05-06 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 幹細胞培養のためのマイクロキャリア
RU2359030C1 (ru) 2008-03-19 2009-06-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты)
AU2008355123B2 (en) 2008-04-21 2014-12-04 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
US8338170B2 (en) 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
US8728812B2 (en) 2008-04-22 2014-05-20 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of PDX1+ pancreatic cells
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
US20090298178A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
EP2297319B1 (en) 2008-06-03 2015-10-07 Viacyte, Inc. Growth factors for production of definitive endoderm
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
EP2942392B1 (en) 2008-06-30 2018-10-03 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
AU2009267167A1 (en) * 2008-06-30 2010-01-07 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
WO2010022395A2 (en) 2008-08-22 2010-02-25 President And Fellows Of Harvard College Methods of reprogramming cells
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
JP5390624B2 (ja) 2008-11-04 2014-01-15 バイアサイト インク 幹細胞集合体懸濁液組成物、その分化方法
JP2012508584A (ja) 2008-11-14 2012-04-12 ヴィアサイト，インコーポレイテッド ヒト多能性幹細胞由来膵臓細胞のカプセル化
KR101774546B1 (ko) 2008-11-20 2017-09-04 얀센 바이오테크 인코포레이티드 마이크로-캐리어 상의 만능 줄기 세포 배양
ES2633935T3 (es) 2008-12-05 2017-09-26 Inserm - Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale Método y medio para la diferenciación neural de células pluripotentes
US9109245B2 (en) * 2009-04-22 2015-08-18 Viacyte, Inc. Cell compositions derived from dedifferentiated reprogrammed cells
CN103952372B (zh) 2009-07-20 2016-10-05 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
CN102482643B (zh) 2009-07-20 2016-06-29 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
US8785184B2 (en) * 2009-07-20 2014-07-22 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
PL2494035T3 (pl) 2009-10-29 2018-07-31 Janssen Biotech, Inc. Pluripotencjalne komórki macierzyste
FI20096288A0 (fi) 2009-12-04 2009-12-04 Kristiina Rajala Formulations and methods for culturing stem cells
SG10201408552YA (en) * 2009-12-23 2015-02-27 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
CN102712902B (zh) 2009-12-23 2019-01-08 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
CA2785966C (en) * 2009-12-29 2020-10-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for manufacturing pancreatic-hormone-producing cells
EP2532741B1 (en) 2010-02-03 2018-04-04 Tetsuya Ishikawa Induced hepatic stem cell and process for production thereof, and applications of the cell
SG10201501513TA (en) 2010-03-02 2015-04-29 Univ Singapore Culture additives to boost stem cell proliferation and differentiation response
CN102959076B (zh) 2010-03-31 2015-09-16 斯克里普斯研究所 重编程细胞
EP2563908B1 (en) 2010-04-25 2019-01-09 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Generation of anterior foregut endoderm from pluripotent cells
RU2587634C2 (ru) 2010-05-12 2016-06-20 Янссен Байотек, Инк. Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека
WO2011160066A1 (en) * 2010-06-17 2011-12-22 Regents Of The University Of Minnesota Production of insulin producing cells
US9279103B2 (en) 2010-08-05 2016-03-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Simplified basic media for human pluripotent cell culture
US9040062B2 (en) * 2010-08-06 2015-05-26 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Preparation for treatment of spinal cord injury
CN103154237B (zh) 2010-08-31 2016-03-16 詹森生物科技公司 多能干细胞的分化
PL2853589T3 (pl) 2010-08-31 2018-05-30 Janssen Biotech, Inc Różnicowanie ludzkich zarodkowych komórek macierzystych
MY177150A (en) 2011-02-28 2020-09-08 Stempeutics Res Malaysia Sdn Bhd Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof
US20130274184A1 (en) 2011-10-11 2013-10-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Er stress relievers in beta cell protection
WO2013055397A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Children's Medical Center Corporation Inhibition and enhancement of reprogramming by chromatin modifying enzymes
FI2794857T3 (fi) 2011-12-22 2026-03-25 Janssen Biotech Inc Ihmisen alkion kantasolujen erilaistaminen yksittäisiksi hormonaalisiksi insuliinipositiivisiksi soluiksi
US10519422B2 (en) 2012-02-29 2019-12-31 Riken Method of producing human retinal pigment epithelial cells
EP3450544A1 (en) 2012-06-08 2019-03-06 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endodrine cells
CN104903440B (zh) 2012-09-03 2018-04-06 诺和诺德股份有限公司 使用小分子从多能干细胞产生胰内胚层
DK2938723T3 (da) 2012-12-31 2023-02-20 Janssen Biotech Inc Differentiering af humane embryonale stamceller til pancreatiske endokrine celler under anvendelse af hb9-regulatorer
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
CA2906643A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Jackson Laboratory Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof
CN105233291A (zh) * 2014-07-09 2016-01-13 博笛生物科技有限公司 用于治疗癌症的联合治疗组合物和联合治疗方法
EP3350313B1 (en) * 2015-09-15 2025-11-26 Agency For Science, Technology And Research (A*star) Derivation of liver organoids from human pluripotent stem cells
JP7389980B2 (ja) * 2018-12-06 2023-12-01 国立大学法人 琉球大学 ヒト膵臓組織特異的幹／前駆細胞の人工作製方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006500003A (ja) * 2001-12-07 2006-01-05 ジェロン・コーポレーション ヒト胚幹細胞由来の膵島細胞
JP2009528066A (ja) * 2006-03-02 2009-08-06 サイセラ，インコーポレイテッド 内分泌前駆細胞、膵臓ホルモン発現細胞及びそれらの製造方法
KR20100042649A (ko) * 2007-07-18 2010-04-26 라이프스캔, 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
JP2012507289A (ja) * 2008-10-31 2012-03-29 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の膵内分泌系への分化
JP2012507292A (ja) * 2008-10-31 2012-03-29 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の膵内分泌系への分化

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PH12018501295A1 (en) 2020-01-27
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