KR20200074209A

KR20200074209A - 생물 활성이 저하된 항체 배리언트 및 아이소폼

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Publication number: KR20200074209A
Application number: KR1020207015464A
Authority: KR
Inventors: 겐사쿠 호소구치; 마키 구와야마; 지후미 세이다; 요스케 와타나베; 노부유키 다나카; 사토시 사이토; 마사카즈 후쿠다
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2020-06-24
Also published as: CN119161488A; TW201930352A; US20200283544A1; MX2020003472A; JP7777114B2; JP2024037761A; JP2026020200A; PE20210553A1; AU2018361430B2; TW202600611A; RU2020117440A3; UA130422C2; US20250382390A1; EP3705496A1; AR113816A1; EP3705496A4; CR20240273A; BR112020008393A2; IL274265B2; CN111479829A

Abstract

에미시주맙보다도 FVIII양 활성이 낮은 항체 배리언트 및 아이소폼으로서, 가변 영역에 있어서의 특정의 아미노산 잔기가 절단되고 결손되어 있는 항체 배리언트(Q-CDR-Clipped Variant)와, 온화한 환원 조건하에서 중쇄간의 다이설파이드 결합이 환원되기 어려운 항체 아이소폼(Protected disulfide isoform)을 제공한다.

Description

생물 활성이 저하된 항체 배리언트 및 아이소폼

본 발명은, 생물 활성이 저하된 항체 배리언트 및 아이소폼에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명은, 혈액 응고 제VIII 인자(FVIII)양(樣) 활성이 저하된, 에미시주맙의 항체 배리언트 및 아이소폼에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 그와 같은 항체 배리언트 및 아이소폼의 함유율이 낮은 의약 조성물에도 관한 것이다. 본 발명은 더욱이, 당해 항체 배리언트 및 아이소폼의 검출 방법 및 분석 방법에 관한 것이다.

항체는 혈장 중에서의 안정성이 높고, 부작용도 적으므로 의약품으로서 주목받고 있다. 그 중에서도 IgG형의 항체 의약은 다수 출시되어 있고, 현재도 수많은 항체 의약이 개발되고 있다(비특허문헌 1, 2, 3).

혈우병 A는, 선천성의 FVIII의 기능 저하 또는 결손에 의한 출혈 이상증이다. 혈우병 A 환자의 출혈에 대해서는, FVIII 제제가 통상 투여된다(on-demand 투여). 또한, 근년에는, 출혈 이벤트를 막기 위해서, 예방적으로, FVIII 제제가 투여된다(비특허문헌 1, 2)(예방 투여). FVIII 제제의 혈중 반감기는, 약 12∼16시간 정도이다. 그러므로, 계속적인 예방을 위해서는, 주에 3회, FVIII 제제가 환자에게 투여된다(비특허문헌 3, 4). 또한, on-demand 투여에 있어서는, 재출혈을 막기 위해, FVIII 제제를, 필요에 따라서, 일정 간격으로 추가 투여한다. 또한, FVIII 제제의 투여는 정맥 내에 실시된다. 따라서, FVIII 제제와 비교하여 투여의 부담이 적은 약제가, 강하게 요구되고 있었다.

때때로, FVIII에 대한 항체(인히비터)가, 혈우병 환자에게 발생한다. 인히비터는, FVIII 제제의 효과를 지운다. 인히비터가 발생한 환자(인히비터 환자)의 출혈에 대해서는, 바이패스 제제가 투여된다. 그들의 작용 기서는, FVIII의 기능, 즉 활성화 혈액 응고 제IX 인자(FIXa)에 의한 혈액 응고 제X 인자(FX)의 활성화를 촉매하는 기능에 비의존이다. 그 때문에, 바이패스 제제가, 출혈을 충분히 멈출 수 없는 케이스가 있다. 따라서, 인히비터의 존재에 좌우되지 않고, 또한 FVIII의 기능을 대체하는 약제가, 강하게 요구되고 있었다.

이들 과제를 해결하는 수단으로서, FVIII의 기능을 대체하는 이중 특이성 항체 및 그 사용이 보고되어 있다(특허문헌 1, 2, 3 및 4). FIXa와 FX에 대한 이중 특이성 항체는, 양 인자를 근방에 위치시키는 것에 의해, FVIII양의 활성을 발휘하여, FVIII의 기능을 대체하는 것이 가능하다(비특허문헌 5). 해당 항체의 FVIII양 활성은 FIXa와 FX에 대한 친화성을 최적화하는 것에 의해 향상시킬 수 있음이 보고되어 있다(비특허문헌 6). 해당 항체의 하나로서, 높은 FVIII양 활성을 갖는 에미시주맙(Emicizumab: ACE910)은, 원숭이 혈우병 모델에서 지혈 효과를 발휘함이 보고되어 있고(비특허문헌 7, 8), 혈우병 A 환자를 대상으로 한 임상 시험이 행해지고 있다.

WO 2005/035754 WO 2005/035756 WO 2006/109592 WO 2012/067176

Blood 58, 1-13 (1981) Nature 312, 330-337(1984) Nature 312, 337-342(1984) Biochim. Biophys. Acta 871, 268-278(1986) Nat Med. 2012 Oct;18(10):1570-4. PLoS One. 2013;8(2):e57479. J Thromb Haemost. 2014 Feb;12(2):206-213. Blood. 2014 Nov 13;124(20):3165-71. J. Appl. Cryst. 13, 577-584 (1980) IUCrJ. 2, 9-18 (2015)

본 발명은 상기와 같은 상황에 비추어 이루어진 것으로, FVIII양 활성이 낮은 항체 배리언트 또는 아이소폼을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해서 예의 연구한 결과, 본 발명자들은, 에미시주맙을 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물에 포함되는 항체 배리언트 및 아이소폼을 동정하는 것에 성공했다. 또한, 이들 항체 배리언트 및 아이소폼의 FVIII양 활성이 에미시주맙과 비교하여 극히 낮음을 발견했다.

본 발명은 이와 같은 지견에 기초하는 것으로, 구체적으로는 하기 〔1〕∼〔21〕을 제공하는 것이다.

〔1〕 아미노산 서열 SISPSGQSTYYRREVKG(서열 번호 2)를 포함하는 가변 영역을 갖는 항체의 배리언트로서,

(a) 상기 서열의 N말단측으로부터 12번째의 위치(에미시주맙 Q쇄의 N말단측으로부터 61번째의 위치: Kabat 넘버링 60위)에 있어서의 아미노산 잔기 R; 또는

(b) 상기 서열의 N말단측으로부터 10∼12번째의 위치(에미시주맙 Q쇄의 N말단측으로부터 59∼61번째의 위치: Kabat 넘버링 58∼60위)에 있어서의 아미노산 잔기 YYR

이 결손되고 당해 가변 영역이 당해 결손 부위에서 절단되어 있는, 항체 배리언트.

〔2〕 상기 서열이 CDR 서열인, 〔1〕의 항체 배리언트.

〔3〕 상기 서열이 CDR2 서열인, 〔1〕의 항체 배리언트.

〔4〕 상기 서열이 중쇄에 포함되는 서열인, 〔1〕의 항체 배리언트.

〔5〕 이중 특이성(Bi-specific) 항체의 배리언트인, 〔1〕의 항체 배리언트.

〔6〕 에미시주맙의 배리언트인, 〔1〕의 항체 배리언트.

〔7〕 아미노산 서열 SISPSGQSTYYRREVKG(서열 번호 2)를 포함하는 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 시료를, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 순상 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 전하에 기초하는 분리, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC), 겔 침투 크로마토그래피(GPC), 또는 그들의 조합에 의해 분리하는 공정을 포함하는, 〔1〕∼〔6〕 중 어느 하나에 기재된 항체 배리언트의 검출 방법.

〔8〕〔1〕∼〔6〕 중 어느 하나의 항체 배리언트를 표준품으로서 사용하는, 〔7〕의 검출 방법.

〔8-2〕 정량 분석, 정성 분석, 및 구조 해석으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 복수의 분석을 행하는 공정을 포함하는, 〔8〕의 검출 방법.

〔9〕〔1〕∼〔6〕 중 어느 하나의 항체 배리언트를 포함하는 의약 조성물로서, 해당 의약 조성물 중의 전체 항체 분자에 있어서의 해당 항체 배리언트의 비율이 5% 이하인, 의약 조성물.

〔10〕 항체가 에미시주맙인, 〔9〕의 의약 조성물.

〔11〕 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)에 의한 정제를 포함하는 정제 공정에 의해 얻어지는, 〔9〕의 의약 조성물.

〔12〕 항체 산생 세포를 pH 7.1 이상 또한/또는 배양 온도 36℃ 이하에서 배양하는 공정을 포함하는, 〔1〕∼〔6〕 중 어느 하나의 항체 배리언트의 생성을 억제하는 방법.

〔12-2〕 항체 산생 세포의 배양 조건을, 배양의 도중에서, pH 7.1 이상 또한/또는 배양 온도 36℃ 이하에서의 배양으로 변경하는, 〔12〕의 방법.

〔13〕 제 1 중쇄(Q쇄: 서열 번호 10) 및 제 2 중쇄(J쇄: 서열 번호 11)를 포함하는 이중 특이성 항체의 아이소폼으로서,

(1a) 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 144위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 150번째의 위치)의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 200위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 202번째의 위치)의 시스테인 사이; 및

(1b) 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 200위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 206번째의 위치)의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 144위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 146번째의 위치)의 시스테인 사이

에 있어서 다이설파이드 결합을 형성하고 있거나, 혹은

(2a) 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 226위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 229번째의 위치)의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 229위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 228번째의 위치)의 시스테인 사이; 및

(2b) 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 229위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 232번째의 위치)의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 226위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 225번째의 위치)의 시스테인 사이

에 있어서 다이설파이드 결합을 형성하고 있는, 이중 특이성 항체 아이소폼.

〔14〕 상기 (1a) 및 (1b)에 있어서 다이설파이드 결합을 형성하고 있는, 〔13〕의 이중 특이성 항체 아이소폼.

〔15〕 제 1 중쇄(Q쇄: 서열 번호 10) 및 제 2 중쇄(J쇄: 서열 번호 11)를 포함하는 이중 특이성 항체의 아이소폼으로서, 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분리했을 경우에 상기 이중 특이성 항체보다도 알칼리성측의 영역에서 용출되는 것을 특징으로 하는, 이중 특이성 항체 아이소폼.

〔16〕 에미시주맙의 아이소폼인, 〔13〕∼〔15〕 중 어느 하나의 이중 특이성 항체 아이소폼.

〔17〕 이중 특이성 항체를 포함하는 시료를, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 순상 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 전하에 기초하는 분리, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC), 겔 침투 크로마토그래피(GPC), 또는 그들의 조합에 의해 분리하는 공정을 포함하는, 〔13〕∼〔16〕 중 어느 한 항에 기재된 항체 아이소폼의 검출 방법.

〔18〕〔13〕∼〔16〕 중 어느 하나의 이중 특이성 항체 아이소폼을 표준품으로서 사용하는, 〔17〕의 검출 방법.

〔18-2〕 정량 분석, 정성 분석, 및 구조 해석으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 복수의 분석을 행하는 공정을 포함하는, 〔18〕의 검출 방법.

〔19〕〔13〕∼〔16〕 중 어느 하나의 이중 특이성 항체 아이소폼을 포함하는 의약 조성물로서, 해당 의약 조성물 중의 전체 항체 분자에 있어서의 해당 항체 아이소폼의 비율이 2% 이하인, 의약 조성물.

〔20〕 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하는 공정을 포함하는, 〔13〕∼〔16〕 중 어느 하나의 이중 특이성 항체 아이소폼의 함유율을 저감하는 방법.

〔21〕 항체의 생물 활성이 현저하게 저하되어 있는, 〔1〕, 〔13〕 또는 〔15〕의 항체 아이소폼 또는 배리언트.

〔22〕 각각 상이한 에피토프를 인식하는 2개의 가변 영역을 갖는 항체 또는 그의 유도체의 아이소폼으로서, 당해 항체 또는 그의 유도체에 대해, Rg의 평균치가 3% 이상, 바람직하게는 4% 이상, 보다 바람직하게는 5% 이상, 보다 바람직하게는 6% 이상 작고, 및/또는 Dmax의 평균치가 5% 이상, 바람직하게는 6% 이상, 보다 바람직하게는 7% 이상, 보다 바람직하게는 7.5% 이상 작은 아이소폼.

〔23〕 각각 상이한 에피토프를 인식하는 2개의 가변 영역을 갖는 항체 또는 그의 유도체의 아이소폼으로서, 당해 항체 또는 그의 유도체에 대해, Rg의 평균치가 0.15nm 이상, 바람직하게는 0.2nm 이상, 보다 바람직하게는 0.25nm 이상, 보다 바람직하게는 0.3nm 이상 작고, 및/또는 Dmax의 평균치가 0.5nm 이상, 바람직하게는 1.0nm 이상, 보다 바람직하게는 1.2nm 이상, 보다 바람직하게는 1.4nm 이상 작은 아이소폼.

〔24〕 당해 항체 또는 그의 유도체와 상이한 다이설파이드 결합을 갖는 〔22〕 또는 〔23〕의 아이소폼.

〔25〕 당해 항체 또는 그의 유도체가 에미시주맙(제 1 중쇄(Q쇄: 서열 번호 10), 제 2 중쇄(J쇄: 서열 번호 11), 및 제 1 중쇄, 제 2 중쇄의 각각과 쌍을 형성하는 공통 경쇄(서열 번호 12)를 포함하는 이중 특이성 항체)인 〔22〕∼〔24〕 중 어느 하나의 아이소폼.

〔26〕 에미시주맙의 아이소폼으로서, Rg의 평균치가 4.9nm 이하, 바람직하게는 4.8nm 이하이고, 및/또는 Dmax의 평균치가 17.0nm 이하, 바람직하게는 16.5nm 이하인 아이소폼.

〔27〕 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 144위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 150번째의 위치)의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 200위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 202번째의 위치)의 시스테인 사이 및 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 200위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 206번째의 위치)의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 144위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 146번째의 위치)의 시스테인 사이에 다이설파이드 결합을 갖는 〔25〕 또는 〔26〕의 아이소폼.

〔28〕 에미시주맙 및 〔22〕∼〔27〕 중 어느 하나의 아이소폼을 포함하는 의약 조성물로서, 해당 의약 조성물 중의 전체 항체 분자에 있어서의 해당 아이소폼의 비율이 2% 이하인, 의약 조성물.

〔29〕 제 1 중쇄(Q쇄: 서열 번호 10), 제 2 중쇄(J쇄: 서열 번호 11), 및 제 1 중쇄, 제 2 중쇄의 각각과 쌍을 형성하는 공통 경쇄(서열 번호 12)를 포함하는 이중 특이성 항체(Q499-z121/J327-z119/L404-k; 에미시주맙)의 아이소폼으로서, Q쇄에 있어서의 EU 넘버링 146위로부터 174위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 152번째로부터 180번째)의 아미노산 잔기 및 J쇄에 있어서의 EU 넘버링 146위로부터 174위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 148번째로부터 176번째)의 아미노산 잔기에 있어서 에미시주맙과 분자 구조상의 차이를 갖는 아이소폼.

〔30〕 당해 분자 구조상의 차이가, HDX-MS 측정에 있어서의 중수소 교환율(%D)의 차로서 측정되는 〔29〕에 기재된 아이소폼.

〔31〕 에미시주맙 및 〔29〕 또는 〔30〕의 아이소폼을 포함하는 의약 조성물로서, 해당 의약 조성물 중의 전체 항체 분자에 있어서의 해당 아이소폼의 비율이 2% 이하인, 의약 조성물.

또한 본 발명은, 하기 〔A1〕∼〔A9〕도 제공한다.

〔A1〕 항체 및/또는 항체 배리언트 혹은 아이소폼을 포함하는 시료를, 환원 반응, 가수분해 반응(소화 반응), 단백질 변성 반응, 또는 그들의 조합에 제공하는 공정을 포함하는, 〔7〕 또는 〔17〕의 검출 방법.

〔A2〕 상기 환원 반응이, 온화한 환원 조건하(예를 들어, Tris 완충액(pH 7.0) 중의 DTT에 의한 37℃에서의 환원)에서 실시되는, 〔A1〕의 검출 방법.

〔A3〕 상기 가수분해 반응이, 부위 특이적 절단 효소(예를 들어, IdeS 프로테아제, Lys-C, 파파인 등의 서열 특이적 프로테아제)를 이용하여 실시되는, 〔A1〕의 검출 방법.

〔A4〕 항체, 항체 배리언트 혹은 아이소폼, 그들의 반응 산물, 또는 그들의 조합을 포함하는 시료를, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 순상 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 전하에 기초하는 분리, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC), 겔 침투 크로마토그래피(GPC), 또는 그들의 조합에 의해 분리하는 공정을 포함하는, 〔7〕, 〔17〕 또는 〔A1〕∼〔A3〕 중 어느 하나의 검출 방법.

〔A5〕 SE-HPLC 분석, 동적 광산란법(DLS), SAXS 측정, 전자현미경 측정, 3D modeling, SPR 평가, HDX MS 분석, 또는 그들의 조합에 의해 분석하는 공정을 포함하는, 〔8〕, 〔18〕 또는 〔A1〕∼〔A4〕 중 어느 하나의 검출 방법.

〔A6〕〔7〕, 〔8〕, 〔17〕, 〔18〕 또는 〔A1〕∼〔A5〕, 또는 그들 방법을 조합하는 공정을 포함하는, 에미시주맙을 함유하는 의약 조성물의 품질 관리 방법.

〔A7〕〔A6〕의 방법의 공정을 포함하는, 에미시주맙을 함유하는 의약 조성물의 제조 방법.

〔A8〕 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)의 Bind & Elute mode의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 에미시주맙을 포함하는 조성물의 정제 방법.

〔A9〕〔A8〕의 정제 방법의 공정을 포함하는, 에미시주맙을 함유하는 의약 조성물의 제조 방법.

본 발명자들은, 에미시주맙을 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물에 포함되는 항체 배리언트 및 아이소폼을 동정하는 것에 성공했다. 또한, 본 발명자들은, 이들 항체 배리언트 및 아이소폼의 FVIII양 활성이 에미시주맙과 비교하여 극히 낮음도 발견했다. 따라서, 에미시주맙을 포함하지만, 이들 항체 배리언트 및 아이소폼의 함유율이 낮은 의약 조성물은, 혈우병의 치료 수단으로서 유용하다.

[도 1a] 도 1A는, CE-HPLC에 의한 에미시주맙 원약의 분리 결과를 나타내는 도면이다. 굵은 테두리로 나타낸 피크는 Q-CDR-Clipped Variant를 나타낸다.
[도 1b] 도 1B는, Q-CDR-Clipped Variant의 분자 구조를 나타내는 모식도이다. 도 중의 숫자 및 그 아래의 알파벳은, 각각, 에미시주맙의 Q쇄의 N말단측으로부터 센 아미노산 잔기의 위치 및 당해 위치에 있어서의 아미노산 잔기(1문자 표기)를 나타낸다.
[도 2a] 도 2A는, CE-HPLC에 의한 에미시주맙 원약의 분리 결과를 나타내는 도면이다. 굵은 테두리로 나타낸 피크는 Protected disulfide isoform을 나타낸다.
[도 2b] 도 2B는, Protected disulfide isoform의 분자 구조를 나타내는 모식도이다. 도 중의 숫자 및 그 왼쪽의 알파벳 C는, 각각, 에미시주맙의 Q쇄의 N말단측으로부터 센 아미노산 잔기의 위치 및 당해 위치에 있어서의 시스테인 잔기를 나타낸다. 도 2C는, 에미시주맙 원약에 있어서의 Protected disulfide isoform의 함유율을 나타내는 도면이다. 여러 가지 조건(항체 산생 세포의 배양 조건)에 있어서의 당해 함유율을, 도 2A가 나타내는 CE-HPLC 분리 결과에 있어서의 Protected disulfide isoform의 피크의 면적%(area%)의 평균치(Mean) 및 표준 편차(Std Dev)로 나타내고 있다.
[도 3] 도 3은, IdeS 소화 및 환원 처리 후의 에미시주맙 및 Protected disulfide isoform을 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 분리한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3A∼D는, IdeS 소화 후에, 변성제를 포함하는 조건(A 및 C: 완전 환원 조건) 또는 포함하지 않는 조건(B 및 D: 부분 환원 조건)하에서 에미시주맙(A 및 B) 또는 Protected disulfide isoform(C 및 D)을 환원시킨 샘플의 분리 결과를 나타내고 있다. 완전 환원 조건(도 3A 및 C)에 있어서는, 에미시주맙과 Protected disulfide isoform의 어느 것에 대해서도, Q쇄 Fd(Q-Fd), J쇄 Fd(J-Fd), Q쇄 Fc(Q-Fc), J쇄 Fc(J-Fc), 및 L쇄(LC)를 나타내는 피크가 검출되어, 에미시주맙과 Protected disulfide isoform 사이에 환원 패턴의 차이는 검출되지 않았다. 한편, 부분 환원 조건(도 3B 및 D)에 있어서는, 완전 환원 조건의 경우와 마찬가지의 Q쇄 Fd, J쇄 Fd, Q쇄 Fc, J쇄 Fc, 및 L쇄를 나타내는 피크에 대하여, Protected Disulfide Isoform에 대해서만, 서로 다이설파이드 결합하고 있는 Q쇄 Fd와 J쇄 Fd의 헤테로2량체(J-Fd-Q-Fd)를 나타내는 특이한 피크가 검출되었다.
[도 4] 도 4는, IdeS 소화(및 변성 처리) 후의 에미시주맙 및 Protected disulfide isoform을 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 분리한 결과를 나타내는 도면이다. 도 4A 및 B는, IdeS 소화 후의 Protected disulfide isoform(A) 또는 에미시주맙(B)의 분리 결과를 나타내고 있다. 도 4C 및 D는, IdeS 소화 후에 변성 처리한 Protected disulfide isoform(C) 또는 에미시주맙(D)의 분리 결과를 나타내고 있다. 변성 처리의 유무에 관계 없이, Protected Disulfide Isoform의 F(ab')2 부분(LC-J Fab-Q Fab-LC)은 에미시주맙의 주성분보다도 보지(保持) 시간이 길게 분리되었다.
[도 5] 도 5는, 여러 가지 배양 조건에서 에미시주맙 산생 CHO 세포를 배양했을 경우의 배양 상청에 포함되는 Q-CDR-Clipped Variant 함유율을 나타내는 도면이다. 배양 상청을 Protein A를 이용하여 정제한 시료를 Q-CDR-Clipped Variant 함유율의 측정에 이용했다. 세로축은 Q-CDR-Clipped Variant 함유율(피크 면적%)을 나타내고, 가로축은 여러 가지 배양 조건을 나타낸다.
[도 6] 도 6은, 여러 가지 배양 조건에서 에미시주맙 산생 CHO 세포를 배양했을 경우의 배양 상청에 포함되는 Q-CDR-Clipped Variant 함유율을 나타내는 도면이다. 배양 상청을 Protein A를 이용하여 정제한 시료를 Q-CDR-Clipped Variant 함유율의 측정에 이용했다. 세로축은 Q-CDR-Clipped Variant 함유율(피크 면적%)을 나타내고, 가로축은 여러 가지 배양 조건을 나타낸다.
[도 7] 도 7은, Q-CDR Clipped Variant를 포함하는 에미시주맙 항체 용액의, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)의 Bind & Elute mode 공정을 포함하는 정제 공정에 있어서의 각 획분을 CE-HPLC 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 「부하 획분」은, 양이온 교환 컬럼에 부하한 항체 용액의 CE-HPLC 분석 결과를 나타낸다. 「세정 획분」은, pH 7.2로 조정한, 25mmol/L의 염화 나트륨을 포함하는 인산 완충액을 컬럼에 통액한 후(세정 후)의 컬럼 흡착 획분의 CE-HPLC 분석 결과를 나타낸다. 「용출 획분」은, 세정 후, pH 6.5로 조정한, 100mmol/L의 염화 나트륨을 포함하는 인산 완충액을 컬럼에 통액한 후의 컬럼 흡착 획분의 CE-HPLC 분석 결과를 나타낸다. 부하 획분 및 세정 획분과 비교하여, 용출 획분에 있어서는, 에미시주맙 항체의 피크보다 산성측의 Q-CDR Clipped Variant의 피크가 소실되고 있었다.
[도 8] 도 8A∼D는 SAXS 장치에 의한 에미시주맙(Main) 및 Protected Disulfide Isoform(BiAb3)의 분자 구조의 분석 결과를 나타내는 도면이다. Pair-distance distribution function [p(r)], Rg(nm), Dmax(nm)는 각각 분자의 2체간 거리 분포 함수, 관성 반경, 최대 길이를 나타낸다.
[도 9a] 도 9A는 HDX-MS 측정에 있어서의 중수소 교환율(%D)의 에미시주맙(양이온 교환 고속 액체 크로마토그래피의 주성분) 및 Protected Disulfide Isoform의 Residual Plot(중수소 교환 시간 30s, 60s, 120s, 240s, 480s, 960s, 1920s 및 3840s)을 나타낸다. 막대 그래프는 Q쇄, J쇄, 및 L쇄에 있어서의 각 중수소 교환 시간의 결과의 차의 총합을 나타낸다. 도 9B는 HDX-MS 측정에 의한 에미시주맙 및 Protected Disulfide Isoform의 사이에서 분자 구조의 차이가 시사된 부분을 나타낸다. 양자의 분자 구조상의 차이는 Q쇄에 있어서의 EU 넘버링 146위로부터 174위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 152번째로부터 180번째) 및 J쇄에 있어서의 EU 넘버링 146위로부터 174위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 148번째로부터 176번째)의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드에서 현저했다(별표로 표시).
[도 9b] 도 9a의 계속을 나타낸다.

본 발명의 하나의 실시태양은, 생물 활성(예를 들어 FVIII양 활성)이 저하된 항체 배리언트 및 아이소폼에 관한 것이다. 이들 항체 배리언트 및 아이소폼은, 본 발명자들에 의한 에미시주맙 원약의 분석에 있어서, 2종류의 구조 변화체(Q-CDR-Clipped Variant 및 Protected disulfide isoform)로서 동정되었다. 본 명세서에 있어서, 「항체 배리언트」 및 「항체 아이소폼」은, 항체 분자의 변이체, 또는 이성체라고 칭해지는 경우도 있다.

에미시주맙은, FVIII 보인자 기능 대체 활성을 나타내는 항FIX(a) 및 항FX로 이루어지는 이중 특이성 인간화 IgG4 항체이며, FIX(a) 및 FX 각각을 인식하는 2종류의 중쇄(Q499 및 J327)와 공통 L쇄(L404)로 구성된다.

구체적으로는, 에미시주맙은, 제 1 폴리펩티드와 제 3 폴리펩티드가 쌍을 형성하고, 제 2 폴리펩티드와 제 4 폴리펩티드가 쌍을 형성하는 이중 특이성 항체로서, 제 1 폴리펩티드가 서열 번호: 1, 2, 3(Q499의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 포함하는 H쇄, 제 2 폴리펩티드가 서열 번호: 4, 5, 6(J327의 H쇄 CDR)에 기재된 H쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 포함하는 H쇄, 제 3 폴리펩티드와 제 4 폴리펩티드가 서열 번호: 7, 8, 9(L404의 L쇄CDR)에 기재된 L쇄 CDR1, 2, 3의 아미노산 서열을 포함하는 공통 L쇄로 이루어지는 이중 특이성 항체(Q499-z121/J327-z119/L404-k)이다.

보다 구체적으로는, 에미시주맙은, 제 1 폴리펩티드와 제 3 폴리펩티드가 쌍을 형성하고, 제 2 폴리펩티드와 제 4 폴리펩티드가 쌍을 형성하는 이중 특이성 항체로서, 제 1 폴리펩티드가 서열 번호: 13에 기재된 H쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 H쇄, 제 2 폴리펩티드가 서열 번호: 14에 기재된 H쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 H쇄, 및 제 3 폴리펩티드와 제 4 폴리펩티드가 서열 번호: 15에 기재된 L쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 공통 L쇄로 이루어지는 이중 특이성 항체이다.

더 구체적으로는, 에미시주맙은, 제 1 폴리펩티드와 제 3 폴리펩티드가 쌍을 형성하고, 제 2 폴리펩티드와 제 4 폴리펩티드가 쌍을 형성하는 이중 특이성 항체로서, 제 1 폴리펩티드가 서열 번호: 10에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 제 2 폴리펩티드가 서열 번호: 11에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 H쇄, 및 제 3 폴리펩티드와 제 4 폴리펩티드가 서열 번호: 12에 기재된 공통 L쇄로 이루어지는 이중 특이성 항체(Q499-z121/J327-z119/L404-k)이다.

이와 같은 항체는, 예를 들어 WO2005/035756, WO2006/109592, WO2012/067176 등에 기재된 방법에 따라 취득할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체는, 원하는 항원과 결합하는 한 특별히 제한은 없고, 폴리클로날 항체여도 모노클로날 항체여도 되고, 균질한 항체를 안정되게 생산할 수 있는 점에서 모노클로날 항체가 바람직하다.

한편, 본 발명에서 기재되어 있는 아미노산 서열에 포함되는 아미노산은 번역 후에 수식(예를 들어, N말단의 글루타민의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루타민산으로의 수식은 당업자에게 잘 알려진 수식이다)을 받는 경우도 있지만, 그와 같이 아미노산이 번역 후 수식되었을 경우에도 당연하게도 본 발명에서 사용되는 항체에 포함된다.

본 발명에 있어서, 항체 또는 항체 배리언트 또는 항체 아이소폼의 생물 활성은, 바람직하게는 FVIII양 활성이다. 본 발명에 있어서 「FVIII양 활성」이란, FVIII의 기능을 대체하는 활성(FVIII 보인자 기능 대체 활성)을 의미한다. 본 발명에 있어서 「FVIII의 기능을 대체한다」란, FIX 또는 FIXa, 및, FX를 인식하여, FIXa에 의한 FX의 활성화를 촉진하는(FIXa에 의한 FXa 산생을 촉진하는) 것을 의미한다. FXa 산생 촉진 활성은, 예를 들어, FIXa, FX, 합성 기질 S-2222(FXa의 합성 기질), 인지질로 이루어지는 측정계로 평가할 수 있다. 이와 같은 측정계는, 혈우병 A 증례에 있어서의 질환의 중증도 및 임상 증상과 상관성을 나타낸다(Rosen S, Andersson M, Blomba¨ck M et al. Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination of FVIII activity. Thromb Haemost 1985; 54: 811-23).

에미시주맙 등의 항체 및 항체 배리언트 및 항체 아이소폼의 FVIII양 활성은, 예를 들어, WO2005/035756, WO2006/109592, WO2012/067176 등에 기재된 방법에 따라 평가할 수 있다.

본 발명에 있어서 항체 또는 항체 배리언트 또는 항체 아이소폼의 생물 활성이 저하되어 있다는 것은, 당해 생물 활성이, 비교 대상으로 하는 항체의 생물 활성과 비교하여 저하되어 있으면 되고, 통계학적으로 유의하게 저하되어 있는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서 항체 또는 항체 배리언트 또는 항체 아이소폼의 생물 활성이 현저하게(또는 극히) 저하되어 있다는 것은, 당해 생물 활성이, 비교 대상으로 하는 항체의 생물 활성과 비교하여, 10% 이상, 예를 들어, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상 저하되어 있는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서 「Q쇄(Q Chain)」 및 「J쇄(J chain)」란, 각각 FIX(a) 및 FX에 대해서 결합능을 나타낼 수 있는 가변 영역을 포함하는 H쇄(중쇄)를 의미한다.

본 발명에 있어서 「공통 L쇄」란, 상이한 2종 이상의 H쇄와 각각 쌍을 형성하고, 각각의 항원에 대해서 결합능을 나타낼 수 있는 L쇄이다. 여기에서, 「상이한 H쇄」란, 바람직하게는 상이한 항원에 대한 항체의 H쇄를 가리키지만, 그것에 한정되지 않고, 아미노산 서열이 서로 상이한 H쇄를 의미한다. 공통 L쇄는, 예를 들어 WO2006/109592에 기재된 방법에 따라 취득할 수 있다.

「항체」라고 하는 용어는, 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 2량체, 다량체, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체), 항체 유도체 및 항체 수식물이어도 된다(Miller K et al. J Immunol. 2003, 170(9), 4854-61). 항체는, 마우스, 인간, 인간화, 키메라여도 되고, 또는 다른 종 유래여도, 인공적으로 합성한 것이어도 된다. 본 명세서 중에 개시되는 항체는, 면역글로불린 분자의 임의의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다. 면역글로불린은, 임의의 종(예를 들어, 인간, 마우스 또는 토끼) 유래일 수 있다. 한편, 「항체」, 「면역글로불린」 및 「이뮤노글로불린」이란 용어는 호환성을 갖고 광의인 의미로 사용된다.

「이중 특이성」 항체는, 각각 상이한 에피토프를 인식하는 2개의 가변 영역을 동일한 항체 분자 내에 갖는 항체를 말한다. 이중 특이성 항체는 2개 이상의 상이한 항원을 인식하는 항체여도 되고, 동일 항원 상의 상이한 2개 이상의 에피토프를 인식하는 항체여도 된다. 이중 특이성 항체에는, whole의 항체뿐만 아니라 항체 유도체가 포함되어 있어도 된다.

항체로서는, 유전자 재조합 기술을 이용하여 산생한 재조합형 항체를 이용할 수 있다. 재조합형 항체는, 그것을 코딩하는 DNA를 하이브리도마, 또는 항체를 산생하는 감작 림프구 등의 항체 산생 세포로부터 클로닝하고, 벡터에 짜넣고, 이것을 숙주(숙주 세포)에 도입하여 산생시키는 것에 의해 얻을 수 있다.

이중 특이성 항체는 IgG 타입의 것에 한정되지 않지만, 예를 들어 IgG 타입 이중 특이성 항체는 IgG 항체를 산생하는 하이브리도마 2종을 융합하는 것에 의해 생기는 hybrid hybridoma(quadroma)에 의해 분비시킬 수 있다(Milstein C et al. Nature 1983, 305: 537-540). 또한 목적하는 2종의 IgG를 구성하는 L쇄 및 H쇄의 유전자, 합계 4종의 유전자를 세포에 도입하는 것에 의해 공발현시키는 것에 의해 분비시킬 수 있다.

본 발명의 항체는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 구체적으로는, 목적으로 하는 항체를 코딩하는 DNA를 발현 벡터에 짜넣는다. 그 때, 발현 제어 영역, 예를 들어, 인핸서, 프로모터의 제어하에서 발현되도록 발현 벡터에 짜넣는다. 다음에, 이 발현 벡터에 의해 숙주 세포를 형질 전환하여, 항체를 발현시킨다. 그 때에는, 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다.

이것에 의해 얻어진 본 발명의 항체는, 숙주 세포내 또는 세포외(배지 등)로부터 단리하여, 실질적으로 순수하고 균일한 항체로서 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는, 통상의 항체의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 되고, 전혀 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, IgG2 다이설파이드 아이소폼의 분리에 대해서는, WO2013/086448에 기재된 방법이 알려져 있다. 본 발명의 항체 및 항체 배리언트 또는 항체 아이소폼의 분리, 정제에 대해서는, 예를 들어, 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외 여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역 침강, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택, 조합하면 항체 및 항체 배리언트 또는 항체 아이소폼을 분리, 정제할 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래피 컬럼을 이용한 분리, 정제에 있어서는, 강양이온 교환 매트릭스, 약양이온 교환 매트릭스, 항인간 IgG 친화성 매트릭스, 및 프로테인 L 매트릭스 등의 여러 가지 매트릭스를 이용할 수 있다.

일 국면에 있어서, 본 발명은, 이하의 특징을 갖는 항체 배리언트(본 명세서에 있어서, Q-CDR-Clipped Variant라고 칭하는 경우가 있다)에 관한 것이다:

· 에미시주맙에 비해, 생물 활성(FVIII양 활성)이 극히 낮다;

· 결손되어 있는 아미노산 잔기의 N말단측의 단편과 C말단측의 단편이 다이설파이드 결합에 의해 결합하고 있다(도 1B).

· 항체 산생 세포의 배양 시간, 배양 온도, 및 배양 pH에 따라 생성량이 상이하다.

일 태양에 있어서, Q-CDR-Clipped Variant는, 아미노산 서열 SISPSGQSTYYRREVKG(서열 번호 2)를 포함하는 가변 영역을 갖는 항체의 배리언트로서,

(a) 서열 번호 2의 아미노산 서열의 N말단측으로부터 12번째의 위치(에미시주맙의 Q쇄의 N말단측으로부터 61번째의 위치, 즉 Kabat 넘버링 60위)에 있어서의 아미노산 잔기 R; 또는

(b) 서열 번호 2의 아미노산 서열의 N말단측으로부터 10∼12번째의 위치(에미시주맙의 Q쇄의 N말단측으로부터 59∼61번째의 위치: Kabat 넘버링 58∼60위)에 있어서의 아미노산 잔기 YYR

이 결손되고 당해 가변 영역이 당해 결손 부위에서 절단되어 있는, 항체 배리언트이다.

Q-CDR-Clipped Variant는, 바람직하게는 이중 특이성(Bi-specific) 항체의 배리언트이며, 특히 바람직하게는 에미시주맙의 배리언트이다.

다른 국면에 있어서, 본 발명은, Q-CDR-Clipped Variant의 검출 방법 및 분석 방법에도 관한 것이다. 일 태양에 있어서, Q-CDR-Clipped Variant의 검출 방법은, 아미노산 서열 SISPSGQSTYYRREVKG(서열 번호 2)를 포함하는 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 시료를, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 순상 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 전하에 기초하는 분리, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC), 겔 침투 크로마토그래피(GPC), 또는 그들의 조합에 의해 분리하는 공정을 포함한다. 또한, 일 태양에 있어서, Q-CDR-Clipped Variant의 분석 방법은, Q-CDR-Clipped Variant를 표준품으로서 사용하여, 정량 분석, 정성 분석, 및 구조 해석으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 복수의 분석을 행하는 공정을 포함한다.

그와 같은 검출 방법 및 분석 방법에 있어서는, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 Fab(Q쇄Fab)에 있어서의 결손 부위의 유무를 지표로 하여 검출 및 분석할 수 있다. 당해 결손 부위는, 예를 들어, LCMS 분석에 있어서의, 당해 결손에 기인하는 분자량의 시프트를 지표로 하여 검출할 수 있다. 또한, Q-CDR-Clipped Variant에 있어서, 결손되어 있는 아미노산 잔기의 N말단측의 단편과 C말단측의 단편은 다이설파이드 결합에 의해 결합하고 있기 때문에, 다이설파이드 결합의 환원 반응에 제공한 후의 시료를 CE-HPLC, LCMS, LC-UV 등의 여러 가지 분석 기술을 이용하여 분석하는 것에 의해, 결손 부위의 유무에 기인하는 환원 패턴의 차이를 검출할 수 있다. 또한, NMR 측정 등에 의한 구조 해석을 이용할 수도 있다.

혹은, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 분리도의 차이를 지표로 할 수도 있고, 예를 들어 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리했을 경우, Q-CDR-Clipped Variant는, 에미시주맙의 주요 피크와 비교하여 산성측의 영역에서 분리된다.

다른 국면에 있어서, 본 발명은, 상기와 같은 검출 방법 및 분석 방법 중 하나 또는 그들의 조합을 실시하는 것에 의해, 에미시주맙을 함유하는 의약 조성물의 제조 및 품질 관리를 행할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 상기와 같은 검출 방법 및 분석 방법의 실시, 또는 그들 방법을 조합하는 공정을 포함하는, 에미시주맙을 함유하는 의약 조성물의 품질 관리 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 그와 같은 품질 관리 방법을 실시하는 공정을 포함하는, 에미시주맙을 함유하는 의약 조성물의 제조에도 관한 것이다.

다른 국면에 있어서, 본 발명은, 에미시주맙 및 Q-CDR-Clipped Variant를 포함하는 의약 조성물로서, 해당 의약 조성물 중의 항체 분자에 있어서의 Q-CDR-Clipped Variant의 비율이 낮게 억제되어 있는, 의약 조성물에 관한 것이다. 당해 의약 조성물은, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)에 의한 정제를 포함하는 정제 공정에 의해 얻어진다. 예를 들어, 에미시주맙 및 Q-CDR-Clipped Variant를 포함하는 항체 용액을 양이온 교환 컬럼에 흡착시킨 후, Q-CDR Clipped Variant 포함하는 산성측의 배리언트만을 특이적으로 용출시켜, 제거할 수 있다. 당해 의약 조성물 중의 전체 항체 분자에 있어서의 Q-CDR-Clipped Variant의 비율은, 상기의 Q-CDR-Clipped Variant 검출/분석 방법을 포함하는 여러 가지 방법에 의해 평가할 수 있고, 예를 들어, 당해 의약 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)나 CE-HPLC로 분석했을 때의 Q-CDR-Clipped Variant의 피크 면적의 비율(피크 에리어비)에 의해 나타낼 수 있다. 당해 의약 조성물 중의 전체 항체 분자에 있어서의 Q-CDR-Clipped Variant의 비율(예를 들어, CEX의 피크 에리어비)은, 바람직하게는 5% 이하이며, 예를 들어, 5.0% 이하, 4.0% 이하, 3.0% 이하, 2.0% 이하, 또는 1.0% 이하이다.

또한, 본 발명은, Q-CDR-Clipped Variant의 함유율이 낮게 억제된 의약 조성물의 제조 방법, 및 Q-CDR-Clipped Variant의 생성을 억제하는 방법에도 관한 것이다. Q-CDR-Clipped Variant의 생성량은, 항체 산생 세포의 배양 시간을 짧게 하는(예를 들어 15일 이내, 바람직하게는 13일 이내로 하는) 것에 의해, 혹은 배양 온도를 낮게 하는(예를 들어 38℃ 이하, 바람직하게는 37℃ 이하, 더 바람직하게는 36℃ 이하로 하는) 것에 의해, 및/또는, 배양 pH를 높게 하는(예를 들어 6.7 이상, 바람직하게는 6.9 이상, 더 바람직하게는 7.1 이상으로 하는) 것에 의해, 저감할 수 있다(도 4). 따라서, 상기 방법은, 항체(예를 들어 에미시주맙) 산생 세포를, 종래보다도 낮은 배양 온도(예를 들어 약 36℃ 이하), 높은 pH(예를 들어 약 7.1 이상)에서 일정 시간(예를 들어 약 15일 이내) 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 일 태양에 있어서, 상기 방법은, 항체 산생 세포를 pH 7.1 이상 또한/또는 배양 온도 36℃ 이하에서 배양하는 공정을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 상기 방법은, 항체 산생 세포의 배양 조건을, 배양의 도중(예를 들어 배양 2일째 이후)에, pH 7.1 이상 또한/또는 배양 온도 36℃ 이하에서의 배양 조건으로 시프트하는 것을 특징으로 한다.

다른 국면에 있어서, 본 발명은, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)의 Bind & Elute mode의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 에미시주맙을 포함하는 조성물의 정제 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 당해 정제 방법을 실시하는 공정을 포함하는, 에미시주맙을 함유하는 의약 조성물의 제조 방법에도 관한 것이다.

다른 국면에 있어서, 본 발명은, 이하의 특징을 갖는 항체 아이소폼(본 명세서에 있어서, Protected disulfide isoform이라고 칭하는 경우가 있다)에 관한 것이다:

· 에미시주맙에 비해, 생물 활성(FVIII양 활성)이 극히 낮다;

· 에미시주맙에 비해, 소수성이 강하다;

· 에미시주맙에 비해, 온화한 환원 조건(부분 환원 조건)하에서 중쇄간의 다이설파이드 결합(도 2B)이 환원되기 어렵다;

· 항체 산생 세포의 배양액 중의 용존 산소 농도 및 초기 pH, 및 MTX(methotrexate) 첨가 전의 배양 시간 등의 조건(제조 파라미터)에 관계 없이 생성된다.

일 태양에 있어서, Protected disulfide isoform은, 항원인 FIX(a) 및 FX와 결합할 수는 있지만, 생물 활성(FVIII양 활성)은 나타내지 않는 것을 특징으로 한다.

특정의 태양에 있어서, Protected disulfide isoform은, 에미시주맙과 동일한 (정상적인) 다이설파이드 결합을 갖고 있지만, Fab 부분의 구조 변화에 의해 통상보다도 강한 소수성을 가져, 중쇄간의 다이설파이드 결합이 통상보다 환원되기 어려워진 구조 이성체이다.

다른 태양에 있어서, Protected disulfide isoform은, 제 1 중쇄(Q쇄: 서열 번호 10) 및 제 2 중쇄(J쇄: 서열 번호 11)를 포함하는 이중 특이성 항체의 아이소폼으로서,

에 있어서 다이설파이드 결합을 형성하고 있거나, 혹은

에 있어서 다이설파이드 결합을 형성하고 있는, 이중 특이성 항체 아이소폼이다.

특정의 태양에 있어서, Protected disulfide isoform은,

(1a) 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 144위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 150번째의 위치)의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 200위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 202번째의 위치)의 시스테인 사이;

(1b) 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 200위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 206번째의 위치)의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 144위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 146번째의 위치)의 시스테인 사이;

(1c) 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 226위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 229번째의 위치)의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 226위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 225번째의 위치)의 시스테인 사이; 및

(1d) 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 229위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 232번째의 위치)의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 229위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 228번째의 위치)의 시스테인 사이

에 있어서 다이설파이드 결합을 형성하고 있거나, 혹은

(2a) 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 226위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 229번째의 위치)의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 229위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 228번째의 위치)의 시스테인 사이;

(2b) 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 229위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 232번째의 위치)의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 226위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 225번째의 위치)의 시스테인 사이;

(2c) 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 144위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 150번째의 위치)의 시스테인과, 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 200위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 206번째의 위치)의 시스테인 사이; 및

(2d) 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 144위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 146번째의 위치)의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 200위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 202번째의 위치)의 시스테인 사이

에 있어서 다이설파이드 결합을 형성하고 있는, 이중 특이성 항체 아이소폼이며, 특히 바람직하게는 에미시주맙의 아이소폼이다.

다른 국면에 있어서, 본 발명은, Protected disulfide isoform의 검출 방법 및 분석 방법에도 관한 것이다. 일 태양에 있어서, Protected disulfide isoform의 검출 방법은, 이중 특이성 항체를 포함하는 시료를, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 순상 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 전하에 기초하는 분리, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC), 겔 침투 크로마토그래피(GPC), 또는 그들의 조합에 의해 분리하는 공정을 포함한다. 또한, 일 태양에 있어서, Protected disulfide isoform의 분석 방법은, Protected disulfide isoform을 표준품으로서 사용하여, 정량 분석, 정성 분석, 및 구조 해석으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 복수의 분석을 행하는 공정을 포함한다.

그와 같은 검출 방법 및 분석 방법에 있어서는, 중쇄간 다이설파이드 결합 영역 및/또는 Fab 영역의 구조에 있어서의, Protected disulfide isoform와 에미시주맙의 차이를 이용하여 분석할 수 있다. 이 구조면의 차이는, 예를 들어 이하에 나타내는 바와 같은 여러 가지 분석 수법에 의해 검출할 수 있다.

예를 들어, 비환원 조건하에서 IdeS 프로테아제에 의한 소화 반응(IgG의 힌지 영역 하의 단일 부위를 절단하여, F(ab')2와 Fc 단편을 생기게 한다)을 행한 후의 시료를, 역상 컬럼(예를 들어 C4 컬럼)을 이용하여 분석하는 것에 의해, 에미시주맙과 Protected disulfide isoform의 입체 구조의 차이 또는 소수성의 강도를 반영한 피크를 검출할 수 있다.

또한, IdeS 소화 후에, 온화한 환원 조건하(예를 들어 Tris 완충액(pH 7.0) 중의 DTT에 의한 37℃에서의 환원)에서 환원 반응을 행한 후의 시료를 역상 컬럼에 의해 분석하는 것에 의해, 에미시주맙과 Protected disulfide isoform에 있어서의 다이설파이드 결합의 환원되기 쉬움의 차이를 반영한 피크를 검출할 수 있다.

에미시주맙과 Protected disulfide isoform은, 모든 다이설파이드 결합이 환원되는 조건하에서 환원 반응을 행했을 경우는 역상 컬럼에 의한 분석 결과에 차이가 검출되지 않지만, 상기의 온화한 환원 조건하에서 환원 반응을 행했을 경우는 역상 컬럼에 의한 분석 결과에 있어서, 환원 패턴의 차이가 검출된다. 특정의 이론에 의해 한정되는 것을 의도하는 것은 아니지만, 상기의 온화한 환원 조건하에서는, 에미시주맙은, 중쇄-경쇄간의 다이설파이드 결합도 중쇄간의 다이설파이드 결합도 환원되는 데 반해, Protected disulfide isoform은, 중쇄-경쇄간의 다이설파이드 결합만 환원되고 중쇄간의 다이설파이드 결합은 환원되지 않는다고 생각된다.

또한, 비변성 조건하(예를 들어 Tris 완충액 중)에서 (예를 들어 Lys-C 소화 반응을 도중에 멈추는 것에 의해) 한정적 Lys-C 소화를 행했을 경우의 시료를, 역상 컬럼(예를 들어 C4 컬럼)을 이용하여 분석하는 것에 의해, 에미시주맙과 Protected disulfide isoform의 입체 구조의 차이에 기인하는 Lys-C 소화 패턴의 차이를 반영한 피크를 검출할 수 있다. 특정의 이론에 의해 한정되는 것을 의도하는 것은 아니지만, 비변성 조건에 있어서의 Lys-C 소화를 위해, 입체 구조를 유지 한 상태에서 Lys-C가 액세스하기 쉬운 부위가 우선적으로 절단된 결과, 입체 구조의 차이가 반영된 Lys-C 소화 패턴이 검출된다고 생각된다.

혹은, 변성 처리(예를 들어, 5M 구아니딘, 37℃, 30분 처리) 후의 비환원 시료(즉 SS 결합은 유지하고 있다)에 대해서 한정으로 Lys-C 소화를 행한 다음에 역상 컬럼을 이용하여 분석하는 것에 의해, 에미시주맙과 Protected disulfide isoform의 입체 구조의 차이에 기인하는 Lys-C 소화 패턴의 차이를 반영한 피크를 검출할 수 있다. 특정의 이론에 의해 한정되는 것을 의도하는 것은 아니지만, 변성 후의 비환원 시료의 Lys-C 소화를 위해, 입체 구조는 유지하고 있지 않지만 SS 결합(다이설파이드 결합)은 유지하고 있는 상태에서 Lys-C가 액세스하기 쉬운 부위가 우선적으로 절단된 결과, SS 결합의 차이가 반영된 Lys-C 소화 패턴이 검출된다고 생각된다.

상기와 같은, 비변성 조건 또는 변성 조건에 있어서의, 환원 반응, IdeS 소화, 한정적 Lys-C 소화 외에, 파파인 소화 등의 여러 가지 분해 반응을 이용할 수 있다. 또한, C4 컬럼 등을 이용한 역상 크로마토그래피 외에, SE-HPLC 분석, 동적 광산란법(DLS), SAXS 측정, 전자현미경 측정, 3D modeling, SPR 평가, HDX MS 분석 등의 여러 가지 분석 기술을 이용할 수 있다.

다른 국면에 있어서, 본 발명은, 에미시주맙 및 Protected disulfide isoform을 포함하는 의약 조성물로서, 해당 의약 조성물 중의 항체 분자에 있어서의 Protected disulfide isoform의 비율이 낮게 억제되어 있는, 의약 조성물에 관한 것이다. 당해 의약 조성물 중의 전체 항체 분자에 있어서의 Protected disulfide isoform의 비율은, 상기의 Protected disulfide isoform 검출/분석 방법을 포함하는 여러 가지 방법에 의해 평가할 수 있고, 예를 들어, 당해 의약 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)나 CE-HPLC로 분석했을 때의 Protected disulfide isoform의 피크 면적의 비율(피크 에리어비)에 의해 나타낼 수 있다. 당해 의약 조성물 중의 전체 항체 분자에 있어서의 Protected disulfide isoform의 비율(예를 들어, CEX의 피크 에리어비)은, 바람직하게는 2% 이하이며, 예를 들어, 2.0% 이하, 1.5% 이하, 1.0% 이하, 또는 0.5% 이하이다.

다른 국면에 있어서, 본 발명은, 에미시주맙의 아이소폼(Protected disulfide isoform)으로서, 에미시주맙과 동일한 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 갖지만, 에미시주맙보다도 Rg(nm) 및/또는 Dmax(nm)의 값이 작은 분자 구조를 갖는 아이소폼을 개시한다. 이와 같은 아이소폼은, 에미시주맙보다도 J쇄-Q쇄의 N말단간의 거리가 짧은 분자 구조를 갖고, 구체적으로는 SAXS 장치로 측정한 Rg의 평균치가 에미시주맙에 대해 3% 이상, 바람직하게는 4% 이상, 보다 바람직하게는 5% 이상, 보다 바람직하게는 6% 이상 작고, 및/또는 Dmax의 평균치가 5% 이상, 바람직하게는 6% 이상, 보다 바람직하게는 7% 이상, 보다 바람직하게는 7.5% 이상 작다. 또한, Rg의 평균치가 에미시주맙에 대해 0.15nm 이상, 바람직하게는 0.2nm 이상, 보다 바람직하게는 0.25nm 이상, 보다 바람직하게는 0.3nm 이상 작고, 및/또는 Dmax의 평균치가 0.5nm 이상, 바람직하게는 1.0nm 이상, 보다 바람직하게는 1.2nm 이상, 보다 바람직하게는 1.4nm 이상 작다. 또한 이와 같은 아이소폼은, Rg의 평균치가 4.9nm 이하, 바람직하게는 4.8nm 이하이고, 및/또는 Dmax의 평균치가 17.0nm 이하, 바람직하게는 16.5nm 이하이다.

이와 같은 Rg, Dmax의 값은 이하의 조건하에서 측정된다.

(1) 항체 농도: 항체 농도 7.54mg/mL

(2) 용매 조건: 150mmol/L arginine, 20mmol/L histidine-aspartic acid, pH 6.0

(3) 온도: 25℃

여기에서, Rg의 평균치는 Guinier plot로부터 Rg를 측정마다 계산하고, 그들을 평균하는 것에 의해 산출할 수 있다. Dmax의 평균치는 p(r)의 x절편으로부터 Dmax를 측정마다 계산하고, 그들을 평균하는 것에 의해 산출할 수 있다. 한편, Guinier plot 및 p(r)에 관한 해석 방법은, 실시예 9에 기재한 바와 같다.

다른 국면에 있어서, 본 발명은, 에미시주맙의 아이소폼(Protected disulfide isoform)으로서, 에미시주맙과 동일한 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열을 갖지만, 에미시주맙과 비교하여 Q쇄에 있어서의 EU 넘버링 146위로부터 174위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 152번째로부터 180번째)의 아미노산 잔기 및 J쇄에 있어서의 EU 넘버링 146위로부터 174위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 148번째로부터 176번째)의 아미노산 잔기에 있어서 분자 구조상의 차이를 갖는 아이소폼을 개시한다. 이와 같은 구조상의 차이는, HDX-MS 측정에 있어서의 중수소 교환율(%D)의 차로서 측정하는 것이 가능하고, 구체적으로, 도 9A에 나타내는 바와 같이, 이 영역의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드의 중수소 교환 시간의 차로서 확인할 수 있다.

다른 국면에 있어서, 본 발명은, 에미시주맙 및 해당 아이소폼을 포함하는 의약 조성물로서, 해당 의약 조성물 중의 전체 항체 분자에 있어서의 해당 아이소폼의 비율이 2% 이하인, 의약 조성물을 개시한다.

상기, 항체 분자, 항체 배리언트, 항체 아이소폼, 항체 배리언트 또는 아이소폼을 포함하는 의약 조성물, 항체 배리언트 또는 아이소폼의 분석 방법, 및 항체 배리언트 또는 아이소폼의 생성을 억제하는 방법에 있어서는, 항체는 바람직하게는 이중 특이성 항체이며, 더 바람직하게는 에미시주맙(ACE910)이다.

본 명세서에 있어서 이용하는 경우, 「···을 포함하는(comprising)」이라는 표현에 의해 나타내는 태양은, 「본질적으로···로 이루어지는(essentially consisting of)」이라는 표현에 의해 나타내는 태양, 및 「···로 이루어지는(consisting of)」이라는 표현에 의해 나타내는 태양을 포함한다.

본 명세서에 기재된 수치는, 예를 들어 기기, 측정 조건, 당업자의 손재주에 기인하여, 일정한 범위 내에서 변동할 수 있는 것이고, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 범위 내이면, 예를 들어 10% 정도 변동하는 것은 있을 수 있다.

본 명세서에 있어서 명시적으로 인용되는 모든 특허 및 참고 문헌의 내용은 모두 본 명세서에 참조로서 원용된다.

본 발명은, 이하의 실시예에 의해 더 예시되지만, 하기의 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예

〔실시예 1〕 유전자 재조합 인간화 이중 특이성 모노클로날 항체(에미시주맙 항체)의 제조

에미시주맙의 이성체(항체 배리언트 및 아이소폼)의 구조 해석을 위해서, 대량의 에미시주맙 항체를 다음과 같은 방법으로 제조했다. 에미시주맙을 코딩하는 유전자를 짜넣은 CHO 세포를 에미시주맙 산생 세포로 하여 시판되는 기초 배지(동물 세포 배양용 기초 배지)에서 배양했다. 배양 조건은, 일반적으로 CHO 세포의 배양에 적합한 환경에서 행했다.

발현된 항체의 정제는, 일반적인 컬럼 크로마토그래피, 예를 들어 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피 등의 조합에 의해 행했다.

〔실시예 2〕 Q-CDR Clipped Variant 및 Protected Disulfide Isoform의 분리(양이온 교환 고속 액체 크로마토그래피법)

분석 검체를 이동상 A액(조성 후기)으로 희석한 시료 용액을 양이온 교환 컬럼(ProPac WCX-10, 입자경 10마이크로미터, 내경 4.0mm, 길이 250mm)에 주입하고, 산성의 이동상(9.6mmol/L Tris, 6.0mmol/L 피페라진, 11.0mmol/L 이미다졸 완충액을 포함하는 pH 6.0의 이동상 A액) 및 알칼리성의 이동상(9.6mmol/L Tris, 6.0mmol/L 피페라진, 11.0mmol/L 이미다졸 및 150mmol/L 염화 나트륨을 포함하는 pH 9.9의 이동상 B액)을 이용하여 액체 크로마토그래피에 의해 분리를 행했다(컬럼 온도: 30±5℃, 측정 파장: 280nm, 유량: 1.0mL/min). 그 결과, 에미시주맙에 대응하는 Main 피크에 비하여 Q-CDR Clipped Variant는 산성측, Protected Disulfide Isoform은 알칼리성측의 영역에서 분리됨이 확인되었다(도 1A, 도 2A).

〔실시예 3〕 Protected Disulfide Isoform의 분리(IdeS 소화, 부분 환원, 역상 고속 액체 크로마토그래피법)

검체를 인산 완충액으로 희석하고, IdeS protease 및 PNGase-F에 의해 소화한 후, 변성제를 포함하지 않는 Tris 완충액 중에서 DTT에 의해 부분 환원을 행한 후, TFA 용액으로 희석한 샘플을 역상 고속 액체 크로마토그래피에 주입하여 분리를 행했다. 그 결과, 에미시주맙의 주성분은 중쇄 및 경쇄간의 다이설파이드 결합이 환원된 상태에서 크로마토그래프 상에서 분리되지만, Protected Disulfide Isoform은 중쇄간이 환원되지 않는 상태의 특이한 피크로서 검출됨을 알 수 있었다(도 3B 및 D).

〔실시예 4〕 Protected Disulfide Isoform의 분리(IdeS 소화, 변성, 역상 고속 액체 크로마토그래피법)

검체를 완충액으로 희석하고, IdeS protease 및 PNGase-F에 의해 소화한 후, 변성 완충액에서 단백질의 변성을 행했다. 그 후, TFA 용액으로 희석한 샘플을 역상 고속 액체 크로마토그래피에 주입하여 분리를 행했다. 그 결과, Protected Disulfide Isoform의 F(ab')2 부분은 에미시주맙의 주성분보다도 보지 시간이 길게 분리됨을 알 수 있었다(도 4C 및 D).

〔실시예 5〕 Protected Disulfide Isoform의 분리(IdeS 소화, 역상 고속 액체 크로마토그래피법)

검체를 완충액으로 희석하고, IdeS protease 및 PNGase-F에 의해 소화한 후, TFA 용액으로 희석한 샘플을 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 분리했다. 그 결과, Protected Disulfide Isoform의 F(ab')2 부분은 에미시주맙의 주성분보다도 보지 시간이 길게 분리됨을 알 수 있었다(도 4A 및 B).

〔실시예 6〕 Q-CDR Clipped Variant 및 Protected Disulfide Isoform의 생물 활성의 평가

Chromogenic assay

인지질을 공급한 반응의 장에 있어서, FIXa와 FX 존재하에서 에미시주맙을 반응시키는 것에 의해 생성되는 활성화 혈액 응고 제X 인자(FXa)의 생성량을 특이적 발색 기질로 정량 측정했다. 구체적으로는, 샘플에 트리스하이드록시메틸아미노메테인, 염화 나트륨, BSA를 포함하는 용액(TBSB)을 가하여 각종 농도의 에미시주맙 희석액을 조제했다. 희석액을 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 각각 첨가하고, 각 웰에 FIXa, FX, 염화 칼슘, 염화 마그네슘, 인지질 및 TBSB를 포함하는 응고 인자 용액을 가하고 진탕 후, 30분간 방치했다. 그 후, 각 웰에 에틸렌다이아민 사아세트산 용액을 가하고 진탕, 추가로 각 웰에 Chromogenic 기질 용액(N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-glycyl-L-arginine-p-nitroaniline hydrochloride and its methyl ester)을 가하고 진탕 후, 35분간 방치했다. 1∼2분간 진탕한 후, 플레이트 리더를 이용하여 각 웰의 405nm에 있어서의 흡광도(Abs)를 측정했다. 각 농도의 시료 용액 및 표준 용액으로부터 얻어진 흡광도로부터, 4-파라미터 평행선 로지스틱 해석 프로그램을 사용하여 회귀 곡선으로부터 표준 용액에 대한 시료의 비활성을 구했다. 그 결과, 에미시주맙의 표준 용액에 대해서, Q-CDR Clipped Variant는 18±1%, Protected Disulfide Isoform은 8±0%의 생물 활성을 나타냈다.

Clotting assay

본 시험에서는, 인간 제VIII 인자 결핍 혈장을 이용하여, 내인계 응고 활성화 기서를 반영한 계에서, 피브린 생성에 의한 응고까지의 시간을, 탁도 변화를 지표로 측정했다. 구체적으로는, 샘플에 트리스하이드록시메틸아미노메테인, 염화 나트륨, BSA를 포함하는 용액을 가하여 각종 농도의 에미시주맙 희석액을 조제했다. 전자동 혈액 응고 측정 장치에 의해 제VIII 인자 결핍 혈장을 희석액에 가하여 인큐베이트하고, 다음에 APTT 시약을 첨가하여 인큐베이트, 마지막에 염화 칼슘액을 첨가하여 응고 시간을 측정했다. 표준 물질에 대한 시료의 비활성의 산출은, 평행선 검정법에 의해 행했다. 그 결과, 에미시주맙의 표준 용액에 대해서, Q-CDR Clipped Variant는 18±1%, Protected Disulfide Isoform은 16±1%의 생물 활성을 나타냈다.

〔실시예 7〕 배양 파라미터의 Q-CDR Clipped Variant 비율에 대한 영향 평가

〔초발 배지〕

시판되는 기초 배지에 식물 유래의 가수분해물·아미노산 등을 첨가하고, 용해 후에 여과 멸균했다.

〔유가(流加) 배지〕

시판되는 기초 배지에 글루코스·아미노산 등을 첨가하고, 용해 후에 여과 멸균했다.

〔세포〕

에미시주맙을 코딩하는 유전자를 짜넣은 에미시주맙 산생 CHO 세포(DXB-11주)를 이용했다.

〔배양법〕

1L 스케일의 세포 배양 장치에 생산 배지(표준 농도의 -10∼10%)를 가하고, 이것에 상기 CHO 세포주를 2∼6×10⁵cells/mL가 되도록 파종하고, 온도 36∼38℃, 용존 산소 농도 40%, 초기 pH 7.20에서 배양을 개시했다. 배양 개시 후 1-3일째부터 유가 배지(표준 농도의 -10∼10%)를 일정 유속으로 첨가하고, 배양 개시 후 3일째부터 pH를 6.70-7.10으로 시프트하여, 13∼15일간 배양했다.

12개의 중심점을 포함하는 중심 복합 계획(6인자: 생산 배지 농도, 유가 배지 농도, 초발 세포 밀도, 온도, 유가 개시의 타이밍, 시프트 후 pH)에 기초하여 디자인된 실험 계획에 따라, 전체 56조건에서 배양했다. 모든 조건에 대해서, 배양 13일째, 14일째, 및 15일째의 배양액을 샘플링하여(합계 168샘플), 원심(3000rpm, 5분간) 상청을 Protein A 정제 후에 Q-CDR Clipped Variant 비율의 측정에 사용했다.

〔분석 방법〕

생 세포수·생존율 측정은 트리판블루 염색법에 의해 측정했다. Q-CDR Clipped Variant는, 양이온 컬럼(ProPac WCX-10)을 이용한 양이온 교환 고속 액체 크로마토그래피법에 의해, 피크로서 검출했다.

〔결과〕

결과를 도 5 및 도 6에 나타낸다. Q-CDR Clipped Variant 비율은 온도와 시프트 후 pH의 영향을 받고, 시험한 범위(온도 36-38℃, 시프트 후 pH 6.70-7.10)에서는, 36℃ 배양 쪽이 Q-CDR Clipped Variant 비율을 저감할 수 있고, 시프트 후 pH 7.10에서 배양한 쪽이 Q-CDR Clipped Variant 비율을 저감할 수 있었다. 또한, 온도와 시프트 후 pH에는 교호 작용이 나타나, 38℃ 배양 조건하에서도 시프트 후 pH를 6.70으로 낮게 함으로써, Q-CDR Clipped Variant 비율을 저감할 수 있었다.

배양 온도를 36-38℃, 배양 개시 후 3일째부터의 pH를 6.70-7.10으로 제어함으로써, Q-CDR Clipped Variant를 4% 이하로 제어할 수 있었다.

〔실시예 8〕 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 Q-CDR Clipped Variant의 제거

Q-CDR Clipped Variant와 에미시주맙 항체의 정전적 성질의 차이를 이용하여, 이들을 분리하는 방법을 확립했다. 이하에 실시예를 나타낸다.

양이온 교환 수지로서 GE사제 Capto SP ImpRes 또는 상당품을 컬럼에 충전하고, 평형화 후, Q-CDR Clipped Variant를 포함하는 에미시주맙 항체 용액을 부하하여, 일단 모두 흡착시켰다. 부하 후, 염화 나트륨을 포함하는 인산 완충액으로 세정하고, Q-CDR Clipped Variant 포함하는 산성측의 배리언트만을 특이적으로 용출시켜, 에미시주맙 항체와 분리, 제거했다. 제거 상황을 나타내기 위해, 이 세정 획분과 용출 획분, 및 분리 전의 부하 획분을 CE-HPLC 분석했다(도 7).

부하, 세정, 및 용출의 조건을 이하에 나타냈다.

부하: pH 5.0으로 조정한, 에미시주맙 항체를 포함하는 트리스염산 완충액을, 수지 1L당 33g 에미시주맙 항체의 조건에서 부하했다.

세정: pH 7.2로 조정한, 25mmol/L의 염화 나트륨을 포함하는 인산 완충액을, 실온에서 3.5 CV 컬럼에 통액했다.

용출: pH 6.5로 조정한, 100mmol/L의 염화 나트륨을 포함하는 인산 완충액을, 실온에서 6.5 CV 컬럼에 통액했다.

〔실시예 9〕 Protected Disulfide Isoform의 분자 구조의 분석

에미시주맙 및 Protected Disulfide Isoform의 각각에 대하여 항체 제제(항체 농도 7.54mg/mL, 150mmol/L arginine, 20mmol/L histidine-aspartic acid, pH 6.0)를 조제했다. SAXS 측정에는, SAXSess mc2 system(Anton Paar, Graz, Austria)의 라인-콜리메이션된 X선(CuKα, λ=0.1542nm)을 이용했다. 측정 온도는 25℃로 했다. 검출에는 2차원 이미징 플레이트를 이용했다. X선 조사 시간은 30분으로 했다. 2차원의 산란 강도는 SAXSQuant software(Anton Paar)를 이용하여 1차원의 산란 강도 I(q)로 변환했다. 여기에서, q는 산란 벡터이며, q=(4π/λ)sin(θ/2)로 정의된다. θ는 산란각이다. 산란 곡선은, 빔 스토퍼를 투과한 q=0에 있어서의 산란 강도로 규격화한 후, 블랭크(캐필러리와 Buffer) 보정과 광학계(디스미어) 보정을 행했다. 보정 후의 산란 곡선에 대해서, q×Rg<1.3을 만족시키는 조건하에서 Guinier plot을 행하여, 관성 반경 Rg(nm)를 구했다. 단, 소각측에서 산란 강도의 저하가 나타나는 경우는, 입자간 반발의 기여를 피하기 위해서, 그와 같은 q의 영역을 제외하고 Guinier plot을 행했다. 입자간 상호작용이 없다고 가정하는 계(구조 인자 S(q)=1)에서는, 산란 강도 I(q)는 2체 거리 분포 함수 p(r)의 푸리에 변환으로서 주어진다. 보정 후의 산란 곡선에 대해서 간접 푸리에 변환법(비특허문헌 9)을 적용하여, 입자의 p(r)을 얻었다. p(r)의 x축 절편으로부터 최대 길이 Dmax(nm)를 얻었다. 한편, 측정은 에미시주맙 항체 제제(Main)와 Protected Disulfide Isoform 항체 제제(BiAb3)에서 각각 3회 행했다.

그 결과, Protected Disulfide Isoform의 Rg의 평균치는 4.8nm 이하(에미시주맙보다 0.3nm 이상 작은 값), Dmax의 평균치는 16.5nm 이하(에미시주맙보다 1.4nm 이상 작은 값)로, 에미시주맙에 비해, Rg의 평균치로 6% 이상 작고, Dmax의 평균치로 7.5% 이상 작은 값을 나타냈다. 에미시주맙과 동일한 서브클래스의 IgG4 항체 분자의 Dmax는, 2개의 Fab 도메인의 선단의 거리에 상당함이 보고되어 있으므로(비특허문헌 10), Protected Disulfide Isoform에 있어서는 2개의 Fab 도메인의 선단의 거리가 짧아져 있고, 이것에 의해, 분자의 중심으로부터의 퍼짐을 의미하는 Rg도 작은 값을 나타낸 것이라고 생각된다. 이상으로부터, Protected Disulfide Isoform은 에미시주맙보다도 J쇄-Q쇄의 N말단간의 거리가 짧은 분자 구조를 취함이 확인되었다(도 8). 2종류의 항원간의 상호작용을 중개하는 이중 특이성 항체에 있어서는, 입체 구조상, Fab 도메인간의 거리가 항원끼리의 상호작용에 결정적으로 중요한 역할을 한다고 상상된다. 따라서, 의약 조성물 중의 해당 아이소폼의 비율을 제어하는 것은, 에미시주맙뿐만 아니라, 이중 특이성 항체 의약 일반에 있어서 중요하다.

〔실시예 10〕 HDX-MS(Hydrogen. Deuterium eXchange Mass Spectrometry)의 분자 구조의 분석

에미시주맙 및 Protected Disulfide Isoform의 각각에 대하여 항체 제제(항체 농도 1mg/mL, 150mmol/L arginine, 20mmol/L histidine-aspartic acid, pH 6.0)를 조제하고, HDX-MS 장치(Orbitrap Fusion Lumos(Thermo Fisher Scientific), UltiMate30000RSLCnano(Thermo Fisher Scientific) with HDX-PAL(LEAP Technologies))에 의한 HDX-MS 측정(중수소 교환 시간 30s, 60s, 120s, 240s, 480s, 960s, 1920s 및 3840s의 측정)을 행했다.

그 결과, Q쇄에 있어서의 EU 넘버링 146위로부터 174위(서열 번호 10의 N말단측으로부터 152번째로부터 180번째)의 아미노산 잔기 및 J쇄에 있어서의 EU 넘버링 146위로부터 174위(서열 번호 11의 N말단측으로부터 148번째로부터 176번째)의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드에서, HDX-MS 측정에 있어서의 중수 교환율(D%)의 차가 현저했다. 이 결과로부터, Protected Disulfide Isoform은 에미시주맙과 비교하여, 당해 영역의 구조가 변화하고 있음이 확인되었다(도 9).

본 발명의 항체 배리언트 및 아이소폼은, 에미시주맙과 비교하여 FVIII양 활성이 극히 낮아, 에미시주맙을 포함하고 또한 그들 항체 배리언트 및 아이소폼의 함유율이 낮게 억제된 본 발명의 의약 조성물은, 혈우병의 치료 수단으로서 유용하다. 또한, 본 발명의 항체 배리언트 및 아이소폼의 분석 방법은, 에미시주맙 제제의 품질 평가에 유용한 데다가, 항체 배리언트 및 아이소폼의 함유율이 억제된 에미시주맙 제제의 개발이나, 항체 배리언트 및 아이소폼의 생성을 억제하는 방법의 개발에 있어서도 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> ANTIBODY VARIANT AND ISOFORM WITH LOWERED BIOLOGICAL ACTIVITY <130> C1-A1719P <150> JP 2017-212179 <151> 2017-11-01 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region CDR1 <400> 1 Tyr Tyr Asp Ile Gln 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region CDR2 <400> 2 Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region CDR3 <400> 3 Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region CDR1 <400> 4 Asp Asn Asn Met Asp 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region CDR2 <400> 5 Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe Gln 1 5 10 15 Asp <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region CDR3 <400> 6 Arg Lys Ser Tyr Gly Tyr Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region CDR1 <400> 7 Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Gln Leu Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region CDR2 <400> 8 Gln Ala Ser Arg Lys Glu Ser 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region CDR3 <400> 9 Gln Gln Tyr Ser Asp Pro Pro Leu Thr 1 5 <210> 10 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30 Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val 195 200 205 Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 210 215 220 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Gln Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 <210> 11 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn 20 25 30 Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Ile Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Lys Ser Tyr Gly Tyr Tyr Leu Asp Glu Trp Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 <210> 12 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain <400> 12 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Gln 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gln Ala Ser Arg Lys Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Pro Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 13 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30 Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn 20 25 30 Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Ile Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr His Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Lys Ser Tyr Gly Tyr Tyr Leu Asp Glu Trp Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region <400> 15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Gln 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gln Ala Ser Arg Lys Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Pro Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims

아미노산 서열 SISPSGQSTYYRREVKG(서열 번호 2)를 포함하는 가변 영역을 갖는 항체의 배리언트로서,
(a) 상기 서열의 N말단측으로부터 12번째의 위치에 있어서의 아미노산 잔기 R; 또는
(b) 상기 서열의 N말단측으로부터 10∼12번째의 위치에 있어서의 아미노산 잔기 YYR
이 결손되고 당해 가변 영역이 당해 결손 부위에서 절단되어 있는, 항체 배리언트.
제 1 항에 있어서,
상기 서열이 CDR 서열인, 항체 배리언트.
제 1 항에 있어서,
상기 서열이 CDR2 서열인, 항체 배리언트.
제 1 항에 있어서,
상기 서열이 중쇄에 포함되는 서열인, 항체 배리언트.
제 1 항에 있어서,
이중 특이성(Bi-specific) 항체의 배리언트인, 항체 배리언트.
제 1 항에 있어서,
에미시주맙의 배리언트인, 항체 배리언트.
아미노산 서열 SISPSGQSTYYRREVKG(서열 번호 2)를 포함하는 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 시료를, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 순상 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 전하에 기초하는 분리, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC), 겔 침투 크로마토그래피(GPC), 또는 그들의 조합에 의해 분리하는 공정을 포함하는, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 배리언트의 검출 방법.
제 7 항에 있어서,
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 배리언트를 표준품으로서 사용하는, 검출 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 배리언트를 포함하는 의약 조성물로서, 해당 의약 조성물 중의 전체 항체 분자에 있어서의 해당 항체 배리언트의 비율이 5% 이하인, 의약 조성물.
제 9 항에 있어서,
항체가 에미시주맙인, 의약 조성물.
제 9 항에 있어서,
양이온 교환 크로마토그래피(CEX)에 의한 정제를 포함하는 정제 공정에 의해 얻어지는, 의약 조성물.
항체 산생 세포를 pH 7.1 이상 또한/또는 배양 온도 36℃ 이하에서 배양하는 공정을 포함하는, 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 배리언트의 생성을 억제하는 방법.
제 1 중쇄 및 제 2 중쇄를 포함하는 이중 특이성 항체의 아이소폼으로서,
(1a) 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 144위의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 200위의 시스테인 사이; 및
(1b) 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 200위의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 144위의 시스테인 사이
에 있어서 다이설파이드 결합을 형성하고 있거나, 혹은
(2a) 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 226위의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 229위의 시스테인 사이; 및
(2b) 제 1 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 229위의 시스테인과, 제 2 중쇄에 있어서의 EU 넘버링 226위의 시스테인 사이
에 있어서 다이설파이드 결합을 형성하고 있는, 이중 특이성 항체 아이소폼.
제 13 항에 있어서,
상기 (1a) 및 (1b)에 있어서 다이설파이드 결합을 형성하고 있는, 이중 특이성 항체 아이소폼.
제 1 중쇄 및 제 2 중쇄를 포함하는 이중 특이성 항체의 아이소폼으로서, 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 분리했을 경우에 상기 이중 특이성 항체보다도 알칼리성측의 영역에서 용출되는 것을 특징으로 하는, 이중 특이성 항체 아이소폼.
제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
에미시주맙의 아이소폼인, 이중 특이성 항체 아이소폼.
이중 특이성 항체를 포함하는 시료를, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 순상 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 전하에 기초하는 분리, 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC), 겔 침투 크로마토그래피(GPC), 또는 그들의 조합에 의해 분리하는 공정을 포함하는, 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 아이소폼의 검출 방법.
제 17 항에 있어서,
제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 아이소폼을 표준품으로서 사용하는, 검출 방법.
제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 이중 특이성 항체 아이소폼을 포함하는 의약 조성물로서, 해당 의약 조성물 중의 전체 항체 분자에 있어서의 해당 항체 아이소폼의 비율이 2% 이하인, 의약 조성물.
양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하는 공정을 포함하는, 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 이중 특이성 항체 아이소폼의 함유율을 저감 하는 방법.
제 1 항, 제 13 항 또는 제 15 항에 있어서,
항체의 생물 활성이 현저하게 저하되어 있는, 항체 아이소폼 또는 배리언트.