TW202120533A - 基於突變體ｃａｌｒ及ｊａｋ２之疫苗及其等之用途 - Google Patents

基於突變體ｃａｌｒ及ｊａｋ２之疫苗及其等之用途 Download PDF

Info

Publication number
TW202120533A
TW202120533A TW109140142A TW109140142A TW202120533A TW 202120533 A TW202120533 A TW 202120533A TW 109140142 A TW109140142 A TW 109140142A TW 109140142 A TW109140142 A TW 109140142A TW 202120533 A TW202120533 A TW 202120533A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
sequence identity
epitope
vector
calr
Prior art date
Application number
TW109140142A
Other languages
English (en)
Inventor
里卡多 阿塔爾
傑森 德哈特
賽琳娜 可漢
維諾德 克里斯納
詹妮弗 隆
克里斯帝 梅因
芭芭拉 桑德斯
曼努 塞普維達
帕特里克 威爾金森
羅蘭 札恩
Original Assignee
美商健生生物科技公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商健生生物科技公司 filed Critical 美商健生生物科技公司
Publication of TW202120533A publication Critical patent/TW202120533A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A61K39/001162—Kinases, e.g. Raf or Src
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/10—Protein-tyrosine kinases (2.7.10)
    • C12Y207/10002—Non-specific protein-tyrosine kinase (2.7.10.2), i.e. spleen tyrosine kinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/50—Vectors for producing vectors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本揭露提供疫苗、基於突變體CALR及JAK2序列之多肽及多核苷酸、載體、宿主細胞、病毒、及製造與使用其等的方法。本揭露亦提供誘發免疫反應之方法及治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F或CALR外顯子9突變體或JAK2V617F及CALR外顯子9突變體兩者，其中該方法包含複數次投予包含本文中所揭示之多核苷酸、多肽、或載體之組成物的任一者。

Description

基於突變體CALR及JAK2之疫苗及其等之用途
本揭露提供疫苗、基於突變體鈣網伴護蛋白(CALR)及Janus激酶2 (JAK2)序列之多肽及多核苷酸、載體、宿主細胞、病毒、及製造與使用其等的方法。
典型的骨髓增生性腫瘤(MPN)亦稱為BCR-ABL-MPN，是骨髓增生性病症中最常見的疾病。MPN的特徵在於過度生產具完整功能性的終末分化血液細胞。典型MPN已被分類為三個實體：真性紅血球增多症(PV)、原發性血小板血症(ET)、及原發性骨髓纖維化(PMF)，其具有常見的疾病相關併發症，諸如靜脈及動脈血栓形成、出血、及轉變成急性骨髓樣白血病(AML)。所有MPN實體均源自複製性擴增並產生幾乎所有骨髓樣細胞、及B及NK細胞的單一體突變造血幹細胞(HSC)。MPN HSC的複製性擴增伴隨單一或多譜系增生。
PV的特徵不僅在於過量之紅血球且主要涉及紅血球譜系，但亦與巨核細胞/顆粒球譜系的可變增生相關聯。ET的特徵在於血小板數增加伴隨巨核細胞增生，然而PMF係較為異質性的病症，其藉由骨髓纖維化（特別是膠原蛋白纖維過量）及巨核細胞增生的存在來定義。PMF中的骨髓增生起初主要在骨髓中且稍後擴增至髓外部位，諸如脾臟。疾病開始的診斷時常具有挑戰性，但2016版本的MPN世界衛生組織(WHO)診斷標準有助於定義MPN的分子、臨床及症狀表現。然而，在許多患者中，觀察到ET及PV進展成繼發性骨髓纖維化(MF)。此外，這三種病症之間的邊界並無法充分建立，特別是在ET與PMF之間。因此，過渡性實體可出現描述性疾病狀態，諸如在診斷時展示ET表型伴隨典型骨髓組織學之纖維化前PMF（或早期PMF），但具有進展成MF之高可能性及比起ET更差的預後。
超過50%的MPN患者具有JAK2V617F突變。此外，在大約60%的患有JAK2野生型原發性血小板增多症(ET)或原發性骨髓纖維化(PMF)的患者中發現在鈣網伴護蛋白(CALR)基因外顯子9中之突變。
在2005年，發現在JAK2之外顯子14中核苷酸1849的G至T體細胞突變。此突變導致在JAK2之假激酶域中密碼子617的纈胺酸取代成苯丙胺酸(V617F)。此突變可在大約70%的骨髓增生性腫瘤(MPN)中發現：95%的真性紅血球增多症(PV)及50%至60%的ET及PMF。JAK2V617F通常經歷從異型合子至同型合子的轉變，因為發生導致在染色體9短臂上可變大小區域之副本中性失異合性(9pLOH)之有絲分裂重組。JAK2V617F起源於多能性造血祖細胞，存在於所有骨髓譜系，且亦可在淋巴細胞主要是B細胞及自然殺手(NK)細胞及較為罕見及較後期的T細胞疾病中偵測到。JAK2V617F主要限於典型MPN，例外為難治性貧血伴隨環形鐵粒幼細胞及血小板增多症(RARS T)。然而，在正常族群（包括新生兒）中，已偵測到非常低水準（低於1%）的JAK2V617F。其係與老化相關聯之複製性造血（未定潛能的複製性造血）中最常發現的突變之一。JAK2V71F突變之存在導致組成性活化信號傳導因子及轉錄活化子(STAT)傳訊，導致增加的細胞增生、活化、及自分泌/旁分泌釋放。在患有心血管適應症之患者中，亦已識別出JAK2V617F突變。
在2013年，在JAK2基因之V617F突變(JAK2V617F)及血小板生成素受體(MPL)基因之突變陰性的原發性血小板血症(ET)及原發性骨髓纖維化(PMF)患者中識別出CALR基因外顯子9之讀框移位突變。識別出超過50個讀框移位突變，其中＞85%導致相同的44個胺基酸突變體C端尾。C端尾的突變移除KDEL模體，導致喪失內質網(ER)保留且轉位至細胞表面膜。此外，突變體版本的CALR具有帶正電C端尾，其破壞Ca2+結合且限制典型功能。二個最常見的CALR突變對應於亦稱為第1型之52 bp刪除(p.L367fs*46)及亦稱為第2型之5 bp插入(p.K385fs*47)。ET及PMF的第1型與第2型突變之間的頻率有高度差異：在ET中，第1型及第2型突變係接近地分布（55%對比35%），然而在PMF中，大多以第1型為主（75%對比15%）。綜上所述，這些結果指示突變體CALR係致癌驅動因子且CALRmut經由MPL-JAK2-STAT傳訊途徑誘發轉變。
MPN患者具有高症狀負荷、危及生命的併發症、及進展至急性白血病的風險，同時亦具有有限的治療選項。MPN患者治療最佳分成觀察、醫學療法、及同種異體幹細胞移植(allo-SCT)之類別。醫學療法本身屬於細胞減滅劑、單一劑JAK抑制劑、及免疫調節劑干擾素(IFN)-α之類別。特別用於MPN患者之目前標準照護且為唯一經核准之治療劑係小分子JAK1/2抑制劑JAKAFI® （魯索替尼(ruxolitinib)）。JAKAFI® （魯索替尼）係第一個用於中至高風險PMF及真性紅血球增多症後骨髓纖維化(PPV-MF)及原發性血小板血症後骨髓纖維化(PET-MF)之靶向性美國食品藥物管理局(FDA)核准藥物，但最近也獲得核准用於PV及移植物抗宿主病(GVHD)患者族群。在COMFORT-I及COMFORT-II研究中已建立療效且顯示顯著的脾臟大小減少作為主要終點。然而，3年涉及約50%及5年75%的患者因為喪失反應、疾病進展、及治療相關不良事件而中止。JAKAFI® （魯索替尼）療法在MF患者中亦與增加侵略性B細胞淋巴瘤風險相關聯。事實上，在107位MF患者中止JAKAFI® （魯索替尼）治療的研究中，中位整體存活期僅14個月。雖然有患者子集可因JAKAFI® （魯索替尼）使用而衍生存活優點，但大部分MPN患者的疾病持續進展。
本揭露提供一種多肽，其包含下列中至少二或更多個表位序列：SEQ ID NO: 6 (FCGDENILV)之Janus激酶2 (JAK2)表位、SEQ ID NO: 5(VLNYGVCFC)之JAK2表位、SEQ ID NO: 4 (KLSHKH LVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG)之JAK2表位、SEQ ID NO: 1 (MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE)之鈣網伴護蛋白(CALR)表位、及SEQ ID NO: 2 (EEAEDNCRRMMRTK)之CALR表位。
本揭露亦提供一種多肽，其包含二或更多個重複的SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，多肽包含2、3、4、5、或超過5個重複的由連接子序列諸如AAY、RR或DPP、HHAA、HHA、HHL、RKSYL、RKSY、SSL、或REKR隔開之SEQ ID NO: 6。
本揭露亦提供SEQ ID NO:28 (FCGDENILVAA YFCGDENILV)之多肽，其包含二個由非天然連接子序列AAY連接之SEQ ID NO: 6之多肽。
本揭露亦提供編碼在本文中揭示之多肽之多核苷酸及包含編碼在本文中揭示之多肽之多核苷酸之載體。
本揭露亦提供誘發免疫反應之方法及治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F或CALR外顯子9突變體或JAK2V617F及CALR外顯子9突變體兩者，該方法包含向有此需要之對象投予本文中所揭示之多核苷酸、多肽、或載體的任一者。
本揭露亦提供誘發免疫反應之方法及治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F或CALR外顯子9突變體或JAK2V617F及CALR外顯子9突變體兩者，其中該方法包含複數次投予包含本文中所揭示之多核苷酸、多肽、或載體之組成物的任一者。
本揭露亦提供投予抗CTLA-4抗體、抗PD-1、或抗PD-L1抗體與包含本文中所揭示之多核苷酸、多肽、或載體之組成物的任一者之組合。
本揭露亦提供誘發免疫反應之方法及治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F或CALR外顯子9突變體或JAK2V617F及CALR外顯子9突變體兩者，其中該方法包含向有此需要之對象投予二或更多次載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 6 (FCGDENILV)之JAK2表位、SEQ ID NO: 5 (VLNYGVCFC)之JAK2表位、SEQ ID NO: 1 (MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCRE ACLQGWTE)之CALR表位、及SEQ ID NO: 2 (EEAEDNCRRMMRTK)之CALR表位的多核苷酸；其中該載體係Ad26、GAd20、MVA、或自我複製RNA。
在一些實施例中，誘發免疫反應之方法及治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含向有此需要之對象投予二或更多次載體，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F或CALR外顯子9突變體或JAK2V617F及CALR外顯子9突變體兩者，該載體包含編碼多肽之多核苷酸，該多肽包含二或更多個重複的SEQ ID NO: 6；其中該載體係Ad26、GAd20、MVA、或自我複製RNA。
本揭露亦提供用於治療或預防對象的骨髓增生性疾病之方法，其中該方法包含向有此需要之對象投予二或更多次載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 6 (FCGDENILV)之JAK2表位、SEQ ID NO: 5 (VLNYGVCFC)之JAK2表位、SEQ ID NO: 1 (MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREAC LQGWTE)之CALR表位、及SEQ ID NO: 2 (EEAEDNCRRMMRTK)之CALR表位的多核苷酸；其中該載體係Ad26、GAd20、MVA、或自我複製RNA。
定義
所有在本說明中引用、包括但不限於專利及專利申請文件之發表文獻在此全部併入作為參照。
應理解的是，本文中所使用的用語僅用於描述特定實施例，且不意欲為限制性。除非另有定義，否則本文使用之所有技術及科學用語，均與具有本發明有關技藝之通常知識者所一般了解之意義相同。
雖然任何類似或等效於本文中所述者之方法及材料可用於測試本發明之實務中，本文中仍描述例示性材料及方法。在描述及請求本發明時，將使用下列用語。
於本說明書及隨附的申請專利範圍中，除非內文另有明確說明，否則單數形式的「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱。因此，例如對於「一細胞(a cell)」之指稱包括兩或更多個細胞之組合與類似者。
「約(about)」意指在特定值的可接受誤差範圍內，如所屬技術領域中具有通常知識者所判定，其將部分地取決於該值是如何測量或判定的，即測量系統的限制。除非在實例或說明書中的其他地方在一特定檢定、結果或實施例的上下文中另有明確說明，「約(about)」意指根據本領域的實務在一個標準偏差內，或者至多5%的範圍，以較大者為準。
「佐劑(adjuvant)」及「免疫刺激劑(immune stimulant)」在本文中可互換使用，且係定義為造成免疫系統刺激之一或多種物質。在此背景下，佐劑係用來增強對本揭露之疫苗的免疫反應。
「替代支架(alternative scaffold)」係指一種單鏈蛋白質架構，其含有與具有高構形容許度之可變域相關聯的結構化核心。該等可變域容許變異引入而不會減損支架完整性，因而該等可變域可經工程改造且經選擇以結合至特定抗原。
「抗原呈現細胞(antigen presenting cell)」(APC)係指在其表面上呈現與主要組織相容性複合體分子相關聯之抗原的任何細胞，主要組織相容性複合體分子係MHC I類或MHC II類分子、或兩者。
「抗體(antibody)」係指免疫球蛋白分子，包括單株抗體（包括鼠類、人類、人源化(humanized)、及嵌合單株抗體）、抗原結合片段、雙特異性或多特異性抗體、二聚體、四聚體、或多聚體抗體、單鏈抗體、域抗體、及任何其他包含具有所需特異性之抗原結合位的免疫球蛋白分子之修飾組態。
「抗原結合片段(antigen-binding fragment)」係指免疫球蛋白分子之保留親系全長抗體之抗原結合特性的部分。例示性抗原結合片段係重鏈互補決定區(HCDR) 1、2、及/或3、輕鏈互補決定區(LCDR) 1、2、及/或3、VH、VL、VH及VL、Fab、F(ab')2、Fd、及Fv片段、以及由一個VH域或一個VL域所組成的域抗體(dAb)。VH及VL域可經由合成連接子連接在一起以形成各種類型的單鏈抗體設計，其中VH/VL域會進行分子內配對，或者在VH及VL域係由分開之鏈所表現之情況下則會進行分子間配對，以形成單價抗原結合位，諸如單鏈Fv (scFv)或雙價抗體(diabody)；描述於例如國際專利公開號WO1998/44001、國際專利公開號WO1988/01649、國際專利公開號WO1994/13804、或國際專利公開號WO1992/01047中。
連接詞「包含(comprising)」、「基本上由...組成(consisting essentially of)」、及「由...組成(consisting of)」意欲意味著彼等在專利語言中一般公認的意義；亦即，(i)「包含(comprising)」與「包括(including)」、「含有(containing)」、或「其特徵在於(characterized by)」同義，係包括式或開放式，且不排除額外、未列舉之元件或方法步驟；(ii)「由…組成」排除請求項中未指明的任何元件、步驟、或成分；且(iii)「基本上由…組成」將請求項的範疇限制在所指明的材料或步驟「及不實質影響（所請發明的）（多個）基本及新穎特徵者」。以片語「包含」（或其均等詞）描述的實施例亦提供以「由…組成」及「基本上由…組成」所獨立描述之實施例。
「CALR」係指人類鈣網伴護蛋白。人類CALR蛋白質包含如例如UniProt編號P27797所示之胺基酸序列。
「下游環(Downstream loop)」或「DLP模體(DLP motif)」係指包含至少一個RNA莖環之多核苷酸序列，當其被置於開讀框(ORF)之起始密碼子下游時，相較於不具DLP模體之其他都相同的建構體提供增加的ORF轉譯。
當與免疫反應有關時，「增強(enhance)」或「誘發(induce)」係指增加免疫反應之規模及/或效率或延長免疫反應之持續時間。該等用語可與「提升(augment)」互換使用。
如本文中所使用，「表位序列(epitope sequence)」係指被免疫系統，例如，抗體、B細胞（例如B淋巴細胞）及/或T細胞辨識之多肽或胺基酸序列的一部分，例如多肽或胺基酸序列之一級、二級、三級、或四級結構的一部分。
「表現載體(expression vector)」係指可在生物系統或重構生物系統中用以指引多肽轉譯的載體，該多肽係由存在於該表現載體中之多核苷酸序列所編碼。
「促進子元件(facilitator element)」係指可操作地連接至多核苷酸或多肽之多核苷酸或多肽元件，且包括啟動子、增強子、多腺核苷酸化信號、終止密碼子、蛋白質標籤（諸如組胺酸標籤）、及類似者。
「異源(heterologous)」係指二或更多個多核苷酸或二或更多個多肽，其等本質上彼此找不到相同關係。
「免疫原性片段(immunogenic fragment)」係指當片段與MHC I類或MHC II類分子複合時，由細胞毒性T淋巴球、輔助T淋巴球、或B細胞辨識之多肽。
「框內(in-frame)」係指第一多核苷酸中的密碼子讀框係與連接在一起以形成多核苷酸之第二多核苷酸中的密碼子讀框相同。框內多核苷酸編碼由第一多核苷酸及第二多核苷酸兩者所編碼之多肽。
「免疫原性的(immunogenic)」係指包含一或多種免疫原性片段之多肽。
「免疫反應(immune response)」係指由脊椎動物對象之免疫系統對免疫原性多肽或多核苷酸或片段的任何反應。例示性免疫反應包括局部及全身性細胞免疫以及體液免疫，諸如細胞毒性T淋巴球(CTL)反應（包括CD8+ CTL之抗原特異性誘發）、輔助T細胞反應（包括T細胞增生反應及細胞介素釋放）、及B細胞反應（包括抗體反應）。
「與...組合(in combination with)」意指將二或更多種治療劑一起以混合物形式投予至對象，其係並行以單劑投予或以任何順序以單劑依序投予。
「經單離(isolated)」係指已自產出該分子的系統（諸如重組細胞）的其他組分實質上分離及/或純化出之均質分子族群（諸如合成多核苷酸或多肽）、以及已經受至少一次純化或單離步驟的蛋白質。「經單離」係指實質上不含其他細胞材料及/或化學物之分子，且涵蓋經單離成更高純度之分子，諸如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%純度。
「JAK2」係指人類Janus激酶2。人類JAK2蛋白質包含如例如UniPort編號O060674所示之胺基酸序列。
「突變體CALR (mutant CALR)」係指獲取一或多個外顯子9突變之CALR。
「突變體JAK2 (mutant JAK2)」係指獲取V617F突變之JAK2。
「非天然存在(non-naturally occurring)」係指不存在於自然中之分子。
「可操作地連接(operatively linked)」之序列係指鄰接所調節之核酸序列及在異側作用之調節序列的表現控制序列、或在遠處控制所調節核酸序列的表現控制序列兩者。
「費城染色體(Philadelphia chromosome)」或「Ph」係指眾所周知之染色體9與22之間的染色體易位，導致致癌BCR-ABL基因與組成性活性酪胺酸激酶活性融合。易位導致來自染色體22q11之BCR基因的一部分變得與來自染色體9q34之ABL基因的一部分融合，且經指定為t(9;22)(q34;q11)，遵照人類細胞遺傳命名國際系統(ISCN)。取決於融合的精確位置，所得之融合蛋白之分子量可自185至210 kDa不等。「費城染色體」係指所有因(9; 22)(q34; q11)易位所形成的BCR-ABL融合蛋白。
「多核苷酸(polynucleotide)」係指包含以糖-磷酸主鏈或其他等效共價化學結構所共價連接之核苷酸鏈的分子。多核苷酸之實例包括RNA及DNA。
「多肽(polypeptide)」或「蛋白質(protein)」係指包含至少二個以肽鍵連接之胺基酸殘基以形成多肽的分子。
疾病或病症之「預防(prevent/preventing/prevention/prophylaxis)」意指預防病症在對象中發生。
「初免-加強(prime-boost)」或「初免-加強方案(prime-boost regimen)」係指一種治療對象之方法，其涉及用第一疫苗引發T細胞反應，接著用第二疫苗加強該免疫反應。第一疫苗及第二疫苗一般係不同的。此等初免-加強免疫法誘發之免疫反應較用相同疫苗來引發及加強所能達成的高度及寬度更大。初免步驟啟動記憶細胞而加強步驟擴大記憶反應。加強可發生一次或多次。
「重組(recombinant)」係指藉由重組方式製備、表現、建立、或單離之多核苷酸、多肽、載體、病毒、及其他巨分子。
「難治性(refractory)」係指對治療沒有反應的疾病。難治性疾病可在治療之前或在開始治療時對該治療具有抗性，或者難治性疾病可在治療期間變成具有抗性。
「復發(relapsed)」係指在先前用治療劑治療後的一段時間改善之後，疾病或疾病之徵象及症狀的回歸。
「複製子(replicon)」係指能夠引導其自身之拷貝產生的病毒核酸，且包括RNA以及DNA。例如，動脈炎病毒(arterivirus)基因體之雙股DNA版本可用來產生構成動脈炎病毒複製子之單股RNA轉錄本。通常而言，病毒複製子含有病毒之完整基因體。
「RNA複製子」（或「自我複製RNA」、或「自我複製RNA分子」、或「srRNA」）係指含有在容許病毒感染細胞(permissive cell)內引導其自身之擴增或自我複製所必需之所有基因資訊的RNA分子。為了引導其自身之複製，RNA分子：1)編碼聚合酶、複製酶、或其他可與病毒或宿主細胞衍生蛋白質、核酸、或核醣核蛋白交互作用之其他蛋白質，以催化RNA擴增程序；及2)含有複製及轉錄複製子編碼之RNA所必需之順式作用(cis-acting) RNA序列。自我複製RNA分子一般係衍生自正股RNA病毒之基因體，且可用作為藉由置換編碼結構或非結構基因之病毒序列、或插入編碼結構或非結構基因之序列的外來序列5’或3’而將外來序列引入宿主細胞之基底。可將外來序列引入α病毒之次基因體區域。可將自我複製RNA分子包裝於重組病毒顆粒（諸如重組α病毒顆粒）中，或替代地使用脂質奈米粒子(LNP)將其遞送至宿主。自我複製RNA之大小可係至少1 kb、或至少2 kb、或至少3 kb、或至少4 kb、或至少5 kb、或至少6 kb、或至少7 kb、或至少8 kb、或至少10 kb、或至少12 kb、或至少15 kb、或至少17 kb、或至少19 kb、或至少20 kb，或者大小可係100 bp至8 kb、或500 bp至8 kb、或500 bp至7 kb、或1至7 kb、或1至8 kb、或2至15 kb、或2至20 kb、或5至15 kb、或5至20 kb、或7至15 kb、或7至18 kb、或7至20 kb。自我複製RNA係描述於例如WO2017/180770、WO2018/075235、及WO2019143949A2中。
「特異性結合(specifically binds/secific binding/specifically binding)」或「結合(bind)」係指蛋白質分子以比對其他抗原更大之親和力結合至抗原或抗原內之表位。一般而言，蛋白質分子以下列平衡解離常數(KD)結合至抗原或抗原內的表位：約1×10-7 M或更小，例如約5×10-8 M或更小、約1×10-8 M或更小、約1×10-9 M或更小、約1×10-10 M或更小、約1×10-11 M或更小、或約1×10-12 M或更小，一般以小於其結合至非特異性抗原（例如BSA、酪蛋白）之KD至少一百倍的KD結合。在本文所述之分子的背景下，「特異性結合(specific binding)」係指蛋白質分子與CALR/JAK2突變體多肽、CALR突變體多肽、或JAK2突變體多肽單獨或與HLA複合時結合，而不與野生型CALR或JAK2單獨或與HLA複合時可偵測地結合。
「次基因體RNA (subgenomic RNA)」係指長度或大小小於其所衍生自之基因體RNA的RNA分子。病毒次基因體RNA可自內部啟動子轉錄，該內部啟動子之序列位於基因體RNA或其互補物之內。次基因體RNA的轉錄可藉由與宿主細胞編碼蛋白質、（多個）核糖核蛋白、或其組合相關聯之（多個）病毒編碼聚合酶來媒介。許多RNA病毒產生用於表現其3'-近端基因之次基因體mRNA (sgRNA)。病毒次基因體RNA可自內部啟動子轉錄，該內部啟動子之序列位於基因體RNA或其互補物之內。次基因體RNA的轉錄可藉由與宿主細胞編碼蛋白質、（多個）核糖核蛋白、或其組合相關聯之（多個）病毒編碼聚合酶來媒介。
「次基因體複製子(subgenomic replicon)」係指病毒核酸，其含有基因之非完整互補及病毒基因體之其他特徵，但又能夠引導其自身拷貝之產生。例如，動脈炎病毒之次基因體複製子可含有病毒非結構蛋白之大多數基因，但遺漏編碼結構蛋白之大多數基因。次基因體複製子能夠引導病毒次基因體之複製（次基因體複製子之複製）所必需的所有病毒基因之表現，而無需生產病毒顆粒。
「對象(subject)」包括任何人類或非人類動物。「非人類動物(nonhuman animal)」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長類、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬蟲動物等。用語「對象」與「患者(patient)」在本文中可互換使用。
疾病或病症（諸如癌症）之「治療(treat/treating/treatment)」係指達成下列一或多者：減少病症之嚴重性及/或持續時間、抑制所治療病症特有之症狀的惡化、限制或預防病症於先前已患有該病症之對象中復發、或限制或預防症狀於先前已有該病症症狀之對象中復發。
「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指有效達成所欲治療成果所需之劑量及時間段的量。治療有效量可依不同因素而異，諸如個體之疾病狀態、年齡、性別、及體重、以及治療劑或治療劑的組合在個體中誘發所欲反應的能力。有效的治療劑或治療劑組合之例示性指標包括例如對象之幸福感改善。
「疫苗(vaccine)」係指一種組成物，其包含一或多種免疫原性多肽、編碼免疫原性多肽之多核苷酸或片段、包含編碼免疫原性多肽之多核苷酸的載體、或其任何組合並經刻意投予以在接受者（例如，對象）中誘發後天免疫力。
「載體(vector)」係指在生物系統內能夠被複製或者可在此等系統之間移動的多核苷酸。載體聚核苷酸一般含有作用為促進這些聚核苷酸在生物系統中的複製或維持的元素，諸如複製源、多腺核苷酸化信號或選擇標記。此等生物系統的實例可包括細胞、病毒、動物、植物、及利用能夠複製載體之生物組件的重構生物系統(reconstituted biological system)。包含載體之聚核苷酸可為DNA或RNA分子或這些分子的雜交物。
「病毒載體(viral vector)」係指一種載體建構體，其包括至少一種病毒來源的多核苷酸元件，且具有被包裝成病毒載體顆粒之能力。
「變體(variant)」、「突變體(mutant)」、或「經改變(altered)」係指因一或多個修飾（例如一或多個取代、插入、或缺失）而與參考多肽或參考多核苷酸不同的多肽或多核苷酸。多肽
本文揭示可誘發對象的免疫反應之包含突變體CALR及突變體JAK2之表位序列的多肽。在一些實施例中，多肽可包含選自由下列所組成之群組的至少二或更多個表位序列： ●    SEQ ID NO: 1 (MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRR TRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE)或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 2 (EEAEDNCRRMMRTK)或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 4 (KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG)或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 5 (VLNYGVCFC)或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 6 (FCGDENILV)或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之JAK2表位；及其組合。
在一些實施例中，本揭露提供包含下列之表位序列的多肽：SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之CALR表位；SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位；及SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性之JAK2表位。SEQ ID NO: 1、2、及4之表位序列可以任何順序存在且可由連接子隔開。例示性連接子序列包括AAY、RR、DPP、HHAA、HHA、HHL、RKSYL、RKSY、SSL、或REKR。
在一些實施例中，本揭露提供包含下列之表位序列的多肽：SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之Janus激酶2 (JAK2)表位、SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之鈣網伴護蛋白(CALR)表位、及SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位。SEQ ID NO: 6、1、及2之表位序列可以任何順序存在且可由連接子隔開。例示性連接子序列包括AAY、RR、DPP、HHAA、HHA、HHL、RKSYL、RKSY、SSL、或REKR。
在一些實施例中，本揭露亦提供包含下列之表位序列的多肽：SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之Janus激酶2 (JAK2)表位、SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性之JAK2表位、SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之鈣網伴護蛋白(CALR)表位、及SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位。SEQ ID NO: 6、5、1、及2之表位序列可以任何順序存在且可由連接子諸如AAY、RR、DPP、HHAA、HHA、HHL、RKSYL、RKSY、SSL、或REKR隔開。
本揭露亦提供包含下列胺基酸序列一或多者的多肽：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 31、或其免疫原性片段。
在一些實施例中，本揭露提供一種多肽，其包含SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO: 3具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露提供一種多肽，其包含SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露提供一種多肽，其包含SEQ ID NO: 7或與SEQ ID NO: 7具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露提供一種多肽，其包含SEQ ID NO: 9或與SEQ ID NO: 9具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露提供一種多肽，其包含SEQ ID NO: 10或與SEQ ID NO: 10具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露提供一種多肽，其包含SEQ ID NO: 11或與SEQ ID NO: 11具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露提供一種多肽，其包含SEQ ID NO: 12或與SEQ ID NO: 12具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露提供一種多肽，其包含SEQ ID NO: 13或與SEQ ID NO: 13具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露提供一種多肽，其包含SEQ ID NO: 14或與SEQ ID NO: 14具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露提供一種多肽，其包含SEQ ID NO: 15或與SEQ ID NO: 15具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露提供一種多肽，其包含SEQ ID NO: 28或與SEQ ID NO: 28具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露提供一種多肽，其包含SEQ ID NO: 31或與SEQ ID NO: 31具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，該多肽包含一種多肽，其包含SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。本揭露亦提供一種多肽，其包含二或更多個重複的SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，多肽包含2、3、4、5、或超過5個重複的SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，重複的SEQ ID NO: 6可由連接子隔開。例示性連接子序列包括AAY、RR或DPP、HHAA、HHA、HHL、RKSYL、RKSY、SSL、或REKR。
在一些實施例中，在本文中揭示之連接子可包含蛋白酶切割位點，以使多肽可在對象的體內切割成包含表位序列之肽片段，導致改善的免疫反應。
在一些實施例中，本揭露之多肽的N端可進一步包含前導序列或T細胞增強子序列(TCE)。前導序列可增加表現及/或增加免疫反應。例示性前導序列包括T2 淋巴細胞之TCR受體的α鏈(HAVT20) (MACPGFLWALVISTC LEFSMA; SEQ ID NO: 8)、泛素信號序列(Ubiq) (MQIFVKTLTGKTITLEVEP SDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGVR; SEQ ID NO: 54)、或T細胞增強子(TCE)序列，諸如來自鱖魚不變鏈之長度28aa之肽片段(MGQKEQIHTLQKNSERMSKQLTRSSQAV; SEQ ID NO: 29)。咸信前導序列可有助於增加對本文所揭示之表位的免疫反應。多核苷酸
本揭露亦提供多核苷酸，其編碼本文所揭示之多肽之任一者。
在一些實施例中，多核苷酸編碼包含選自由下列所組成之群組的至少二或更多個表位序列的多肽： ●    SEQ ID NO: 1 (MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRR TRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE)或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 2 (EEAEDNCRRMMRTK)或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 4 (KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG)或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 5 (VLNYGVCFC)或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 6 (FCGDENILV)或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之JAK2表位；及其組合。
在一些實施例中，本揭露提供編碼包含下列之表位序列的多肽之多核苷酸：SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之CALR表位；SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位；及SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性之JAK2表位。SEQ ID NO: 1、2、及4之表位序列可以任何順序存在且可由連接子隔開。
在一些實施例中，本揭露提供編碼包含下列之表位序列的多肽之多核苷酸：SEQ ID NO: 6 (FCGDENILV)或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之Janus激酶2 (JAK2)表位、SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之鈣網伴護蛋白(CALR)表位、及SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位。SEQ ID NO: 6、1、及2之表位序列可以任何順序存在且可由連接子隔開。
在一些實施例中，本揭露提供編碼包含下列之表位序列的多肽之多核苷酸：SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之Janus激酶2 (JAK2)表位、SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性之JAK2表位、SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之鈣網伴護蛋白(CALR)表位、及SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位。SEQ ID NO: 6、5、1、及2之表位序列可以任何順序存在且可由連接子隔開。
在一些實施例中，經單離之多核苷酸編碼多肽，其包含SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO: 3具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，經單離之多核苷酸編碼多肽，其包含SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，經單離之多核苷酸編碼多肽，其包含SEQ ID NO: 7或與SEQ ID NO: 7具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，經單離之多核苷酸編碼多肽，其包含SEQ ID NO: 12或與SEQ ID NO: 12具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，經單離之多核苷酸編碼多肽，其包含SEQ ID NO: 13或與SEQ ID NO: 13具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
在一些實施例中，經單離之多核苷酸編碼多肽，其包含SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列。
本揭露亦提供一種經單離之編碼多肽之多核苷酸，該多肽包含二或更多個重複的SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，多核苷酸編碼包含2、3、4、5、或超過5個重複的SEQ ID NO: 6的多肽。在一些實施例中，重複的SEQ ID NO: 6可由連接子隔開。
在一些實施例中，多核苷酸係選自由下列所組成之群組：
SEQ ID NO: 16或與SEQ ID NO: 16具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之核酸序列；
SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之核酸序列；
SEQ ID NO: 18或與SEQ ID NO: 18具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之核酸序列；
SEQ ID NO: 19或與SEQ ID NO: 19具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之核酸序列；
SEQ ID NO: 20或與SEQ ID NO: 20具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之核酸序列；
SEQ ID NO: 21或與SEQ ID NO: 21具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之核酸序列；
SEQ ID NO: 22或與SEQ ID NO: 22具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之核酸序列；
SEQ ID NO: 26或與SEQ ID NO: 26具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之核酸序列；及
SEQ ID NO: 27或與SEQ ID NO: 27具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之核酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸包含DNA。
在一些實施例中，多核苷酸包含RNA。
在一些實施例中，RNA係mRNA或自我複製RNA。
在一些實施例中，多核苷酸包含啟動子、增強子、多腺核苷酸化位點、Kozak序列、終止密碼子、或其任何組合。
產生本揭露之多核苷酸之方法在所屬技術領域中係已知的，且包括化學合成、酶合成（例如，體外轉錄）、較長前驅物之酶或化學切割、多核苷酸之較小片段的化學合成接著該等片段之連接、或已知的PCR方法。可將待合成之多核苷酸序列設計為針對所欲胺基酸序列具有適當之密碼子。通常而言，較佳密碼子可針對預期宿主來加以選擇，該序列在該宿主將用於表現。載體
本揭露亦提供載體，其包含本文所揭示之多核苷酸之任一者。本揭露亦提供載體，其包含編碼本文所揭示之多肽之任一者的多核苷酸。
在一些實施例中，載體包含多核苷酸，該多核苷酸編碼包含選自由下列所組成之群組的至少二或更多個表位序列的多肽： ●    SEQ ID NO: 1 (MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRR TRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE)或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 2 (EEAEDNCRRMMRTK)或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 4 (KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG)或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 5 (VLNYGVCFC)或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 6 (FCGDENILV)或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之JAK2表位；及其組合。
載體可為意欲用於在任何宿主（諸如細菌、酵母、或哺乳動物）中表現本揭露之多核苷酸的載體。合適之表現載體一般在宿主生物中可複製作為游離基因體(episome)或宿主染色體DNA的整體部分。常見的是，表現載體含有選擇標記，諸如安比西林(ampicillin)抗性、潮黴素(hygromycin)抗性、四環素抗性、康黴素(kanamycin)抗性、或新黴素抗性，以允許偵測經所欲DNA序列轉形或轉導的細胞。例示性載體係質體、黏質體、噬菌體、病毒載體、或人工染色體。
可使用的合適載體係細菌的：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., USA)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、及pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Sweden)。真核：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG (Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、及pSVL (Pharmacia)。
本揭露提供一種表現載體，其包含本揭露之多核苷酸。本揭露亦提供一種表現載體，其包含編碼本揭露之多肽的多核苷酸。
本揭露亦提供一種病毒載體，其包含本揭露之多核苷酸之任一者。
本揭露亦提供一種病毒載體，其包含編碼本揭露之多肽之任一者的多核苷酸。
病毒載體係衍生自天然存在之病毒基因體，其一般經修飾為無能力複製的(replication incompetent)，例如非複製的。非複製病毒需要提供蛋白質在異側(in trans)以供複製。一般而言，該等蛋白質會在病毒生產細胞系中穩定或暫時表現，藉以讓病毒能夠複製。因此，病毒載體一般具有感染性且係非複製的。病毒載體可係腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體（例如，AAV第5型及第2型）、大猿腺病毒載體(GAd)、α病毒載體（例如，委內瑞拉馬腦炎病毒(VEE)、Sindbis病毒(SIN)、Semliki森林病毒(SFV)、及VEE-SIN嵌合體）、疱疹病毒載體（例如，衍生自巨細胞病毒（像恆河猴巨細胞病毒(RhCMV)）之載體）、沙狀病毒載體（例如，淋巴球性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)載體）、麻疹病毒載體、痘病毒載體（例如，痘苗病毒、經修飾安卡拉痘苗病毒(MVA)、NYVAC（衍生自痘苗病毒之哥本哈根株）、及鳥類痘病毒載體（金絲雀痘病毒(ALVAC)及禽痘病毒(FPV)載體））、水疱性口炎病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、類病毒顆粒、及細菌孢子。
在一些實施例中，病毒載體係衍生自腺病毒、痘病毒、α病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒或自我複製RNA分子。 腺病毒載體
在一些實施例中，病毒載體係衍生自腺病毒。
腺病毒載體可衍生自人類腺病毒(Ad)，但亦可衍生自感染其他物種之腺病毒，諸如牛腺病毒（例如，牛腺病毒3、BAdV3）、犬腺病毒（例如，CAdV2）、豬腺病毒（例如，PAdV3或5）、或大猿（諸如黑猩猩(Pan )、大猩猩(Gorilla )、紅毛猩猩(Pongo )、倭黑猩猩(Pan paniscus )、及常見黑猩猩(Pan troglodytes )）。一般而言，天然存在之大猿腺病毒係單離自個別大猿之糞便樣本。
人類腺病毒載體可衍生自各種腺病毒血清型，例如衍生自人類腺病毒血清型hAd5、hAd7、hAd11、hAd26、hAd34、hAd35、hAd48、hAd49、或hAd50（該等血清型亦稱為Ad5、Ad7、Ad11、Ad26、Ad34、Ad35、Ad48、Ad49、或Ad50）。
大猿腺病毒(GAd)載體可衍生自各種腺病毒血清型，例如衍生自大猿腺病毒血清型GAd20、Gad19、GAd21、GAd25、GAd26、GAd27、GAd28、GAd29、GAd30、GAd31、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAdI7、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2、或PanAd3。
腺病毒載體在所屬技術領域中係已知的。大多數人類及非人類腺病毒之序列係已知的，且其他者可使用常規程序獲得。Ad26之例示性基因體序例可見於GenBank登錄號EF153474及國際專利公開號WO2007/104792之SEQ ID NO: 1中。Ad35之例示性基因體序列可見於國際專利公開號WO2000/70071之圖6中。基於Ad26之載體係描述於例如國際專利公開號WO2007/104792中。基於Ad35之載體係描述於例如美國專利第7,270,811號及國際專利公開號WO2000/70071中。基於ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63、及ChAd82之載體係描述於WO2005/071093中。基於PanAd1、PanAd2、PanAd3、ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146、及ChAd147之載體係描述於國際專利公開號WO2010/086189中。
腺病毒載體經工程改造以包含至少一個功能性缺失或病毒複製不可或缺之基因產物的完全移除，諸如一或多個腺病毒區E1、E2、及E4，因而使腺病毒無法複製。El區之缺失可包含EIA、EIB 55K、或EIB 21K、或其任何組合之缺失。複製缺陷腺病毒係藉由下列增殖：由生產細胞利用輔助質體提供由缺失區編碼之蛋白質在異側，或者工程改造生產細胞以表現所需之蛋白質。腺病毒載體亦可在E3區（其對於複製而言係非必需的）具有缺失，因而此缺失不必加以互補。本揭露之腺病毒載體可包含E1區之功能性缺失或E1區及至少一部分E3區之完全移除。本揭露之腺病毒載體可進一步包含E4區及/或E2區之功能性缺失或完全移除。可利用之合適生產細胞係以El永生化之人類視網膜細胞（例如911或PER.C6細胞（參見例如，美國專利第5,994,128號））、El轉形之羊水細胞(amniocyte)（參見例如，EP 1230354）、E 1轉形之A549細胞（參見例如，國際專利公開號WO1998/39411、美國專利第5,891,690號）。可使用之例示性載體係包含足以供病毒複製之功能性E1編碼區、E3編碼區中之缺失、及E4編碼區中之缺失的Ad26，前提是E4開讀框6/7未經刪除（參見例如，美國專利第9,750,801號）。
在一些實施例中，腺病毒載體係人類腺病毒(Ad)載體。在一些實施例中，Ad載體係衍生自Ad5。在一些實施例中，Ad載體係衍生自Ad11。在一些實施例中，Ad載體係衍生自Ad7。在一些實施例中，Ad載體係衍生自Ad26。在一些實施例中，Ad載體係衍生自Ad34。在一些實施例中，Ad載體係衍生自Ad35。在一些實施例中，Ad載體係衍生自Ad48。在一些實施例中，Ad載體係衍生自Ad49。在一些實施例中，Ad載體係衍生自Ad50。
在一些實施例中，腺病毒載體係大猿腺病毒(GAd)載體。在一些實施例中，GAd載體係衍生自GAd20。在一些實施例中，GAd載體係衍生自GAd19。在一些實施例中，GAd載體係衍生自GAd21。在一些實施例中，GAd載體係衍生自GAd25。在一些實施例中，GAd載體係衍生自GAd26。在一些實施例中，GAd載體係衍生自GAd27。在一些實施例中，GAd載體係衍生自GAd28。在一些實施例中，GAd載體係衍生自GAd29。在一些實施例中，GAd載體係衍生自GAd30。在一些實施例中，GAd載體係衍生自GAd31。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd3。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd4。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd5。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd6。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd7。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd8。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd9。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd9。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd10。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd11。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd16。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd17。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd19。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd20。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd22。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd24。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd26。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd30。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd31。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd32。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd31。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd33。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd37。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd38。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd44。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd55。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd63。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd68。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd73。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd82。在一些實施例中，GAd載體係衍生自ChAd83。GAd19-21及GAd25-31係描述於國際專利公開號WO2019/008111中，且代表具有高免疫原性且在一般人類群體中沒有預先存在之免疫力的株。GAd20基因體之多核苷酸序列係揭示於國際專利公開號WO2019/008111。
可將本揭露之多核苷酸插入載體中不影響所得重組病毒之病毒生存力的位點或區域（插入區）。可將本揭露之多核苷酸以平行（5'至3'方向轉錄）或反平行（相對於載體主鏈以3'至5'方向轉錄）方向插入經刪除E1區或。此外，可將能夠在哺乳動物宿主細胞（準備將載體用於其）中引導多肽或本揭露之多肽之表現的適當轉錄調節元件可操作地連接至多肽或本揭露之多肽。
重組腺病毒顆粒可根據所屬技術領域中之任何習知技術（例如，國際專利公開號WO1996/17070），使用互補細胞系或輔助病毒（其在異側供應病毒複製所必需之遺漏病毒基因）來製備及增殖。細胞系293、PER.C6、E1 A549及911通常用來互補El刪除。其他細胞系已經工程改造以互補缺陷載體（Yeh, et al., 1996, J. Virol.70: 559-565；Kroughak and Graham, 1995, Human Gene Ther.6: 1575-1586；Wang, et al., 1995, Gene Ther.2: 775-783；Lusky, et al., 1998, J. Virol.72: 2022-203；EP 919627、及國際專利公開號WO1997/04119）。腺病毒顆粒可回收自培養物上清液，但亦可回收自裂解後之細胞且可選地根據標準技術（例如，層析術、超離心，如國際專利公開號WO1996/27677、國際專利公開號WO1998/00524、國際專利公開號WO1998/26048、及國際專利公開號WO2000/50573中所述）經進一步純化。用於增殖腺病毒載體之建構及方法亦描述於例如美國專利第5,559,099號、第5,837,511號、第5,846,782號、第5,851,806號、第5,994,106號、第5,994,128號、第5,965,541號、第5,981,225號、第6,040,174號、第6,020,191號、及第6,113,913號中。
本文提供一種病毒載體，其包含本揭露之多核苷酸中任一者，其中該載體係衍生自hAd26（亦稱為具有Ad26）。
在一些實施例中，Ad26載體包含SEQ ID NO: 16或與SEQ ID NO: 16具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含SEQ ID NO: 18或與SEQ ID NO: 18具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含SEQ ID NO: 19或與SEQ ID NO: 19具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含SEQ ID NO: 20或與SEQ ID NO: 20具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含SEQ ID NO: 21或與SEQ ID NO: 21具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含SEQ ID NO: 22或與SEQ ID NO: 22具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含SEQ ID NO: 23或與SEQ ID NO: 23具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少90%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含SEQ ID NO: 26或與SEQ ID NO: 26具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含SEQ ID NO: 27或與SEQ ID NO: 27具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含編碼SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含編碼SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含編碼SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO: 3具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含編碼SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含編碼SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含編碼SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含編碼SEQ ID NO: 7或與SEQ ID NO: 7具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含編碼SEQ ID NO: 9或與SEQ ID NO: 9具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含編碼SEQ ID NO: 10或與SEQ ID NO: 10具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含編碼SEQ ID NO: 11或與SEQ ID NO: 11具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含編碼SEQ ID NO: 12或與SEQ ID NO: 12具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含編碼SEQ ID NO: 13或與SEQ ID NO: 13具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含編碼SEQ ID NO: 14或與SEQ ID NO: 14具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含編碼SEQ ID NO: 15或與SEQ ID NO: 15具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，Ad26載體包含編碼SEQ ID NO: 31或與SEQ ID NO: 31具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
本文提供一種病毒載體，其包含本揭露之多核苷酸中任一者，其中該載體係衍生自GAd20。
在一些實施例中，GAd20載體包含SEQ ID NO: 16或與SEQ ID NO: 16具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含SEQ ID NO: 18或與SEQ ID NO: 18具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含SEQ ID NO: 19或與SEQ ID NO: 19具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含SEQ ID NO: 20或與SEQ ID NO: 20具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含SEQ ID NO: 21或與SEQ ID NO: 21具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含SEQ ID NO: 22或與SEQ ID NO: 22具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含SEQ ID NO: 23或與SEQ ID NO: 23具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含SEQ ID NO: 26或與SEQ ID NO: 26具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含SEQ ID NO: 27或與SEQ ID NO: 27具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含編碼SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含編碼SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含編碼SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO: 3具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含編碼SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含編碼SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含編碼SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含編碼SEQ ID NO: 7或與SEQ ID NO: 7具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含編碼SEQ ID NO: 9或與SEQ ID NO: 9具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含編碼SEQ ID NO: 10或與SEQ ID NO: 10具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含編碼SEQ ID NO: 11或與SEQ ID NO: 11具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含編碼SEQ ID NO: 12或與SEQ ID NO: 12具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含編碼SEQ ID NO: 13或與SEQ ID NO: 13具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含編碼SEQ ID NO: 14或與SEQ ID NO: 14具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含編碼SEQ ID NO: 15或與SEQ ID NO: 15具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，GAd20載體包含編碼SEQ ID NO: 31或與SEQ ID NO: 31具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。 痘病毒載體
痘病毒（痘病毒科(Poxviridae )）載體可衍生自天花病毒(smallpox virus/variola)、痘苗病毒、痘苗病毒、或猴痘病毒。例示性痘苗病毒係哥本哈根痘苗病毒(W)、紐約減毒痘苗病毒(NYVAC)、ALVAC、TROVAC、或經修飾安卡拉痘苗病毒(MVA)。
MVA源自留存在土耳其安卡拉疫苗研究所(Vaccination Institute)多年之安卡拉皮膚痘苗株（安卡拉絨毛尿囊膜痘苗(Chorioallantois vaccinia Ankara, CVA)病毒），並用作為人類疫苗接種之基礎。然而，由於經常有與痘苗病毒(VACV)相關聯之嚴重疫苗接種後併發症，有一些嘗試要產生更減毒、更安全之天花疫苗。
MVA已由CVA病毒在雞胚纖維母細胞上之516次連續繼代(serial passage)來產生（Meyer et al.,J. Gen. Virol ., 72: 1031-1038 (1991)及美國專利第10,035,832號）。由於這些長期繼代，所得MVA病毒缺失了其基因體序列的約3.1萬個鹼基，並因此將其描述為高度限制於禽類細胞的宿主細胞（Meyer, H. et al., Mapping of deletions in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038, 1991；Meisinger-Henschel et al., Genomic sequence of chorioallantois vaccinia virus Ankara, the ancestor of modified vaccinia virus Ankara, J. Gen. Virol. 88, 3249-3259, 2007）。MVA基因體與其親體CVA之比對顯示基因體DNA有6個主要缺失（缺失I、II、III、IV、V、及VI），總共31,000個鹼基對。(Meyer et al., J. Gen. Virol. 72:1031-8 (1991))。在各種動物模型中均顯示，所得MVA係顯著無毒性的(avirulent) (Mayr, A. & Danner, K. Vaccination against pox diseases under immunosuppressive conditions, Dev. Biol. Stand. 41: 225-34, 1978)。由於使用許多繼代來減毒MVA，因此有許多不同的株或單離體，此係取決於CEF細胞中之繼代次數，諸如MVA 476 MG/14/78、MVA-571、MVA-572、MVA-574、MVA-575、及MVA-BN。MVA 476 MG/14/78係描述於例如國際專利公開號WO2019/115816A1中。MVA-572株係在1994年1月27日寄存於European Collection of Animal Cell Cultures (「ECACC」，Health Protection Agency, Microbiology Services, Porton Down, Salisbury SP4 0JG, United Kingdom (「UK」))，寄存號為ECACC 94012707。MVA-575株係在2000年12月7日寄存於ECACC，寄存號為ECACC 00120707；MVA-Bavarian Nordic (「MVA-BN」)株係在2000年8月30日寄存於ECACC，寄存號為V00080038。MVA-BN及MVA-572之基因體序列可在GenBank取得（登錄號分別為DQ983238及DQ983237）。其他MVA株之基因體序列可使用標準定序方法獲得。
本揭露之載體及病毒可衍生自任何MVA株或MVA株之進一步衍生物。進一步例示性MVA株係寄存物VR-1508，寄存於美國典型培養物保藏中心(American Type Culture collection, ATCC, Manassas, Va. 20108, USA)。
MVA之衍生物係指展現出與親體MVA基本上相同之特徵的病毒，但在其基因體之一或多個部分展現出差異。
在一些實施例中，MVA載體係衍生自MVA 476 MG/14/78。在一些實施例中，MVA載體係衍生自MVA-571。在一些實施例中，MVA載體係衍生自MVA-572。在一些實施例中，MVA載體係衍生自MVA-574。在一些實施例中，MVA載體係衍生自MVA-575。在一些實施例中，MVA載體係衍生自MVA-BN。
可將本揭露之多核苷酸插入MVA載體中不影響所得重組病毒之病毒生存力的位點或區域（插入區）。此類區域可藉由測試病毒DNA區段之容許重組形成但不會嚴重影響重組病毒之病毒生存力的區域而被輕易識別出來。胸苷激酶(TK)基因係可使用之插入區，且存在於許多病毒中，諸如在所有檢測過的痘病毒基因體中。此外，MVA含有6個天然缺失位點，各缺失位點皆可用作為插入位點（例如，缺失I、II、III、IV、V、及VI；參見例如，美國專利第5,185,146號及美國專利第6.440,442號）。MVA之一或多個基因間區(intergenic region, IGR)亦可用作為插入位點，諸如IGR IGR07/08、IGR 44/45、IGR 64/65、IGR 88/89、IGR 136/137、及IGR 148/149（參見例如，美國專利公開號2018/0064803）。額外合適的插入位點係描述於國際專利公開號WO2005/048957中。
重組痘病毒顆粒（諸如rMVA）係如所屬技術領域中所述製備（Piccini, et al., 1987, Methods of Enzymology 153: 545-563；美國專利第4,769,330號；美國專利第4,772,848號；美國專利第4,603,112號；美國專利第5,100,587號、及美國專利第5,179,993號）。在例示性方法中，可將所要插入病毒中之DNA序列放入大腸桿菌質體建構體中，同源於該MVA之DNA區段的DNA已插入其中。另外，可將所要插入之DNA序列連接至啟動子。可將啟動子-基因連接定位於質體建構體中，使得該啟動子-基因連接在兩端與DNA側接，該DNA同源於側接含有非必需基因座之MVA DNA區域的DNA序列。所得質體建構體可藉由在大腸桿菌內增殖並單離來擴增。可將含有所要插入之DNA基因序列的經單離質體轉染至（例如雞胚纖維母細胞(CEF)之）細胞培養物中，同時將培養物用MVA加以感染。質體中同源MVA DNA與病毒基因體之間的重組分別可產生藉由外來DNA序列之存在所修飾的MVA。rMVA顆粒可自培養物上清液中回收，或在裂解步驟（例如，化學裂解、冷凍/解凍、滲透性休克、音波處理、及類似者）後自經培養之細胞中回收。可使用連續多輪的斑點(plaque)純化來移除污染野生型病毒。接著可使用所屬技術領域中已知之技術（例如，層析法或以氯化銫或蔗糖梯度進行超離心）來純化病毒顆粒。
本文提供一種病毒載體，其包含本揭露之多核苷酸中任一者，其中該載體係衍生自MVA。
在一些實施例中，MVA載體包含SEQ ID NO: 16或與SEQ ID NO: 16具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含SEQ ID NO: 18或與SEQ ID NO: 18具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含SEQ ID NO: 19或與SEQ ID NO: 19具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含SEQ ID NO: 20或與SEQ ID NO: 20具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含SEQ ID NO: 21或與SEQ ID NO: 21具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含SEQ ID NO: 22或與SEQ ID NO: 22具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含SEQ ID NO: 23或與SEQ ID NO: 23具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含SEQ ID NO: 26或與SEQ ID NO: 26具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含SEQ ID NO: 27或與SEQ ID NO: 27具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含編碼SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含編碼SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含編碼SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO: 3具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含編碼SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含編碼SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含編碼SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含編碼SEQ ID NO: 7或與SEQ ID NO: 7具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含編碼SEQ ID NO: 9或與SEQ ID NO: 9具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含編碼SEQ ID NO: 10或與SEQ ID NO: 10具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含編碼SEQ ID NO: 11或與SEQ ID NO: 11具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含編碼SEQ ID NO: 12或與SEQ ID NO: 12具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含編碼SEQ ID NO: 13或與SEQ ID NO: 13具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含編碼SEQ ID NO: 14或與SEQ ID NO: 14具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含編碼SEQ ID NO: 15或與SEQ ID NO: 15具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。
在一些實施例中，MVA載體包含編碼SEQ ID NO: 31或與SEQ ID NO: 31具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之多核苷酸。 自我複製RNA分子
自我複製RNA可衍生自α病毒。α病毒可屬於VEEV/EEEV群、或SF群、或SIN群。SF群α病毒之非限制性實例包括Semliki森林病毒、O'Nyong-Nyong病毒、羅斯河病毒、Middelburg病毒、屈公病病毒、Barmah森林病毒、Getah病毒、Mayaro病毒、Sagiyama病毒、Bebaru病毒、及Una病毒。SIN群α病毒之非限制性實例包括Sindbis病毒、Girdwood S. A.病毒、南非節足動物攜帶性病毒86號、Ockelbo病毒、Aura病毒、Babanki病毒、Whataroa病毒、及Kyzylagach病毒。VEEV/EEEV群α病毒之非限制性實例包括東部馬腦炎病毒(EEEV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、Everglades病毒(EVEV)、Mucambo病毒(MUCV)、Pixuna病毒(PIXV)、Middleburg病毒(MIDV)、屈公病病毒(CHIKV)、O'Nyong-Nyong病毒(ONNV)、羅斯河病毒(RRV)、Barmah森林病毒(BF)、Getah病毒(GET)、Sagiyama病毒(SAGV)、Bebaru病毒(BEBV)、Mayaro病毒(MAYV)、及Una病毒(UNAV)。
自我複製RNA分子可衍生自α病毒基因體，表示它們具有一些α病毒基因體之結構特徵、或類似於α病毒基因體。自我複製RNA分子可衍生自經修飾之α病毒基因體。
自我複製RNA分子可衍生自東部馬腦炎病毒(EEEV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、Everglades病毒(EVEV)、Mucambo病毒(MUCV)、Semliki森林病毒(SFV)、Pixuna病毒(PIXV)、Middleburg病毒(MIDV)、屈公病病毒(CHIKV)、O'Nyong-Nyong病毒(ONNV)、羅斯河病毒(RRV)、Barmah森林病毒(BF)、Getah病毒(GET)、Sagiyama病毒(SAGV)、Bebaru病毒(BEBV)、Mayaro病毒(MAYV)、Una病毒(UNAV)、Sindbis病毒(SINV)、Aura病毒(AURAV)、Whataroa病毒(WHAV)、Babanki病毒(BABV)、Kyzylagach病毒(KYZV)、西部馬腦炎病毒(WEEV)、Highland J病毒(HJV)、Fort Morgan病毒(FMV)、Ndumu病毒(NDUV)、及Buggy Creek病毒。毒性及非毒性α病毒株兩者皆適用。在一些實施例中，α病毒RNA複製子係來自Sindbis病毒(SIN)、Semliki森林病毒(SFV)、羅斯河病毒(RRV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、或東部馬腦炎病毒(EEEV)。
在一些實施例中，α病毒衍生性自我複製RNA分子係委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)。
自我複製RNA分子可含有來自野生型新世界或舊世界α病毒基因體（或由其所編碼之胺基酸序列）之RNA序列。本文所揭示之自我複製RNA分子之任一者可含有「衍生自」或「基於」野生型α病毒基因體序列之RNA序列，表示它們與來自野生型RNA α病毒基因體之RNA序列（其可為對應RNA序列）具有至少60%、或至少65%、或至少68%、或至少70%、或至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%、或至少97%、或至少98%、或至少99%、或100%、或80至99%、或90至100%、或95至99%、或95至100%、或97至99%、或98至99%序列同一性，該野生型RNA α病毒基因體可為新世界、或舊世界α病毒基因體。
自我複製RNA分子含有在容許病毒感染細胞(permissive cell)內引導其自身之擴增或自我複製所必需之所有基因資訊。為了引導其自身之複製，自我複製RNA分子編碼聚合酶、複製酶、或其他可與病毒或宿主細胞衍生蛋白質、核酸、或核醣核蛋白交互作用之其他蛋白質，以催化RNA擴增程序；及含有複製及轉錄複製子編碼之RNA所必需之順式作用(cis-acting) RNA序列。因此，RNA複製導致生產多個子RNA。這些子RNA以及共線次基因體轉錄物可經轉譯以提供關注基因之原位表現，或可經轉錄以提供與該經遞送之RNA同義之進一步轉錄物，該進一步轉錄物經轉譯以提供關注基因之原位表現。此序列轉錄的整體結果係該經導入之複製子RNA的數量大幅擴增，且因此該經編碼之關注基因變成細胞的主要多肽產物。
在α病毒之基因組中有兩個開讀框(ORF)，即非結構(ns)及結構基因。該ns ORF編碼病毒RNA轉錄及複製所需之蛋白質（nsP1至nsP4）並且生產為多聚蛋白，其係該病毒複製之機器。結構ORF編碼三個結構蛋白：核心核鞘蛋白C、及連結作為異二聚體之套膜蛋白P62及El。病毒的膜錨定表面醣蛋白負責受體辨識及經由膜融合進入標靶細胞。四個ns蛋白質基因係由在基因體5'三分之二的基因編碼，然而三個結構蛋白係自與基因體3'三分之一共線之次基因體mRNA轉譯。α病毒基因體之例示性描繪係顯示於圖18A。
自我複製RNA分子可用作為藉由置換編碼結構基因之病毒序列、或插入編碼結構基因之序列的外來序列5’或3’而將外來序列引入宿主細胞之基底。其等可經工程改造以將複製酶下游之在次基因體啟動子控制下之病毒結構基因置換成關注基因(GOI)，例如，編碼本揭露之多肽之多核苷酸。在轉染時，立即經轉譯之複製酶與基因體RNA之5'及3'端交互作用，並合成互補基因體RNA副本。彼等作用為模板，用於合成新穎的正股、加蓋、及多腺苷酸化基因體副本及次基因體轉錄物（圖18B）。擴增最終導致非常高的RNA拷貝數，每細胞至多2 × 105 個副本。結果係一致及/或增強的GOI（例如，編碼本揭露之多肽之多核苷酸）表現，其可影響疫苗療效或治療的治療效果。相較於習知病毒載體，由於基於自我複製RNA分子之疫苗產生非常高的RNA副本數，因此可以非常低的水準給藥。在本文中揭示之組成物及方法的一個顯著價值在於，可增加疫苗在處於慢性或急性免疫活化狀態下的個體的療效。
本揭露之自我複製RNA分子（其包含編碼本揭露之CALR/JAK2或JAK2表位2多肽之RNA）可用作為治療劑，使用各種技術將其等遞送至患有骨髓增生性腫瘤之對象，包括如本文中所述之病毒載體或如本文中亦敘述之其他遞送技術。
本揭露提供自我複製RNA分子，其含有在容許病毒感染細胞(permissive cell)內引導其自身之擴增或自我複製所必需之所有基因資訊。
本揭露亦提供可用來作為藉由置換編碼結構基因之病毒序列而將外來序列（例如，本揭露之CALR/JAK2或JAK2表位2多肽）引入宿主細胞之基底的自我複製RNA分子。
本文提供一種病毒載體，其包含本揭露之多核苷酸中任一者，其中該載體係自我複製RNA分子。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含衍生自SEQ ID NO: 16或與SEQ ID NO: 16具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含衍生自SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含衍生自SEQ ID NO: 18或與SEQ ID NO: 18具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含衍生自SEQ ID NO: 19或與SEQ ID NO: 19具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含衍生自SEQ ID NO: 20或與SEQ ID NO: 20具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含衍生自SEQ ID NO: 21或與SEQ ID NO: 21具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含衍生自SEQ ID NO: 22或與SEQ ID NO: 22具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含衍生自SEQ ID NO: 23或與SEQ ID NO: 23具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含衍生自SEQ ID NO: 24或與SEQ ID NO: 24具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含衍生自SEQ ID NO: 25或與SEQ ID NO: 25具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含衍生自SEQ ID NO: 26或與SEQ ID NO: 26具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含衍生自SEQ ID NO: 27或與SEQ ID NO: 27具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之多核苷酸之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含編碼SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含編碼SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含編碼SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO: 3具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含編碼SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含編碼SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含編碼SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含編碼SEQ ID NO: 7或與SEQ ID NO: 7具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含編碼SEQ ID NO: 9或與SEQ ID NO: 9具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含編碼SEQ ID NO: 10或與SEQ ID NO: 10具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含編碼SEQ ID NO: 11或與SEQ ID NO: 11具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含編碼SEQ ID NO: 12或與SEQ ID NO: 12具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含編碼SEQ ID NO: 13或與SEQ ID NO: 13具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含編碼SEQ ID NO: 14或與SEQ ID NO: 14具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含編碼SEQ ID NO: 15或與SEQ ID NO: 15具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之RNA序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含編碼SEQ ID NO: 31或與SEQ ID NO: 31具有至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性、或至少99%序列同一性之胺基酸序列之RNA序列。
上述自我複製RNA分子之任一者可進一步包含下列一或多者： ●    一或多個非結構基因nsP1、nsP2、nsP3、及nsP4； ●    至少一個DLP模體、5’UTR、3’UTR、及Poly A；及 ●    次基因體啟動子。
在一些實施例中，例如，自我複製RNA分子可包含下列一或多者： ●    一或多個非結構基因nsP1、nsP2、nsP3、及nsP4； ●    至少一個DLP模體、5’UTR、3’UTR、及Poly A；及 ●    次基因體啟動子；及 ● 編碼SEQ ID NO: 3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15、或31之胺基酸且可操作地連接至次基因體啟動子之RNA。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含編碼蛋白質或肽之RNA序列；5’及3’α病毒非轉譯區；編碼衍生自新世界α病毒VEEV非結構蛋白nsP1、nsP2、nsP3、及nsP4之胺基酸序列之RNA序列；可操作地連接並調節編碼蛋白質之RNA序列的轉譯之次基因體啟動子；5'罩蓋及3’poly-A尾；正義、單股RNA；來自Sindbis病毒非結構蛋白1 (nsP1)上游之DLP；2A核糖體跳躍元件；及5’-UTR下游及DLP上游之nsp1核苷酸重複。
在一些實施例中，自我複製RNA分子之大小可係至少1 kb、或至少2 kb、或至少3 kb、或至少4 kb、或至少5 kb、或至少6 kb、或至少7 kb、或至少8 kb、或至少10 kb、或至少12 kb、或至少15 kb、或至少17 kb、或至少19 kb、或至少20 kb，或者大小可係100 bp至8 kb、或500 bp至8 kb、或500 bp至7 kb、或1至7 kb、或1至8 kb、或2至15 kb、或2至20 kb、或5至15 kb、或5至20 kb、或7至15 kb、或7至18 kb、或7至20 kb。
以上揭示之自我複製RNA分子之任一者可進一步包括自體蛋白酶肽（例如，自催化自我切割肽）之編碼序列，其中自體蛋白酶之編碼序列係可選地可操作地連接至第二核酸序列上游。
通常，所屬技術領域中已知之任何蛋白分解切割位點可被併入本揭露之核酸分子中，且可為例如藉由蛋白酶在生產後切割之蛋白分解切割序列。進一步合適的蛋白分解切割位點亦包括可在添加外部蛋白酶之後切割之蛋白分解切割序列。如本文中所使用，用語「自體蛋白酶(autoprotease)」係指具有自體蛋白分解活性且能夠將其自身自較大多肽部份切割之「自我切割」肽。最早在小核糖核酸病毒群之成員口蹄疫病毒(FMDV)中識別，後續識別出數種自體蛋白酶，諸如例如來自馬鼻炎A病毒(E2A)、豬捷申病毒(teschovirus)-1 (P2A)及明脈扁刺蛾(Thosea asigna)病毒(T2A)之「類2A」肽，且其等在蛋白分解切割之活性已在各種體外及體內真核系統中顯示。因此，自體蛋白酶之概念係為所屬技術領域中具有通常知識者所用，因為已識別出許多天然存在的自體蛋白酶系統。良好研究的自體蛋白酶系統係例如病毒蛋白酶、發育蛋白質（例如，HetR、刺蝟蛋白質）、RumA自體蛋白酶域、UmuD、等。適用於本揭露之組成物及方法的自體蛋白酶肽之非限制性實例包括來自豬捷申病毒-1 2A (P2A)、口蹄疫病毒(FMDV) 2A (F2A)、馬鼻炎A病毒(ERAV) 2A (E2A)、明脈扁刺蛾病毒2A (T2A)、細胞質多面體症病毒2A (BmCPV2A)、家蠶軟化症(Flacherie)病毒2A (BmIFV2A)、或其組合。
在一些實施例中，自體蛋白酶肽之編碼序列係可操作地連接DLP模體下游及第一及第二多核苷酸上游。
在一些實施例中，自體蛋白酶肽包含下列或由下列組成：選自由豬捷申病毒-1 2A (P2A)、口蹄疫病毒(FMDV) 2A (F2A)、馬鼻炎A病毒(ERAV) 2A (E2A)、明脈扁刺蛾病毒2A (T2A)、細胞質多面體症病毒2A (BmCPV2A)、家蠶軟化症(Flacherie)病毒2A (BmIFV2A)、及其組合所組成之群組的肽序列。在一些實施例中，自體蛋白酶肽包括豬捷申病毒-1 2A (P2A)之肽序列。
在一些實施例中，自體蛋白酶肽係選自由豬捷申病毒-1 2A (P2A)、口蹄疫病毒(FMDV) 2A (F2A)、馬鼻炎A病毒(ERAV) 2A (E2A)、明脈扁刺蛾病毒2A (T2A)、細胞質多面體症病毒2A (BmCPV2A)、家蠶軟化症(Flacherie)病毒2A (BmIFV2A)、及其組合所組成之群組。
在一些實施例中，自體蛋白酶肽係豬捷申病毒-1 2A (P2A)。
將P2A肽併入本揭露之經修飾之病毒RNA複製子允許由GOI所編碼之蛋白質（例如，本揭露之CALR-JAK2或JAK2表位2多肽）自殼體-GOI融合釋放。
在本文中揭示之一些實施例中，豬捷申病毒-1 2A (P2A)肽序列係經工程改造以框內緊接DLP序列之後及框內緊接所有GOI上游。
以上揭示之自我複製RNA分子之任一者可進一步包括編碼序列下游環(DLP)模體。
一些病毒具有能夠形成一或多個莖環結構之序列，其調節（例如，增加）殼體基因表現。在本文中使用之病毒殼體增強子係指調節元件，其包含能夠形成該莖環結構之序列。在一些實例中，莖環結構係由在殼體蛋白之編碼序列內之序列形成且命名為下游環(DLP)序列。如本文所揭示，這些莖環結構或其變體可用於調節（例如，增加）關注基因之表現水準。例如，這些莖環結構或其變體可用於重組載體（例如，異源病毒基因體）中，以增強可操作地連接至其下游之編碼序列的轉錄及/或轉譯。
在宿主細胞中的α病毒複製已知會誘發雙股RNA依賴性蛋白激酶(PKR)。PKR磷酸化真核轉譯起始因子2α (eIF2α)。eIF2α的磷酸化阻斷mRNA的轉譯起始，因而使得病毒無法完成生產複製循環。用Sindbis病毒感染細胞誘發PKR且導致eIF2α的磷酸化，但病毒次基因體mRNA仍經有效轉譯而所有其他細胞性mRNA的轉譯則受到限制。病毒次基因體mRNA在Sindbis病毒中的有效轉譯是藉由位於病毒殼體蛋白（例如，殼體增強子）野生型AUG起始密碼子下游之穩定RNA髮夾環（或DLP模體）的存在而變得可能。報告指出，DLP結構可使核糖體停頓在野生型AUG上，且此支持次基因體mRNA的轉譯不需要功能性eIF2α。因此，有效轉譯Sindbis病毒(SINV)以及其他α病毒的次基因體mRNA，即使在具有高度活性PKR且導致eIF2α完全磷酸化之細胞中。
DLP結構首先係在Sindbis病毒(SINV) 26S mRNA中表徵，且亦在Semliki森林病毒(SFV)中偵測到。報告指出，類似的DLP結構存在於α病毒屬的至少14個其他成員中，包括新世界（例如，MAYV、UNAV、EEEV (NA)、EEEV (SA)、AURAV）及舊世界（SV、SFV、BEBV、RRV、SAG、GETV、MIDV、CHIKV、及ONNV）成員。這些α病毒26S mRNA的預測結構係基於SHAPE（選擇性2'-羥基醯基化及引子延長）資料建構(Toribio et al., Nucleic Acids Res. May 19; 44(9):4368-80, 2016)，其內容特此以引用方式併入本文中。在除了CHIKV及ONNV以外的所有情況下偵測到穩定莖環結構，然而MAYV及EEEV顯示較低穩定性的DLP（Toribio et al., 2016（同上））。該些含有最穩定DLP結構之α病毒報告最高DLP活性。
作為一實例，α病毒屬之成員可藉由存在於病毒26S轉錄物內之下游環(DLP)來抵抗經抗病毒RNA活化之蛋白激酶(PKR)的活化，其允許這些mRNA的eIF2非依賴性轉譯起始。下游環(DLP)位於SINV 26S mRNA中AUG的下游及α病毒屬的其他成員中。
在一些實施例中，本揭露之核酸分子可包括可操作地連接至（多個）DLP模體之關注基因(GOI)編碼序列及/或DLP模體之編碼序列。
在一些實施例中，本揭露之自我複製RNA分子包含下游環(DLP)。
在一些實施例中，下游環(DLP)包含至少一個RNA莖環。
在一些情況下，DLP活性取決於DLP模體與起始密碼子AUG (AUGi)之間的距離。在α病毒26S mRNA中AUG-DLP間距係以允許將AUGi置於被DLP所停頓之40S次單位的P位點之方式調諧成核糖體18S rRNA之ES6S區的拓樸，從而允許在無eIF2參與下併入Met-tRNA。在Sindbis病毒的情況下，DLP模體被發現在Sindbis次基因體RNA的前150 nt中。髮夾係位於Sindbis殼體AUG起始密碼子（在Sindbis次基因體RNA nt 50處之AUG）下游且導致停頓核糖體以使正確殼體基因AUG被用於起始轉譯。序列比較及結構RNA分析的先前研究顯示在SINV中的DLP演化保留且預測在α病毒屬的許多成員中存在等效DLP結構（見例如，Ventoso, J. Virol. 9484-9494, Vol. 86, September 2012）。
在不受任何特定理論束縛之前提下，據信將DLP模體置於任何GOI編碼序列上游一般而言導致髮夾區編碼之N端殼體胺基酸與GOI編碼蛋白質之融合蛋白，因為起始發生在殼體AUG而非GOI AUG。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含置於非結構蛋白1 (nsP1)上游之下游環。
在一些實施例中，下游環係置於非結構蛋白1 (nsP1)上游且係藉由豬捷申病毒-1 2A (P2A)核糖體跳躍元件連接至nsP1。
本揭露之含有DLP之自我複製RNA可用於授予對對象的先天免疫系統之抗性。未經修飾之RNA複製子對於經其導入之細胞的初始先天免疫系統狀態敏感。如果細胞/個體係處於高度活性先天免疫系統狀態，則RNA複製子性能（例如，GOI的複製及表現）可受到負面影響。藉由工程改造DLP以控制蛋白質（特別是非結構蛋白）轉譯的起始，移除或減輕先天免疫系統之原先既有活化狀態影響有效RNA複製子複製的影響。結果係更一致及/或增強的GOI表現，其可影響疫苗療效或治療的治療效果。
本揭露之自我複製RNA之DLP模體可在細胞環境中授予有效的mRNA轉譯，其中細胞性mRNA轉譯受到抑制。當DLP與複製子載體的非結構蛋白基因轉譯連接時，複製酶及轉錄酶蛋白質能夠在PKR活化的細胞環境中起始功能性複製。當DLP與次基因體mRNA轉譯連接時，即使當細胞性mRNA因為先天免疫活化受到限制，仍可能有強健的GOI表現。因此，工程改造含有DLP結構之自我複製RNA以幫助驅使非結構蛋白基因及次基因體mRNA兩者的轉譯提供克服先天免疫活化的有力方法。
包含DLP模體之自我複製RNA載體的實例係描述於美國專利申請公開案US2018/0171340及國際專利申請公開案WO2018106615，其內容全文以引用方式併入本文中。
以上揭示之自我複製RNA分子之任一者可進一步包含非結構基因nsP1、nsP2、nsP3、及/或nsP4。在一些實施例中，自我複製RNA分子不編碼功能性病毒結構蛋白。
α病毒基因體編碼非結構蛋白nsP1、nsP2、nsP3、及nsP4，其係經生產為單一多聚蛋白前驅物，有時稱為P1234（或nsP1至4或nsP1234），且其係經由蛋白分解處理被切割成成熟蛋白質（圖18B）。nsP1的大小可為約60 kDa且可具有甲基轉移酶活性且涉及病毒加蓋反應。nsP2的大小為約90 kDa且可具有解螺旋酶及蛋白酶活性，而nsP3係約60 kDa且含有三個域：巨域、中央（或α病毒獨特）域、及超變異域(HVD)。nsP4的大小係約70 kDa，且含有核心RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)催化域。在感染之後，α病毒基因體RNA係經轉譯以產生P1234多聚蛋白，其係經切割成個別蛋白質。
α病毒基因體亦編碼三個結構蛋白：核心核鞘蛋白C、及連結作為異二聚體之套膜蛋白P62及E1。結構蛋白係在次基因體啟動子的控制下且可經置換成關注基因(GIO)。
在本揭露之一些實施例中，自我複製RNA可缺乏（或不含有）至少一個（或所有）結構性病毒蛋白（例如，核鞘蛋白C、及套膜蛋白P62、6K、及E1）之（多個）序列。在這些實施例中，編碼一或多個結構基因之序列可經一或多個序列取代，諸如例如至少一個蛋白質或肽的編碼序列（或其他關注基因(GOI)），例如本揭露之CALR/JAK2多肽或JAK2表位2多肽。
在一些實施例中，自我複製RNA缺乏編碼α病毒結構蛋白之序列；或不編碼α病毒（或可選地任何其他）結構蛋白。在一些實施例中，自我複製RNA分子進一步缺乏一或多個病毒結構蛋白之整個編碼區的一部分。例如，α病毒表現系統可缺乏病毒殼體蛋白C、E1醣蛋白、E2醣蛋白、E3蛋白質及6K蛋白質之一或多者的一部分或整個編碼序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子不含有結構性病毒蛋白之至少一者的編碼序列。在這些情況下，編碼結構基因之序列可經一或多個序列取代，諸如例如GOI，例如本揭露圖18B或圖19之CALR/JAK2或JAK2表位2多肽的編碼序列。
本揭露亦提供包含非結構基因nsP1、nsP2、nsP3、及nsP4之自我複製RNA分子，且其中自我複製RNA分子不編碼功能性病毒結構蛋白。
在一些實施例中，本揭露提供包含至少一個、至少二個、至少三個、或至少四個非結構性病毒蛋白（例如，nsP1、nsP2、nsP3、nsP4）編碼序列的自我複製RNA分子。由複製子編碼之nsP1、nsP2、nsP3、及nsP4蛋白質係功能性或生物活性蛋白質。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包括至少一個非結構性病毒蛋白的一部分的編碼序列。例如，自我複製RNA分子可包括約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、或介於這些值之任二者之間之範圍的至少一個非結構性病毒蛋白的編碼序列。在一些實施例中，自我複製RNA分子可包括至少一個非結構性病毒蛋白的實質部分的編碼序列。如本文中所使用，「實質部分(substantial portion)」的編碼非結構性病毒蛋白之核酸序列包含足夠的編碼非結構性病毒蛋白之核酸序列，以提供不論藉由所屬技術領域中具有通常知識者人工評估序列，或藉由使用演算法諸如BLAST進行電腦自動化序列比較及識別來假定識別該蛋白質（見例如，「Basic Local Alignment Search Tool」；Tool」；Altschul S F et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1993）。
在一些實施例中，自我複製RNA分子可包括至少一個非結構蛋白的整個編碼序列。在一些實施例中，自我複製RNA分子包含天然病毒非結構蛋白的實質上所有編碼序列。在某些實施例中，一或多個非結構性病毒蛋白係衍生自相同病毒。
在一些實施例中，置於非結構蛋白1 (nsP1)上游的自我複製RNA分子之下游環DLP係衍生自Sindbis病毒。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含衍生自委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之nsP1、nsP2、nsP3、及nsP4序列及衍生自Sindbis病毒(SIN)之DLP模體。
在一些實施例中，自我複製RNA分子亦具有編碼衍生自α病毒nsP3巨域的胺基酸序列之RNA子序列、及編碼衍生自α病毒nsP3中央域的胺基酸序列之RNA子序列。自我複製RNA分子亦可具有編碼完全衍生自舊世界α病毒nsP3超變異域的胺基酸序列之RNA子序列；或可具有胺基酸序列，該胺基酸序列具有一部分衍生自新世界α病毒nsP3超變異域、及一部分衍生自舊世界α病毒nsP3超變異域，即超變異域(HVD)可為雜交或嵌合新世界/舊世界序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子可具有編碼衍生自野生型新世界α病毒nsP1、nsP2、nsP3、及nsP4蛋白質序列之胺基酸序列的RNA序列。在其他實施例中，一或多個非結構蛋白係衍生自不同病毒。
在一些實施例中，自我複製RNA分子可具有編碼衍生自野生型α病毒nsP3之nsP3巨域、及衍生自野生型α病毒nsP3之nsP3中央域的RNA序列。在各種實施例中，（多個）巨域及中央域兩者均可衍生自新世界野生型α病毒nsP3或兩者均可衍生自舊世界野生型α病毒nsP3蛋白質。在其他實施例中，巨域可衍生自新世界野生型α病毒巨域且中央域可衍生自舊世界野生型α病毒中央域，或反之亦然。各種域可為本文所述之任何序列。
在一些實施例中，自我複製RNA分子含有非VEEV非結構蛋白nsP1、nsP2、nsP3、及nsP4。
累積的實驗證據已顯示，VEEV及其他α病毒基因體及其缺陷干擾(DI) RNA的複製/擴增係由三個啟動子元件決定：(i)保守3’端序列元件(3’CSE)及隨後的poly(A)尾；(ii) 5’UTR，其作用為負股及正股RNA合成的關鍵啟動子元件；及(iii) 51-nt保守序列元件(51-nt CSE)，其位於nsP1編碼序列中且作用為α病毒基因體複製之增強子（Kim et al., PNAS, 2014, 111: 10708-10713及其中的參考文獻）。
以上揭示之自我複製RNA分子之任一者可進一步包括未經修飾之5’非轉譯區(5’UTR)。
先前研究顯示在VEEV及Sindbis病毒感染期間，僅共定位一小部分的病毒非結構蛋白(nsP)與dsRNA複製中間物。因此，大部分nsP似乎並不涉及RNA複製(Gorchakov R, et al. (2008) A new role for ns polyprotein cleavage in Sindbis virus replication. J Virol 82(13):6218-6231)。此提供一個在擴增編碼關注蛋白之次基因體RNA中利用不常用ns蛋白的機會，其通常自次基因體啟動子轉錄且不經進一步擴增。
在一些實施例中，本揭露之自我複製RNA分子之nsP1片段係在5’-UTR下游及DLP上游複製。
在一些實施例中，nsP1的前193個核苷酸係在5’UTR下游及DLP上游複製。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含經修飾之5’非轉譯區(5'-UTR)。例如，經修飾之5'-UTR可包含位置1、2、4、或其組合的一或多個核苷酸取代。較佳地，經修飾之5'-UTR包含位置2的核苷酸取代，更佳的是經修飾之5'-UTR具有位置2的U-＞G取代。該自我複製RNA分子之實例係描述於美國專利申請公開案US2018/0104359及國際專利申請公開案WO2018075235，其內容全文以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，UTR可為野生型新世界或舊世界α病毒UTR序列、或自其任一者衍生之序列。5’UTR可具有任何合適長度，諸如約60 nt或50至70 nt或40至80 nt。在一些實施例中，5’UTR亦可具有保守一級或二級結構（例如，一或多個莖環）且可參與α病毒或複製子RNA的複製。3’UTR可具有至多數百個核苷酸，例如其可具有50至900、或100至900、或50至800、或100至700、或200 nt至700 nt。‘3 UTR亦可具有二級結構，例如莖環，且可後接多腺苷酸段或多腺苷酸尾。
5’及3’非轉譯區可被可操作地連接至複製子所編碼之其他序列之任一者。UTR可藉由提供辨識及轉錄其他編碼序列所需之序列及間距而被可操作地連接至啟動子及/或編碼蛋白質或肽之序列。
本揭露之GOI，例如CALR/JAK2或JAK2表位2多核苷酸可在次基因體啟動子的控制下表現。在某些實施例中，不用天然次基因體啟動子，而是可將次基因體RNA置於衍生自腦心肌炎病毒(EMCV)、牛病毒性下痢病毒(BVDV)、脊髓灰白質炎病毒、口蹄疫病毒(FMD)、腸病毒71、或C型肝炎病毒之內部核糖體進入位點(IRES)的控制下。次基因體啟動子從24個核苷酸（Sindbis病毒）至超過100個核苷酸（甜菜壞死性黃脈病毒）不等，且通常見於轉錄開始上游。
自我複製RNA分子可具有3'多腺苷酸尾。其亦可包括靠近其3'端的poly-A聚合酶辨識序列（例如，AAUAAA）。
在該些其中自我複製RNA分子係經包裝於重組α病毒顆粒中的情況下，其可含有一或多個稱為包裝信號的序列，其具有起始與α病毒結構蛋白交互作用而導致顆粒形成的功用。在一些實施例中，α病毒顆粒包含衍生自一或多個α病毒之RNA；及結構蛋白，其中該結構蛋白之至少一者係衍生自二或更多個α病毒。
在一些實施例中，自我複製RNA分子包含VEEV衍生性載體，其中結構性病毒蛋白（例如，核鞘蛋白C、及套膜蛋白P62、6K、及E1）係經移除及置換成本揭露之CARL.JAK2或JAK2表位2多肽之編碼序列。 其他病毒載體及重組病毒
包含本揭露之多核苷酸之病毒載體可衍生自人類腺相關病毒（諸如AAV-2，腺相關病毒第2型）。AAV載體具有吸引力的一項特性是其等不會表現任何病毒基因。AAV載體中所包括之唯一病毒DNA序列是145 bp反向末端重複(inverted terminal repeat, ITR)。因此，如用裸露DNA進行免疫，唯一表現的基因是抗原（或抗原嵌合體）之基因。此外，已知AAV載體會轉導分裂細胞及非分裂細胞，諸如人類周邊血液單核球衍生之樹突細胞，且具有持續之轉殖基因表現、及經口及鼻內遞送以產生黏膜免疫性之可能性。此外，所需之DNA量似乎遠為較低（低上數個數量級），且相比於50 µg或約1015 個拷貝的裸露DNA劑量，最大反應在劑量為1010 至10n 個顆粒或DNA拷貝。AAV載體係藉由合適細胞系（例如，人類293細胞）之共轉染來包裝，且DNA容置在AAV ITR嵌合蛋白編碼建構體中，且AAV輔助質體ACG2含有不帶ITR之AAV編碼區（AAV rep及cap基因）。隨後將細胞用腺病毒Ad5感染。載體可使用所屬技術領域中已知之方法（例如，諸如氯化銫密度梯度超離心）而純化自細胞裂解物，且經過驗證以確保其等不含可偵測之具複製能力的AAV或腺病毒（例如，藉由細胞病變效應生物檢定）。
包含本揭露之多核苷酸之病毒載體亦包括反轉錄病毒載體。反轉錄病毒係整合型病毒的一種類別，其使用病毒編碼之反轉錄酶來複製，以將病毒RNA基因體複製到雙股DNA中，而此DNA會整合至受感染細胞（例如，目標細胞）之染色體DNA中。此類載體包括衍生自鼠類白血病病毒者，尤其是Moloney (Gilboa, et al., 1988, Adv. Exp. Med. Biol. 241: 29)或Friend的FB29株（國際專利公開號WO1995/01447）。通常而言，反轉錄病毒載體缺失病毒基因gag、pol、及env之全部或部分並保留5'及3' LTR及包被(encapsidation)序列。這些元件可經修飾以增加反轉錄病毒載體之表現水平或穩定性。此類修飾包括以反轉錄轉位子（諸如VL30）置換反轉錄病毒包被序列（參見例如，美國專利第5,747,323號）。
可將編碼本揭露之多肽之多核苷酸插入包被序列之下游，諸如以相對於反轉錄病毒基因體之相反方向。反轉錄病毒顆粒係於輔助病毒存在下或在適當互補（包裝）細胞系中製備，該細胞系含有整合至其基因體中該反轉錄病毒載體有缺陷之反轉錄病毒基因（例如，gag/pol及env）。此類細胞系係描述於先前技術中(Miller and Rosman, 1989, BioTechniques 7: 980; Danos and Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460; Markowitz, et al., 1988, Virol. 167: 400)。env基因之產物負責將病毒顆粒結合至存在於目標細胞表面之病毒受體，因此判定反轉錄病毒顆粒之宿主範圍。含有雙嗜性(amphotropic)套膜蛋白之包裝細胞系（諸如PA317細胞(ATCC CRL 9078)或293EI6 (W097/35996)）因而可用來允許人類及其他物種之目標細胞的感染。反轉錄病毒顆粒係回收自培養物上清液，且可選地可根據標準技術（例如，層析術、超離心）經進一步純化。 調節元件
可將編碼本揭露之多肽之多核苷酸可操作地連接至載體中之一或多個調節元件。調節元件可包含啟動子、增強子、多腺核苷酸化信號、抑制子(repressor)、及類似者。如本文中所使用，用語「可操作地連接(operably linked)」應以其最廣泛合理之上下文理解，且係指呈功能性關係之多核苷酸元件的連接。當多核苷酸被置於與另一多核苷酸之功能性關係中時，其係「可操作地連接」。例如，如果啟動子影響編碼序列之轉錄，則其係可操作地連接至該編碼序列。
表現載體及病毒載體中常用之一些增強子及啟動子序列係例如人類巨細胞病毒(hCMV)、痘苗P7.5早期/晚期啟動子、CAG、SV40、小鼠CMV (mCMV)、EF-l、及hPGK啟動子。由於hCMV啟動子具有高效力及大約0.8 kB之中等大小，其係這些啟動子中最常用的之一。hPGK啟動子的特徵在於小尺寸（大約0.4 kB），但其效力低於hCMV啟動子。另一方面，由巨細胞病毒早期增強子元件、啟動子、雞β肌動蛋白基因之第一外顯子及內含子、及兔β球蛋白基因之剪接受體所組成之CAG啟動子可引導極具效力之基因表現，與hCMV啟動子相當，但其大尺寸使其在空間限制可能是明顯顧慮之病毒載體中較不穩定，例如在腺病毒載體(AdV)、腺相關病毒載體(AAV)、或慢病毒載體(LV)中。
可使用之額外啟動子係夜猴疱疹病毒1主要立即早期啟動子(Aotine Herpesvirus 1 major immediate early promoter)（AoHV-1啟動子），其係描述於國際專利公開號WO2018/146205中。可將啟動子可操作地偶合至抑制子操作序列，抑制子蛋白可結合至該序列以於抑制子蛋白存在下抑制該啟動子之表現。在某些實施例中，抑制子操作序列係TetO序列或CuO序列（參見例如，US9790256）。
在某些情況下，可能所欲的是自相同載體表現至少兩種不同的多肽。在此情況下，可將各個多核苷酸可操作地連接至相同或不同之啟動子及/或增強子序列，或者可使用熟知之雙順反子(bicistronic)表現系統，例如藉由利用來自腦心肌炎病毒之內部核糖體進入位點(IRES)。替代地，可使用雙向合成啟動子，諸如hCMV-rhCMV啟動子及國際專利公開號WO2017/220499中所述之其他啟動子。多腺核苷酸化信號可衍生自SV40或牛生長激素(BGH)。
包含編碼本揭露之多肽之多核苷酸的自我複製RNA載體可進一步包含任何調節元件以建立載體之（多個）習知功能，包括但不限於由載體之多核苷酸序列所編碼之本揭露之多肽的複製及表現。調節元件包括但不限於啟動子、強化子、多腺苷酸化信號、轉譯終止密碼子、核糖體結合元件、轉錄終止子、選擇標記、複製起點等。載體可包含一或多個表現匣。「表現匣(expression cassette)」係引導細胞機器以製造RNA及蛋白質的載體的一部分。表現匣一般包含三個組分：啟動子序列、開讀框、及可選地包含多腺苷酸化信號之3'-未轉譯區(UTR)。開讀框(open reading frame, ORF)係含有從開始密碼子至止擋密碼子之所關注蛋白質（例如，本揭露之多肽）之編碼序列的讀框。將表現匣之調節元件可操作地連接至編碼所關注多肽之多核苷酸序列。適用於本文所述之表現匣之任何組分可以任何組合及任何順序使用以製備本申請案之載體。
載體可包含較佳地在表現匣內之啟動子序列，以控制本揭露之多肽的表現。用語「啟動子(protective)」係以其習知意義使用，且係指起始可操作地連接的核苷酸序列的轉錄之核苷酸序列。啟動子位於其轉錄之核苷酸序列附近的同一股上。啟動子可係組成型、誘發型、或阻抑型。啟動子可係天然存在或合成的。啟動子可衍生自包括病毒、細菌、真菌、植物、昆蟲、及動物之來源。啟動子可係同源啟動子（亦即，衍生自與載體相同的遺傳來源）或異源啟動子（亦即，衍生自不同載體或遺傳來源）。較佳地，啟動子係位於表現匣內編碼本揭露之多肽的多核苷酸上游。例如，在自我複製RNA中，啟動子可為α病毒之次基因體啟動子。
在自我複製RNA中，載體可進一步包含穩定經表現轉錄本、增強RNA轉錄本的核輸出、及/或改善轉錄轉譯偶合的額外多核苷酸序列。此類序列之實例包括多腺苷酸化信號及強化子序列。多腺苷酸化信號一般位於載體之表現匣內的所關注蛋白質（例如，本揭露之多肽）之編碼序列下游。當由轉錄因子結合時，該等強化子序列係調節DNA序列，其強化相關基因的轉錄。增強子序列係較佳地位於編碼本揭露之多肽之多核苷酸序列上游，但在載體的表現匣內之啟動子序列下游。
可使用鑒於本揭露之所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何一個強化子序列。
本揭露之自我複製RNA載體的任何組分或序列可功能性或可操作地連接至任何其他組分或序列。自我複製RNA分子的組分或序列可被可操作地連接以在宿主細胞或經處理之有機體中表現至少一種蛋白質或肽（或生物治療劑）及/或複製子自我複製的能力。
當適當酶存在時，可操作地連接至編碼序列之啟動子或UTR能夠致效編碼序列的轉錄及表現。啟動子不需要與編碼序列鄰接，只要其具有引導其表現的作用即可。因此，編碼蛋白質或肽之RNA序列與調節序列（例如，啟動子或UTR）之間可操作性連接係允許關注多核苷酸表現的功能性連接。可操作地連接亦可指序列諸如編碼RdRp（例如，nsP4）、nsP1至4、UTR、啟動子之序列與編碼RNA複製子之其他序列係經連接，以使其得以轉錄及轉譯生物治療劑分子及/或複製複製子。UTR可藉由提供核糖體辨識及轉譯其他編碼序列所需之序列及間距而被可操作地連接。
如果分子表現與其天然（或野生型）對應分子至少50%相同的活性，則該分子具功能性或生物活性，但功能性分子亦可表現與其天然（或野生型）對應分子至少60%、或至少70%、或至少90%、或至少95%、或100%相同的活性。自我複製RNA分子亦可編碼衍生自或基於野生型α病毒胺基酸序列之胺基酸序列，表示它們與由野生型RNA α病毒基因體所編碼之胺基酸序列（其可為對應序列）具有至少60%、或至少65%、或至少68%、或至少70%、或至少80%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少95%、或至少97%、或至少98%、或至少99%、或100%、或80至99%、或90至100%、或95至99%、或95至100%、或97至99%、或98至99%序列同一性，該野生型RNA α病毒基因體可為新世界、或舊世界α病毒基因體。衍生自其他序列之序列比起原始序列可較長或較短至多5%、或至多10%、或至多20%、或至多30%。在任何實施例中，任何編碼其上之G3BP或FXR結合部位之核苷酸序列（或其上具有G3BP或FXR結合部位之胺基酸序列）的序列同一性可為至少95%、或至少97%、或至少98%、或至少99%、或100%。這些序列比起原始序列亦可較長或較短至多5%、或至多10%、或至多20%、或至多30%。宿主細胞
本揭露亦提供一種宿主細胞，其包含本揭露上述載體之任一者。在一些實施例中，宿主細胞係原核或真核宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞係PER.C6、PER.C6 TetO、雞胚胎纖維母細胞(CEF)、CHO、HEK293、HT-1080、HKB-11、CAP、HuH-7、或Age1細胞系。組成物
本揭露亦提供組成物，其包含本文所揭示之多核苷酸之任一者、多肽之任一者、及載體之任一者。在一些實施例中，組成物可包含載體，該載體包含本文所揭示之核苷酸之任一者，其中該載體係選自Ad26、GAd20、MVA、或自我複製RNA分子。
上述組成物之任一者可包含或調配成包含該組成物及醫藥上可接受之賦形劑的醫藥組成物。「醫藥上可接受(pharmaceutically acceptable)」係指賦形劑在所採用之劑量及濃度下，在其等所投予之對象中不會造成非所要或有害之效應，賦形劑包括載劑、緩衝劑、穩定劑、或所屬技術領域中具有通常知識者熟知之其他材料。載劑或其他材料之確切本質可取決投予途徑，例如肌內、皮下、口服、靜脈內、皮膚、黏膜內（例如，腸道）、鼻內、或腹膜內途徑。可包括液體載劑，諸如水、石油、動物或植物油、礦物油、或合成油。可包括生理食鹽水溶液、右旋糖或其他醣類溶液、或二醇，諸如乙二醇、丙二醇、或聚乙二醇。例示性配方係Adenovirus World Standard (Hoganson et al, 2002)：20 mM Tris pH 8、25 mM NaCl、2.5%甘油；或20 mM Tris、2 mM MgCl2、25 mM NaCl、蔗糖10% w/v、聚山梨醇酯-80 0.02% w/v；或10至25 mM檸檬酸鹽緩衝劑pH 5.9至6.2、4至6% (w/w)羥丙基-β-環糊精(HBCD)、70至100 mM NaCl、0.018至0.035% (w/w)聚山梨醇酯-80、及可選地0.3至0.45% (w/w)乙醇。可使用許多其他緩衝劑，且適用於純化醫藥製劑之儲存及醫藥投予的配方之實例係已知的。
組成物可包含一或多種佐劑。該佐劑之實例包括但不限於：無機佐劑（例如，無機金屬鹽，諸如磷酸鋁或氫氧化鋁）、有機佐劑（例如，皂素、或角鯊烯）、基於油之佐劑（例如，Freund氏完全佐劑、及Freund氏不完全佐劑）、脂質體、或可生物降解微球）、病毒體、細菌佐劑（例如，單磷醯脂A、或胞壁醯肽）、合成佐劑（例如，非離子嵌段共聚物、胞壁醯肽類似物、或合成脂質A）、或合成多核苷酸佐劑（例如，聚精胺酸、或聚離胺酸）。佐劑之其他非限制性實例包括QS-21、Detox-PC、MPL- SE、MoGM-CSF、TiterMax-G、CRL- 1005、GERBU、TERamide、PSC97B、Adjumer、PG-026、GSK-I、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax、CpG ODN、Betafectin、Alum、及MF59。
可使用之其他佐劑包括凝集素、生長因子、細胞介素、及淋巴激素，諸如α干擾素、γ干擾素、血小板衍生生長因子(PDGF)、顆粒球群落刺激因子(GCSF)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GMCSF)、腫瘤壞死因子(TNF)、表皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、或TLR促效劑、及微粒佐劑（例如，免疫刺激複合物(ISCOMS)）。 奈米粒子
在一些實施例中，組成物可包含奈米粒子。本揭露之多核苷酸之任一者可附接至或接觸奈米粒子以遞送至對象。使用奈米粒子來遞送本揭露之多核苷酸或多肽之任一者可免除在疫苗組成物中包括病毒或佐劑之需要。本揭露之多核苷酸可係DNA或RNA。奈米粒子可含有幫助有效誘發對肽之免疫反應的免疫危險信號。奈米粒子可誘發樹突細胞(DC)活化及成熟，此為穩健免疫反應所需的。奈米粒子可含有改善細胞（諸如抗原呈現細胞）對奈米粒子（因而肽）之吸收的非自身組分。
奈米粒子直徑一般為約1 nm至約100 nm，諸如約20 nm至約40 nm。平均直徑為20至40 nm之奈米粒子可促進胞質液對奈米粒子之吸收（參見例如，WO2019/135086）。例示性奈米粒子係聚合奈米粒子、無機奈米粒子、脂質體、脂質奈米粒子(LNP)、免疫刺激複合物(ISCOM)、類病毒顆粒(VLP)、或自組裝蛋白質。奈米粒子可係磷酸鈣奈米粒子、矽奈米粒子、或金奈米粒子。聚合奈米粒子可包含一或多種合成聚合物，諸如聚(d,l-乳酸交酯-共-乙交酯) (PLG)、聚(d,l-乳酸-共乙醇酸) (PLGA)、聚(g-麩胺酸) (g-PGA)m聚(乙二醇) (PEG)、或聚苯乙烯或一或多種天然聚合物，諸如多醣，例如聚三葡萄糖(pullulan)、藻酸鹽、菊糖、及幾丁聚醣。使用聚合奈米粒子因為可包括在奈米粒子中之聚合物的性質而可能是有利的。例如，以上列舉之天然及合成聚合物可具有良好生物相容性及生物降解性、無毒本質、及/或經操縱成所欲形狀及大小之能力。聚合奈米粒子亦可形成水凝膠奈米粒子、具有有利性質（包括彈性的網格大小、對於多價偶聯而言大的表面積、高水含量、及高抗原裝載容量）之親水性三維聚合物網絡。聚合物（諸如聚(L-乳酸) (PLA)、PLGA、PEG、及多醣）適用於形成水凝膠奈米粒子。無機奈米粒子一般具有剛性結構，並包含殼體（抗原係包封於其中）或核心（抗原可共價附接至其）。核心可包含一或多種原子，諸如金(Au)、銀(Ag)、銅(Cu)原子、Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd、或Au/Ag/Cu/Pd、或磷酸鈣(CaP)。
在一些實施例中，奈米粒子可係脂質體。脂質體一般係形成自可生物降解、無毒性磷脂質，且包含自組裝磷脂質雙層殼體及水性核心。脂質體可係包含單一磷脂質雙層之單層囊泡、或包含數個由水層隔開之同心磷脂質殼體的多層囊泡。因此，可將脂質體訂製為將親水性分子結合至水性核心中或將疏水性分子結合在磷脂質雙層內。脂質體可將本揭露之多核苷酸或多肽或其片段包封在核心內以進行遞送。脂質體及脂質體配方可根據標準方法來製備且在所屬技術領域中係熟知的，參見例如Remington's；Akimaru, 1995, Cytokines Mol. Ther. 1: 197-210；Alving, 1995, Immunol. Rev. 145: 5-31；Szoka, 1980, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467；美國專利第4,235,871號；美國專利第4,501,728號；及美國專利第4,837,028號。脂質體可包含靶向分子以使脂質體複合物靶向特定細胞類型。靶向分子可包含針對生物分子（例如，受體或配體）之結合夥伴（例如，配體或受體）在血管表面或目標組織中所發現之細胞表面上。脂質體電荷係脂質體從血液中清除之重要決定因素，帶負電荷之脂質體會被網狀內皮系統更快速吸收(Juliano, 1975, Biochem. Biophys. Res. Commun. 63: 651)，並因此在血流中具有較短半衰期。結合磷脂醯乙醇胺(phosphatidylethanolamine)衍生物會藉由防止脂質體聚集而增加循環時間。例如，將N-(ω-羧基)醯基醯胺基磷脂醯乙醇胺結合至L-α-二硬脂醯磷脂醯膽鹼之大單層囊泡會大幅增加體內脂質體循環壽命（參見例如，Ahl, 1997, Biochim. Biophys. Acta 1329: 370-382）。一般而言，將脂質體製備為具有約5至15莫耳百分比帶負電荷磷脂質，諸如磷脂醯甘油、磷脂醯絲胺酸、或磷脂醯-肌醇。所添加之帶負電荷磷脂質（諸如磷脂醯甘油）亦具有防止自發脂質體聚集的功用，並因而使尺寸過小脂質體聚集體形成之風險降至最低。膜剛性化劑(rigidifying agent)（諸如鞘磷脂或飽和中性磷脂質，在至少約50莫耳百分比之濃度下）及5至15莫耳百分比的單唾液基神經節苷脂(monosialylganglioside)亦可所欲地賦予脂質體性質，諸如剛性（參見例如，美國專利第4,837,028號）。此外，脂質體懸浮液可包括脂質保護劑，其會保護脂質在儲存時免受自由基及脂質過氧化損傷。親脂性自由基淬滅劑（諸如α-生育酚及水溶性鐵特異性螯合劑，諸如鐵草胺(ferrioxianine)）係較佳的。
自我複製RNA分子及/或包含彼之組成物亦可使用聚合物、脂質、及/或其他可生物降解劑諸如但不限於磷酸鈣、聚合物之組合來調配為奈米粒子。可將組分組合成核心-殼體、雜交物、及/或層層(layer-by-layer)架構，以允許微調奈米粒子使得本揭露之分子及/或組成物之遞送可被增強。
在一些實施例中，奈米粒子可包括具有異質大小之多層囊泡。例如，可將形成囊泡之脂質溶於合適有機溶劑或溶劑系統中，並在真空或惰氣下乾燥以形成薄脂質膜。如果需要，可將膜再溶於合適溶劑（諸如三級丁醇）中，然後冷凍乾燥以形成更均勻之脂質混合物，其係呈更容易水合之粉末狀形式。將此膜用多肽或多核苷酸之水溶液覆蓋並讓其水合，一般經過15至60分鐘期間並伴隨攪拌。所得多層囊泡之大小分佈可藉由使脂質在更激烈之攪拌條件下或藉由添加助溶清潔劑（諸如去氧膽酸鹽(deoxycholate)）而朝向較小之大小偏移。水合介質可包含核酸，其濃度係在最終脂質體懸浮液內脂質體內部體積中所欲者。可用來形成多層囊泡之合適脂質包括DOTMA (Feigner, et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417)、DOGS、或Transfectain™ (Behr, et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6982- 6986)、DNERIE或DORIE（Feigner, et al.，方法5：67-75）、DC-CHOL (Gao and Huang, 1991, BBRC 179: 280-285)、DOTAP™ (McLachlan, et al., 1995, Gene Therapy 2: 674-622)、Lipofectamine™、及甘油脂質化合物（參見例如，EP901463及W098/37916）。
在一些實施例中，奈米粒子可係免疫刺激複合物(ISCOM)。ISCOM係籠狀粒子，其一般係形成自膠態含皂素微胞。ISCOM可包含膽固醇、磷脂質（諸如磷脂醯乙醇胺或磷脂醯膽鹼）及皂素（諸如Quil A，來自皂樹(Quillaia saponaria)樹木）。
在一些實施例中，奈米粒子可係類病毒顆粒(VLP)。VLP係缺乏感染性核酸之自組裝奈米粒子，其係藉由生物相容性殼體蛋白之自組裝而形成。VLP之直徑一般係約20至約l50 nm，諸如約20至約40 nm、約30至約l40 nm、約40至約l30 nm、約50至約l20 nm、約60至約110 nm、約70至約100 nm、或約80至約90 nm。VLP有利地利用進化病毒結構之威力，此結構針對與免疫系統之交互作用而經自然最佳化。經自然最佳化之奈米粒子大小及重複結構順序意指VLP會誘發強力之免疫反應，即使佐劑不存在亦然。
適用於與本揭露之多核苷酸複合的其他分子包括陽離子分子，諸如聚醯胺基胺(Haensler and Szoka, 1993, Bioconjugate Chem.4: 372-379)、樹枝狀聚離胺酸（國際專利公開號WO1995/24221）、聚乙烯亞胺(polyethylene irinine)或聚丙烯亞胺(polypropylene h-nine)（國際專利公開號WO1996/02655）、聚離胺酸（美國專利第5,595,897號）、幾丁聚醣（美國專利第5,744,166號）、DNA-明膠凝聚物（參見例如，美國專利第6,207,195號；美國專利第6,025,337號；美國專利第5,972,707號）或DEAE葡聚糖(Lopata, et al., 1984, Nucleic Acid Res. 12: 5707-5717)。
在一些實施例中，自我複製RNA分子可經包裝或包封於陽離子分子中，諸如聚醯胺基胺(Haensler and Szoka, 1993, Bioconjugate Chem. 4: 372-379)、樹枝狀聚離胺酸（國際專利公開號WO1995/24221）、聚乙烯亞胺(polyethylene irinine)或聚丙烯亞胺(polypropylene h-nine)（國際專利公開號WO1996/02655）、聚離胺酸（美國專利第5,595,897號）、幾丁聚醣（美國專利第5,744,166號）、DNA-明膠凝聚物（參見例如，美國專利第6,207,195號；美國專利第6,025,337號；美國專利第5,972,707號）或DEAE葡聚糖(Lopata, et al., 1984, Nucleic Acid Res.12: 5707-5717)、樹枝狀聚合物（參見例如，WO1996/19240）、或聚乙烯亞胺(PEI)（參見例如，Sun et al., 2014, Mol Med Rep. 10(5):2657-2662）。
所揭示之自我複製RNA分子及/或包含編碼本揭露之多肽之任一者的自我複製RNA分子之組成物可使用一或多種脂質體、脂質複合物、及/或脂質奈米粒子包封。脂質體係人工製備之囊泡，其主要可由脂質雙層構成且可用來作為投予多核苷酸及自我複製RNA分子之遞送媒劑。脂質體可具有不同大小，諸如但不限於直徑可為數百奈米且可含有一系列由狹窄水性隔室隔開之同心雙層之多層囊泡(MLV)、直徑可小於50 nm之小型單細胞囊泡(SUV)、及直徑可介於50與500 nm之間之大型單層囊泡(LUV)。脂質體設計可包括但不限於為了改善脂質體附著至不健康組織或為了活化事件諸如但不限於胞飲作用之調理素或配體。為了改善本文所揭示之多核苷酸及自我複製RNA分子的遞送，脂質體可含有低或高pH。
脂質體的形成可取決於物理化學特徵，諸如但不限於：所包埋之醫藥配方及脂質體成分、脂質囊泡分散於其中之介質的本質、經包埋之物質的有效濃度及其潛在毒性、在施用及/或遞送囊泡期間涉及之任何額外過程、用於意欲應用之囊泡的最佳大小、多分散性及架儲期、及批次對批次再現性、及大規模生產安全及有效脂質體產物的可能性。
在一些實施例中，自我複製RNA分子係包封於下列中、與下列結合、或吸附在下列上：脂質體、脂質複合物、脂質奈米粒子、或其組合，較佳地自我複製RNA分子係包封於脂質奈米粒子中。
在一些實施例中，編碼本揭露之多肽之任一者之自我複製RNA分子可完全包封於粒子的脂質部分內，藉此保護RNA免於核酸酶降解。「經完全包封(fully encapsulated)」是指當暴露於將顯著降解游離RNA之血清或核酸酶檢定之後，RNA並未顯著降解。當完全包封時，較佳地小於25%之粒子中的核酸在正常降解100%游離核酸之處理中降解，更佳的是小於10%、及最佳的是小於5%之粒子中的核酸係經降解。「經完全包封」亦指核酸-脂質粒子在經體內投予後不會快速分解成其組分部分。
在一些實施例中，自我複製RNA分子及/或包含彼之本揭露之組成物可經調配於在官能化脂質雙層之間可具有交聯之脂質囊泡中。在一些實施例中，本揭露之自我複製RNA分子及/或組成物可經調配於脂質-多價陽離子複合物中。該脂質-多價陽離子複合物的形成可藉由所屬技術領域中已知的方法完成。作為非限制性實例，多價陽離子可包括陽離子肽或多肽，諸如但不限於聚離胺酸、聚鳥胺酸、及/或聚精胺酸、及陽離子肽。在一些實施例中，本文所揭示之自我複製RNA分子及/或組成物可經調配於脂質-多價陽離子複合物中，該複合物可進一步包括中性脂質，諸如但不限於膽固醇或二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)。脂質奈米粒子配方可受到但不限於下列影響：陽離子脂質組分的選擇、陽離子脂質飽和程度、聚乙二醇化之本質、所有組分之比例、及生物物理學參數（諸如大小）。
在一些實施例中，在本文中揭示之自我複製RNA分子係包封於如圖20所示之脂質奈米粒子(LNP)中。脂質奈米粒子一般包含四種不同脂質—可離子化脂質、中性輔助脂質、膽固醇、及可擴散聚乙二醇(PEG)脂質。LNP類似於脂質體但具有稍微不同之功能及組成。LNP是針對包封多核苷酸（諸如DNA、mRNA、siRNA、及sRNA）而設計。傳統脂質體含有受一或多個脂質雙層包圍之水性核心。LNP可採取類微胞結構，將多核苷酸包封在非水性核心中。LNP一般含有陽離子脂質、非陽離子脂質、及防止粒子聚集之脂質（例如，PEG-脂質偶聯物）。LNP可用於全身性施用，因為其在靜脈內(i.e.)注射後展現出延長之循環壽命，並會累積在遠端部位（例如，與投予部位實體上分開之部位）。LNP可具有約50 nm至約150 nm之平均直徑，諸如約60 nm至約130 nm、或約70 nm至約110 nm、或約70 nm至約90 nm，且係實質上無毒性的。裝載多核苷酸之LNP的製備係揭示於例如美國專利第5,976,567號；第5,981,501號；第6,534,484號；第6,586,410號；第6,815,432號；及PCT公開號WO 96/40964。含多核苷酸之LNP係描述於例如WO2019/191780中。
在一些實施例中，脂質奈米粒子包含陽離子脂質（例如，本文所述之一或多個陽離子脂質、或其鹽）、磷脂質、及抑制粒子聚集之共軛脂質（例如，一或多種PEG-脂質共軛體）。脂質粒子亦可包括膽固醇。脂質粒子可包封至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多個編碼一或多個多肽之自我複製RNA分子。
在一些實施例中，包含多價陽離子組成物之LNP配方可用於體內及/或體外遞送本文所述之自我複製RNA分子。本揭露進一步提供包含陽離子脂質之LNP配方。
用語「陽離子脂質(cationic lipid)」及「胺基脂質(amino lipid)」在本文中可互換使用以包括該些具有一、二、三、或更多個脂肪酸或脂肪烷基鏈及pH可滴定胺基頭部基團（例如，烷基胺基或二烷基胺基頭部基團）的脂質及其鹽。陽離子脂質一般在低於陽離子脂質之pKa的pH下係經質子化（即，帶正電）且在高於pKa的pH下係實質上中性。陽離子脂質亦可稱為可滴定陽離子脂質。在一些實施例中，陽離子脂質包含：可質子化三級胺（例如，pH可滴定）頭部基團；C18烷基鏈，其中各烷基鏈獨立地具有0至3個（例如，0、1、2、或3個）雙鍵；及介於頭部基團與烷基鏈之間的醚、酯、或縮酮鍵聯。該陽離子脂質包括但不限於：DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、γ-DLenDMA、DLin-K- DMA、DLin-K-C2-DMA（亦稱為DLin-C2K-DMA、XTC2、及C2K）、DLin-K-C3-DM A、DLin-K-C4-DMA、DLen-C2K-DMA、y-DLen-C2K-DMA、DLin-M-C2-DMA（亦稱為MC2）、DLin-M-C3-DMA（亦稱為MC3）、及(DLin-MP-DMA)（亦稱為1-B1 1）。
本揭露亦提供經包封之自我複製RNA分子，其中陽離子脂質包含可質子化三級胺。在一些實施例中，陽離子脂質係二((Z)-壬-2-烯-1-基)8,8’-((((2-(二甲基胺基)乙基)硫基)羰基)氮烷二基)二辛酸酯。
在一些實施例中，陽離子脂質化合物係相對無細胞毒性。陽離子脂質化合物可為可生物相容及可生物降解。陽離子脂質可具有在大約5.5至大約7.5範圍內、更佳的是介於大約6.0與大約7.0之間之pKa。
在本文中描述之陽離子脂質化合物因為數個原因用於藥物遞送特別具有吸引力：其等含有胺基基團以與DNA、RNA、其他多核苷酸、及其他帶負電劑交互作用、以緩衝pH、以造成內滲透(endo-osmolysis)、以保護待遞送之自我複製RNA分子；其等可自市售起始材料合成；及/或其等具pH反應性且可經工程改造以具有所欲pKa。
脂質奈米粒子配方可藉由將陽離子脂質置換成可生物降解陽離子脂質來改善，其被稱為快速消除脂質奈米粒子(reLNP)。可離子化陽離子脂質（諸如但不限於DLinDMA、DLin-KC2-DMA、及DLin-MC3-DMA）已顯示隨時間累積在血漿及組織中且可為毒性之潛在來源。快速消除脂質的快速代謝可改善脂質奈米粒子的耐受性及治療指數達數量級，在大鼠從1 mg/kg之劑量至10 mg/kg之劑量。包括經酶催化降解之酯鍵聯可改善陽離子組分的降解及代謝輪廓，同時仍維持reLNP配方之活性。酯鍵聯可內部位於脂質鏈內或其可末端位於脂質鏈末端。內部酯鍵聯可置換脂質鏈中的任何碳。脂質粒子可包含脂質共軛體。共軛脂質可用於防止粒子聚集。合適的共軛脂質包括但不限於PEG-脂質共軛體、陽離子-聚合物-脂質共軛體、及其混合物。
PEG係具有二個末端羥基之乙烯PEG重複單元的線性、水溶性聚合物。PEG係藉由其分子量分類；且包括下列：單甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、單甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、單甲氧基聚乙二醇-琥珀醯亞胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、單甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、單甲氧基聚乙二醇-三氟乙基磺酸酯(MePEG-TRES)、單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)、以及含有末端羥基而非末端甲氧基之該等化合物（例如，HO-PEG-S、HO-PEG-S-NHS、HO- PEG-NH2）。
本文所述之PEG-脂質共軛體的PEG部份可包含自550道爾頓至10,000道爾頓不等之平均分子量。PEG-脂質之實例包括但不限於PEG耦合至二烷基氧基丙基(PEG-DAA)、PEG耦合至二醯基甘油(PEG-DAG)、PEG耦合至磷脂質諸如磷脂醯乙醇胺(PEG- PE)、PEG共軛至腦醯胺、PEG共軛至膽固醇或其衍生物、及其混合物。在一些實施例中，PEG共軛脂質係DMG-PEG-2000。
自我複製RNA分子亦可經調配於包含非陽離子脂質之粒子中。合適之非陽離子脂質包括例如能夠生產穩定複合物之中性不帶電、兩性離子、或陰離子脂質。非陽離子脂質之非限制性實例包括磷脂質，諸如卵磷脂、磷脂醯乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、鞘磷脂、蛋鞘磷脂(ESM)、腦磷脂、心磷脂、磷脂酸、腦苷脂、雙十六基磷酸酯、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯基油醯基-磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯基-油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE)、棕櫚醯基油醯基-磷脂醯甘油(POPG)、二油醯基磷脂醯乙醇胺4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-l-羧酸酯(DOPE-mal)、磷脂醯乙醇胺磷脂醯乙醇胺磷脂醯乙醇胺磷脂醯乙醇胺、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯乙醇胺二棕櫚醯基-二肉豆蔻醯基-二硬脂醯基-單甲基-二甲基-二反油醯基-硬脂醯基油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)、溶血磷脂醯膽鹼、二亞麻油醯基磷脂醯膽鹼、及其混合物。亦可使用其他二醯基磷脂醯膽鹼及二醯基磷脂醯乙醇胺磷脂質。這些脂質中的醯基係較佳地衍生自具有C10至C24碳鏈之脂肪酸的醯基，例如月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基、硬脂醯基、或油醯基。
非陽離子脂質之額外實例包括固醇，諸如膽固醇及其衍生物。膽固醇衍生物之非限制性實例包括極性類似物，諸如5a-膽甾烷醇、5a-糞甾烷醇、膽硬脂基-(2'-羥基)-乙醚、膽硬脂基-(4'-羥基)-丁基醚、及6-酮基膽甾烷醇。非極性類似物諸如5a-膽甾烷、膽甾烯酮、5a-膽甾烷酮、5a-膽甾烷酮、及膽硬脂基癸酸酯；及其混合物。在較佳實施例中，膽固醇衍生物係極性類似物，諸如膽硬脂基-(4'-羥基)-丁基醚。在一些實施例中，磷脂質係DSPC。在一些實施例中，存在於脂質粒子中之非陽離子脂質包含下列或由下列組成：一或多種磷脂質及膽固醇或其衍生物之混合物。在一些其中脂質粒子含有磷脂質及膽固醇或膽固醇衍生物之混合物之實施例中，混合物可包含至多40 mol %、45 mol %、50 mol %、55 mol %、或60 mol %之總脂質存在於粒子中。
在一些實施例中，LNP可包含30至70%陽離子脂質化合物、0至60%膽固醇、0至30%磷脂質、及1至10%聚乙二醇(PEG)。
在一些實施例中，陽離子脂質、兩性離子脂質、膽固醇、及經共軛之脂質係分別以50:7:40:3之莫耳比組合於脂質奈米粒子中。
在一些實施例中，本文所述之LNP配方可額外包含通透性增強分子。
在一些實施例中，奈米粒子配方可為包含碳水化合物載劑及自我複製RNA分子之碳水化合物奈米粒子。作為非限制性實例，碳水化合物載劑可包括但不限於經酐修飾之植物糖原或糖原類型材料、植物糖原辛烯基琥珀酸鹽、植物糖原β-糊精、及經酐修飾之植物糖原β-糊精。套組
本揭露亦提供一種套組，其包含本揭露之一或多個組成物、一或多個多核苷酸、一或多個多肽、或一或多個載體。本揭露亦提供一種套組，其包含一或多個本揭露之重組病毒。套組可用於促進執行本文中所述之方法。在一些實施例中，套組進一步包含用於促進本揭露之疫苗進入細胞的試劑，諸如基於脂質之配方或病毒包裝材料。
在一些實施例中，套組包含一或多個Ad26載體，其包含本揭露之多核苷酸之任一者。在一些實施例中，套組包含一或多個MVA載體，其包含本揭露之多核苷酸之任一者。在一些實施例中，套組包含一或多個GAd20載體，其包含本揭露之多核苷酸之任一者。在一些實施例中，套組包含一或多個自我複製RNA分子，其包含本揭露之多核苷酸之任一者。
在一些實施例中，套組包含本揭露之Ad26載體及本揭露之MVA載體。在一些實施例中，套組包含本揭露之GAd20載體及本揭露之MVA載體。在一些實施例中，套組包含本揭露之Ad26載體及本揭露之Gad20載體。在一些實施例中，套組包含本揭露之自我複製RNA分子及本揭露之Gad20載體。在一些實施例中，套組包含本揭露之自我複製RNA分子及本揭露之MVA載體。在一些實施例中，套組包含本揭露之自我複製RNA分子及本揭露之Ad26載體。在一些實施例中，套組包含一或多個本揭露之多核苷酸。在一些實施例中，套組包含一或多個本揭露之多肽。在一些實施例中，套組包含一或多個本揭露之細胞。其他分子 肽-HLA複合物
本揭露亦提供一種蛋白質複合物，其包含人類白血球抗原(HLA)及多肽，該多肽包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO: 31、或其片段之胺基酸序列。
在一些實施例中，片段係在本文中揭示之多肽之任一者的免疫原性片段。在一些實施例中，片段係介於約6與25個胺基酸之間長。在一些實施例中，片段係約6個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約7個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約8個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約9個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約10個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約11個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約12個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約13個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約14個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約15個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約16個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約17個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約18個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約19個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約20個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約21個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約22個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約23個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約24個胺基酸長。在一些實施例中，片段係約25個胺基酸長。
在一些實施例中，HLA係HLA I類或HLA II類。
在一些實施例中，HLA係HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-B*07:02、及HLA-C*07:02、或其任何組合。
在一些實施例中，蛋白質複合物係與偵測劑或細胞毒性劑共軛。
本揭露亦提供一種特異性結合本揭露之多肽或HLA與多肽之複合物的經單離之蛋白質分子。 蛋白質分子
在一些實施例中，蛋白質分子係抗體、替代支架、嵌合抗原受體(CAR)、或T細胞受體(TCR)。
在一些實施例中，蛋白質分子係抗體。
在一些實施例中，蛋白質分子係替代支架。
在一些實施例中，蛋白質分子係嵌合抗原受體(CAR)。
在一些實施例中，蛋白質分子係T細胞受體(TCR)。
蛋白質分子與本揭露之多肽或肽-HLA複合物的結合可使用任何合適方法以實驗方式判定。此類方法可利用ProteOn XPR36、Biacore 3000或KinExA儀器設備、ELISA或所屬領域中具有通常知識者已知的競爭性結合檢定。如果在不同條件（例如，滲透性、pH）下測量，則所測得之結合可能有所變化。因此，親和力及其他結合參數（例如KD 、Kon 、Koff ）之測量一般是以標準化條件及標準化緩衝液進行，諸如本文中所述之緩衝液。所屬領域中具有通常知識者將理解，在一般偵測極限內，親和力測量（例如使用Biacore 3000或ProteOn進行）的內部誤差（測量為標準偏差(SD)）一般可在測量結果的5至33%內。「非實質(insubstantial)」係指相較於所測得蛋白質分子與本揭露之多肽或HLA/肽的結合時低上100倍。 抗體
結合多肽或HLA/肽複合物之抗體可使用已知方法產生。舉例而言，Kohler及Milstein,Nature 256:495, 1975之融合瘤法可用來產生單株抗體。在融合瘤法中，將小鼠或其他宿主動物（諸如倉鼠、大鼠、或猴子）用一或多種多肽或其片段來免疫化，接著使用標準方法將來自經免疫化動物之脾細胞與骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤細胞(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。對自單一永生化融合瘤細胞產生之群落針對是否生產出具有所欲性質之抗體進行篩選，該等所欲性質諸如結合特異性及親和力。
可使用各種宿主動物來生產抗體。例如，Balb/c小鼠、大鼠、或雞可用以產生含有VH/VL對之抗體，而駱馬及羊駝可用以使用標準免疫化規程來產生僅重鏈(heavy chain only) (VHH)抗體。在非人類動物中所製造之抗體可使用各種技術來人源化，以產生更近似人類序列。
例示性人源化技術（包括人類受體架構之選擇）係已知的，且包括CDR移植（美國專利第5,225,539號）、SDR移植（美國專利第6,818,749號）、表面重塑(resurfacing) (Padlan, (1991)Mol Immunol 28:489-499)、特異性決定殘基表面重塑(specificity determining residues resurfacing)（美國專利公開號2010/0261620）、人類架構適應（美國專利第8,748,356）、及超人源化(superhumanization)（美國專利第7,709,226號）。在這些方法中，將親本抗體之CDR轉移至人類架構上，該等架構可基於其與親本架構之整體同源性、基於CDR長度之相似性、或正則結構(canonical structure)同一性、或其任何組合來選擇。
可將人源化抗體進一步最佳化以改善其對所欲抗原的選擇性或親和力，此係藉由諸如在國際專利申請案公開號WO1090/007861及WO1992/22653中所述之技術，藉由引入經修改架構支撐殘基以保持結合親和力（回復突變(backmutation)），或藉由在例如任何CDR引入變異以改善抗體的親和力。
在其基因體中攜帶人類免疫球蛋白(Ig)基因位點的基因轉殖動物（諸如小鼠或大鼠）可用於產生針對目標蛋白的人類抗體，且係描述於例如下列文獻中：美國專利第6,150,584號、國際專利公開號WO99/45962、國際專利公開號WO2002/066630、WO2002/43478、WO2002/043478、及WO1990/04036。可將此動物中之內源性免疫球蛋白基因座破壞或刪除，且可使用同源或非同源重組、使用轉染色體(transchromosome)、或使用袖珍基因(minigene)將至少一個完整或部分人類免疫球蛋白基因座插入動物基因組中。可聘用諸如Regeneron (http://_www_regeneron_com)、Harbour Antibodies (http://_www_harbourantibodies_com)、Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (http://_www_omtinc_net)、KyMab (http://_www_kymab_com)、Trianni (http://_www.trianni_com)及Ablexis (http://_www_ablexis_com)等公司來使用如上所述之技術提供針對所選抗原的人類抗體。
人類抗體可選自噬菌體展示庫，其中噬菌體經工程改造以表現人類免疫球蛋白或其部分，諸如Fab、單鏈抗體(scFv)、或未配對或配對抗體可變區。本揭露之抗體可自例如表現抗體重鏈及輕鏈可變區為具有噬菌體pIX外套蛋白質之多肽的噬菌體展示庫單離。該等庫可篩選出結合至所欲抗原之噬菌體，且所得之陽性殖株可經進一步表徵，將Fab從殖株溶解產物(lysate)單離出來，且表現為全長IgG。此類用於單離人類抗體的噬菌體展示方法係在例如下列中被描述：美國專利第5,223,409、5,403,484、5,571,698、5,427,908、5, 580,717、5,969,108、6,172,197、5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915及6,593,081號。
免疫原性抗原之製備及單株抗體生產可使用任何合適技術來執行，諸如重組蛋白質生產或藉由肽之化學合成。免疫性抗原可用經純化的蛋白質或包括全細胞或細胞或組織抽出物的蛋白質混合物之形式來投予給動物，或者抗原可由編碼前述抗原或其之一部分的核酸於該動物體內重新地(de novo)形成。 替代支架
結合多肽或HLA/肽複合物之替代支架（亦稱為抗體擬似物）可使用所屬技術領域中已知及本文中所述之各種支架來產生。替代支架可係單抗體，設計用來併入纖連蛋白素(fibronectin)或腱生蛋白(tenascin)之纖連蛋白素III型域(Fn3)作為蛋白質支架（美國專利第6,673,901號；美國專利第6,348,584號），或併入合成FN3域（諸如tencon），如美國專利公開號2010/0216708及美國專利公開號2010/0255056中所述。額外替代支架包含Adnectin™、iMab、Anticalin®、EETI-II/AGRP、Kunitz域、硫氧化還原蛋白肽適配體(thioredoxin peptide aptamer)、Affibody®、DARPin、Affilin、Tetranectin、Fynomer、及Avimer。替代支架係單鏈多肽架構，其含有與高構形容許度之可變域相關聯的高度結構化核心，從而容許可變域內之插入、缺失、或其他取代。將多樣性引入一或多個可變域（且在一些情況下引入結構化核心）之庫可使用已知規程來產生，且可對所得之庫針對與本揭露之新抗原的結合進行篩選，且可進一步將所識別出之結合子(binder)針對其特異性使用已知方法來表徵。替代支架可衍生自蛋白質A（尤其是其Z域（親和抗體(affibody)））、ImmE7（免疫蛋白）、BPTI/APPI（Kunitz域）、Ras結合蛋白AF-6（PDZ域）、卡律蝎毒素(charybdotoxin)（蠍毒素）、CTLA-4、Min-23（打結素(knottin)）、脂質運載蛋白(lipocalin) (anticalin)、新抑癌素(neokarzinostatin)、纖連蛋白域、錨蛋白共有重複域(ankyrin consensus repeat domain)、或硫氧化還原蛋白(Skerra, A.，「Alternative Non-Antibody Scaffolds for Molecular Recognition，」Curr. Opin. Biotechnol . 18:295-304 (2005); Hosse et al.，「A New Generation of Protein Display Scaffolds for Molecular Recognition，」Protein Sci . 15:14-27 (2006); Nicaise et al.，「Affinity Transfer by CDR Grafting on a Nonimmunoglobulin Scaffold，」Protein Sci . 13:1882-1891 (2004); Nygren and Uhlen，「Scaffolds for Engineering Novel Binding Sites in Proteins，」Curr. Opin. Struc. Biol . 7:463-469 (1997)。 嵌合抗原受體(CAR)
可產生結合多肽或HLA/肽複合物之CAR。嵌合抗原受體(CAR)係經基因工程改造受體。這些經工程改造受體可根據所屬技術領域中已知之技術輕易插入免疫細胞並由免疫細胞表現，包括T細胞。利用CAR，單一受體可經設定(programmed)以辨識特異性抗原，且當與抗原結合時，活化免疫細胞以攻擊及摧毀帶有該抗原之細胞。當這些抗原存在於腫瘤細胞上時，表現CAR之免疫細胞可靶向且殺滅腫瘤細胞。
CAR一般包含與抗原結合之胞外域、可選的連接子、跨膜域、及包含共刺激域及/或傳訊域之胞質域。
CAR之胞外域可含有任何結合所欲抗原的多肽。胞外域可包含scFv、抗體的一部分或替代支架。CAR亦可經工程改造以結合二或更多種所欲抗原，該等抗原可係串聯排列且由連接子序列隔開。例如，一或多個域抗體、scFv、駱馬VHH抗體或其他僅VH抗體片段可經由連接子串聯組織，以提供雙特異性或多特異性給CAR。
CAR之跨膜域可衍生自下列之跨膜域：CD8、T細胞受體之α、β、或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1（CDI la、CD18）、ICOS (CD278)、4-1 BB (CD137)、4-1 BBL、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRFI)、CD160、CD1 9、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDI Id、ITGAE、CD103、ITGAL、CDI la、LFA-1、ITGAM、CDI lb、ITGAX、CDI lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD1 8、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、及/或NKG2C。
CAR之細胞內共刺激域可衍生自一或多個共刺激分子之胞內域。共刺激分子係除抗原受體或Fc受體以外之廣為周知之細胞表面分子，其提供T淋巴細胞與抗原結合時有效活化及作動所需的第二信號。可用於CAR之例示性共刺激域係4-1BB、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54 (ICAM)、CD83、CD134 (OX40)、CD150 (SLAMF1)、CD152 (CTLA4)、CD223 (LAG3)、CD270 (HVEM)、CD278 (ICOS)、DAP10、LAT、NKD2C SLP76、TRIM、及ZAP70之胞內域。
CAR之細胞內傳訊域可衍生自例如CD3ζ、CD3ε、CD22、CD79a、CD66d或CD39之傳訊域。「胞內傳訊域(intracellular signaling domain)」係指CAR多肽參與傳導有效CAR與目標抗原結合之訊息至免疫效應細胞內部以誘發效應細胞功能的CAR多肽部分，效應細胞功能例如活化、細胞介素生產、增生及細胞毒性活性（包括將細胞毒性因子釋放至CAR結合之目標細胞）、或在抗原結合至胞外CAR域後所誘發的其他細胞反應。
位於胞外域與跨膜域之間的CAR之可選連接子可係長度約2至100個胺基酸之多肽。連接子可包括可撓性殘基或由可撓性殘基構成，諸如甘胺酸及絲胺酸，使得相鄰蛋白質域可相對於彼此自由移動。當確保二個相鄰結構域在空間上不互相干擾係為所欲時，可使用較長連接子。連接子可為可切割或不可切割。可切割連接子之實例包括2A連接子（例如T2A）、2A樣連接子或其功能等效物及其組合。連接子亦可衍生自任何免疫球蛋白之鉸鏈區或鉸鏈區的一部分。
可使用之例示性CAR係例如含有結合與本揭露之CALR/JAK2多肽片段複合之HLA的胞外域、CD8跨膜域、及CD3ζ傳訊域之CAR。其他例示性CAR含有CD8或CD28跨膜域、CD28、41BB或OX40共刺激域、及CD3ζ傳訊域。
CAR係藉由標準分子生物學技術產生。與所欲抗原結合之胞外域可衍生自使用本文所述之技術所產製之抗體或其抗原結合片段。 T細胞受體(TCR)
可產生結合本揭露之HLA/肽複合物之TCR。TCR可基於T細胞結合至HLA/肽複合物且隨後定序TCR來識別。所識別之TCR可識別自
αβ T細胞。所識別之TCR可進一步經工程改造以改善其親和力、穩定性、溶解度、或類似者。例如，TCR可經半胱胺酸穩定化、表現為可溶性TCR、表現為單鏈TCR、表現為與N端或C端表位標籤融合、經工程改造在疏水性核心中具有突變以改善穩定性（諸如α鏈之位置11、13、19、21、53、76、89、91、或94）、結構域交換（其中α及β鏈可變及/或恆定結構域交換），如US7329731、US7569664、US9133264、US9624292、US2016/0130319及US9884075所述。使用本文組成物之任一者之方法
本文提供使用本文所揭示之組成物治療對象之方法。本文提供之方法包含投予本揭露之多核苷酸、多肽、載體、及組成物之任一者。本揭露之多核苷酸、多肽、載體、組成物及投予方案可用於治療、預防、或減少臨床病況的風險。
在一些實施例中，臨床病況係癌症、骨髓增生性疾病、或心血管疾病。
在一些實施例中，臨床病況係癌症，該癌症係選自肺癌、淋巴樣癌症、急性淋巴樣白血病、急性骨髓樣白血病、慢性骨髓性白血病、Burkitt氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、漿細胞骨髓瘤、膽管癌、膀胱癌、肝癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、泌尿道癌症、中樞神經系統癌症、神經胚細胞瘤、腎癌、乳癌、子宮頸癌、睪丸癌、及軟組織癌症。
在一些實施例中，臨床病況係骨髓增生性疾病，該骨髓增生性疾病係選自原發性骨髓纖維化(MPN)、真性紅血球增多症(PV)、原發性血小板血症(ET)、原發性骨髓纖維化(PFM)、繼發性骨髓纖維化、急性骨髓樣白血病(AML)、繼發性AML、慢性骨髓性白血病(CML)、未定潛能的複製性造血(CHIP)、及慢性骨髓單核球性白血病(CMML)。
在一些實施例中，心血管疾病係選自急性冠狀動脈症候群、缺血性腦血管疾病、缺血性心臟病、血栓形成、靜脈血栓性栓塞、深層靜脈栓塞、肺栓塞、災難性腹內血栓形成、周邊動脈疾病、高血壓、心衰竭、心房顫動、冠心病、動脈粥樣硬化、或複製性造血。
在一些實施例中，對象係費城染色體陰性。在一些實施例中，對象從未接受治療(treatment naïve)。在一些實施例中，對象已變成或疑似變成對一或多種抗癌治療劑呈現抗性或難治性。在一些實施例中，對象不符合幹細胞移植資格。在一些實施例中，對象已用幹細胞移植治療。
在一些實施例中，治療、預防、減少對象的臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含向有此需要之對象投予在本文中揭示之組成物的任一者，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，且其中該投予包含一或多次投予該組成物。在一些實施例中，臨床病況係癌症、骨髓增生性疾病、或心血管疾病。
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法包含向有此需要之對象投予在本文中揭示之組成物的任一者，該對象攜帶JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變，且其中該投予包含一或多次投予該組成物。
在一些實施例中，治療或預防對象的骨髓增生性疾病之方法包含向有此需要之對象投予在本文中揭示之組成物的任一者，且其中投予包含一或多次投予該組成物。在一些實施例中，骨髓增生性疾病係選自原發性骨髓纖維化(MPN)、真性紅血球增多症(PV)、原發性血小板血症(ET)、原發性骨髓纖維化(PFM)、繼發性骨髓纖維化、急性骨髓樣白血病(AML)、繼發性AML、慢性骨髓性白血病(CML)、未定潛能的複製性造血(CHIP)、及慢性骨髓單核球性白血病(CMML)。
在一些實施例中，治療對象的癌症之方法包含向有此需要之對象投予在本文中揭示之組成物的任一者，且其中該投予包含一或多次投予該組成物。在一些實施例中，癌症係選自肺癌、淋巴樣癌症、急性淋巴樣白血病、急性骨髓樣白血病、慢性骨髓性白血病、Burkitt氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、漿細胞骨髓瘤、膽管癌、膀胱癌、肝癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、泌尿道癌症、中樞神經系統癌症、神經胚細胞瘤、腎癌、乳癌、子宮頸癌、睪丸癌、及軟組織癌症。
在一些實施例中，治療對象的心血管疾病之方法包含向有此需要之對象投予組成物，該組成物包含在本文中揭示之組成物的任一者，且其中該投予包含一或多次投予該組成物。在一些實施例中，心血管疾病係選自急性冠狀動脈症候群、缺血性腦血管疾病、缺血性心臟病、血栓形成、靜脈血栓性栓塞、深層靜脈栓塞、肺栓塞、災難性腹內血栓形成、周邊動脈疾病、高血壓、心衰竭、心房顫動、冠心病、動脈粥樣硬化、及複製性造血。
在一些實施例中，在本文中揭示之方法包含向有此需要之對象投予包含多肽、或多核苷酸、或載體之組成物，該多肽包含至少二或更多個表位序列，該多核苷酸編碼包含至少二或更多個表位序列之多肽，該載體包含編碼包含至少二或更多個表位序列之多肽的多核苷酸，其中該表位序列係選自： ●    SEQ ID NO: 1 (MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRR TRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE)或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 2 (EEAEDNCRRMMRTK)或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 4 (KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG)或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 5 (VLNYGVCFC)或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 6 (FCGDENILV)或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之JAK2表位；及其組合。
在本文中揭示之方法之任一者中，向對象投予之組成物可包含選自腺病毒載體、α病毒載體、痘病毒載體、腺病毒相關病毒載體、反轉錄病毒載體、自我複製RNA分子、及其組合之載體。在一些實施例中，載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、自我複製RNA分子、及其組合。
在一些實施例中，在本文中揭示之方法包含一或多次投予本揭露所提供之組成物。例如，方法包含第一投予、及隨後的第二投予，且在兩次投予之間相隔一段時間。
在一些實施例中，第一投予及第二投予可包含相同或不同組成物。例如，第一投予可包含組成物，該組成物包含選自Ad26載體、GAd20載體、MVA載體、或自我複製RNA分子之載體，該載體編碼由SEQ NO: 1、SEQ NO: 2、SEQ NO: 4、SEQ NO: 5、及SEQ NO: 6表示之表位序列。在一些實施例中，第二投予可包含組成物，該組成物包含選自Ad26載體、GAd20載體、MVA載體、或自我複製RNA分子之載體，該載體編碼由SEQ NO: 1、SEQ NO: 2、SEQ NO: 4、SEQ NO: 5、及SEQ NO: 6表示之表位序列。
在一些實施例中，第一投予及第二投予在對象的壽命期間投予一次。在一些實施例中，第一投予及第二投予在對象的壽命期間投予二或更多次。
在一些實施例中，介於第一投予與第二投予之間的該段時間係約1週至約2週、約1週至約4週、約1週至約6週、約1週至約8週、約1週至約12週、約1週至約20週、約1週至約24週、或約1週至約52週。
在一些實施例中，介於第一投予與第二投予之間的該段時間係約2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約7週、約8週、約9週、約10週、約11週、約12週、約13週、約14週、約15週、約16週、約17週、約18週、約19週、約20週、約21週、約22週、約23週、約24週、約25週、約26週、約27週、約28週、約29週、約30週、約31週、約32週、約33週、約34週、約35週、約36週、約37週、約38週、約39週、約40週、約41週、約42週、約43週、約44週、約45週、約46週、約47週、約48週、約49週、約50週、約51週、或約52週。
在一些實施例中，介於第一投予與第二投予之間的該段時間係約2週。
在一些實施例中，介於第一投予與第二投予之間的該段時間係約4週。
在一些實施例中，第一投予及第二投予構成週期，且治療方案可包括二或更多個週期，各週期相隔約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、或約12個月。
提供下列實例以進一步描述一些本文所揭示之實施例。該等實例意欲說明而非限制所揭露之實施例。在一些實施例中，第一投予及第二投予可包含下表1提供之載體的任何組合或表2提供之表位的任何組合。 [表1] 第一及第二投予中的載體組成物
第一投予 第二投予
Ad26 MVA
Ad26 GAd20
Ad26 自我複製RNA分子
Ad26 Ad26
MVA Ad26
MVA GAd20
MVA 自我複製RNA分子
MVA MVA
GAd20 Ad26
GAd20 MVA
GAd20 自我複製RNA分子
GAd20 GAd20
自我複製RNA分子 Ad26
自我複製RNA分子 MVA
自我複製RNA分子 GAd20
自我複製RNA分子 自我複製RNA分子
[表2] 存在於第一及第二投予之載體組成物中的表位。
疫苗 世代 第一投予 SEQ ID NO: 第二投予 SEQ ID NO:
1 CALR1表位1及2 + JAK2表位2 1、2、6 CALR1表位1及2 + JAK2表位2 1、2、6
2 CALR1表位1及2 + JAK2表位2 1、2、6 CALR1表位1及2 + JAK2表位2 + JAK2表位1 1、2、6、5
3 CALR-JAK2-2x9mer 12 CALR-JAK2-2x9mer 12
4 CALR-JAK2-30mer 13 CALR-JAK2-30mer 13
5 LS_CALR-JAK2-2x9mer 10 LS_CALR-JAK2-2x9mer 10
6 LS_CALR-JAK2-2x9mer 10 TCE_CALR-JAK2-2x9mer 31
7 LS_CALR-JAK2-30mer 11 LS_CALR-JAK2-30mer 11
8 TCE_CALR-JAK2-2x9mer 31 TCE_CALR-JAK2-2x9mer 31
9 JAK2表位2 6 JAK2表位2 6
10 CALR-JAK2-2x9mer 12 JAK2表位2 6
11 CALR-JAK2-30mer 13 JAK2表位2 6
9 JAK2表位2.AAY. JAK2表位2 28 JAK2表位2.AAY. JAK2表位2 28
10 CALR-JAK2-2x9mer 12 JAK2表位2.AAY. JAK2表位2 28
11 CALR-JAK2-30mer 13 JAK2表位2.AAY. JAK2表位2 28
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法或治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含治療週期，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子；及 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子。
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法或治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含治療週期，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子；及 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子。
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法或治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含治療週期，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係Ad26載體；及 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係Ad26載體。
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法或治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含治療週期，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體；及 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體。
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法或治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含治療週期，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係MVA載體；及 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係MVA載體。
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法或治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含治療週期，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體；及 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子。
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法或治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含治療週期，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼2或更多個串聯重複的SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子； 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼2或更多個串聯重複的SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子。 第三投予
在一些實施例中，在本文中揭示之方法之任一者可進一步包含第三投予。例如，方法可包含第一投予、第二投予、及隨後的第三投予，且在各次投予之間相隔一段時間。
在一些實施例中，第一投予、第二投予、及第三投予可包含相同或不同組成物。例如，第一投予可包含組成物，該組成物包含選自Ad26載體、GAd20載體、MVA載體、或自我複製RNA分子之載體，該載體編碼由SEQ NO: 1、SEQ NO: 2、SEQ NO: 4、SEQ NO: 5、及SEQ NO: 6表示之表位序列。在一些實施例中，第二投予可包含組成物，該組成物包含選自Ad26載體、GAd20載體、MVA載體、或自我複製RNA分子之載體，該載體編碼由SEQ NO: 1、SEQ NO: 2、SEQ NO: 4、SEQ NO: 5、及SEQ NO: 6表示之表位序列。在一些實施例中，第三投予可包含組成物，該組成物包含選自Ad26載體、GAd20載體、MVA載體、或自我複製RNA分子之載體，該載體編碼由SEQ NO: 1、SEQ NO: 2、SEQ NO: 4、SEQ NO: 5、及SEQ NO: 6表示之表位序列。
在一些實施例中，第一投予、第二投予、及第三投予在對象的壽命期間投予一次。在一些實施例中，第一、第二、及第三投予在對象的壽命期間投予二或更多次。
在一些實施例中，介於第二投予與第三投予之間的該段時間係約1週至約2週、約1週至約4週、約1週至約6週、約1週至約8週、約1週至約12週、約1週至約20週、約1週至約24週、或約1週至約52週。
在一些實施例中，介於第二投予與第三投予之間的該段時間係約2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約7週、約8週、約9週、約10週、約11週、約12週、約13週、約14週、約15週、約16週、約17週、約18週、約19週、約20週、約21週、約22週、約23週、約24週、約25週、約26週、約27週、約28週、約29週、約30週、約31週、約32週、約33週、約34週、約35週、約36週、約37週、約38週、約39週、約40週、約41週、約42週、約43週、約44週、約45週、約46週、約47週、約48週、約49週、約50週、約51週、或約52週。
在一些實施例中，介於第二投予與第三投予之間的該段時間係約6週。
在一些實施例中，介於第二投予與第三投予之間的該段時間係約8週。
在一些實施例中，第一投予、第二投予、及第三投予一起構成週期，且治療方案可包括二或更多個週期，各週期相隔約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、或約12個月。
提供下列實例以進一步描述一些本文所揭示之實施例。在本文中揭示之方法所使用之第一、第二、及第三投予可包含下表3及表4提供之表位及組成物的任何組合。 [表3] 存在於第一、第二、及第三投予之載體組成物中的表位
疫苗 世代 第一投予 SEQ ID NO: 第二投予 SEQ ID NO: 第三投予 SEQ ID NO:
1 CALR1表位1及2 + JAK2 表位2 1、2、6 CALR1表位1及2 + JAK2 表位2 1、2、6 CALR1表位1及2 + JAK2 表位2 1、2、6
2 CALR1表位1及2 + JAK2 表位2 1、2、6 CALR1表位1及2 + JAK2 表位2 + JAK2 表位1 1、2、6、5 CALR1表位1及2 + JAK2 表位2 + JAK2 表位1 1、2、6、5
3 CALR-JAK2-2x9mer 12 CALR-JAK2-2x9mer 12 CALR-JAK2-2x9mer 12
4 CALR-JAK2-30mer 13 CALR-JAK2-30mer 13 CALR-JAK2-30mer 13
5 LS_CALR-JAK2-2x9mer 10 LS_CALR-JAK2-2x9mer 10 LS_CALR-JAK2-2x9mer 10
6 LS_CALR-JAK2-2x9mer 10 TCE_CALR-JAK2-2x9mer 31 TCE_CALR-JAK2-2x9mer 31
7 LS_CALR-JAK2-30mer 11 LS_CALR-JAK2-30mer 11 LS_CALR-JAK2-30mer 11
8 TCE_CALR-JAK2-2x9mer 31 TCE_CALR-JAK2-2x9mer 31 TCE_CALR-JAK2-2x9mer 31
9 JAK2表位2 6 JAK2表位2 6 JAK2表位2 6
[表4] 第一、第二、及第三投予中的載體組成物
第一投予 第二投予 第三投予
Ad26 Ad26 Ad26
Ad26 Ad26 MVA
Ad26 Ad26 GAd20
Ad26 Ad26 自我複製RNA分子
Ad26 MVA Ad26
Ad26 MVA MVA
Ad26 MVA GAd20
Ad26 MVA 自我複製RNA分子
Ad26 GAd20 Ad26
Ad26 GAd20 MVA
Ad26 GAd20 GAd20
Ad26 GAd20 自我複製RNA分子
Ad26 自我複製RNA分子 Ad26
Ad26 自我複製RNA分子 MVA
Ad26 自我複製RNA分子 GAd20
Ad26 自我複製RNA分子 自我複製RNA分子
MVA Ad26 Ad26
MVA Ad26 MVA
MVA Ad26 GAd20
MVA Ad26 自我複製RNA分子
MVA MVA Ad26
MVA MVA MVA
MVA MVA GAd20
MVA MVA 自我複製RNA分子
MVA GAd20 Ad26
MVA GAd20 MVA
MVA GAd20 GAd20
MVA GAd20 自我複製RNA分子
MVA 自我複製RNA分子 Ad26
MVA 自我複製RNA分子 MVA
MVA 自我複製RNA分子 GAd20
MVA 自我複製RNA分子 自我複製RNA分子
GAd20 Ad26 Ad26
GAd20 Ad26 MVA
GAd20 Ad26 GAd20
GAd20 Ad26 自我複製RNA分子
GAd20 MVA Ad26
GAd20 MVA MVA
GAd20 MVA GAd20
GAd20 MVA 自我複製RNA分子
GAd20 GAd20 Ad26
GAd20 GAd20 MVA
GAd20 GAd20 GAd20
GAd20 GAd20 自我複製RNA分子
GAd20 自我複製RNA分子 Ad26
GAd20 自我複製RNA分子 MVA
GAd20 自我複製RNA分子 GAd20
GAd20 自我複製RNA分子 自我複製RNA分子
自我複製RNA分子 Ad26 Ad26
自我複製RNA分子 Ad26 MVA
自我複製RNA分子 Ad26 GAd20
自我複製RNA分子 Ad26 自我複製RNA分子
自我複製RNA分子 MVA Ad26
自我複製RNA分子 MVA MVA
自我複製RNA分子 MVA GAd20
自我複製RNA分子 MVA 自我複製RNA分子
自我複製RNA分子 GAd20 Ad26
自我複製RNA分子 GAd20 MVA
自我複製RNA分子 GAd20 GAd20
自我複製RNA分子 GAd20 自我複製RNA分子
自我複製RNA分子 自我複製RNA分子 Ad26
自我複製RNA分子 自我複製RNA分子 MVA
自我複製RNA分子 自我複製RNA分子 GAd20
自我複製RNA分子 自我複製RNA分子 自我複製RNA分子
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法或治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含治療週期，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子；及 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子；及 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子；
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法或治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含治療週期，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係Ad26； 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係Ad26；及
第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係MVA。
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法或治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含治療週期，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係Ad26； 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係MVA；及 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係MVA。
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法或治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含治療週期，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd； 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd；及 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係MVA。
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法或治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含治療週期，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20； 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA；及 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係MVA。
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法或治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含治療週期，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼2或更多個串聯重複的SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子； 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼2或更多個串聯重複的SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子；及 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼2或更多個串聯重複的SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子。 第四投予
在一些實施例中，在本文中揭示之方法之任一者可進一步包含第四投予。例如，方法可包含第一投予、第二投予、第三投予、及第四投予，且在各次投予之間相隔一段時間。在一些實施例中，第一投予、第二投予、第三投予、及第四投予可包含相同或不同組成物。
例如，第四投予可包含組成物，該組成物包含選自Ad26載體、GAd20載體、MVA載體、或自我複製RNA分子之載體，該載體編碼由SEQ NO: 1、SEQ NO: 2、SEQ NO: 4、SEQ NO: 5、及SEQ NO: 6表示之表位序列。
在一些實施例中，第一投予、第二投予、第三投予、及第四投予在對象的壽命期間投予一次。在一些實施例中，第一、第二、第三、及第四投予在對象的壽命期間投予二或更多次。
在一些實施例中，介於第三投予與第四投予之間的該段時間係約1週至約2週、約1週至約4週、約1週至約6週、約1週至約8週、約1週至約12週、約1週至約20週、約1週至約24週、或約1週至約52週。
在一些實施例中，介於第三投予與第四投予之間的該段時間係約2週、約3週、約4週、約5週、約6週、約7週、約8週、約9週、約10週、約11週、約12週、約13週、約14週、約15週、約16週、約17週、約18週、約19週、約20週、約21週、約22週、約23週、約24週、約25週、約26週、約27週、約28週、約29週、約30週、約31週、約32週、約33週、約34週、約35週、約36週、約37週、約38週、約39週、約40週、約41週、約42週、約43週、約44週、約45週、約46週、約47週、約48週、約49週、約50週、約51週、或約52週。
在一些實施例中，介於第三投予與第四投予之間的該段時間係約4週。
在一些實施例中，介於第三投予與第四投予之間的該段時間係約8週。
在一些實施例中，第一投予、第二投予、第三投予、及第四投予一起構成週期，且治療方案可包括二或更多個週期，各週期相隔約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、或約12個月。
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法或治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含治療週期，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子；及 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子； 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子；及 第四投予，其包含第四組成物，該第四組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子。
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法或治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含治療週期，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體；及 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體； 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係MVA載體；及 第四投予，其包含第四組成物，該第四組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子。
在一些實施例中，誘發對象的免疫反應之方法或治療、預防、減少臨床病況之開始風險或延緩開始之方法包含治療週期，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體；及 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體； 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子；及 第四投予，其包含第四組成物，該第四組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子。 維持投予
在一些實施例中，方法進一步包含在治療週期期間以規律間隔向對象投予組成物，且即使在治療週期已結束之後仍可持續。例如，可在治療方案期間每個月向對象投予組成物，且可持續額外6個月。在一些實施例中，組成物可在二個治療週期之間投予。在一些實施例中，組成物可為在本文中揭示之組成物之任一者，諸如包含載體之組成物，該載體選自Ad26載體、GAd20載體、MVA載體、或自我複製RNA分子且編碼表位序列。投予劑量及途徑
在一些實施例中，包含腺病毒載體之組成物係以每劑量約1×104 IFU（感染單位）至約1×1012 IFU、每劑量約1×104 IFU至約1×1011 IFU、每劑量約1×104 IFU至約1×1010 IFU、每劑量約1×104 IFU至約1×109 IFU、每劑量約1×104 IFU至約1×108 IFU、或每劑量約1×104 IFU至約1×106 IFU的劑量投予。
在一些實施例中，包含腺病毒載體之組成物係以每劑量約1×106 VP（病毒顆粒）至約1×1014 VP、每劑量約1×106 VP至約1×1012 VP、每劑量約1×106 VP至約1×1010 VP、每劑量約1×106 VP至約1×108 VP、或每劑量約1×106 VP至約1×107 VP的劑量投予。
在一些實施例中，包含Ad26載體之組成物係以每劑量約1×1010 IFU投予。在一些實施例中，包含Ad26載體之組成物係以每劑量約1×1011 IFU投予。在一些實施例中，包含Ad26載體之組成物係以每劑量約1×1010 VP投予。在一些實施例中，包含Ad26載體之組成物係以每劑量約1×1011 VP投予。
在一些實施例中，包含GAd20載體之組成物係以每劑量約1×108 IFU投予。在一些實施例中，包含GAd20載體之組成物係以每劑量約1×1010 IFU投予。在一些實施例中，包含GAd20載體之組成物係以每劑量約1×1010 VP投予。在一些實施例中，包含GAd20載體之組成物係以每劑量約1×1011 VP投予。
在一些實施例中，包含痘病毒載體之組成物係以每劑量約1×104 IFU（感染單位）至約1×1012 IFU、每劑量約1×104 IFU至約1×1011 IFU、每劑量約1×104 IFU至約1×1010 IFU、每劑量約1×104 IFU至約1×109 IFU、每劑量約1×104 IFU至約1×108 IFU、或每劑量約1×104 IFU至約1×106 IFU的劑量投予。
在一些實施例中，包含MVA載體之組成物係自每劑量約1×108 IFU投予。在一些實施例中，包含MVA載體之組成物係自每劑量約1×1010 IFU投予。
在一些實施例中，包含自我複製RNA分子之組成物係以約1微克至約100微克、約1微克至約90微克、約1微克至約80微克、約1微克至約70微克、約1微克至約60微克、約1微克至約50微克、約1微克至約40微克、約1微克至約30微克、約1微克至約20微克、約1微克至約10微克、或約1微克至約5微克之自我複製RNA分子的劑量投予。
在一些實施例中，在本文中揭示之組成物可藉由多種途徑向對象投予，諸如皮下、局部、口服、及肌內。組成物之投予可經口服或腸胃外完成。腸胃外遞送方法包括局部、動脈內（直接至組織）、肌內、皮下、髓內、鞘內、室內、靜脈內、腹膜內、或鼻內投予。本揭露亦具有提供合適的局部、口服、全身性、及腸胃外配方以用於預防及治療方法之目的。
在一些實施例中，疫苗組成物之肌內投予可藉由使用針頭達成。替代方式係使用無針頭注射裝置來投予組成物（使用例如Biojector(TM)）或含有疫苗之凍乾粉末。針對靜脈內、皮膚、或皮下注射、或在病痛部位之注射，組成物可係腸胃外可接受水性溶液之形式，其係無熱原(pyrogen)的且具有合適pH、等滲性、及穩定性。所屬技術領域中具有通常知識者有充份能力使用例如等滲媒劑來製備合適溶液，等滲媒劑諸如氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringer's Injection)、乳酸林格氏注射液(Lactated Ringer's Injection)。可視需要包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑、及/或其他添加劑。亦可採用緩釋配方。
通常，在臨床症狀的發展之前，投予將具有一種用於產生對突變CALR及/或突變體的免疫反應。本揭露之組成物係投予至對象，從而在對象中產生免疫反應。將能夠誘發可偵測免疫反應之組成物量定義為「免疫有效劑量(immunologically effective dose)」。本揭露之疫苗可誘發體液以及細胞媒介之免疫反應。在典型實施例中，免疫反應係保護性免疫反應。
實際投予量（及投予速率與時程）將取決於要治療者之本質及嚴重性。治療之處方（例如，對於劑量之決定等）係屬於全科醫師及其他醫學醫生之責任，且一般會考量所要治療之病症、個別患者之病況、遞送部位、投予方法、及醫師所知之其他因素。
在一個例示性方案中，包含腺病毒載體之組成物係以範圍在約100 µL至約10 ml（含有約104 至1012 個病毒顆粒/ml之濃度）之間的體積投予（例如，肌內）。腺病毒載體組成物可以範圍在0.25與1.0 ml之間的體積投予，諸如以0.5 ml之體積。
在一個例示性方案中，包含MVA載體之組成物係以範圍在約100 µL至約10 ml的鹽水溶液之間的體積投予（例如，肌內），該鹽水溶液含有約l×l07 TCID50 至l×109 TCID50 （50%組織培養感染劑量(Tissue Culture Infective Dose)）或Inf.U.（感染單位）之劑量。MVA載體組成物可以範圍在0.25與1.0 ml之間的體積投予。第二治療劑
在一些實施例中，在本文中揭示之方法進一步包含投予第二治療劑。在一些實施例中，第二治療劑係免疫刺激劑、化學治療劑、抗生素、檢查點抑制劑、或細胞療法。
在一些實施例中，第二治療劑係選自：CTLA-4抗體、CTLA4配體、PD-1軸抑制劑、PD-L1軸抑制劑、TLR促效劑、CD40促效劑、OX40促效劑、羥脲、魯索替尼(ruxolitinib)、菲達替尼(fedratinib)、41BB促效劑、CD28促效劑、STING拮抗劑、RIG-1拮抗劑、TCR-T療法、CAR-T療法、FLT3配體、硫酸鋁、BTK抑制劑、JAK抑制劑、CD38抗體、CDK抑制劑、CD33抗體、CD37抗體、CD25抗體、GM-CSF抑制劑、IL-2、IL-15、IL-7、CD3重定向分子、普馬利米(pomalimib)、IFNγ、IFNα、TNFα、VEGF抗體、CD70抗體、CD27抗體、BCMA抗體、或GPRC5D抗體、及其組合。
在一些實施例中，第二治療劑係選自下列之檢查點抑制劑：伊匹單抗(pilimumab)、塞特瑞利單抗(cetrelimab)、派姆單抗(pembrolizumab)、納武單抗(nivolumab)、信迪利單抗(sintilimab)、賽米單抗(cemiplimab)、特瑞普利單抗(toripalimab)、卡瑞利珠單抗(camrelizumab)、替雷利珠單抗(tislelizumab)、多斯利單抗(dostralimab)、斯巴達利珠單抗(spartalizumab)、普哥利單抗(prolgolimab)、巴斯特利單抗(balstilimab)、布地哥利單抗(budigalimab)、薩善利單抗(sasanlimab)、阿維單抗(avelumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、恩弗利單抗(envafolimab)、或艾達普利單抗(iodapolimab)、或其任何組合。
在一些實施例中，第二治療劑係JAK抑制劑。
在一些實施例中，第二治療劑可與第一投予之第一組成物、或第二投予之第二組成物、或第三投予之第三組成物、或第四投予之第四組成物組合投予。
在一些實施例中，抗CTLA-4抗體係與本揭露之組成物之第一、或第二、或第三、或第四投予之任一者組合。
在一些實施例中，抗PD-1或抗PD-L1抗體係與本揭露之組成物之第一、或第二、或第三、或第四投予之任一者組合。
在一些實施例中，檢查點抑制劑係以約0.5至約5 mg/kg、約5至約10 mg/kg、約10至約15 mg/kg、約15至約20 mg/kg、約20至約25 mg/kg、約20至約50 mg/kg、約25至約50 mg/kg、約50至約75 mg/kg、約50至約100 mg/kg、約75至約100 mg/kg、約100至約125 mg/kg、約125至約150 mg/kg、約150至約175 mg/kg、約175至約200 mg/kg、約200至約225 mg/kg、約225至約250 mg/kg、或約250至約300 mg/kg的劑量投予。實例 實例 1 ： JAK2 V617F 表位 2 的識別及 JAK2 V617F 表位的電腦上免疫原性評估
產生具有V617F突變作為中央殘基之JAK2蛋白質的17mer序列及含有在此17mer序列中的所有鄰接胺基酸之9mer。這些9mer與常見HLA-A及HLA-B等位基因的結合親和力之電腦上預測係使用netMHCpan4.0預測。結合預測被分類至三個分類：弱結合（預測親和力＞ 500 nM）、中度結合（預測親和力介於50 nM至500 nM之間）、及強烈結合（預測親和力＜ 50nM）經常存在之HLA-A等位基因。自此分析選擇SEQ ID NO: 5 (VLNYGVCFC)之9merJAK2表位1及SEQ ID NO: 6 (FCGDENILV)之新穎9merJAK2表位2以用於進一步實驗追蹤。SEQ ID NO: 6之肽先前未經描述為免疫原性JAK2片段。表5顯示之JAK2表位2的預測結合親和力低於JAK2表位1之結合。[ 表 5] JAK2表位2之親和力。結合分類係非結合劑=秩＞ 2.0；中度結合劑=秩介於0.5至2.0之間；強烈黏合劑=秩＜ 0.5。
等位基因 結合親和力nM 結合秩
HLA-A01:01 22680 11
HLA-A02:01 2878 7
HLA-A03:01 42208 84
HLA-A24:02 41245 52
HLA-B07:02 40322 66
HLA-B08:01 35548 69
HLA-B15:01 38417 76
HLA-B27:05 40573 84
HLA-B40:01 39076 44
實例 2 ：疾病患者樣本中突變體 JAK2 對比野生型 JAK2 表位的免疫原性
PBMC係自具有經證實之JAK617F突變的原發性血小板血症(ET)或原發性骨髓纖維化(PMF)患者單離。個別的I類相關mutJAK2或野生型JAK2肽在第0天以5 µg/ml濃度外源性投予至250,000個PBMC。將細胞在10 IU/ml的人類IL-2及10 ng/ml的人類IL-15存在下培養10天，且後續藉由肽脈衝召回及細胞內染色流動式細胞測量術分析產生IFNγ及TNFα之CD8+ T細胞來評估突變體或野生型JAK2抗原特異性T細胞的頻率。如果IFNγ/TNFα + CD8+ T細胞的頻率相較於在第0天僅經DMSO處理之細胞大於三倍且大於0.1%，則抗原特異性反應被視為陽性。結果顯示於表6。[ 表 6]
疾病 供體編號 對照病毒抗原CEF 反應 突變體JAK2 表位2 突變體JAK2 表位1 野生型JAK2 表位2 野生型JAK2 表位1
PMF 120174174 是 是(30%) 否 否 否
PMF 120250311 是 否 否 否 否
PMF 120800910 否 否 否 否 否
PMF 120800936 是 是(0.63%) 是(0.62%) 否 否
PMF 120817869 是 否 否 否 否
ET 120708928 是 否 否 否 否
ET 120815833 是 是(30.6%) 否 否 是(1.3%)
ET 120824685 是 否 否 否 否
「是」指示相較於各供體僅DMSO刺激的細胞，IFNγ/TNFα + CD8+ T細胞的頻率增加3倍。括弧指示IFNγ/TNFα + CD8+ T細胞的實際頻率。
圖1顯示疾病患者樣本中JAK2表位1及JAK2表位2相較於相同表位區之野生型序列的免疫原性。亦評估mutJAK2表位I及II之對應野生型肽序列且顯示具有類似於DMSO對照組的反應。實例 3 ：設計及產生用於 Ad26 及 MVA 表現之 CALR.JAK2 多核苷酸及多肽
為了選擇導致良好抗原表現及T細胞活化之疫苗組成物，設計並測試一系列CALR.JAK2多核苷酸及多肽。
將CALR第1型及第2型突變包括於多核苷酸中。基於電腦上(in silico ) T細胞表位預測及HLA結合研究，將CALR突變體第1型之54mer肽(SEQ ID NO: 1)及CALR突變體第2型蛋白質之截短型14mer肽(SEQ ID NO: 2)包括於多核苷酸中。多核苷酸的CARL部分編碼SEQ ID NO: 3所示之胺基酸序列。為了確保所有蛋白質之良好的細胞內處理，個別肽係藉由促進蛋白酶體切割之AAY (ala-ala-tyr)連接子連接。
亦基於電腦上T細胞表位預測及HLA結合研究，將包括二個獨特的JAK2肽，即30mer肽(SEQ ID NO: 4)或二個9mer肽（SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6），其等之各者含有V617F突變。SEQ ID NO: 6之肽早先未經描述為免疫原性JAK2片段。
為了確保所有蛋白質之良好的細胞內處理，個別肽亦藉由促進蛋白酶體切割之AAY (ala-ala-tyr)連接子連接。SEQ ID NO: 7代表由AAY連接子隔開之JAK2二個9mer的胺基酸序列。
設計二種不同建構體，其中CALR部分係相同的，但JAK2部分係30mer肽或二個9mer肽。這二種不同的轉殖基因係經設計為N端不具前導序列(LS)、具有HAVT20 LS (MACPGFLWALVISTCLEFSMA; SEQ ID NO: 8)、或泛素信號(Ubiq) (MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGVR; SEQ ID NO: 54)。建構體係示於表3。HAVT20 LS應引導轉殖基因至ER，而泛素序列靶向蛋白酶體。這可能導致建構體之間TG不同的表現水準。此外，產生僅編碼來自兩個突變體CALR蛋白質的序列之建構體，其係用來作為CALR蛋白質表現的對照組。轉殖基因之蛋白質及多核苷酸序列係顯示於表7中。所示之多核苷酸序列係針對腺病毒表現而最佳化。[ 表 7] 用於腺病毒表現之建構體
建構體名稱 突變體CALR序列 JAK2突變體序列
LS_CALR CALR突變體第1型，截短 型CALR突變體第2型 無
LS_CALR_JAK2-2x9mer CALR突變體第1型，截短 型CALR突變體第2型 2x9-mer
LS_CALR_JAK2-30mer CALR突變體第1型，截短 型CALR突變體第2型 （30-mer）
CALR_JAK2-2x9mer CALR突變體第1型，截短 型CALR突變體第2型 2x9-mer
CALR_JAK2-30mer CALR突變體第1型，截短 型CALR突變體第2型 （30-mer）
Ubiq_CALR_JAK2-2x9mer CALR突變體第1型，截短 型CALR突變體第2型 2x9-mer
Ubiq_CALR_JAK2-30mer CALR突變體第1型，截短 型CALR突變體第2型 （30-mer）
LS：前導序列；Ubiq：泛素
[ 表 8] CALR.JAK2多肽SEQ ID及多核苷酸SEQ ID NO
建構體名稱 蛋白質SEQ ID NO: 多核苷酸SEQ ID NO:
LS_CALR 9 16
LS_CALR_JAK2-2x9mer 10 17
LS_CALR_JAK2-30mer 11 18
CALR_JAK2-2x9mer 12 19
CALR_JAK2-30mer 13 20
Ubiq_CALR_JAK2-2x9mer 14 21
Ubiq_CALR_JAK2-30mer 15 22
使用腺病毒表現的標準方法，將CALR.JAK2建構體選殖至pUC57穿梭質體中。表現匣係由下列組成：含有四環素操作子(TetO)之巨細胞病毒(CMV)啟動子（以允許與PER.C6 TetR細胞系組合使用）、Kozak序列、CALR.JAK2多核苷酸、及側接表現匣之外的Ad26特異性序列之猿猴病毒40 (SV40)多腺苷酸化信號。這些側接的Ad26特異性序列係與Ad26骨架質體序列同源以確保質體藉由同源重組產生。序列係經人類基因最佳化以用於增強的轉殖基因表現。
為了測試這些不同建構體的CALR.JAK2表現，HEK293細胞係經各別DNA質體轉染，並在轉染後72小時藉由西方墨點轉漬法檢查細胞裂解物中的表現。此外，蛋白酶體活性係藉由在收集樣本之前4小時添加蛋白酶體抑制劑MG132來抑制，以檢查對轉殖基因表現的效應。所有建構體皆表現CALR.JAK2表位，且最高表現係在具有HAVT20 LS之建構體觀察到。蛋白酶體抑制適度增強具有泛素信號之建構體的轉殖基因表現，但此差異無法藉由西方墨點轉漬法定量。基於CALR.JAK2表現資料，選擇二個具有HATV20前導序列(LS)之建構體以用於生產腺病毒，即Ad26.LS_CALR_JAK2-30mer (Ad26HEME001)及Ad26.LS_CALR_JAK2-2x9mer (Ad26HEME002)。此外，生產Ad26-LS-CALR (AD26HEME003)作為可能的對照組。Ad26HEME001之多核苷酸序列（其含有：含有四環素操作子(TetO)之巨細胞病毒(CMV)啟動子、Kozak序列、CALR,JAK2、及猿猴病毒40 (SV40)多腺苷酸化信號）係顯示於SEQ ID NO: 23中。Ad26HEME002之多核苷酸序列（其含有：含有四環素操作子(TetO)之巨細胞病毒(CMV)啟動子、Kozak序列、CALR.JAK2、及猿猴病毒40 (SV40)多腺苷酸化信號）係顯示於SEQ ID NO: 24中。
為了選擇生產Ad26HEME001及Ad26HEME002之細胞系，藉由在PER.C6®相較於PER.C6 TetR細胞中轉染病毒基因體DNA來測量病毒救援能力。Ad26HEME001與Ad26HEME002建構體之間的細胞病變效應(CPE)及斑塊形成（一起顯示救援能力）係可相比的（表9）。總而言之，兩種建構體在8天內在PER.C6 TetR上顯示完全CPE，但在PER.C6®細胞上則否。Ad26HEME001及Ad26HEME002在第8天的co-easy轉染分別顯示在PER.C6®細胞上約13及約11個斑塊及在PER.C6 TetR細胞上＞100個斑塊。此指示救援能力在PER.C6®細胞上受到抑制。難以救援的腺病毒載體具有有限的生產特徵且在轉殖基因表現匣中具有高風險的刪除及突變。基於這些結果，選擇PER.C6 TetR作為病毒生產Ad26HEME001及Ad26HEME002的細胞系。Ad26HEME003亦在PER.C6 TetR細胞上生產。[ 表 9]
  完全CPE PER.C6® / PER.C6 TetR 斑塊# PER.C6® / PER.C6 TetR
Ad26HEME001 無CPE / ＜8天 13 / ＞100
Ad26HEME002 無CPE / ＜8天 11 / ＞100
實例 4 ：產生 Ad26HEME001 及 Ad26HEME002
研究批次係自經單一基因體pAd26HEME001 (pAd26.LS_CALR_JAK2-30mer)、pAd26HEME002 (pAd26.LS_CALR_JAK2-2x9mer)、及pAd26HEME003 (pAd26.LS_CALR)質體轉染之細胞產生。
使用pUC57質體DNA將Ad26早期區1 (E1) TG表現匣選殖至pAd26骨架中以產生pAd26HEME001、pAd26HEME002、及pAd26HEME003質體。將pAd26骨架中之E1區刪除以使載體無法在非互補細胞（諸如人類細胞）中複製。此外，將一部分的Ad26早期區3 (E3)區域移除(ΔE3)以在病毒基因體中產生足夠空間以用於插入外來抗原，且將Ad26早期區4 (E4)開讀框(orf) 6交換成腺病毒第5型(Ad5)同源物，使之得以在Ad5-E1互補細胞系如HEK293、PER.C6®、及HER96細胞中生產無法複製之Ad26載體。pAd26骨架係藉由使用稍後將導入TG卡匣之區域中的獨特限制位點(Asi SI)來線性化。此線性化質體兩端均含有與存在E1轉殖基因表現匣之外之Ad26特異性序列同源之重疊序列。此使得質體產生得以使用同源重組技術藉由將轉殖基因卡匣選殖至pAd26骨架中來進行。已驗證完整質體序列。
為了產生Ad26HEME001、Ad26HEME002、及Ad26HEME003載體，將質體轉染至PER.C6 TetR細胞中。使病毒在PER.C6 TetR細胞上擴增、純化、並測試腺病毒基因體的完整性及同一性及TG的正確表現。 批次產生及表徵
產生一個Ad26HEME001、二個Ad26HEME002、及一個Ad26HEME003研究批次並表徵評估感染性、轉殖基因表現、批次基因穩定性、及在懸浮液PER.C6 (sPER.C6) TetR細胞中的相對生產性。所有研究批次均在附著的PER.C6 TetR細胞上產生。批次品質係藉由經編碼之抗原在非複製條件下的表現、病毒顆粒(VP)及感染單位(IU)的數量來表徵。
所有經生產的研究批次均顯示經編碼之抗原的表現（如西方墨點轉漬法所示）且所有批次均具有低VP/IU比例。Ad26HEME001之研究批次顯示VP/IU比例為29。Ad26HEME002之二個研究批次顯示VP/IU比例為5，且Ad26HEME003顯示VP/IU比例為8。基因穩定性及生產性兩者對於規模擴大生產腺病毒載體為臨床試驗材料(CTM)或商業規模之可行性而言均為重要。藉由載體基因體之變化及在生產細胞系增殖期間具有非所欲性質之族群過度生長所定義之基因不穩定性的風險，可藉由小規模增殖數種病毒族群來評估。對於所有研究批次而言，基因穩定性係在最終批次材料上藉由轉殖基因區、E3基因區、及E4基因區之鑑定聚合酶連鎖反應(ID PCR)來評估。此外，轉殖基因區之聚合酶連鎖反應(PCR)產物係經定序。所有研究批次均發現為基因穩定的。
生產性（藉由VP/mL之力價定義）係在小規模實驗中藉由比較疫苗候選載體與各別基準對照物來評估，其中各別基準對照物在10L製程強化(PIN)生物反應器中的表現係已知。簡言之，sPER.C6 TetR細胞係經70、300、及900 VP/細胞之經純化的研究批次材料及二個Ad26基準對照物轉導。Ad26HEME001、Ad26HEME002、及Ad26HEME003顯示在70、300、及900 VP/細胞下與標準對照物可相比的生產性，表示所有三種載體均為良好生產者（對照物顯示預期結果），在培養中2至3天後產生約1011 VP/ml。
包括各種元件之Ad26HEME002載體的多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 24且其等所編碼之胺基酸序列係顯示於SEQ ID NO: 10。實例 5 ：產生 MVA.CALR.JAK2 及 GAd20.CALR.JAK2 建構體
CALR.JAK2轉殖基因之胺基酸序列係基於人類密碼子用途轉換成核苷酸序列。避免用於MVA載體之終止模體(TTTTTnT)。接著將BamH1限制位點及KOZAK序列添加至核苷酸序列的上游。在核苷酸序列的下游添加兩個終止密碼子及隨後的Asc1限制位點。將編碼來自鱖魚不變鏈之長度28aa之小型肽片段之T細胞增強子(TCE)多核苷酸(SEQ ID NO:29)置於轉殖基因之N端。臨床前資料已顯示此序列增加病毒載體的免疫反應。轉殖基因的合成係使用已知方法執行。
將在痘苗P7.5早期/晚期啟動子(SEQ ID NO: 32)控制下選殖之MVA轉殖基因藉由同源重組插入至MVA之刪除III基因座中（FlankIII-1及-2區）並使用已知方法生產重組病毒顆粒。
將GAd20轉殖基因經由EcoRI-Not1限制位點次選殖至穿梭質體中介於具有二個TetO重複之CMV啟動子與BGH polyA之間。藉由在合適大腸桿菌菌株中進行同源重組，將所得表現匣轉移至GAd20基因體中，該菌株經CMV-轉殖基因-BGH DNA片段及攜帶GAd20基因體之建構體轉形。重組涉及CMV及BGH作為同源臂，其等已經存在於GAd20建構體中代替E1刪除（轉殖基因之插入位點）。接著將重組GAd20載體藉由轉染E1互補、表現TetR之M9細胞救援且後續再感染新鮮M9細胞來擴增。
使用已知方法產生表現多肽TCE_CALR_JAK2-2x9mer (SEQ ID NO: 31) (HCalJ-9.9)之MVA及GAd20載體。實例 6 ： Ad26.CALR.JAK2 載體表現、處理及呈現抗原給自體 T 細胞
本研究的目的是要測試人類抗原呈現細胞(APC)處理及呈現疫苗新抗原及發動T細胞反應的能力。
自體CD1c+ DC及自體CD4+ /CD8+ T細胞之冷凍小瓶係經由磁珠負向選擇單離。CD1c+ DC係經Ad26HEME002或Ad5HEME002（經工程改造以表現LS_CALR_JAK2-2x9mer轉殖基因之Ad5載體）以50,000 VP之感染複數(MOI)隔夜感染。在感染後18至24小時，將相同供體自體T細胞與CD1c+ DC以10:1比例混合。在第0天將人類IL-15以10 ng/mL添加至培養，且每2至3天執行2× IL-15及IL-2 (10 IU/mL)的一半培養基更換直到第11天。在第11天，將對應CALRmut、JAK2V617F、或Adeno Hexon蛋白質（陽性對照）之肽與蛋白質運輸抑制劑一起添加至DC / T細胞培養隔夜。將所得培養物進行T細胞標記（CD4、CD8、CD3）及經活化之T細胞標記（IFN-γ、TNF-α）染色，並藉由流動式細胞測量術分析。在第11天肽隔夜刺激之後IFN-γ及TNF-α染色增加，指示CALR突變體及/或JAK2V617F抗原特異性T細胞因為Ad26/Ad5-HEME002驅使轉殖基因表現而特異性擴增。IFN-γ及TNF-α雙陽性CD8 T細胞比起Ad26/Ad5空載體增加3倍被視為陽性反應。排除標準係(i) Adeno Hexon反應低於0.5%的IFN-γ及TNF-α雙陽性T細胞，或(ii) ＜1%的病毒抗原（腺病毒CEF建構體）IFN-γ及TNF-α雙陽性T細胞；在此情況下，實驗被認為是次佳的，且陰性反應可能是供體或實驗設定的技術失敗。
總共篩選24個獨特的健康供體細胞。圖2顯示在一個供體上篩選CALR突變體特異性T細胞反應之代表性結果。在實驗中，對細胞進行活/CD3+/CD8+細胞圈選，並評估IFN-γ及TNF-α染色。在感染之後觀察到CD8（第I型）及CD4（第II型）兩種反應。實驗進行3次獨立分析，且實驗的反應頻率類似，不論使用小麥穗(wheatear) Ad26或Ad5皆為約35%。圖3顯示兩種包括在疫苗中的JAK2表位（SEQ ID NO: 5 (VLNYGVCFC)，圖3中之表位1；及SEQ ID NO: 6 (FCGDENILV)，圖3中之表位2）皆具免疫原性。圖4顯示篩選一個供體之JAK2突變體特異性T細胞反應之代表性結果。資料顯示兩種JAK2突變體新表位皆自疫苗轉殖基因序列處理，指示這些表位可由癌細胞呈現。所有測試供體之HLA類型顯示於表10。[ 表 10]
供體 HLA A1 HLA B1 HLA C1 HLA A2 HLA B2 HLA C2
2480 03:01 15:03 2:10 23:01 44:02 05:01
013B 01:01 07:02 07:01 03:01 08:01 07:02
4384 24:02 35:01 04:01 30:01 42:01 07:01
118 02:01 14:02 1:01 68:02:00 27:05 8:02
676 1:01 08:01 3:04 32:01:00 15:01 7:01
274 03:01          
3942 02:02 08:01 03:04 03:01   07:02
240 03:01 15:03 02:10 23:01 44:02:00 5:01
644 03:01 07:02 06:02 66:01:00 13:02 7:02
359 1:01 07:02 7:01 03:01 08:01 7:01
538 02:01 27:05 1:02 03:01 38:01:00 12:03
實例 7 ： Ad26.CALR.JAK2 載體表現在小鼠中誘發細胞性反應
本研究之目的是要使用IFN-γ酶連接免疫斑點法檢定(ELISpot)測試由含有Ad26之Ad26HEME001或A26HEME002所誘發之T細胞反應是否高於由空Ad26載體所誘發之T細胞反應，並選擇用於進一步免疫原性研究之最佳小鼠品系。
在此免疫原性研究中測試C57BL/6及Balb/c小鼠品系，因為表位預測分析顯示潛在CD8 T細胞表位存在於這些小鼠品系中。以1010 VP/小鼠之劑量的Ad26HEME001或Ad26HEME002，或不編碼轉殖基因之Ad26 (Ad26.Empty)注射小鼠。使用橫跨Ad26HEME001或Ad26HEME002插入物之15mer重疊肽池來評估初免免疫之後14天的細胞性免疫反應(IFN-γ ELISpot)。實驗組係顯示於表11中。[ 表 11]
組 動物nr 組之說明 小鼠品系
1a 4 Ad26.Empty劑量1010 VP C57BL/6
1b 4 Ad26.Empty劑量1010 VP Balb/c
2 8 Ad26HEME001劑量1010 VP C57BL/6
3 8 Ad26HEME002劑量1010 VP C57BL/6
4 8 Ad26HEME001劑量1010 VP Balb/c
5 8 Ad26HEME002劑量1010 VP Balb/c
在初免之後14天，在C57BL/6及Balb/c小鼠中誘發插入物特異性T細胞反應（如藉由IFN-γ ELISpot所測量），且比起由Ad26.Empty免疫之動物所誘發者，用Ad26HEME001（圖5）或Ad26HEME002（圖6）免疫之動物誘發顯著較高之免疫反應。未偵測到針對LS肽之細胞性免疫反應（資料未顯示）。當跨小鼠品系觀察時，由二個載體所誘發之免疫反應之間沒有顯著差異。類似地，當跨疫苗候選物觀察時，由Balb/c及C57BL/6所誘發之對HEME001肽池的免疫反應之間沒有顯著差異。當跨疫苗候選物觀察時，由Balb/c及C57BL/6所誘發之對HEME002肽池的免疫反應之間有顯著差異。實例 8 ： Ad26.CALR.JAK2 及 MVA.CALR.JAK2 載體在小鼠中誘發細胞性反應
這些研究之目的是要判定編碼HCalJ-9.9之經修飾安卡拉痘苗病毒(MVA)載體（即，MVA-HCalJ-9.9、MVAHEME002）是否可在Balb/c小鼠中加強由Ad26HEME002初免免疫所誘發之免疫反應。基於實例7所述之資料選擇Balb/c小鼠品系，其中在Balb/c小鼠品系相較於C57BL/6小鼠品系見到較少變異。
在第一個研究中，Ad26HEME002係以1010 VP給藥且MVA-HCalJ-9.9係以107 IU給藥。在第0週，小鼠係藉由IM注射Ad26HEME002免疫；一半的動物不接受加強免疫（第2組）且一半的動物在第3週用MVA-HCalJ-9.9加強（第3組）。另一組小鼠在第3週用MVA-HCalJ-9.9免疫（初免）（第1組）。對照小鼠在第0週用Ad26.Empty初免（第4組）。在第4週，犧牲所有動物且以橫跨Ad26HEME002插入物之15mer重疊肽池、或涵蓋插入物中CALR序列之肽池、或涵蓋二個JAK2 9mer序列之9mer刺激脾細胞。生產IFN-γ之細胞的誘發係藉由IFN-γ ELISpot測量。表12顯示各種實驗組。[ 表 12]
組 動物nr 組之說明
1 (#5) 5 MVA-HCalJ-9.9劑量107 IU
2 (#7) 10 Ad26HEME002劑量1010 VP
3 (#8) 10 Ad26HEME002劑量1010 VP / MVA-HCalJ-9.9劑量107 IU
4 (#9) 3 Ad26.Empty劑量1010 VP
所有用Ad26HEME002單獨免疫或與MVA-HCalJ-9.9加強組合免疫之動物在經由重疊11個胺基酸且涵蓋整個HEME002 (LS_CALR.JAK2.2x9mer)之15mer肽構成之肽池（圖7）或由重疊11個胺基酸且涵蓋僅HEME002之mutCALR部分之15mer肽所組成之mutCALR肽池（圖8）刺激時發展出生產IFN-γ之細胞。相對地，在經二個9merJAK2肽刺激時，未偵測到誘發生產細胞介素之細胞（資料未顯示）。重要的是，在Ad26HEME002初免免疫之後用MVA-HCalJ-9.9加強（第3組）比起僅在第0週用Ad26HEME002初免之動物（第2組）誘發顯著較高之反應（HEME002肽池：p=0.038；CALRmut肽池：p=0.00025；ANOVA）。總結來說，ELISpot資料顯示MVA能夠加強由Ad26HEME002初免免疫所誘發之插入物特異性細胞性免疫反應。
在第二個研究中，Ad26HEME002係以109 VP或1010 VP給藥且MVA-HCalJ-9.9係以107 IU給藥。在第0週，小鼠係藉由IM注射Ad26HEME002免疫，隨後在第3週用MVA-HCalJ-9.9加強。在第4週，犧牲所有動物且以橫跨Ad26HEME002插入物之15mer重疊肽池、或涵蓋插入物中CALR序列之肽池、或涵蓋二個JAK2 9mer序列之9mer刺激脾細胞。生產IFN-γ之細胞的誘發係藉由IFN-γ ELISpot測量。以1×1010 VP進行Ad26HEME002初免且隨後以1×107斑塊形成單位(pfu)之MVA-HCalJ-9.9加強導致IFN-γ當相較於單獨1×1010 VP之Ad26.Empty載體時有統計顯著的增加（3.2倍增加，p=0.0042）。相對地，IFN-γ在以1×109 VP之較低劑量Ad26HEME002初免且隨後以1×107 pfu之MVA-HCalJ-9.9加強並未觀察到顯著變化(p=0.090)。增加生產IFN-γ之脾細胞係在1×1010 VP Ad26HEME002觀察到（相較於1×109 VP投藥）。圖9顯示實驗的結果。實例 9 ： Ad26HEME002 及 MVA-HCalJ 9.9 於非人類靈長動物 (NHP) 中之免疫原性
本研究之主要目的是要判定用Ad26HEME002及MVA-HCalJ-9.9免疫比起單獨用Ad26HEME002免疫，是否在NHP中誘發較高量值及持續時間之CALR及/或JAK2特異性T細胞反應。次要目的是要評估抗CTLA-4單株抗體（即，YERVOY® （伊匹單抗）([Ipi])）與Ad26HEME002及MVA-HCalJ-9.9之組合是否能夠增強免疫反應。此外，探索性目的是要評估抗CTLA-4抗體與Ad26HEME002同源物二方案投藥之組合相較於Ad26HEME002一方案投藥是否能夠增強插入物特異性T細胞反應。
根據表13所示之時程，食蟹獼猴(Cynomolgus macaque)係單獨用Ad26HEME002及/或MVA-HCalJ-9.9或與Ipi（10 mg/kg靜脈內[IV]）之組合進行IM免疫。簡言之，NHP係單獨用Ad26HEME002 (5×1010 VP, IM)（第1組及第2組）或與Ipi 10 mg/kg IV組合（第3組及第4組）免疫。動物在第4及8週單獨用MVA-HCalJ-9.9（108 IU，IM，第2組）或MVA-HCalJ-9.9與Ipi 10 mg/kg IV之組合（第3組）加強，或動物在第4週用Ad26HEME002與Ipi之組合加強且隨後在第14週用MVA-HCalJ-9.9與Ipi 10 mg/kg IV之組合投藥（第4組），或動物未接受任何加強（第1組）。在各種時間點將動物放血，並單離PBMC及血清以進行免疫檢定。在研究期間的各種時間點，使用肽池在PBMC中藉由IFN-γ ELISpot評估對CALRmut或JAK2之免疫反應的誘發，該肽池橫跨CALRmut或JAK2 2x9mer插入物序列、前導序列、或全插入物(HEME002; CALR_JAK2-2x9mer)。[ 表 13]
    免疫  
組 動物nr （第0週） （第4週） （第8週） （第14週） Ipi mg/kg IV
1 5 Ad26HEME002 (5×1010 VP) NA NA NA NA
2 7 Ad26HEME002 (5×1010 VP) MVA-HCalJ-9.9 (108 IU) MVA-HCalJ-9.9 (108 IU) NA NA
3 7a Ad26HEME002 (5×1010 VP) MVA-HCalJ-9.9 (108 IU) MVA-HCalJ-9.9 (108 IU) NA 10
4 5 Ad26HEME002 (5×1010 VP) Ad26HEME002 (5×1010 VP) NA MVA-HCalJ-9.9 (108 IU) 10
Ipi，伊匹單抗；nr，數量；VP，病毒顆粒; IU，感染單位；IV，靜脈內；PBMC，周邊血液單核細胞。  
在研究的各種時間點，在一些動物中見到高度非特異性背景反應，其可隱蔽對特別是低反應的判讀。所有動物均包括在資料集中。
在任何測量的時間點，對JAK2或前導序列肽池沒有可偵測的免疫反應（資料未顯示）。所測量之對CALR及CALR_JAK2-2x9mer (HEME002)肽池的量值及反應動物率非常類似，且因此僅顯示CALR_JAK2-2x9mer (HEME002)資料集。圖10顯示在四組中誘發生產IFN-γ之人類HEME002特異性T細胞的動力學。單一Ad26HEME002免疫並未在任何動物中誘發對HEME002肽池的可偵測之生產IFN-γ之細胞（圖10）。相對地，在第2週（圖12）及第4週（資料未顯示），在用Ad26HEME002與Ipi之組合（第3組及第4組合併）免疫之12隻動物中的5隻偵測到低度但可偵測之HEME002特異性生產IFN-γ之細胞，且此免疫反應顯著高於在僅用Ad26HEME002給藥之動物中所偵測到者(p＜0.001)。
自第6週開始，在用Ad26HEME002及MVA-HCalJ-9.9給藥之動物中見到對CALR_JAK2-2x9mer (HEME002)的免疫反應。無論動物接受一個劑量（圖13）或二個劑量（圖14）的MVA-HCalJ-9.9，反應動物率（7隻動物中3至4隻）僅微小變化。在反應動物中，HEME002免疫反應的平均量值自129至453 SFU/106 個細胞不等（圖13至15）。圖11顯示在研究第-2週（即，在第一劑之前2週）的免疫反應。圖12顯示在第2週的免疫反應。圖13顯示在第6週的免疫反應。圖14顯示在第10週的免疫反應。圖15顯示在第16週的免疫反應。在第4週及第8週用MVA-HCalJ-9.9與Ipi之組合給藥的動物（第3組）相較於在Ad26HEME002免疫之後具有增加的HEME002特異性免疫反應量值（反應動物之平均的平均反應：第2週93 SFU/106 個細胞，第6週1,945 SFU/106 個細胞，及第10週983 SFU/106 個細胞），然而比較MVA投藥之前及之後的整體反應動物率並無增加。
生產IFN-γ之細胞的量值在二個劑量的Ad26HEME002與Ipi之組合之後相較於Ad26HEME002與Ipi之組合單一投藥增加（第4組）：反應動物之平均的平均HEME002反應為第2週93 SFU/106 個細胞（第一次投藥後）及第6週580 SFU/106 個細胞（第二次投藥後）。在第14週，第4組接受MVA-HCalJ-9.9與Ipi之組合的投藥，其導致反應動物之平均的平均反應增加4.6倍（第12週400 SFU/106 個細胞及第16週1,827 SFU/106 個細胞；Tobit在變化分數上p＜0.001），然而並未見到反應動物率變化。在反應動物中，僅見到免疫反應微小收縮，其中在第20週HEME002的平均反應為1,698 SFU/106 個細胞（用MVA-HCalJ-9.9 + Ipi投藥後6週）（第4組）。
HEME002免疫反應的曲線下面積（AUC；Tobit搭配Bonferroni校正）之分析在下列時間窗進行：(i)第2週至第20週，(ii)第2週至第12週，及(iii)第16週至第20週。因為高變異及高量的設限值，當比較第1組與第2組的AUC、或第2組與第3組的AUC時，並未發現統計顯著差異（圖10）。相對地，當比較第3組及第4組的時間窗第16週與第20週時，HEME002反應的AUC有顯著差異(p=0.029)。在第43天，將動物#3002（樣本#14）安樂死。動物#4003（樣本#22）在第16週顯示太多而無法計數的孔，將此樣本設定為2,000 SFU/106 個細胞且亦用於統計分析。
非臨床研究顯示，所生產之表現CALRmut及JAK2 2x9mer融合蛋白之Ad26及MVA載體能夠在體外產生T細胞活化且在小鼠及NHP中誘發細胞性免疫反應。實例 10 ： MutCALR/MutJAK2 建構體研究、投藥、及排程
本研究之主要目的是要比較抗CTLA4抗體與Ad/Ad/MVA疫苗之組合的皮下(SC)對比IV投予。該目的也要評估抗CTLA4抗體之多次投藥對比單次劑量與Ad/Ad/MVA疫苗之組合。次要目的是要評估抗CTLA-4單株抗體（即，YERVOY® （伊匹單抗）([Ipi])）與抗PD-1抗體（尼沃魯單抗）是否能夠進一步增強特異性T細胞反應。
抗CLTA4抗體係在與Ad26免疫相同的時間定位於Ad26注射經SC投予。替代地，抗CTLA4抗體係在Ad26投予之後立即經IV隨時間輸注。將每隻動物3 mg/kg之抗CTLA4抗體的SC投予與IV投予比較。在第2週分析，16隻動物接受抗CTLA4 IV (3 mg/kg)及31隻動物經由SC投予接受抗CTLA4 (3 mg/kg)。在經IV及SC投予抗CTLA4投予之研究世代中，分別觀察到類似數量的反應動物7/16 (44%)及13/31 (42%)。此外，如藉由Tobit LRT分析搭配Bonferroni校正所判定，反應的平均量值並無顯著不同(p＜0.05)（圖16，表14）。[ 表 14]
組 初免/加強 加強’ IO劑  
第0天及第28天 第84天 第0天 第28天 第84天 第29天開始每28天  
1 Ad26 / Ad26 MVA aCTLA4 3mpk iv aCTLA4 3mpk iv aCTLA4 3mpk iv -  
2 Ad26 / Ad26 MVA aCTLA4 3mpk iv -  
3 Ad26 / Ad26 MVA aCTLA4 3mpk sc aCTLA4 3mpk sc aCTLA4 3mpk sc -  
4 Ad26 / Ad26 MVA aCTLA4 3mpk sc -  
5 Ad26 / Ad26 MVA aCTLA4 3mpk sc aCTLA4 3mpk sc aCTLA4 3mpk sc aPD1 10mpk IV  
6 Ad26 / Ad26 MVA aCTLA4 3mpk sc aPD1 10mpk IV  
IV，靜脈內；sc，皮下。
第4週開始包括抗αPD-1抗體（尼沃魯單抗10 mg/kg Iv）至Ad/Ad/MVA +伊匹單抗改善mutCALR特異性T細胞反應的量值（圖17）。mutCALR肽反應係基於mutCALR特異性反應-背景計算。第6週初步ELISpot分析亦指示多劑的抗αCTLA4抗體及Ad/Ad/MVA投藥方案優於單次劑量（圖17）。實例 11 ：產生自我複製 RNA CALR_JAK2-2x9 建構體
將LS_CALR.JAK2-2x9mer多核苷酸選殖至自我複製RNA中。
將委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)之TC-83株的基因體序列作為用於建構本發明之複製子的鹼基序列。此序列係藉由將來自Sindbis病毒之下游環(DLP)置於非結構蛋白1 (nsP1)上游來修飾，且二者藉由來自豬捷申病毒-1之2A核糖體跳躍元件連接。除了突變成TAG之起始密碼子以外，在5’UTR下游及DLP上游複製nsP1的前193個核苷酸。此確保維持複製所需之所有調節及二級結構，但防止此部分nsp1序列的轉譯。將結構基因移除並將EcoR V及Asc I限制位點置於次基因體啟動子下游作為多選殖位點(MCS)以促進任何關注基因的插入（圖19）。將LS_CALR_JAK2-2x9mer插入選殖位點。轉殖基因係藉由IDT合成為dsDNA片段，其5’及3’端與MCS具有40 bp的同源性，且使用NEB HiFi DNA組裝預混試劑(cat # E2621S)選殖至經EcoRV及AscI消化之VEEV衍生性自我複製RNA載體。
完整自我複製RNA質體之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 33中。T7終止子之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 34中。AmpR啟動子之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 35中。最小26S啟動子之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 36中。T7啟動子之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 37中。Poly A位點之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 38中。來自nsP1之α 5’複製序列之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 39中。DLP之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 40中。P2A之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 41中。Bom之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO:42中。DLP nsp ORF之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 43中。nsP2之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 44中。nsP4之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 45中。nsP3之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 46中。nsP1之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 47中。KanR之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 48中。Rop之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 49中。5’UTR之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 50中。3’UTR之多核苷酸序列係顯示於SEQ ID NO: 51中。實例 12 ： srRNA.CALR/JAK2 複製子 RNA 平台在小鼠中誘發細胞性反應
這些研究之目的是要判定編碼CALR_JAK2-2x9mer之自我複製RNA分子是否可在Balb/c小鼠中初免免疫反應。基於實例7所述之資料選擇Balb/c小鼠品系，其中在Balb/c小鼠品系相較於C57BL/6小鼠品系見到較少變異。
在第一個研究中，編碼LS_CALR_JAK2-2x9mer (srRNA.CALR/JAK2)之自身複製RNA係以3、10、及30 µg給藥。在第0週，Balb/c小鼠係藉由IM注射所示劑量（3、10、及30 µg）之srRNA.CALR/JAK2免疫且對照組係經鹽水注射。在第2週，犧牲所有動物且以涵蓋插入物中CALR序列之15mer重疊肽(SEQ ID NO: 3)池、或涵蓋二個JAK2 9mer序列之9mer(SEQ ID NO:7)刺激脾細胞。生產IFN-γ之細胞的誘發係藉由IFN-γ ELISpot測量。CD8及CD4多功能性T細胞反應係藉由流動式細胞測量術測量IFN-γ、TNFα、及IL-2的生產來判定。表15顯示各種實驗組。[ 表 15]
組 動物nr 組之說明
1 5 鹽水
2 5 srRNA.CALR/JAK2 3 µg
3 5 srRNA.CALR/JAK2 10 µg
4 5 srRNA.CALR/JAK2 30 µg
所有用srRNA.CALR/JAK2免疫之動物在經涵蓋CALRmut序列之肽刺激時發展出生產IFNγ之細胞（圖21A），相對地在經二個9merJAK2肽（SEQ ID NO: 5及6）刺激時未偵測到誘發生產細胞介素之細胞（資料未顯示）。細胞內流動式細胞測量術顯示在所有測試劑量下，抗CALR反應係由CD4驅使且係多功能性（圖21B）。
在第一個研究中的自我複製RNA分子係裸露注射至動物。在第二個研究中，我們將自身複製RNA分子調配於脂質奈米粒子(LNP)中且執行表16中概述之類似研究。與第一個研究類似，所有用srRNA.CALR/JAK2免疫之動物在經涵蓋CALRmut序列之肽刺激時發展出生產IFNγ之細胞（圖22A），相對地在經二個9merJAK2肽（SEQ ID NO: 5及6）刺激時未偵測到誘發生產細胞介素之細胞（資料未顯示）。細胞內流動式細胞測量術顯示在未經調配及經LNP調配兩種版本的所有測試劑量下，抗CALR反應係由CD4驅使且係多功能性（圖22B）。[ 表 16]
組 動物nr 組之說明
1 5 鹽水
2 5 srRNA.CALR/JAK2 0.2 µg，經LNP調配
3 5 srRNA.CALR/JAK2 2 µg，經LNP調配
4 5 srRNA.CALR/JAK2 20 µg，經LNP調配
5 5 srRNA.CALR/JAK2 20 µg，未經調配
在第三個研究中，我們測試srRNA.CALR/JAK2與二種其他疫苗平台Ad26及MVA之組合，以判定異源性初免/加強方案是否增加抗CALR T細胞功能。所有平台編碼CALR_JAK2-2x9mer建構體。在第0週，Balb/c小鼠係經鹽水、Ad26HEME002 (1010 PFU)、或srRNA/CALR.JAK2 (20 µg)注射。在第4週，小鼠係經Ad26HEME002、MVA-HCalJ-9.9 (107 PFU)、或srRNA.CALR/JAK2注射且在加強後一週分析脾臟（見以下實驗設計，表17）。新增使用3週初免/加強間隔之Ad26/MVA的對照組以橋接歷史資料且在加強後2週分析脾臟。使用重疊CALR肽，藉由如上述之ELISpot及ICS分析脾臟。[ 表 17]
組 動物nr 組之說明
1 5 鹽水
2 8 僅srRNA初免
3 8 僅Ad26初免
4 8 srRNA/srRNA
5 8 Ad26/Ad26
6 8 srRNA/Ad26
7 8 Ad26/srRNA
8 8 srRNA/MVA
9 8 Ad26/MVA
10 6 Ad26/MVA 3週間隔
根據IFNγ ELISpot，添加Ad26或MVA加強至自我複製RNA初免導致統計顯著的加強（p＜0.001，分別增加5.1及6.5倍）。在Ad26初免之後添加自我複製RNA作為加強劑導致比起單獨Ad26初免增加1.7倍（不具統計顯著性）（圖23A）。細胞內細胞介素染色顯示，在自我複製RNA初免之後，添加Ad26及/或MVA作為加強導致多功能性IFNγ+ TNFα+ IL-2+ CD4 T細胞統計顯著的增加（p＜0.001，分別增加4.9及3.6倍）。在Ad26初免之後用自我複製RNA加強導致多功能性三細胞介素陽性T細胞比起單獨Ad26初免增加2倍（不具統計顯著性）（圖23B）。實例 13. srRNA.CALR/JAK2 及 MVA-HCalJ-9.9 於非人類靈長動物 (NHP) 中之免疫原性
此研究之主要目的是要判定用srRNA.CALR/JAK2及MVA-HCalJ-9.9免疫比起單獨用srRNA.CALR/JAK2免疫，是否在NHP中誘發較高量值及持續時間之抗原特異性T細胞反應。次要目的是要評估抗CTLA-4單株抗體（即，YERVOY® （伊匹單抗）([Ipi])）與srRNA.CALR/JAK2及MVA-HCalJ-9.9之組合是否可增強疫苗誘發之免疫反應。此外，探索性目的是要評估抗PD-1單株抗體OPDIVO® （尼沃魯單抗）與疫苗方案及抗CTLA-4抗體之組合相較於無抗PD-1給藥之動物是否係可相比的或增加插入物特異性T細胞反應。根據表18所示之時程，食蟹獼猴係單獨用srRNA.CALR/JAK2及/或MVA-HCalJ-9.9、或與Ipi（3 mg/kg皮下[SC]）之組合、或與尼沃魯單抗（10 mg/kg靜脈內[IV]）之組合進行IM免疫。簡言之，NHP將用srRNA.CALR/JAK2及MVA-HCalJ-9.9與Ipi 3 mg/kg SC之組合（第2組）或與Ipi 3 mg/kg SC及尼沃魯單抗IV 10 mg/kg IV之組合（第4組）免疫。在各種時間點將動物放血，並單離PBMC及血清以進行免疫檢定。在研究期間的各種時間點，使用包含對應於整個CALR插入物序列之15mer重疊肽之肽池，在PBMC中藉由IFNγ ELISpot評估對CALR抗原具特異性之免疫反應的誘發。
預期當srRNA.CALR/JAK2疫苗作為與MVA-HCalJ-9.9組合投予之方案時，其所誘發之抗原特異性T細胞反應可進一步增加。使用免疫檢查點阻斷單株抗體抗CTLA-4及/或抗PD-1抗體與srRNA.CALR/JAK2及MVA-HCalJ-9.9之組合將導致較高量值、品質、及更為持久的抗原特異性T細胞反應。[ 表 18]
組 第0/28天 第70天 抗CTLA-4 mAb 抗PD-1 mAb
1 srRNA/srRNA MVA - -
2 srRNA/srRNA MVA 0、28、70 -
3 srRNA/srRNA MVA 0、28、70 29、57、84、113
實例 14 。在非人類靈長動物 (NHP) 中 GAd.CALR.JAK2 之免疫原性及 srRNA.CALR/JAK2 之連續呈現
本研究之主要目的是要證實用GAd20.CALR.JAK2與抗CTL-4抗體及MVA或sRNA之組合免疫誘發抗原特異性T細胞反應。本研究亦經設計以判定當用srRNA.CALR/JAK2與GAd20或GAD20/MVA組合免疫時是否增加T細胞，及是否可使用srRNA代替MVA。本研究之目的也要評估GAD20/MVA/srRNA與抗CTLA4抗體之組合是否可誘發大於單獨GAD20/MVA/srRNA之抗原特異性T細胞反應。預期添加srRNA.CALR/JAK2載體至GAd20/MVA疫苗作為三重組合在癌症患者中驅使較大及更為持久的抗原特異性T細胞反應。
本研究之第二目的是要評估srRNA.CALR.JAK2多劑方案完全消除或在投予MVA之後消除抗CTL-4抗體之需求的能力。此外，本研究係經建構以判定srRNA是否可多次投予（每月）以持續增加或維持抗原特異性T細胞反應。所產生之抗mutCALR/mutJAK2靶向T細胞的最高及最持久水準將需要對Ab媒介之中和作用不具感受性之載體連續新抗原呈現，導致惡性選殖株廓清及對MPN患者的臨床優點。基於自我複製RNA之疫苗的一項潛在優點在於缺乏載體特異性免疫力之發展。不存在載體特異性免疫反應可允許重複投予自我複製RNA而不縮小抗原呈現，因為基於自我複製RNA之疫苗無法產生對載體具特異性之中和抗體。測試多劑方案以評估srRNA.CALR/JAK2是否可藉由每月肌內投藥時程投予來維持抗原特異性T細胞反應。
在本研究中，食蟹獼猴係根據表19所示之時程免疫。在各種時間點將動物放血，並單離PBMC及血清以進行免疫檢定。在研究期間的各種時間點，使用包含對應於整個CALR插入物序列之15mer重疊肽之肽池，在PBMC中藉由IFNγ ELISpot評估對CALR抗原具特異性之免疫反應的誘發。
在GAd20/MVA免疫之後，獨立於或與CPI投予組合之srRNA.CALR/JAK2的投予將允許持續加強以延長抗原特異性T細胞反應。預期基於多劑srRNA.CALR/JAK2自我複製RNA之方案誘發較長持續時間之較高量值的T細胞反應。[ 表 19]
組 組之說明
1 GAd20/MVA/srRNA
2 GAd20/MVA/srRNA/srRNA
3 GAd20/srRNA/srRNA/srRNA
4 GAD20/GAD20/MVA +抗CTLA4抗體3 mg/kg IV
5 GAD20/GAD20 /MVA/srRNA/srRNA/srRNA +抗CTLA4抗體3 mg/kg IV
6 GAD20/GAD20/srRNA/srRNA/srRNA/srRNA +抗CTLA4抗體3 mg/kg IV
4 GAD20/GAD20/srRNA/srRNA/srRNA/srRNA
實施例
下面的實施例列表係意在補充而非代替或取代先前的描述。 實施例1.         一種多肽，其包含選自由下列所組成之群組的至少二或更多個表位序列： MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE (SEQ ID NO: 1)或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性者； EEAEDNCRRMMRTK (SEQ ID NO: 2)或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性者； KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG (SEQ ID NO: 4)或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性者； VLNYGVCFC (SEQ ID NO: 5)或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性者； FCGDENILV (SEQ ID NO: 6)或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性者；及其組合。 實施例2.         如實施例1所述之多肽，其中該多肽包含該表位序列： MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE (SEQ ID NO: 1)或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性者； EEAEDNCRRMMRTK (SEQ ID NO: 2)或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性者； VLNYGVCFC (SEQ ID NO: 5)或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性者；及 FCGDENILV (SEQ ID NO: 6)或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性者。 實施例3.         如實施例1所述之多肽，其中該多肽包含該表位序列： MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE (SEQ ID NO: 1)或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性者； EEAEDNCRRMMRTK (SEQ ID NO: 2)或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性者；及 KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG (SEQ ID NO: 4)或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性者。 實施例4.         如實施例1所述之多肽，其中該多肽包含該表位序列： MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE (SEQ ID NO: 1)或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性者；及 EEAEDNCRRMMRTK (SEQ ID NO: 2)或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性者。 實施例5.         如實施例1至4中任一項所述之多肽，其在N端進一步包含選自下列之前導序列： MACPGFLWALVISTCLEFSMA (SEQ ID NO: 8)； MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGV (SEQ ID NO: 54)；及 MGQKEQIHTLQKNSERMSKQLTRSSQAV (SEQ ID NO: 29)。 實施例6.         如實施例1至5中任一項所述之多肽，其中該等表位序列係藉由連接子序列彼此連接。 實施例7.         如實施例6所述之多肽，其中該連接子序列係選自AAY、RR、DPP、HHAA、HHA、HHL、RKSYL、RKSY、SSL、或REKR。 實施例8.         如實施例6所述之多肽，其中該連接子序列包含蛋白酶切割位點。 實施例9.         如實施例1所述之多肽，其中該多肽係選自： SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO: 3具有至少90%序列同一性之胺基酸序列； SEQ ID NO: 7或與SEQ ID NO: 7具有至少90%序列同一性之胺基酸序列； SEQ ID NO: 9或與SEQ ID NO: 9具有至少90%序列同一性之胺基酸序列； SEQ ID NO: 10或與SEQ ID NO: 10具有至少90%序列同一性之胺基酸序列； SEQ ID NO: 11或與SEQ ID NO: 11具有至少90%序列同一性之胺基酸序列； SEQ ID NO: 12或與SEQ ID NO: 12具有至少90%序列同一性之胺基酸序列； SEQ ID NO: 13或與SEQ ID NO: 13具有至少90%序列同一性之胺基酸序列； SEQ ID NO: 14或與SEQ ID NO: 14具有至少90%序列同一性之胺基酸序列； SEQ ID NO: 15或與SEQ ID NO: 15具有至少90%序列同一性之胺基酸序列；及 SEQ ID NO: 31或與SEQ ID NO: 31具有至少90%序列同一性之胺基酸序列。 實施例10.       一種多核苷酸，其編碼如實施例1至9中任一項所述之多肽。 實施例11.       如實施例10所述之多核苷酸，其中該多核苷酸係選自由下列所組成之群組： SEQ ID NO: 16或與SEQ ID NO: 16具有至少90%序列同一性之核酸序列； SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少90%序列同一性之核酸序列； SEQ ID NO: 18或與SEQ ID NO: 18具有至少90%序列同一性之核酸序列； SEQ ID NO: 19或與SEQ ID NO: 19具有至少90%序列同一性之核酸序列； SEQ ID NO: 20或與SEQ ID NO: 20具有至少90%序列同一性之核酸序列； SEQ ID NO: 21或與SEQ ID NO: 21具有至少90%序列同一性之核酸序列； SEQ ID NO: 22或與SEQ ID NO: 22具有至少90%序列同一性之核酸序列； SEQ ID NO: 26或與SEQ ID NO: 26具有至少90%序列同一性之核酸序列；及 SEQ ID NO: 27或與SEQ ID NO: 27具有至少90%序列同一性之核酸序列。 實施例12.       一種載體，其包含如實施例10或實施例11所述之多核苷酸。 實施例13.       如實施例12所述之載體，其中該載體係選自腺病毒載體、α病毒載體、痘病毒載體、腺病毒相關病毒載體、反轉錄病毒載體、自我複製RNA分子、及其組合。 實施例14.       如實施例13所述之載體，其中該腺病毒載體係選自hAd5、hAd7、hAd11、hAd26、hAd34、hAd35、hAd48、hAd49、hAd50、GAd20、Gad19、GAd21、GAd25、GAd26、GAd27、GAd28、GAd29、GAd30、GAd31、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAdI7、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2、及PanAd3。 實施例15.       如實施例13所述之載體，其中該痘病毒載體係選自天花病毒載體、痘苗病毒載體、牛痘病毒載體、猴痘病毒載體、哥本哈根痘苗病毒(W)載體、紐約減毒痘苗病毒(NYVAC)載體、及經修飾安卡拉痘苗病毒(MVA)載體。 實施例16.       如實施例12所述之載體，其中該載體係該腺病毒載體，其包含編碼如實施例1至9中任一項所述之多肽中任一者之多核苷酸。 實施例17.       如實施例12所述之載體，其中該載體係該自我複製RNA分子，其包含編碼如實施例1至9中任一項所述之多肽中任一者之多核苷酸。 實施例18.       如實施例12所述之載體，其中該載體係Ad26，其包含編碼SEQ ID NO: 10或與SEQ ID NO: 10具有至少90%序列同一性之多肽之多核苷酸。 實施例19.       如實施例12所述之載體，其中該載體係MVA載體，其包含編碼SEQ ID NO: 31或與SEQ ID NO: 31具有至少90%序列同一性之多肽之多核苷酸。 實施例20.       如實施例12所述之載體，其中該載體係GAd20，其包含編碼SEQ ID NO: 31或與SEQ ID NO: 31具有至少90%序列同一性之多肽之多核苷酸。 實施例21.       如實施例12所述之載體，其中該載體係自我複製RNA分子，其包含編碼SEQ ID NO: 12或與SEQ ID NO: 12具有至少90%序列同一性之多肽之多核苷酸。 實施例22.       一種醫藥組成物，其包含如實施例1至9中任一項所述之多肽。 實施例23.       一種醫藥組成物，其包含如實施例10及11中任一項所述之多核苷酸。 實施例24.       一種醫藥組成物，其包含如實施例12至21中任一項所述之載體。 實施例25.       如實施例24所述之醫藥組成物，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、自我複製RNA分子、及其組合。 實施例26.       一種治療、預防、減少對象的臨床病況之開始風險或延緩開始之方法，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，該方法包含向有此需要之該對象投予如實施例22至25中任一項所述之醫藥組成物。 實施例27.       一種誘發對象的免疫反應之方法，該對象攜帶JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變，該方法包含向有此需要之該對象投予如實施例22至25中任一項所述之醫藥組成物。 實施例28.       一種治療或預防對象的骨髓增生性疾病之方法，該方法包含向有此需要之該對象投予如實施例22至25中任一項所述之醫藥組成物。 實施例29.       一種治療對象的癌症之方法，該方法包含向有此需要之該對象投予如實施例22至25中任一項所述之醫藥組成物。 實施例30.       一種治療對象的心血管疾病之方法，該方法包含向有此需要之該對象投予如實施例22至25中任一項所述之醫藥組成物。 實施例31.       一種治療、預防、減少對象的臨床病況之開始風險或延緩開始之方法，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，該方法包含向有此需要之該對象投予包含載體之組成物，該載體包含編碼至少二或更多個表位序列之多核苷酸，該至少二或更多個表位序列係選自由下列所組成之群組： ●    SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之JAK2表位；及其組合，且 其中該投予包含一或多次投予該組成物。 實施例32.       一種誘發對象的免疫反應之方法，該對象攜帶JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變，該方法包含向有此需要之該對象投予包含載體之組成物，該載體包含編碼至少二或更多個表位序列之多核苷酸，該至少二或更多個表位序列係選自由下列所組成之群組： ●    SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之JAK2表位；及其組合，且 其中該投予包含一或多次投予該組成物。 實施例33.       一種治療或預防對象的骨髓增生性疾病之方法，該方法包含向有此需要之該對象投予包含載體之組成物，該載體包含編碼至少二或更多個表位序列之多核苷酸，該至少二或更多個表位序列係選自由下列所組成之群組： ●    SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之JAK2表位；及其組合，且 其中該投予包含一或多次投予該組成物。 實施例34.       如實施例33所述之方法，其中該骨髓增生性疾病係選自原發性骨髓纖維化(MPN)、真性紅血球增多症(PV)、原發性血小板血症(ET)、原發性骨髓纖維化(PFM)、繼發性骨髓纖維化、急性骨髓樣白血病(AML)、繼發性AML、慢性骨髓性白血病(CML)、未定潛能的複製性造血(CHIP)、及慢性骨髓單核球性白血病(CMML)。 實施例35.       一種治療對象的癌症之方法，該方法包含向有此需要之該對象投予包含載體之組成物，該載體包含編碼至少二或更多個表位序列之多核苷酸，該至少二或更多個表位序列係選自由下列所組成之群組： ●    SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之JAK2表位；及其組合，且 其中該投予包含一或多次投予該組成物。 實施例36.       如實施例35所述之方法，其中該癌症係選自肺癌、淋巴樣癌症、急性淋巴樣白血病、急性骨髓樣白血病、慢性骨髓性白血病、Burkitt氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、漿細胞骨髓瘤、膽管癌、膀胱癌、肝癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、泌尿道癌症、中樞神經系統癌症、神經胚細胞瘤、腎癌、乳癌、子宮頸癌、睪丸癌、及軟組織癌症。 實施例37.       一種治療對象的心血管疾病之方法，該方法包含向有此需要之該對象投予包含載體之組成物，該載體包含編碼至少二或更多個表位序列之多核苷酸，該至少二或更多個表位序列係選自由下列所組成之群組： ●    SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●    SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●    SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之JAK2表位；及其組合，且 其中該投予包含一或多次投予該組成物。 實施例38.       如實施例37所述之方法，其中該心血管疾病係選自急性冠狀動脈症候群、缺血性腦血管疾病、缺血性心臟病、血栓形成、靜脈血栓性栓塞、深層靜脈栓塞、肺栓塞、災難性腹內血栓形成、周邊動脈疾病、高血壓、心衰竭、心房顫動、冠心病、動脈粥樣硬化、及複製性造血。 實施例39.       如實施例31至38中任一項所述之方法，其中該載體係選自腺病毒載體、α病毒載體、痘病毒載體、腺病毒相關病毒載體、反轉錄病毒載體、自我複製RNA分子、及其組合。 實施例40.       如實施例31至39中任一項所述之方法，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、自我複製RNA分子、及其組合。 實施例41.       如實施例31至39中任一項所述之方法，其中該載體係Ad26載體，其包含編碼多肽之多核苷酸，該多肽包含SEQ ID NO: 1之鈣網伴護蛋白(CALR)表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的表位序列。 實施例42.       如實施例31至39中任一項所述之方法，其中該載體係GAd20載體，其包含編碼多肽之多核苷酸，該多肽包含SEQ ID NO: 1之鈣網伴護蛋白(CALR)表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的表位序列。 實施例43.       如實施例31至39中任一項所述之方法，其中該載體係MVA載體，其包含編碼多肽之多核苷酸，該多肽包含SEQ ID NO: 1之鈣網伴護蛋白(CALR)表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的表位序列。 實施例44.       如實施例31至39中任一項所述之方法，其中該載體係自我複製RNA分子，其包含編碼多肽之多核苷酸，該多肽包含SEQ ID NO: 1之鈣網伴護蛋白(CALR)表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之Janus激酶2 (JAK2)表位的表位序列。 實施例45.       如實施例31至44中任一項所述之方法，其包含一或多個治療週期，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子；及 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子。 實施例46.       如實施例31至44中任一項所述之方法，其包含一或多個治療週期，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子；及 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子；及
第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子。 實施例47.       如實施例31至44中任一項所述之方法，其包含一或多個治療週期，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體； 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子；及 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係MVA載體。 實施例48.       如實施例31至44中任一項所述之方法，其包含一或多個治療週期，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體； 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體；及 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係MVA載體。 實施例49.       如實施例31至44中任一項所述之方法，其包含一或多個治療週期，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體； 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體； 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係MVA載體；及 第四投予，其包含第四組成物，該第四組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子。 實施例50.       如實施例31至44中任一項所述之方法，其包含一或多個治療週期，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體； 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係MVA載體； 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子；及 第四投予，其包含第四組成物，該第四組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子。 實施例51.       如實施例31至44中任一項所述之方法，其包含一或多個治療週期，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體； 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子； 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子；及 第四投予，其包含第四組成物，該第四組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子。 實施例52.       如實施例31至44中任一項所述之方法，其包含一或多個治療週期，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體；及 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體； 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子； 第四投予，其包含第四組成物，該第四組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子； 第五投予，其包含第五組成物，該第五組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子；及 第六投予，其包含第六組成物，該第六組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子。 實施例53.       如實施例31至52中任一項所述之方法，其進一步包含投予選自下列之第二治療劑：CTLA-4抗體、PD-1抗體、PD-L1抗體、TLR促效劑、CD40促效劑、OX40促效劑、羥脲、魯索替尼(ruxolitinib)、菲達替尼(fedratinib)、41BB促效劑、CD28促效劑、FLT3配體、硫酸鋁、BTK抑制劑、JAK抑制劑、CD38抗體、CDK抑制劑、CD33抗體、CD37抗體、CD25抗體、GM-CSF抑制劑、IL-2、IL-15、IL-7、IFNγ、IFNα、TNFα、VEGF抗體、CD70抗體、CD27抗體、BCMA抗體、GPRC5D抗體、及其組合。 實施例54.       如實施例31至44中任一項所述之方法，其包含一或多個治療週期，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體； 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體；及 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係MVA載體；及 其中該治療週期進一步包含投予檢查點抑制劑與該第一、第二、及/或第三組成物之組合，該檢查點抑制劑係選自抗CTLA-4抗體、PD-1抗體、及PD-L1抗體。 實施例55.       如實施例31至44中任一項所述之方法，其包含一或多個治療週期，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體； 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體； 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係MVA載體； 第四投予，其包含第四組成物，該第四組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子； 第五投予，其包含第五組成物，該第五組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子；及 第六投予，其包含第六組成物，該第六組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子；及 其中該治療週期進一步包含投予檢查點抑制劑與該第一、第二、第三、第四、第五、及/或第六組成物之組合，該檢查點抑制劑係選自抗CTLA-4抗體、PD-1抗體、及PD-L1抗體。 實施例56.       如實施例31至44中任一項所述之方法，其包含一或多個治療週期，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體；及 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體； 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製； 第四投予，其包含第四組成物，該第四組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子； 第五投予，其包含第五組成物，該第五組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子；及 第六投予，其包含第六組成物，該第六組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子；及 其中該治療週期進一步包含投予檢查點抑制劑與該第一、第二、第三、第四、第五、及/或第六組成物之組合，該檢查點抑制劑係選自抗CTLA-4抗體、PD-1抗體、及PD-L1抗體。 實施例57.       如實施例31至44中任一項所述之方法，其包含一或多個治療週期，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體； 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體； 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係MVA載體； 第四投予，其包含第四組成物，該第四組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子； 第五投予，其包含第五組成物，該第五組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子；及 第六投予，其包含第六組成物，該第六組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子；及 其中該治療週期進一步包含投予檢查點抑制劑與該第一、第二、第三、第四、第五、及/或第六組成物之組合，該檢查點抑制劑係選自抗CTLA-4抗體、PD-1抗體、及PD-L1抗體。 實施例58.       如實施例31至44中任一項所述之方法，其包含一或多個治療週期，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體；及 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係GAd20載體； 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製； 第四投予，其包含第四組成物，該第四組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子； 第五投予，其包含第五組成物，該第五組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子；及 第六投予，其包含第六組成物，該第六組成物包含載體，該載體包含編碼SEQ ID NO: 1之CALR表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係自我複製RNA分子；及 其中該治療週期進一步包含投予檢查點抑制劑與該第一、第二、第三、第四、第五、及/或第六組成物之組合，該檢查點抑制劑係選自抗CTLA-4抗體、PD-1抗體、及PD-L1抗體。 實施例58.       如實施例31至44中任一項所述之方法，其包含一或多個治療週期，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼2或更多個串聯重複的SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子； 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼2或更多個串聯重複的SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子。 實施例59.       如實施例31至44中任一項所述之方法，其包含一或多個治療週期，其中各週期包含： 第一投予，其包含第一組成物，該第一組成物包含載體，該載體包含編碼2或更多個串聯重複的SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子； 第二投予，其包含第二組成物，該第二組成物包含載體，該載體包含編碼2或更多個串聯重複的SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子； 第三投予，其包含第三組成物，該第三組成物包含載體，該載體包含編碼2或更多個串聯重複的SEQ ID NO: 6之JAK2表位的多核苷酸，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、或自我複製RNA分子；及 其中該治療週期進一步包含投予檢查點抑制劑與該第一、第二、及/或第三組成物之組合，該檢查點抑制劑係選自抗CTLA-4抗體、PD-1抗體、及PD-L1抗體。序列表
SEQ ID NO: 表位 序列
1 CALR表位I MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE
2 CALR表位II EEAEDNCRRMMRTK
3 CALR表位I-AAY-CALR表位II MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEAAYEEAEDNCRRMMRTK
4 JAK2 30mer表位 KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG
5 JAK2表位1 VLNYGVCFC
6 JAK2表位2 FCGDENILV
7 2X9mer JAK2 VLNYGVCFCAAYFCGDENILV
8 HAVt20前導序列(LS) MACPGFLWALVISTCLEFSMA
9 LS_CALR (HEME003) MACPGFLWALVISTCLEFSMAMKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEAAYEEAEDNCRRMMRTK
10 LS_CALR_JAK2-2x9mer (HEME002) MACPGFLWALVISTCLEFSMAMKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEAAYEEAEDNCRRMMRTKAAYVLNYGVCFCAAYFCGDENILV
11 LS_CALR_JAK2-30mer (HEME001) MACPGFLWALVISTCLEFSMAMKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEAAYEEAEDNCRRMMRTKAAYKLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG
12 CALR_JAK2-2x9mer MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEAAYEEAEDNCRRMMRTKAAYVLNYGVCFCAAYFCGDENILV
13 CALR_JAK2-30mer MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEAAY EEAEDNCRRMMRTKAAYKLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG
14 Ubiq_CALR_JAK2-2x9mer MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGVRKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEAAYEEAEDNCRRMMRTKAAYVLNYGVCFCAAYFCGDENILV
15 Ubiq_CALR_JAK2-30mer MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGVRKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEAAYEEAEDNCRRMMRTKAAYKLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG
16 LS_CALR ATGGCATGCCCAGGCTTCCTGTGGGCCCTGGTCATCAGCACCTGTCTGGAGTTTTCCATGGCCATGAAGGACAAGCAGGATGAGGAGCAGCGGACCCGGAGAATGATGAGGACAAAGATGCGCATGAGGCGCATGCGGAGAACAAGGCGCAAGATGCGGAGAAAGATGTCTCCAGCAAGGCCTAGAACCAGCTGCAGGGAGGCATGTCTGCAGGGATGGACAGAGGCAGCATACGAGGAGGCAGAGGACAACTGCAGGCGCATGATGAGGACCAAG
17 LS_CALR_JAK2-2x9mer ATGGCATGCCCAGGCTTCCTGTGGGCCCTGGTCATCAGCACCTGTCTGGAGTTTTCCATGGCCATGAAGGACAAGCAGGATGAGGAGCAGCGGACCCGGAGAATGATGAGGACAAAGATGCGCATGAGGCGCATGCGGAGAACAAGGCGCAAGATGCGGAGAAAGATGTCTCCAGCAAGGCCTAGAACCAGCTGCAGGGAGGCATGTCTGCAGGGATGGACAGAGGCAGCATACGAGGAGGCAGAGGACAACTGCAGGCGCATGATGAGGACCAAGGCCGCCTACGTGCTGAATTATGGCGTGTGCTTCTGTGCCGCCTATTTTTGTGGCGATGAGAACATCCTGGTG
18 LS_CALR_JAK2-30mer ATGGCATGCCCAGGCTTCCTGTGGGCCCTGGTCATCAGCACCTGTCTGGAGTTTTCCATGGCCATGAAGGACAAGCAGGATGAGGAGCAGCGGACCCGGAGAATGATGAGGACAAAGATGCGCATGAGGCGCATGCGGAGAACAAGGCGCAAGATGCGGAGAAAGATGTCTCCAGCAAGGCCTAGAACCAGCTGCAGGGAGGCATGTCTGCAGGGATGGACAGAGGCAGCATACGAGGAGGCAGAGGACAACTGCAGGCGCATGATGAGGACCAAGGCCGCCTACAAGCTGAGCCACAAGCACCTGGTGCTGAACTATGGCGTGTGCTTCTGTGGCGATGAGAATATCCTGGTGCAGGAGTTCGTGAAGTTTGGC
19 用於Ad26之CALR_JAK2-2x9mer ATGAAGGACAAGCAGGATGAGGAGCAGCGGACCCGGAGAATGATGAGGACAAAGATGCGCATGAGGCGCATGCGGAGAACAAGGCGCAAGATGCGGAGAAAGATGTCTCCAGCAAGGCCTAGAACCAGCTGCAGGGAGGCATGTCTGCAGGGATGGACAGAGGCAGCATACGAGGAGGCAGAGGACAACTGCAGGCGCATGATGAGGACCAAGGCCGCCTACGTGCTGAATTATGGCGTGTGCTTCTGTGCCGCCTATTTTTGTGGCGATGAGAACATCCTGGTG
20 CALR_JAK2-30mer ATGAAGGACAAGCAGGATGAGGAGCAGCGGACCCGGAGAATGATGAGGACAAAGATGCGCATGAGGCGCATGCGGAGAACAAGGCGCAAGATGCGGAGAAAGATGTCTCCAGCAAGGCCTAGAACCAGCTGCAGGGAGGCATGTCTGCAGGGATGGACAGAGGCAGCATACGAGGAGGCAGAGGACAACTGCAGGCGCATGATGAGGACCAAGGCCGCCTACAAGCTGAGCCACAAGCACCTGGTGCTGAACTATGGCGTGTGCTTCTGTGGCGATGAGAATATCCTGGTGCAGGAGTTCGTGAAGTTTGGC
21 Ubiq_CALR_JAK2-2x9mer ATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACAGGCAAGACCATCACACTGGAGGTGGAGCCCTCCGACACCATCGAGAACGTGAAGGCCAAGATCCAGGACAAGGAGGGCATCCCCCCTGATCAGCAGCGGCTGATCTTTGCCGGCAAGCAGCTGGAGGACGGCAGAACCCTGTCTGATTACAATATCCAGAAGGAGAGCACACTGCACCTGGTGCTGCGGCTGAGAGGCGTGAGGAAGGACAAGCAGGATGAGGAGCAGCGCACCCGGAGAATGATGCGGACAAAGATGAGAATGAGGCGCATGCGGAGAACCAGGCGCAAGATGCGGAGAAAGATGAGCCCAGCAAGGCCACGCACCTCCTGCAGGGAGGCATGTCTGCAGGGATGGACAGAGGCAGCCTATGAGGAGGCCGAGGACAACTGCAGGCGCATGATGCGGACAAAGGCCGCCTACGTGCTGAATTATGGCGTGTGCTTCTGTGCCGCCTATTTTTGTGGCGATGAGAACATCCTGGTG
22 Ubiq_CALR_JAK2-30mer ATGCAGATCTTCGTGAAGACCCTGACAGGCAAGACCATCACACTGGAGGTGGAGCCCTCCGACACCATCGAGAACGTGAAGGCCAAGATCCAGGACAAGGAGGGCATCCCCCCTGATCAGCAGCGGCTGATCTTTGCCGGCAAGCAGCTGGAGGACGGCAGAACCCTGTCTGATTACAATATCCAGAAGGAGAGCACACTGCACCTGGTGCTGCGGCTGAGAGGCGTGAGGAAGGACAAGCAGGATGAGGAGCAGCGCACCCGGAGAATGATGCGGACAAAGATGAGAATGAGGCGCATGCGGAGAACCAGGCGCAAGATGCGGAGAAAGATGAGCCCAGCAAGGCCACGCACCTCCTGCAGGGAGGCATGTCTGCAGGGATGGACAGAGGCAGCCTATGAGGAGGCCGAGGACAACTGCAGGCGCATGATGCGGACAAAGGCCGCCTACAAGCTGTCTCACAAGCACCTGGTGCTGAACTATGGCGTGTGCTTCTGTGGCGATGAGAATATCCTGGTGCAGGAGTTCGTGAAGTTTGGCTGATAA
23 Ad26HEME001轉殖基因之多核 苷酸序列 （其含有：含有 四環素操作子 (TetO)之巨細胞 病毒(CMV) 啟動子、Kozak 序列、及轉殖基 因、及猿猴病毒 40 (SV40)多腺苷 酸化信號） TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGATCGTCGACGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGATCTAGAGCCACCATGGCATGCCCAGGCTTCCTGTGGGCCCTGGTCATCAGCACCTGTCTGGAGTTTTCCATGGCCATGAAGGACAAGCAGGATGAGGAGCAGCGGACCCGGAGAATGATGAGGACAAAGATGCGCATGAGGCGCATGCGGAGAACAAGGCGCAAGATGCGGAGAAAGATGTCTCCAGCAAGGCCTAGAACCAGCTGCAGGGAGGCATGTCTGCAGGGATGGACAGAGGCAGCATACGAGGAGGCAGAGGACAACTGCAGGCGCATGATGAGGACCAAGGCCGCCTACAAGCTGAGCCACAAGCACCTGGTGCTGAACTATGGCGTGTGCTTCTGTGGCGATGAGAATATCCTGGTGCAGGAGTTCGTGAAGTTTGGCTGATAAGGTACCATCCGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCT
24 Ad26HEME002 轉殖基因之多核 苷酸序列（其含 有：含有四環素操作子(TetO) 之巨細胞病毒 (CMV)啟動子、 Kozak序列、 及轉殖基因、 及猿猴病毒40 (SV40)多腺苷酸 化信號） TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCCCTATCAGTGATAGAGATCTCCCTATCAGTGATAGAGATCGTCGACGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGATCTAGAGCCACCATGGCATGCCCAGGCTTCCTGTGGGCCCTGGTCATCAGCACCTGTCTGGAGTTTTCCATGGCCATGAAGGACAAGCAGGATGAGGAGCAGCGGACCCGGAGAATGATGAGGACAAAGATGCGCATGAGGCGCATGCGGAGAACAAGGCGCAAGATGCGGAGAAAGATGTCTCCAGCAAGGCCTAGAACCAGCTGCAGGGAGGCATGTCTGCAGGGATGGACAGAGGCAGCATACGAGGAGGCAGAGGACAACTGCAGGCGCATGATGAGGACCAAGGCCGCCTACGTGCTGAATTATGGCGTGTGCTTCTGTGCCGCCTATTTTTGTGGCGATGAGAACATCCTGGTGTGATAAGGTACCATCCGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCT
25 HCalJ-9.9 (TCE_CALR_ JAK2-2x9mer)， 用於在MVA及 Gad20中表現之 完整插入物DNA gatcactaattccaaacccacccgctttttatagtaagtttttcacccataaataataaatacaataattaatttctcgtaaaagtagaaaatatattctaatttattgcacggtaaggaagtagaatcataaagaacagtgacGGATCCcgcgacttcgccgccatgggccagaaggaacagattcatacgcttcagaaaaattctgaacgaatgtcaaagcaattgacacgaagttctcaggcagtaatgaaggacaaacaagacgaagaacaacgaactaggcggatgatgaggactaagatgaggatgcggaggatgagacggacgcgacgcaagatgcgccggaaaatgtctcccgcccggccaaggacgtcttgtcgggaagcctgtttgcagggctggaccgaagcagcttacgaagaagcagaagacaattgtcggcgaatgatgagaacgaaggctgcttacgtgcttaactatggagtgtgcttctgcgctgcctatttctgcggagatgagaacattctggtgtagtaaaGGCGCGCC
26 HCalJ-9.9 (TCE_CALR_ JAK2-2x9mer)， 用於在MVA及 Gad20中表現之 僅轉殖基因與前 導序列 atgggccagaaggaacagattcatacgcttcagaaaaattctgaacgaatgtcaaagcaattgacacgaagttctcaggcagtaatgaaggacaaacaagacgaagaacaacgaactaggcggatgatgaggactaagatgaggatgcggaggatgagacggacgcgacgcaagatgcgccggaaaatgtctcccgcccggccaaggacgtcttgtcgggaagcctgtttgcagggctggaccgaagcagcttacgaagaagcagaagacaattgtcggcgaatgatgagaacgaaggctgcttacgtgcttaactatggagtgtgcttctgcgctgcctatttctgcggagatgagaacattctggtg
27 CALR_ JAK2-2x9mer， 用於在MVA及 Gad20中表現之 僅轉殖基因 （不含前導序列 DNA） atgaaggacaaacaagacgaagaacaacgaactaggcggatgatgaggactaagatgaggatgcggaggatgagacggacgcgacgcaagatgcgccggaaaatgtctcccgcccggccaaggacgtcttgtcgggaagcctgtttgcagggctggaccgaagcagcttacgaagaagcagaagacaattgtcggcgaatgatgagaacgaaggctgcttacgtgcttaactatggagtgtgcttctgcgctgcctatttctgcggagatgagaacattctggt
28 JAK2表位 2-AAY-JAK2 表位2 FCGDENILVAAYFCGDENILV
29 TCE MGQKEQIHTLQKNSERMSKQLTRSSQAV
30 TCE多核苷酸 atgggccagaaggaacagattcatacgcttcagaaaaattctgaacgaatgtcaaagcaattgacacgaagttctcaggcagta
31 TCE_CALR_ JAK2-2x9mer MGQKEQIHTLQKNSERMSKQLTRSSQAVMKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEAAYEEAEDNCRRMMRTKAAYVLNYGVCFCAAYFCGDENILV
32 P7.5啟動子 gatcactaattccaaacccacccgctttttatagtaagtttttcacccataaataataaatacaataattaatttctcgtaaaagtagaaaatatattctaatttattgcacggtaaggaagtagaatcataaagaacagtgacGGATC
33 完整自我複製 RNA質體之多 核苷酸序列 TAATACGACTCACTATAGATAGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAATAGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAATAGTCAGCATAGTACATTTCATCTGACTAATACTACAACACCACCACCATGAATAGAGGATTCTTTAACATGCTCGGCCGCCGCCCCTTCCCGGCCCCCACTGCCATGTGGAGGCCGCGGAGAAGGAGGCAGGCGGCCCCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTCGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCTGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATCCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCATACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGCTAACCTGAATGGACTACGACATAGTCTAGTCCGCCAAGATATCGGCGCGCCGTTTAAACGGCCGGCCTTAATTAAGTAACGATACAGCAGCAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCTTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCCCTCTCTAAACGGAGGGGTTTTTTTCAGCGTAACTGGACTGGCCACAGTTAGGCGGCCGCGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCTCCATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGGCATCAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTATTAGAAAAATTCATCCAGCAGACGATAAAACGCAATACGCTGGCTATCCGGTGCCGCAATGCCATACAGCACCAGAAAACGATCCGCCCATTCGCCGCCCAGTTCTTCCGCAATATCACGGGTGGCCAGCGCAATATCCTGATAACGATCCGCCACGCCCAGACGGCCGCAATCAATAAAGCCGCTAAAACGGCCATTTTCCACCATAATGTTCGGCAGGCACGCATCACCATGGGTCACCACCAGATCTTCGCCATCCGGCATGCTCGCTTTCAGACGCGCAAACAGCTCTGCCGGTGCCAGGCCCTGATGTTCTTCATCCAGATCATCCTGATCCACCAGGCCCGCTTCCATACGGGTACGCGCACGTTCAATACGATGTTTCGCCTGATGATCAAACGGACAGGTCGCCGGGTCCAGGGTATGCAGACGACGCATGGCATCCGCCATAATGCTCACTTTTTCTGCCGGCGCCAGATGGCTAGACAGCAGATCCTGACCCGGCACTTCGCCCAGCAGCAGCCAATCACGGCCCGCTTCGGTCACCACATCCAGCACCGCCGCACACGGAACACCGGTGGTGGCCAGCCAGCTCAGACGCGCCGCTTCATCCTGCAGCTCGTTCAGCGCACCGCTCAGATCGGTTTTCACAAACAGCACCGGACGACCCTGCGCGCTCAGACGAAACACCGCCGCATCAGAGCAGCCAATGGTCTGCTGCGCCCAATCATAGCCAAACAGACGTTCCACCCACGCTGCCGGGCTACCCGCATGCAGGCCATCCTGTTCAATCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAAGCATCCGCCTTTCGTTTTATTTGACCATGTTGGTATG
34 T7終止子 AACCCCTCTCTAAACGGAGGGGTTTTTTT
35 AmpR啟動子 CGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGT
36 26S啟動子 CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGA
37 T7啟動子 TAATACGACTCACTATAG
38 Poly A位點 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
39 來自nsP1的 α 5'複製序列 TAGGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGA
40 DLP ATAGTCAGCATAGTACATTTCATCTGACTAATACTACAACACCACCACCATGAATAGAGGATTCTTTAACATGCTCGGCCGCCGCCCCTTCCCGGCCCCCACTGCCATGTGGAGGCCGCGGAGAAGGAGGCAGGCGGCCCCG
41 P2A GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT
42 Bon CGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGG
43 DLP nsp ORF ATGAATAGAGGATTCTTTAACATGCTCGGCCGCCGCCCCTTCCCGGCCCCCACTGCCATGTGGAGGCCGCGGAGAAGGAGGCAGGCGGCCCCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTGAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTCGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCCGGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCTGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATCCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGTGCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGA
44 nsP2 GGCTCAGTGGAGACACCTCGTGGCTTGATAAAGGTTACCAGCTACGATGGCGAGGACAAGATCGGCTCTTACGCTGTGCTTTCTCCGCAGGCTGTACTCAAGAGTGAAAAATTATCTTGCATCCACCCTCTCGCTGAACAAGTCATAGTGATAACACACTCTGGCCGAAAAGGGCGTTATGCCGTGGAACCATACCATGGTAAAGTAGTGGTGCCAGAGGGACATGCAATACCCGTCCAGGACTTTCAAGCTCTGAGTGAAAGTGCCACCATTGTGTACAACGAACGTGAGTTCGTAAACAGGTACCTGCACCATATTGCCACACATGGAGGAGCGCTGAACACTGATGAAGAATATTACAAAACTGTCAAGCCCAGCGAGCACGACGGCGAATACCTGTACGACATCGACAGGAAACAGTGCGTCAAGAAAGAACTAGTCACTGGGCTAGGGCTCACAGGCGAGCTGGTGGATCCTCCCTTCCATGAATTCGCCTACGAGAGTCTGAGAACACGACCAGCCGCTCCTTACCAAGTACCAACCATAGGGGTGTATGGCGTGCCAGGATCAGGCAAGTCTGGCATCATTAAAAGCGCAGTCACCAAAAAAGATCTAGTGGTGAGCGCCAAGAAAGAAAACTGTGCAGAAATTATAAGGGACGTCAAGAAAATGAAAGGGCTGGACGTCAATGCCAGAACTGTGGACTCAGTGCTCTTGAATGGATGCAAACACCCCGTAGAGACCCTGTATATTGACGAAGCTTTTGCTTGTCATGCAGGTACTCTCAGAGCGCTCATAGCCATTATAAGACCTAAAAAGGCAGTGCTCTGCGGGGATCCCAAACAGTGCGGTTTTTTTAACATGATGTGCCTGAAAGTGCATTTTAACCACGAGATTTGCACACAAGTCTTCCACAAAAGCATCTCTCGCCGTTGCACTAAATCTGTGACTTCGGTCGTCTCAACCTTGTTTTACGACAAAAAAATGAGAACGACGAATCCGAAAGAGACTAAGATTGTGATTGACACTACCGGCAGTACCAAACCTAAGCAGGACGATCTCATTCTCACTTGTTTCAGAGGGTGGGTGAAGCAGTTGCAAATAGATTACAAAGGCAACGAAATAATGACGGCAGCTGCCTCTCAAGGGCTGACCCGTAAAGGTGTGTATGCCGTTCGGTACAAGGTGAATGAAAATCCTCTGTACGCACCCACCTCTGAACATGTGAACGTCCTACTGACCCGCACGGAGGACCGCATCGTGTGGAAAACACTAGCCGGCGACCCATGGATAAAAACACTGACTGCCAAGTACCCTGGGAATTTCACTGCCACGATAGAGGAGTGGCAAGCAGAGCATGATGCCATCATGAGGCACATCTTGGAGAGACCGGACCCTACCGACGTCTTCCAGAATAAGGCAAACGTGTGTTGGGCCAAGGCTTTAGTGCCGGTGCTGAAGACCGCTGGCATAGACATGACCACTGAACAATGGAACACTGTGGATTATTTTGAAACGGACAAAGCTCACTCAGCAGAGATAGTATTGAACCAACTATGCGTGAGGTTCTTTGGACTCGATCTGGACTCCGGTCTATTTTCTGCACCCACTGTTCCGTTATCCATTAGGAATAATCACTGGGATAACTCCCCGTCGCCTAACATGTACGGGCTGAATAAAGAAGTGGTCCGTCAGCTCTCTCGCAGGTACCCACAACTGCCTCGGGCAGTTGCCACTGGAAGAGTCTATGACATGAACACTGGTACACTGCGCAATTATGATCCGCGCATAAACCTAGTACCTGTAAACAGAAGACTGCCTCATGCTTTAGTCCTCCACCATAATGAACACCCACAGAGTGACTTTTCTTCATTCGTCAGCAAATTGAAGGGCAGAACTGTCCTGGTGGTCGGGGAAAAGTTGTCCGTCCCAGGCAAAATGGTTGACTGGTTGTCAGACCGGCCTGAGGCTACCTTCAGAGCTCGGCTGGATTTAGGCATCCCAGGTGATGTGCCCAAATATGACATAATATTTGTTAATGTGAGGACCCCATATAAATACCATCACTATCAGCAGTGTGAAGACCATGCCATTAAGCTTAGCATGTTGACCAAGAAAGCTTGTCTGCATCTGAATCCCGGCGGAACCTGTGTCAGCATAGGTTATGGTTACGCTGACAGGGCCAGCGAAAGCATCATTGGTGCTATAGCGCGGCAGTTCAAGTTTTCCCGGGTATGCAAACCGAAATCCTCACTTGAAGAGACGGAAGTTCTGTTTGTATTCATTGGGTACGATCGCAAGGCCCGTACGCACAATCCTTACAAGCTTTCATCAACCTTGACCAACATTTATACAGGTTCCAGACTCCACGAAGCCGGATGT
45 nsP4 TACATCTTTTCCTCCGACACCGGTCAAGGGCATTTACAACAAAAATCAGTAAGGCAAACGGTGCTATCCGAAGTGGTGTTGGAGAGGACCGAATTGGAGATTTCGTATGCCCCGCGCCTCGACCAAGAAAAAGAAGAATTACTACGCAAGAAATTACAGTTAAATCCCACACCTGCTAACAGAAGCAGATACCAGTCCAGGAAGGTGGAGAACATGAAAGCCATAACAGCTAGACGTATTCTGCAAGGCCTAGGGCATTATTTGAAGGCAGAAGGAAAAGTGGAGTGCTACCGAACCCTGCATCCTGTTCCTTTGTATTCATCTAGTGTGAACCGTGCCTTTTCAAGCCCCAAGGTCGCAGTGGAAGCCTGTAACGCCATGTTGAAAGAGAACTTTCCGACTGTGGCTTCTTACTGTATTATTCCAGAGTACGATGCCTATTTGGACATGGTTGACGGAGCTTCATGCTGCTTAGACACTGCCAGTTTTTGCCCTGCAAAGCTGCGCAGCTTTCCAAAGAAACACTCCTATTTGGAACCCACAATACGATCGGCAGTGCCTTCAGCGATCCAGAACACGCTCCAGAACGTCCTGGCAGCTGCCACAAAAAGAAATTGCAATGTCACGCAAATGAGAGAATTGCCCGTATTGGATTCGGCGGCCTTTAATGTGGAATGCTTCAAGAAATATGCGTGTAATAATGAATATTGGGAAACGTTTAAAGAAAACCCCATCAGGCTTACTGAAGAAAACGTGGTAAATTACATTACCAAATTAAAAGGACCAAAAGCTGCTGCTCTTTTTGCGAAGACACATAATTTGAATATGTTGCAGGACATACCAATGGACAGGTTTGTAATGGACTTAAAGAGAGACGTGAAAGTGACTCCAGGAACAAAACATACTGAAGAACGGCCCAAGGTACAGGTGATCCAGGCTGCCGATCCGCTAGCAACAGCGTATCTGTGCGGAATCCACCGAGAGCTGGTTAGGAGATTAAATGCGGTCCTGCTTCCGAACATTCATACACTGTTTGATATGTCGGCTGAAGACTTTGACGCTATTATAGCCGAGCACTTCCAGCCTGGGGATTGTGTTCTGGAAACTGACATCGCGTCGTTTGATAAAAGTGAGGACGACGCCATGGCTCTGACCGCGTTAATGATTCTGGAAGACTTAGGTGTGGACGCAGAGCTGTTGACGCTGATTGAGGCGGCTTTCGGCGAAATTTCATCAATACATTTGCCCACTAAAACTAAATTTAAATTCGGAGCCATGATGAAATCTGGAATGTTCCTCACACTGTTTGTGAACACAGTCATTAACATTGTAATCGCAAGCAGAGTGTTGAGAGAACGGCTAACCGGATCACCATGTGCAGCATTCATTGGAGATGACAATATCGTGAAAGGAGTCAAATCGGACAAATTAATGGCAGACAGGTGCGCCACCTGGTTGAATATGGAAGTCAAGATTATAGATGCTGTGGTGGGCGAGAAAGCGCCTTATTTCTGTGGAGGGTTTATTTTGTGTGACTCCGTGACCGGCACAGCGTGCCGTGTGGCAGACCCCCTAAAAAGGCTGTTTAAGCTTGGCAAACCTCTGGCAGCAGACGATGAACATGATGATGACAGGAGAAGGGCATTGCATGAAGAGTCAACACGCTGGAACCGAGTGGGTATTCTTTCAGAGCTGTGCAAGGCAGTAGAATCAAGGTATGAAACCGTAGGAACTTCCATCATAGTTATGGCCATGACTACTCTAGCTAGCAGTGTTAAATCATTCAGCTACCTGAGAGGGGCCCCTATAACTCTCTACGGC
46 nsP3 GCACCCTCATATCATGTGGTGCGAGGGGATATTGCCACGGCCACCGAAGGAGTGATTATAAATGCTGCTAACAGCAAAGGACAACCTGGCGGAGGGGTGTGCGGAGCGCTGTATAAGAAATTCCCGGAAAGCTTCGATTTACAGCCGATCGAAGTAGGAAAAGCGCGACTGGTCAAAGGTGCAGCTAAACATATCATTCATGCCGTAGGACCAAACTTCAACAAAGTTTCGGAGGTTGAAGGTGACAAACAGTTGGCAGAGGCTTATGAGTCCATCGCTAAGATTGTCAACGATAACAATTACAAGTCAGTAGCGATTCCACTGTTGTCCACCGGCATCTTTTCCGGGAACAAAGATCGACTAACCCAATCATTGAACCATTTGCTGACAGCTTTAGACACCACTGATGCAGATGTAGCCATATACTGCAGGGACAAGAAATGGGAAATGACTCTCAAGGAAGCAGTGGCTAGGAGAGAAGCAGTGGAGGAGATATGCATATCCGACGACTCTTCAGTGACAGAACCTGATGCAGAGCTGGTGAGGGTGCATCCGAAGAGTTCTTTGGCTGGAAGGAAGGGCTACAGCACAAGCGATGGCAAAACTTTCTCATATTTGGAAGGGACCAAGTTTCACCAGGCGGCCAAGGATATAGCAGAAATTAATGCCATGTGGCCCGTTGCAACGGAGGCCAATGAGCAGGTATGCATGTATATCCTCGGAGAAAGCATGAGCAGTATTAGGTCGAAATGCCCCGTCGAAGAGTCGGAAGCCTCCACACCACCTAGCACGCTGCCTTGCTTGTGCATCCATGCCATGACTCCAGAAAGAGTACAGCGCCTAAAAGCCTCACGTCCAGAACAAATTACTGTGTGCTCATCCTTTCCATTGCCGAAGTATAGAATCACTGGTGTGCAGAAGATCCAATGCTCCCAGCCTATATTGTTCTCACCGAAAGTGCCTGCGTATATTCATCCAAGGAAGTATCTCGTGGAAACACCACCGGTAGACGAGACTCCGGAGCCATCGGCAGAGAACCAATCCACAGAGGGGACACCTGAACAACCACCACTTATAACCGAGGATGAGACCAGGACTAGAACGCCTGAGCCGATCATCATCGAAGAGGAAGAAGAGGATAGCATAAGTTTGCTGTCAGATGGCCCGACCCACCAGGTGCTGCAAGTCGAGGCAGACATTCACGGGCCGCCCTCTGTATCTAGCTCATCCTGGTCCATTCCTCATGCATCCGACTTTGATGTGGACAGTTTATCCATACTTGACACCCTGGAGGGAGCTAGCGTGACCAGCGGGGCAACGTCAGCCGAGACTAACTCTTACTTCGCAAAGAGTATGGAGTTTCTGGCGCGACCGGTGCCTGCGCCTCGAACAGTATTCAGGAACCCTCCACATCCCGCTCCGCGCACAAGAACACCGTCACTTGCACCCAGCAGGGCCTGCTCGAGAACCAGCCTAGTTTCCACCCCGCCAGGCGTGAATAGGGTGATCACTAGAGAGGAGCTCGAGGCGCTTACCCCGTCACGCACTCCTAGCAGGTCGGTCTCGAGAACCAGCCTGGTCTCCAACCCGCCAGGCGTAAATAGGGTGATTACAAGAGAGGAGTTTGAGGCGTTCGTAGCACAACAACAATGACGGTTTGATGCGGGTGCA
47 nsP1 GAGAAAGTTCACGTTGACATCGAGGAAGACAGCCCATTCCTCAGAGCTTTGCAGCGGAGCTTCCCGCAGTTTGAGGTAGAAGCCAAGCAGGTCACTGATAATGACCATGCTAATGCCAGAGCGTTTTCGCATCTGGCTTCAAAACTGATCGAAACGGAGGTGGACCCATCCGACACGATCCTTGACATTGGAAGTGCGCCCGCCCGCAGAATGTATTCTAAGCACAAGTATCATTGTATCTGTCCGATGAGATGTGCGGAAGATCCGGACAGATTGTATAAGTATGCAACTAAGCTGAAGAAAAACTGTAAGGAAATAACTGATAAGGAATTGGACAAGAAAATGAAGGAGCTCGCCGCCGTCATGAGCGACCCTGACCTGGAAACTGAGACTATGTGCCTCCACGACGACGAGTCGTGTCGCTACGAAGGGCAAGTCGCTGTTTACCAGGATGTATACGCGGTTGACGGACCGACAAGTCTCTATCACCAAGCCAATAAGGGAGTTAGAGTCGCCTACTGGATAGGCTTTGACACCACCCCTTTTATGTTTAAGAACTTGGCTGGAGCATATCCATCATACTCTACCAACTGGGCCGACGAAACCGTGTTAACGGCTCGTAACATAGGCCTATGCAGCTCTGACGTTATGGAGCGGTCACGTAGAGGGATGTCCATTCTTAGAAAGAAGTATTTGAAACCATCCAACAATGTTCTATTCTCTGTTGGCTCGACCATCTACCACGAGAAGAGGGACTTACTGAGGAGCTGGCACCTGCCGTCTGTATTTCACTTACGTGGCAAGCAAAATTACACATGTCGGTGTGAGACTATAGTTAGTTGCGACGGGTACGTCGTTAAAAGAATAGCTATCAGTCCAGGCCTGTATGGGAAGCCTTCAGGCTATGCTGCTACGATGCACCGCGAGGGATTCTTGTGCTGCAAAGTGACAGACACATTGAACGGGGAGAGGGTCTCTTTTCCCGTGTGCACGTATGTGCCAGCTACATTGTGTGACCAAATGACTGGCATACTGGCAACAGATGTCAGTGCGGACGACGCGCAAAAACTGCTGGTTGGGCTCAACCAGCGTATAGTCGTCAACGGTCGCACCCAGAGAAACACCAATACCATGAAAAATTACCTTTTGCCCGTAGTGGCCCAGGCATTTGCTAGGTGGGCAAAGGAATATAAGGAAGATCAAGAAGATGAAAGGCCACTAGGACTACGAGATAGACAGTTAGTCATGGGGTGTTGTTGGGCTTTTAGAAGGCACAAGATAACATCTATTTATAAGCGCCCGGATACCCAAACCATCATCAAAGTGAACAGCGATTTCCACTCATTCGTGCTGCCCAGGATAGGCAGTAACACATTGGAGATCGGGCTGAGAACAAGAATCAGGAAAATGTTAGAGGAGCACAAGGAGCCGTCACCTCTCATTACCGCCGAGGACGTACAAGAAGCTAAGTGCGCAGCCGATGAGGCTAAGGAGGTGCGTGAAGCCGAGGAGTTGCGCGCAGCTCTACCACCTTTGGCAGCTGATGTTGAGGAGCCCACTCTGGAAGCCGATGTCGACTTGATGTTACAAGAGGCTGGGGCC
48 KanR ATGATTGAACAGGATGGCCTGCATGCGGGTAGCCCGGCAGCGTGGGTGGAACGTCTGTTTGGCTATGATTGGGCGCAGCAGACCATTGGCTGCTCTGATGCGGCGGTGTTTCGTCTGAGCGCGCAGGGTCGTCCGGTGCTGTTTGTGAAAACCGATCTGAGCGGTGCGCTGAACGAGCTGCAGGATGAAGCGGCGCGTCTGAGCTGGCTGGCCACCACCGGTGTTCCGTGTGCGGCGGTGCTGGATGTGGTGACCGAAGCGGGCCGTGATTGGCTGCTGCTGGGCGAAGTGCCGGGTCAGGATCTGCTGTCTAGCCATCTGGCGCCGGCAGAAAAAGTGAGCATTATGGCGGATGCCATGCGTCGTCTGCATACCCTGGACCCGGCGACCTGTCCGTTTGATCATCAGGCGAAACATCGTATTGAACGTGCGCGTACCCGTATGGAAGCGGGCCTGGTGGATCAGGATGATCTGGATGAAGAACATCAGGGCCTGGCACCGGCAGAGCTGTTTGCGCGTCTGAAAGCGAGCATGCCGGATGGCGAAGATCTGGTGGTGACCCATGGTGATGCGTGCCTGCCGAACATTATGGTGGAAAATGGCCGTTTTAGCGGCTTTATTGATTGCGGCCGTCTGGGCGTGGCGGATCGTTATCAGGATATTGCGCTGGCCACCCGTGATATTGCGGAAGAACTGGGCGGCGAATGGGCGGATCGTTTTCTGGTGCTGTATGGCATTGCGGCACCGGATAGCCAGCGTATTGCGTTTTATCGTCTGCTGGATGAATTTTTCTAATAA
49 Rop GTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGA
50 5’UTR ATAGGCGGCGCATGAGAGAAGCCCAGACCAATTACCTACCCAAA
51 3’UTR ATACAGCAGCAATTGGCAAGCTGCTTACATAGAACTCGCGGCGATTGGCATGCCGCTTTAAAATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTTTCCGAATCGGATTTTGTTTTTAATATTTC
52 具有TetO位點 的CVM啟動子 Ccattgcatacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgccatgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctccctatcagtgatagagatctccctatcagtgatagagatcgtcgacgagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagagtga
53 BGH polyA ctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcc
54 泛素前導序列 MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGVR
無
［圖1］顯示對mutJAK2 I型表位1及2的JAK2 V617F+ HLA A02:01+ MPN供體T細胞反應。 ［圖2］顯示來自CD4+及CD8+ T細胞兩者之IFN-γ/TNF-α反應的流動式細胞測量術細胞內細胞介素染色。正常供體樹突細胞係經含有空載體或編碼SEQ ID NO: 10之LS_CALR.JAK2 2X9mer的多核苷酸之腺病毒26載體感染。感染後24小時將自體CD4/CD8 T細胞添加至樹突細胞。將樹突及T細胞共培養11天，並用肽特異性mutCALR之池再刺激。 ［圖3］顯示來自CD8+ T細胞之IFN-γ/TNF-α反應的流動式細胞測量術細胞內細胞介素染色。正常供體樹突細胞係經含有空載體或編碼SEQ ID NO: 10之LS_CALR/JAK2 2X9mer的多核苷酸之腺病毒5載體感染。感染後24小時將自體CD8 T細胞添加至樹突細胞。將樹突及T細胞共培養11天，並用具muJAK2表位1 (SEQ ID NO: 5)或表位2 (SEQ ID NO: 6)特異性之9mer肽再刺激。 ［圖4］顯示來自CD8+ T細胞之IFN-γ/TNF-α反應的流動式細胞測量術細胞內細胞介素染色。正常供體樹突細胞係經含有空載體或編碼LS_CALR.JAK2-30mer (SEQ ID NO: 11)的多核苷酸之腺病毒5載體感染。感染後24小時將自體CD8 T細胞添加至樹突細胞。將樹突及T細胞共培養11天，並用具mutJAK2表位1 (SEQ ID NO: 5)或表位2 (SEQ ID NO:6)特異性之9mer肽再刺激。 ［圖5］顯示來自C57BL/6或Balb/c小鼠的脾細胞在免疫後2週之IFN-γ ELISpot反應，該小鼠係經Ad26HEME001 (LS_CALR_JAK2-30mer, SEQ ID NO: 11)（n=8/組）或Ad26.空(n=4)以1010 VP的劑量IM免疫。將脾細胞用橫跨HEME001序列之15mer肽池刺激隔夜。每106 個脾細胞之IFN-γ SFU數量係藉由ELISpot判定。每組的平均反應係以水平線指示。虛線指示檢定背景，定義為在非刺激脾細胞中觀察到之SFU的95%百分位數（43 SFU/106 個細胞）。使用Wilcoxon秩和檢定進行統計分析，將低於43 SFU/106 個細胞之值設定為此臨界值。VP，病毒顆粒；LOD，偵測極限。 ［圖6］顯示來自C57BL/6或Balb/c小鼠的脾細胞在免疫後2週之IFN-γ ELISpot反應，該小鼠係經Ad26HEME002 (LS_CALR_JAK2-2x9mer, SEQ ID NO: 10)（n=8/組）或Ad26.空(n=4)以1010 VP的劑量IM免疫。將脾細胞用橫跨HEME002序列之15mer肽池刺激隔夜。每106 個脾細胞之IFN-γ SFU數量係藉由ELISpot判定。每組的平均反應係以水平線指示。虛線指示檢定背景，定義為在非刺激脾細胞中觀察到之SFU的95%百分位數（43 SFU/106 個細胞）。使用Wilcoxon秩和檢定進行統計分析，將低於43 SFU/106 個細胞之值設定為此臨界值。VP，病毒顆粒；LOD，偵測極限。 ［圖7］顯示來自C57BL/6小鼠的脾細胞之IFN-γ ELISpot反應，該小鼠係經Ad26HEME002 (LS_CALR_JAK2-2x9mer, SEQ ID NO: 10)、MVA-HCalJ-9.9 (TCE_CALR_JAK2-2x9mer, SEQ ID NO: 26)、或Ad26.空IM免疫（n=10/組，例外為具有5隻動物之第1組[MVA-HCalJ-9.9]及具有3隻動物之第10組[Ad26.空]）。在第4週，將脾細胞用橫跨Ad26HEME002之序列的肽池刺激隔夜。每106 個脾細胞之IFN-γ SFU數量係藉由ELISpot判定。每組的幾何平均反應係以水平線指示。圖中的虛線指示檢定背景，定義為在非刺激脾細胞中觀察到之SFU的95%百分位數。為了進行比較僅Ad26HEME002初免與Ad26HEME002初免免疫及MVA-HCalJ-9.9加強的差異檢定，在經log10 轉換的ELISpot資料上執行ANOVA。將低於52 SFU/106 個細胞之值設定為臨界值。水平槓對應於各組的平均值。Gr：組。 ［圖8］顯示顯示來自C57BL/6小鼠的脾細胞之IFN-γ ELISpot反應，該小鼠係經Ad26HEME002 (LS_CALR_JAK2-2x9mer; SEQ ID NO: 10)、MVA-HCalJ-9.9 (TCE_CALR_JAK2-2x9mer; SEQ ID NO: 26)、或Ad26.空IM免疫（n=10/組，例外為具有5隻動物之第1組[MVA-HCalJ-9.9]及具有3隻動物之第4組[Ad26.空]）。在第4週，將脾細胞用橫跨CALRmut序列的肽池刺激隔夜。每106 個脾細胞之IFN-γ SFU數量係藉由ELISpot判定。每組的幾何平均反應係以水平線指示。圖中的虛線指示檢定背景，定義為在非刺激脾細胞中觀察到之SFU的95%百分位數。為了進行比較僅Ad26HEME002初免與Ad26HEME002初免免疫及MVA-HCalJ-9.9加強的差異檢定，在經log10 轉換的ELISpot資料上執行ANOVA。將低於52 SFU/106 個細胞之值設定為臨界值。水平槓對應於各組的平均值。Gr：組。 ［圖9］顯示顯示來自Balb/c小鼠的脾細胞之IFN-γ ELISpot反應，該小鼠係經Ad26HEME002 (LS_CALR_JAK2-2x9mer; SEQ ID NO: 10)、MVA-HCalJ-9.9 (TCE_CALR_JAK2-2x9mer; SEQ ID NO: 26)、或Ad26.空IM免疫（n=8/組）。在第4週，將脾細胞單離並用橫跨HEME002之序列的肽池刺激隔夜。每106 個脾細胞之IFN-γ SFU數量係藉由ELISpot判定。每組的平均反應係以水平線指示。各個別資料點係減去背景，使用未經肽刺激隔夜之脾細胞評估背景SFU/106 個脾細胞。為了進行比較僅Ad26HEME002初免與Ad26HEME002初免免疫及MVA-HCalJ-9.9加強的差異檢定，運行使用Welches校正之不成對t檢定（不相等SD）以評估統計顯著性。SFU：斑點形成單位；Ad空：Ad26.空；僅MVA：MVA-HCalJ-9.9 (TCE_CALR_JAK2-2x9mer; SEQ ID NO: 26)；Ad：Ad26HEME002 (LS_CALR_JAK2-2x9mer; SEQ ID NO: 10)。 ［圖10］顯示藉由ELISpot隨時間測量之在非人類靈長動物中誘發生產IFN-γ之人類HEME002特異性T細胞的動力學，該非人類靈長動物係經Ad26HEME002 (LS_CALR_JAK2-2x9mer; SEQ ID NO: 10) (Ad)及/或MVA-HCalJ-9.9 (TCE_CALR_JAK2-2x9mer; SEQ ID NO: 26) (MVA)單獨或與YERVOY® （伊匹單抗(ipilimumab)）(Ipi)組合免疫。每106 個PBMC之人類HEME002特異性T細胞反應係隨時間測量。檢定陽性係定義為減去背景反應之SFU/106 個細胞＞50 SFU/106 個細胞，且減去背景反應之SFU/106 個細胞＞2×中位反應。將未通過檢定陽性標準之值調整成50 SFU/106 個細胞。所示者係經log10 轉換之資料。將下虛線設定為50 SFU/106 個細胞且對應LOD，而將上虛線設定為2,000 SFU/106 個細胞且對應ULOQ。箭頭點係指每組免疫的時間。箭頭槓係標準偏差。LOD：偵測下限；ULOQ：定量上限。Gr：組。自圖上方算來的組：最上方的線：Gr4；自上方算來第二條線：Gr3；自上方算來第三條線：Gr2；自上方算來第四條線：Gr1。 ［圖11］顯示在研究第-2週在每組非人類靈長動物中生產IFN-γ之HEME002特異性T細胞的誘發，該非人類靈長動物係經Ad26HEME002 (LS_CALR_JAK2-2x9mer, SEQ ID NO: 10) (Ad)及/或MVA-HCalJ-9.9 (TCE_CALR_JAK2-2x9mer; SEQ ID NO: 26) (MVA)單獨或與YERVOY® （伊匹單抗）(Ipi)組合免疫。IFN-γ的生產係藉由ELISpot評估。所示值為減去背景且將低於50 SFU/106 個細胞之值設定為該值（以空心黑色符號指示）。具有高背景反應＞150 SFU/106 個細胞之動物係以灰色符號指示。槓指示組平均值。統計分析係使用Tobit模型搭配概似比檢定且應用Bonferroni調整在完整資料集上執行，顯著反應具有p＜0.05。將下虛線設定為50 SFU/106 個細胞且對應LOD，而將上虛線設定為2,000 SFU/106 個細胞且對應ULOQ。所示者係經log10 轉換之資料。 ［圖12］顯示在研究第2週在每組非人類靈長動物中生產IFN-γ之HEME002特異性T細胞的誘發，該非人類靈長動物係經Ad26HEME002 (LS_CALR_JAK2-2x9mer, SEQ ID NO: 10) (Ad)及/或MVA-HCalJ-9.9 (TCE_CALR_JAK2-2x9mer; SEQ ID NO: 26) (MVA)單獨或與YERVOY® （伊匹單抗）(Ipi)組合免疫。IFN-γ的生產係藉由ELISpot評估。所示值為減去背景且將低於50 SFU/106 個細胞之值設定為該值（以空心黑色符號指示）。具有高背景反應＞150 SFU/106 個細胞之動物係以灰色符號指示。槓指示組平均值。統計分析係使用Tobit模型搭配概似比檢定且應用Bonferroni調整在完整資料集上執行，顯著反應具有p＜0.05。將下虛線設定為50 SFU/106 個細胞且對應LOD，而將上虛線設定為2,000 SFU/106 個細胞且對應ULOQ。所示者係經log10 轉換之資料。 ［圖13］顯示在研究第6週在每組非人類靈長動物中生產IFN-γ之HEME002特異性T細胞的誘發，該非人類靈長動物係經Ad26HEME002 (LS_CALR_JAK2-2x9mer, SEQ ID NO: 10) (Ad)及/或MVA-HCalJ-9.9 (TCE_CALR_JAK2-2x9mer; SEQ ID NO: 26) (MVA)單獨或與YERVOY® （伊匹單抗）(Ipi)組合免疫。IFN-γ的生產係藉由ELISpot評估。所示值為減去背景且將低於50 SFU/106 個細胞之值設定為該值（以空心黑色符號指示）。具有高背景反應＞150 SFU/106 個細胞之動物係以灰色符號指示。槓指示組平均值。統計分析係使用Tobit模型搭配概似比檢定且應用Bonferroni調整在完整資料集上執行，顯著反應具有p＜0.05。將下虛線設定為50 SFU/106 個細胞且對應LOD，而將上虛線設定為2,000 SFU/106 個細胞且對應ULOQ。所示者係經log10 轉換之資料。 ［圖14］顯示在研究第10週在每組非人類靈長動物中生產IFN-γ之HEME002特異性T細胞的誘發，該非人類靈長動物係經Ad26HEME002 (LS_CALR_JAK2-2x9mer, SEQ ID NO: 10) (Ad)及/或MVA-HCalJ-9.9 (TCE_CALR_JAK2-2x9mer; SEQ ID NO: 26) (MVA)單獨或與YERVOY® （伊匹單抗）(Ipi)組合免疫。IFN-γ的生產係藉由ELISpot評估。所示值為減去背景且將低於50 SFU/106 個細胞之值設定為該值（以空心黑色符號指示）。具有高背景反應＞150 SFU/106 個細胞之動物係以灰色符號指示。槓指示組平均值。統計分析係使用Tobit模型搭配概似比檢定且應用Bonferroni調整在完整資料集上執行，顯著反應具有p＜0.05。將下虛線設定為50 SFU/106 個細胞且對應LOD，而將上虛線設定為2,000 SFU/106 個細胞且對應ULOQ。所示者係經log10 轉換之資料。 ［圖15］顯示在研究第16週在每組非人類靈長動物中生產IFN-γ之HEME002特異性T細胞的誘發，該非人類靈長動物係經Ad26HEME002 (LS_CALR_JAK2-2x9mer, SEQ ID NO: 10) (Ad)及/或MVA-HCalJ-9.9 (TCE_CALR_JAK2-2x9mer; SEQ ID NO: 26) (MVA)單獨或與YERVOY® （伊匹單抗）(Ipi)組合免疫。IFN-γ的生產係藉由ELISpot評估。所示值為減去背景且將低於50 SFU/106 個細胞之值設定為該值（以空心黑色符號指示）。具有高背景反應＞150 SFU/106 個細胞之動物係以灰色符號指示。槓指示組平均值。統計分析係使用Tobit模型搭配概似比檢定且應用Bonferroni調整在完整資料集上執行，顯著反應具有p＜0.05。將下虛線設定為50 SFU/106 個細胞且對應LOD，而將上虛線設定為2,000 SFU/106 個細胞且對應ULOQ。所示者係經log10 轉換之資料。 ［圖16］顯示在NHP中經SC投予之抗CTLA4抗體伊匹單抗所初免之抗原特異性T細胞反應等於經IV投予。伊匹單抗係在載體免疫時以3 mg/kg IV或SC給藥。將來自250K食蟹獼猴PBMC之生產IFNγ之細胞用mutCALR特異性肽刺激隔夜並藉由Elipot分析。mutCALR肽反應係基於mutCALR特異性反應-背景計算。槓指示組平均值。統計分析係使用Tobit模型搭配概似比檢定且應用Bonferroni調整在完整資料集上執行，顯著反應具有p＜0.05。 ［圖17］顯示在第4週開始將抗PD-1抗體（尼沃魯單抗10 mg/kg IV）包括至Ad/Ad/MVA + 1劑（第6組）或2劑（第5組）伊匹單抗(SC)相較於以Ad/Ad/MVA +伊匹單抗(SC)單獨給藥的動物改善mutCALR特異性T細胞反應的量值。Ad26：Ad26HEME002 (LS_CALR_JAK2-2x9mer, SEQ ID NO: 10)；Ipi：伊匹單抗；aPD1：尼沃魯單抗。 ［圖18A］顯示Semliki森林病毒之α病毒基因體的示意圖，其為在5'端編碼非結構多聚蛋白（nsP1至nsP4；複製酶）及在3'端編碼結構基因（殼體及醣蛋白）的正義、單股RNA。 ［圖18B］顯示衍生自α病毒複製子之例示性自我複製RNA分子（複製子）的示意圖，其中病毒結構基因係經置換成在次基因體啟動子(SGP)轉錄控制下的關注基因。在5’及3’端的保守序列元件(CSE)作用為負股及正股RNA轉錄之啟動子。在將複製子遞送至細胞中之後，非結構多聚蛋白前驅物(nsP1234)係自體外(in vitro )轉錄複製子轉譯。nsP1234在早期階段經自體蛋白分解處理成片段nsP123及nsP4，其轉錄複製子之負股副本。之後，nsP123係經完全處理成單一蛋白質，其組裝成(+)股複製酶以轉錄新的正股基因體副本以及編碼關注基因之(+)股次基因體轉錄物。將次基因體RNA以及新基因體RNA加蓋及多腺苷酸化。非活性啟動子係虛線箭頭；活性啟動子係實線箭頭。 ［圖19］係衍生自α病毒之例示性自我擴增RNA之示意圖，其含有5’-罩蓋、非結構基因（NSP1至4）、26S次基因體啟動子（灰色箭頭）、關注基因(GOI)、及3’-多腺苷酸化尾。該圖亦顯示2A核糖體跳躍元件(P2A)及5’-UTR下游及DLP上游經複製之nsP1的前193個核苷酸（起始密碼子除外）。 ［圖20］係包封自我擴增RNA之例示性脂質奈米粒子(LNP)的示意圖，其中脂質組分之莫耳比例百分比如指示(Geall et al., PNAS, 2012, 109:14604-14609)。 ［圖21A］顯示自我複製RNA LS.CALR-JAK2-2x9mer初免抗CALR CD4 T細胞反應。資料顯示藉由ELISpot所測量之用重疊CALR肽庫（未上色長條）或DMSO（灰色長條）再刺激脾細胞的IFN生產。 ［圖21B］顯示自我複製RNA LS.CALR-JAK2-2x9mer初免抗CALR CD4 T細胞反應。資料顯示藉由流動式細胞測量術所測量之用重疊CALR肽再刺激脾細胞的IFN、TNF⍺及IL-2生產。符號代表個別小鼠(n=5)，長條代表平均值及SD。**p＜0.01，Mann-Whitney檢定。 ［圖22A］顯示經脂質奈米粒子調配之自我複製RNA LS.CALR-JAK2-2x9mer初免抗CALR CD4 T細胞反應。將Balb/c小鼠用所示劑量的經LNP調配之自我複製RNA LS.CALR-JAK2-2x9mer以及未經調配版本20 µg免疫，並在14天之後分析脾臟。圖顯示藉由ELISpot所測量之用重疊CALR肽庫（減去DMSLO背景）再刺激脾細胞的IFN生產。 ［圖22B］顯示經脂質奈米粒子調配之自我複製RNA LS.CALR-JAK2-2x9mer初免抗CALR CD4 T細胞反應。資料顯示藉由流動式細胞測量術所測量之用重疊CALR肽再刺激脾細胞的IFN、TNF⍺及IL-2生產。符號代表個別小鼠(n=5)，長條代表平均值及SD。*p＜0.05，**p＜0.01，Mann-Whitney檢定。 ［圖23A］顯示疫苗方案加強抗CALR CD4 T細胞反應。將Balb/c小鼠初免，接著用如圖所示之各種組合的Ad26、自我複製RNA分子（複製子）或MVA加強，接著分析脾臟。圖顯示藉由ELISpot所測量之用重疊CALR肽庫（減去DMSO背景）再刺激脾細胞的IFN生產。 ［圖23B］顯示疫苗方案加強抗CALR CD4 T細胞反應。資料顯示藉由流動式細胞測量術所測量之用重疊CALR肽再刺激脾細胞的IFN、TNF⍺及IL-2生產。符號代表個別小鼠，長條代表平均值及SD。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001 Mann-Whitney檢定。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043

Claims (45)

  1. 一種多肽，其包含選自由下列所組成之群組的至少二或更多個表位序列： MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE (SEQ ID NO: 1)或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性者； EEAEDNCRRMMRTK (SEQ ID NO: 2)或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性者； KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG (SEQ ID NO: 4)或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性者； VLNYGVCFC (SEQ ID NO: 5)或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性者； FCGDENILV (SEQ ID NO: 6)或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性者；及其組合。
  2. 如請求項1所述之多肽，其中該多肽包含下列表位序列： MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE (SEQ ID NO: 1)或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性者； EEAEDNCRRMMRTK (SEQ ID NO: 2)或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性者； VLNYGVCFC (SEQ ID NO: 5)或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性者；及 FCGDENILV (SEQ ID NO: 6)或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性者。
  3. 如請求項1所述之多肽，其中該多肽包含下列表位序列： MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE (SEQ ID NO: 1)或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性者； EEAEDNCRRMMRTK (SEQ ID NO: 2)或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性者；及 KLSHKHLVLNYGVCFCGDENILVQEFVKFG (SEQ ID NO: 4)或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性者。
  4. 如請求項1所述之多肽，其中該多肽包含下列表位序列： MKDKQDEEQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTE (SEQ ID NO: 1)或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性者；及 EEAEDNCRRMMRTK (SEQ ID NO: 2)或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性者。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之多肽，其在N端進一步包含選自下列之前導序列： MACPGFLWALVISTCLEFSMA (SEQ ID NO: 8)； MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGV (SEQ ID NO: 54)；及 MGQKEQIHTLQKNSERMSKQLTRSSQAV (SEQ ID NO: 29)。
  6. 如請求項1至4中任一項所述之多肽，其中該等表位序列係藉由連接子序列彼此連接。
  7. 如請求項6所述之多肽，其中該連接子序列係選自AAY、RR、DPP、HHAA、HHA、HHL、RKSYL、RKSY、SSL、或REKR。
  8. 如請求項6所述之多肽，其中該連接子序列包含蛋白酶切割位點。
  9. 如請求項1所述之多肽，其中該多肽係選自： SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO: 3具有至少90%序列同一性之胺基酸序列； SEQ ID NO: 7或與SEQ ID NO: 7具有至少90%序列同一性之胺基酸序列； SEQ ID NO: 9或與SEQ ID NO: 9具有至少90%序列同一性之胺基酸序列； SEQ ID NO: 10或與SEQ ID NO: 10具有至少90%序列同一性之胺基酸序列； SEQ ID NO: 11或與SEQ ID NO: 11具有至少90%序列同一性之胺基酸序列； SEQ ID NO: 12或與SEQ ID NO: 12具有至少90%序列同一性之胺基酸序列； SEQ ID NO: 13或與SEQ ID NO: 13具有至少90%序列同一性之胺基酸序列； SEQ ID NO: 14或與SEQ ID NO: 14具有至少90%序列同一性之胺基酸序列； SEQ ID NO: 15或與SEQ ID NO: 15具有至少90%序列同一性之胺基酸序列；及 SEQ ID NO: 31或與SEQ ID NO: 31具有至少90%序列同一性之胺基酸序列。
  10. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至9中任一項所述之多肽。
  11. 如請求項10所述之多核苷酸，其中該多核苷酸係選自由下列所組成之群組： SEQ ID NO: 16或與SEQ ID NO: 16具有至少90%序列同一性之核酸序列； SEQ ID NO: 17或與SEQ ID NO: 17具有至少90%序列同一性之核酸序列； SEQ ID NO: 18或與SEQ ID NO: 18具有至少90%序列同一性之核酸序列； SEQ ID NO: 19或與SEQ ID NO: 19具有至少90%序列同一性之核酸序列； SEQ ID NO: 20或與SEQ ID NO: 20具有至少90%序列同一性之核酸序列； SEQ ID NO: 21或與SEQ ID NO: 21具有至少90%序列同一性之核酸序列； SEQ ID NO: 22或與SEQ ID NO: 22具有至少90%序列同一性之核酸序列； SEQ ID NO: 26或與SEQ ID NO: 26具有至少90%序列同一性之核酸序列；及 SEQ ID NO: 27或與SEQ ID NO: 27具有至少90%序列同一性之核酸序列。
  12. 一種載體，其包含如請求項10或請求項11所述之多核苷酸。
  13. 如請求項12所述之載體，其中該載體係選自腺病毒載體、α病毒載體、痘病毒載體、腺病毒相關病毒載體、反轉錄病毒載體、自我複製RNA分子、及其組合。
  14. 如請求項13所述之載體，其中該腺病毒載體係選自hAd5、hAd7、hAd11、hAd26、hAd34、hAd35、hAd48、hAd49、hAd50、GAd20、Gad19、GAd21、GAd25、GAd26、GAd27、GAd28、GAd29、GAd30、GAd31、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAdI7、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2、及PanAd3。
  15. 如請求項13所述之載體，其中該痘病毒載體係選自天花病毒載體、痘苗病毒載體、牛痘病毒載體、猴痘病毒載體、哥本哈根痘苗病毒(W)載體、紐約減毒痘苗病毒(NYVAC)載體、及經修飾安卡拉痘苗病毒(MVA)載體。
  16. 如請求項12所述之載體，其中該載體係該腺病毒載體，其包含編碼如請求項1至9中任一項所述之多肽中任一者之多核苷酸。
  17. 如請求項12所述之載體，其中該載體係該自我複製RNA分子，其包含編碼如請求項1至9中任一項所述之多肽中任一者之多核苷酸。
  18. 如請求項12所述之載體，其中該載體係Ad26，其包含編碼SEQ ID NO: 10或與SEQ ID NO: 10具有至少90%序列同一性之多肽之多核苷酸。
  19. 如請求項12所述之載體，其中該載體係MVA載體，其包含編碼SEQ ID NO: 31或與SEQ ID NO: 31具有至少90%序列同一性之多肽之多核苷酸。
  20. 如請求項12所述之載體，其中該載體係GAd20，其包含編碼SEQ ID NO: 31或與SEQ ID NO: 31具有至少90%序列同一性之多肽之多核苷酸。
  21. 如請求項12所述之載體，其中該載體係自我複製RNA分子，其包含編碼SEQ ID NO: 12或與SEQ ID NO: 12具有至少90%序列同一性之多肽之多核苷酸。
  22. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至9中任一項所述之多肽。
  23. 一種醫藥組成物，其包含如請求項10及11中任一項所述之多核苷酸。
  24. 一種醫藥組成物，其包含如請求項12至21中任一項所述之載體。
  25. 如請求項24所述之醫藥組成物，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、自我複製RNA分子、及其組合。
  26. 一種如請求項22至25中任一項所述之醫藥組成物用於製備藥物之用途，該藥物用於治療、預防、減少對象的臨床病況之開始風險或延緩開始，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體。
  27. 一種如請求項22至25中任一項所述之醫藥組成物用於製備誘發對象的免疫反應的藥物之用途，該對象攜帶JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變。
  28. 一種如請求項22至25中任一項所述之醫藥組成物用於製備治療或預防對象的骨髓增生性疾病的藥物之用途。
  29. 一種如請求項22至25中任一項所述之醫藥組成物用於治療對象的癌症的藥物之用途。
  30. 一種如請求項22至25中任一項所述之醫藥組成物用於製備治療對象的心血管疾病的藥物之用途。
  31. 一種組成物用於製備用於治療、預防、減少對象的臨床病況之開始風險或延緩開始的藥物之用途，該臨床病況的特徵在於表現JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變體，其中該組成物包含載體，該載體包含編碼至少二或更多個表位序列之多核苷酸，該至少二或更多個表位序列係選自由下列所組成之群組： ●      SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●      SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●      SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●      SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●      SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之JAK2表位；及其組合。
  32. 一種組成物用於製備誘發對象的免疫反應的藥物之用途，該對象攜帶JAK2V617F及/或CALR外顯子9突變，其中該組成物包含載體，該載體包含編碼至少二或更多個表位序列之多核苷酸，該至少二或更多個表位序列係選自由下列所組成之群組： ●      SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●      SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●      SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●      SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●      SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之JAK2表位；及其組合。
  33. 一種組成物用於製備治療或預防對象的骨髓增生性疾病的藥物之用途，其中該組成物包含載體，該載體包含編碼至少二或更多個表位序列之多核苷酸，該至少二或更多個表位序列係選自由下列所組成之群組： ●      SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●      SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●      SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●      SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●      SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之JAK2表位；及其組合。
  34. 如請求項33所述之用途，其中該骨髓增生性疾病係選自原發性骨髓纖維化(MPN)、真性紅血球增多症(PV)、原發性血小板血症(ET)、原發性骨髓纖維化(PFM)、繼發性骨髓纖維化、急性骨髓樣白血病(AML)、繼發性AML、慢性骨髓性白血病(CML)、未定潛能的複製性造血(clonal hematopoiesis of indeterminate potential，CHIP)、及慢性骨髓單核球性白血病(CMML)。
  35. 一種組成物用於製備治療對象的癌症的藥物之用途，其中該組成物包含載體，該載體包含編碼至少二或更多個表位序列之多核苷酸，該至少二或更多個表位序列係選自由下列所組成之群組： ●      SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●      SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●      SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●      SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●      SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之JAK2表位；及其組合。
  36. 如請求項35所述之用途，其中該癌症係選自肺癌、淋巴樣癌症、急性淋巴樣白血病、急性骨髓樣白血病、慢性骨髓性白血病、Burkitt氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、漿細胞骨髓瘤、膽管癌、膀胱癌、肝癌、胰臟癌、前列腺癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胃癌、大腸癌、結腸癌、泌尿道癌症、中樞神經系統癌症、神經胚細胞瘤、腎癌、乳癌、子宮頸癌、睪丸癌、及軟組織癌症。
  37. 一種組成物用於製備治療對象的心血管疾病的藥物之用途，其中該組成物包含載體，該載體包含編碼至少二或更多個表位序列之多核苷酸，該至少二或更多個表位序列係選自由下列所組成之群組： ●      SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●      SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少90%序列同一性之CALR表位； ●      SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●      SEQ ID NO: 5或與SEQ ID NO: 5具有至少90%序列同一性之JAK2表位； ●      SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少90%序列同一性之JAK2表位；及其組合。
  38. 如請求項37所述之用途，其中該心血管疾病係選自急性冠狀動脈症候群、缺血性腦血管疾病、缺血性心臟病、血栓形成、靜脈血栓性栓塞、深層靜脈栓塞、肺栓塞、災難性腹內血栓形成、周邊動脈疾病、高血壓、心衰竭、心房顫動、冠心病、動脈粥樣硬化、及複製性造血。
  39. 如請求項31至38中任一項所述之用途，其中該載體係選自腺病毒載體、α病毒載體、痘病毒載體、腺病毒相關病毒載體、反轉錄病毒載體、自我複製RNA分子、及其組合。
  40. 如請求項31至39中任一項所述之用途，其中該載體係選自Ad26載體、MVA載體、GAd20載體、自我複製RNA分子、及其組合。
  41. 如請求項31至39中任一項所述之用途，其中該載體係Ad26載體，其包含編碼多肽之多核苷酸，該多肽包含SEQ ID NO: 1之鈣網伴護蛋白(CALR)表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的表位序列。
  42. 如請求項31至39中任一項所述之用途，其中該載體係GAd20載體，其包含編碼多肽之多核苷酸，該多肽包含SEQ ID NO: 1之鈣網伴護蛋白(CALR)表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的表位序列。
  43. 如請求項31至39中任一項所述之用途，其中該載體係MVA載體，其包含編碼多肽之多核苷酸，該多肽包含SEQ ID NO: 1之鈣網伴護蛋白(CALR)表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的表位序列。
  44. 如請求項31至39中任一項所述之用途，其中該載體係自我複製RNA分子，其包含編碼多肽之多核苷酸，該多肽包含SEQ ID NO: 1之鈣網伴護蛋白(CALR)表位、SEQ ID NO: 2之CALR表位、SEQ ID NO: 5之JAK2表位、及SEQ ID NO: 6之JAK2表位的表位序列。
  45. 如請求項31至44中任一項所述之用途，其進一步包含投予選自下列之第二治療劑：CTLA-4抗體、PD-1抗體、PD-L1抗體、TLR促效劑、CD40促效劑、OX40促效劑、羥脲、魯索替尼(ruxolitinib)、菲達替尼(fedratinib)、41BB促效劑、CD28促效劑、FLT3配體、硫酸鋁、BTK抑制劑、JAK抑制劑、CD38抗體、CDK抑制劑、CD33抗體、CD37抗體、CD25抗體、GM-CSF抑制劑、IL-2、IL-15、IL-7、IFNγ、IFNα、TNFα、VEGF抗體、CD70抗體、CD27抗體、BCMA抗體、GPRC5D抗體、及其組合。
TW109140142A 2019-11-18 2020-11-17 基於突變體ｃａｌｒ及ｊａｋ２之疫苗及其等之用途 TW202120533A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962936846P 2019-11-18 2019-11-18
US201962936841P 2019-11-18 2019-11-18
US62/936,841 2019-11-18
US62/936,846 2019-11-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202120533A true TW202120533A (zh) 2021-06-01

Family

ID=73544235

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109140142A TW202120533A (zh) 2019-11-18 2020-11-17 基於突變體ｃａｌｒ及ｊａｋ２之疫苗及其等之用途

Country Status (22)

Country Link
US (2) US12018289B2 (zh)
EP (1) EP4061405A1 (zh)
JP (1) JP7630507B2 (zh)
KR (1) KR20220115569A (zh)
CN (1) CN114980920A (zh)
AU (1) AU2020385683A1 (zh)
BR (1) BR112022009598A2 (zh)
CA (1) CA3161800A1 (zh)
CL (1) CL2022001298A1 (zh)
CO (1) CO2022008493A2 (zh)
CR (1) CR20220220A (zh)
DO (1) DOP2022000103A (zh)
EC (1) ECSP22048779A (zh)
IL (1) IL293051A (zh)
JO (1) JOP20220116B1 (zh)
MX (1) MX2022005980A (zh)
PE (1) PE20221182A1 (zh)
PH (1) PH12022551208A1 (zh)
SA (1) SA522432649B1 (zh)
TW (1) TW202120533A (zh)
UY (1) UY38961A (zh)
WO (1) WO2021099906A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022216574A1 (en) * 2021-04-05 2022-10-13 Janssen Biotech, Inc. Calr and jak2 t-cell receptors
TW202313967A (zh) * 2021-07-30 2023-04-01 美商亞克圖羅斯醫療公司 Ｒｎａ疫苗
CA3242956A1 (en) * 2021-12-16 2023-06-22 Janssen Biotech, Inc. Vaccines based on mutations of the CALR gene and the JAK2 protein and their uses

Family Cites Families (237)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1051266A (en) 1910-09-26 1913-01-21 George I Rockwood Apparatus for operating alarms or other devices.
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
DE3642912A1 (de) 1986-12-16 1988-06-30 Leybold Ag Messeinrichtung fuer paramagnetische messgeraete mit einer messkammer
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
CA1341245C (en) 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5744166A (en) 1989-02-25 1998-04-28 Danbiosyst Uk Limited Drug delivery compositions
US5100587A (en) 1989-11-13 1992-03-31 The United States Of America As Represented By The Department Of Energy Solid-state radioluminescent zeolite-containing composition and light sources
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5179993A (en) 1991-03-26 1993-01-19 Hughes Aircraft Company Method of fabricating anisometric metal needles and birefringent suspension thereof in dielectric fluid
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
ES2156149T3 (es) 1992-12-04 2001-06-16 Medical Res Council Proteinas de union multivalente y multiespecificas, su fabricacion y su uso.
US5747323A (en) 1992-12-31 1998-05-05 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Retroviral vectors comprising a VL30-derived psi region
FR2705686B1 (fr) 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
FR2707091B1 (fr) 1993-06-30 1997-04-04 Cohen Haguenauer Odile Vecteur rétroviral pour le transfert et l'expression de gènes dans des cellules eucaryotes.
IL112920A (en) 1994-03-07 2003-04-10 Dow Chemical Co Composition comprising a dendritic polymer complexed with at least one unit of biological response modifier and a process for the preparation thereof
FR2719316B1 (fr) 1994-04-28 1996-05-31 Idm Nouveaux complexes d'acide nucléique et de polymère, leur procédé de préparation et leur utilisation pour la transfection de cellules.
ATE336587T1 (de) 1994-06-10 2006-09-15 Genvec Inc Adenoviren-vektor systeme und zelllinien
US5851806A (en) 1994-06-10 1998-12-22 Genvec, Inc. Complementary adenoviral systems and cell lines
JPH11505505A (ja) 1994-06-27 1999-05-21 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー ターゲッティングされた遺伝子輸送システム
FR2722506B1 (fr) 1994-07-13 1996-08-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
US5846782A (en) 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US5965541A (en) 1995-11-28 1999-10-12 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5559099A (en) 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
FR2727689A1 (fr) 1994-12-01 1996-06-07 Transgene Sa Nouveau procede de preparation d'un vecteur viral
WO1996019240A1 (en) 1994-12-21 1996-06-27 Novartis Ag Oligonucleotide-dendrimer conjugates
US5837520A (en) 1995-03-07 1998-11-17 Canji, Inc. Method of purification of viral vectors
AUPO591797A0 (en) 1997-03-27 1997-04-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High avidity polyvalent and polyspecific reagents
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5976567A (en) 1995-06-07 1999-11-02 Inex Pharmaceuticals Corp. Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
IL160406A0 (en) 1995-06-15 2004-07-25 Crucell Holland Bv A cell harbouring nucleic acid encoding adenoritus e1a and e1b gene products
FR2737222B1 (fr) 1995-07-24 1997-10-17 Transgene Sa Nouveaux vecteurs viraux et lignee pour la therapie genique
US5837511A (en) 1995-10-02 1998-11-17 Cornell Research Foundation, Inc. Non-group C adenoviral vectors
WO1997035996A1 (en) 1996-03-25 1997-10-02 Transgene S.A. Packaging cell line based on human 293 cells
US5891690A (en) 1996-04-26 1999-04-06 Massie; Bernard Adenovirus E1-complementing cell lines
IL127692A0 (en) 1996-07-01 1999-10-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Method for producing recombinant adenovirus
JP2000514440A (ja) 1996-07-09 2000-10-31 ザ ジョーンズ ホプキンス ユニバーシティー 遺伝子輸送システム
US6348584B1 (en) 1996-10-17 2002-02-19 John Edward Hodgson Fibronectin binding protein compounds
AU5370598A (en) 1996-12-13 1998-07-03 Schering Corporation Methods for purifying viruses
FR2759382A1 (fr) 1997-02-10 1998-08-14 Transgene Sa Nouveaux composes et compositions les contenant utilisables pour le transfert d'au moins une substance therapeutiquement active, notamment un polynucleotide, dans une cellule cible et utilisation en therapie genique
FR2760193B1 (fr) 1997-02-28 1999-05-28 Transgene Sa Lipides et complexes de lipides cationiques et de substances actives, notamment pour la transfection de cellules
CA2283253A1 (en) 1997-03-04 1998-09-11 Baxter International Inc. Adenovirus e1-complementing cell lines
US6020191A (en) 1997-04-14 2000-02-01 Genzyme Corporation Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression
EP1958962A3 (en) 1997-06-12 2013-05-01 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Artificial antibody polypeptides
CA2303268A1 (en) 1997-06-13 1998-12-17 Scott Walsh Therapeutic nanospheres
US5981225A (en) 1998-04-16 1999-11-09 Baylor College Of Medicine Gene transfer vector, recombinant adenovirus particles containing the same, method for producing the same and method of use of the same
US6113913A (en) 1998-06-26 2000-09-05 Genvec, Inc. Recombinant adenovirus
US6440442B1 (en) 1998-06-29 2002-08-27 Hydromer, Inc. Hydrophilic polymer blends used for dry cow therapy
US6818749B1 (en) 1998-10-31 2004-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Variants of humanized anti carcinoma monoclonal antibody cc49
JP4802366B2 (ja) 1999-02-22 2011-10-26 トランスジェン・ソシエテ・アノニム 精製ウイルス調製物の取得方法
ES2372823T3 (es) 1999-05-17 2012-01-26 Crucell Holland B.V. Adenovirus recombinante del serotipo ad11.
US6913922B1 (en) 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
CA2388337C (en) 1999-10-22 2013-01-08 Aventis Pasteur Limited Method of inducing and/or enhancing an immune response to tumor antigens
DE19955558C2 (de) 1999-11-18 2003-03-20 Stefan Kochanek Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren
JP5087201B2 (ja) 2000-08-03 2012-12-05 ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ 抗原に小胞体シャペロンポリペプチドを連結した分子ワクチン
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
UA76731C2 (uk) 2000-11-23 2006-09-15 Баваріан Нордік А/С Штам mva-bn модифікованого вірусу коров'ячої віспи ankara, фармацевтична композиція, вакцина, застосування mva-bn для приготування лікарського препарату та для приготування вакцини, спосіб введення гомологічної і/або гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти в клітини-мішені in vitro, спосіб одержання пептиду або білка, спосіб одержання mva-bn, клітина, набір для основної/бустерної імунізації
CA2430013C (en) 2000-11-30 2011-11-22 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
MXPA05000511A (es) 2001-07-12 2005-09-30 Jefferson Foote Anticuepros super humanizados.
IL160359A0 (en) 2001-08-31 2004-07-25 Avidex Ltd Soluble t cell receptor
CN100540051C (zh) 2002-04-19 2009-09-16 巴法里安诺迪克有限公司 用于接种新生儿的改良的安卡拉痘苗病毒
CA2501870C (en) 2002-10-09 2013-07-02 Avidex Limited Single chain recombinant t cell receptors
MXPA05005051A (es) 2002-11-12 2006-03-10 Albert B Deisseroth Vacuna de vector adenoviral.
EP2363493B1 (en) 2003-02-20 2012-11-14 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Novel insertion sites in pox vectors
EP1687033A4 (en) 2003-11-12 2008-06-11 Us Navy IMPROVEMENT OF VACCINE-INDUCED IMMUNE REACTIONS AND PROTECTION THROUGH HETEROLOGY REINFORCEMENT WITH ALPHAVIRUS REPLICON VACCINE
US8299229B2 (en) 2003-11-24 2012-10-30 Microvax, Llc Mucin antigen vaccine
DE602005017743D1 (de) 2004-01-23 2009-12-31 Angeletti P Ist Richerche Bio Impfstoffträger für schimpansen-adenovirus
FR2877013A1 (fr) 2004-10-27 2006-04-28 Assist Publ Hopitaux De Paris Indentification d'une mutation de jak2 impliquee dans la polyglobulie de vaquez
WO2007047653A2 (en) * 2005-10-17 2007-04-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthetic hla binding peptide analogues of mutant v617f jak2 enzyme and uses therefor
DE102006010989A1 (de) 2006-03-09 2007-09-13 Wacker Chemie Ag Verfahren zur Herstellung von Organylhydrogenchlorsilanen
WO2007104792A2 (en) 2006-03-16 2007-09-20 Crucell Holland B.V. Recombinant adenoviruses based on serotype 26 and 48, and use thereof
EP1878744A1 (en) 2006-07-13 2008-01-16 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Epitope-tag for surface-expressed T-cell receptor proteins, uses thereof and method of selecting host cells expressing them
DK2596801T3 (en) 2006-10-06 2018-08-13 Bavarian Nordic As RECOMBINANT MODIFIED VACCINIA ANKARA VIRUS CODING A HER-2 ANTIGEN FOR USING CANCER TREATMENT
DK2170384T3 (en) 2007-07-02 2016-07-25 Etubics Corp METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF AN adenovirus vector for use in higher vaccination
AU2008312444B2 (en) 2007-10-18 2014-02-06 Bavarian Nordic A/S Use of MVA to treat prostate cancer
US8748356B2 (en) 2007-10-19 2014-06-10 Janssen Biotech, Inc. Methods for use in human-adapting monoclonal antibodies
RU2503717C2 (ru) 2007-11-19 2014-01-10 Трансжене Са Поксвирусные онколитические векторы
WO2009111738A2 (en) 2008-03-06 2009-09-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Single cycle replicating adenovirus vectors
CA2721333C (en) 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
JP2012505654A (ja) 2008-10-14 2012-03-08 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 抗体をヒト化及び親和性成熟する方法
WO2010051367A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenoviruses sadv-43, -45,-48,-49, and -50 and uses thereof
ES2705714T3 (es) 2008-10-31 2019-03-26 Janssen Biotech Inc Métodos y usos de dominio de Fibronectina tipo III basado en estructuras de composiciones
PL2391638T3 (pl) 2009-02-02 2018-11-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe małpiego adenowirusa, zawierające je wektory i ich zastosowania
BRPI1008532B1 (pt) 2009-02-12 2021-12-14 Janssen Biotech, Inc Arcabouço de proteína isolada, método para construção de uma biblioteca de arcabouço de proteína isolada, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de ácido nucleico isolado, célula hospedeira de bactéria ou fungo, composição, dispositivo médico e artigo de manufatura para uso farmacêutico ou de diagnóstico em seres humanos
US8394385B2 (en) 2009-03-13 2013-03-12 Bavarian Nordic A/S Optimized early-late promoter combined with repeated vaccination favors cytotoxic T cell response against recombinant antigen in MVA vaccines
CA3017298C (en) 2009-05-15 2021-09-28 Irx Therapeutics, Inc. Compositions comprising primary cell-derived biologics for enhancing immune responses in patients
EP3318248B1 (en) 2009-12-01 2019-04-10 Translate Bio, Inc. Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
KR20130010121A (ko) 2010-03-23 2013-01-25 인트렉손 코포레이션 치료적 단백질을 조건부로 발현하는 벡터，상기 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 이의 용도
ES2646669T3 (es) 2010-07-06 2017-12-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procedimientos de aumento de una respuesta inmunitaria mediante el suministro de ARN
EP2591114B1 (en) 2010-07-06 2016-06-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunisation of large mammals with low doses of rna
ES2557382T3 (es) 2010-07-06 2016-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Liposomas con lípidos que tienen un valor de pKa ventajoso para el suministro de ARN
MX342608B (es) 2010-07-06 2016-10-06 Novartis Ag * Particulas de suministro similares a viriones para moleculas de arn de autorreplicacion.
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
LT4226941T (lt) 2010-08-31 2025-01-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pegilintos liposomos, skirtos imunogeną koduojančios rnr pristatymui
SI4043040T1 (sl) 2010-08-31 2023-04-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali liposomi za dostavo imunogen-kodirajoče RNA
WO2012089225A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 Curevac Gmbh Combination of vaccination and inhibition of mhc class i restricted antigen presentation
EP2502934B1 (en) 2011-03-24 2018-01-17 Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Single chain antigen recognizing constructs (scARCs) stabilized by the introduction of novel disulfide bonds
GB201108879D0 (en) 2011-05-25 2011-07-06 Isis Innovation Vector
EP2729165B1 (en) 2011-07-06 2017-11-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic combination compositions and uses thereof
EP4115875A1 (en) 2011-07-06 2023-01-11 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
CA2841047A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Immunogenic compositions and uses thereof
MX366055B (es) 2011-08-31 2019-06-26 Novartis Ag Liposomas pegilados para admistracion de acido ribonucleico (arn) que codifica para inmunogeno.
CN103987726B (zh) 2011-10-05 2017-10-03 金维克有限公司 猴(大猩猩)腺病毒或腺病毒载体及其使用方法
WO2013116778A2 (en) 2012-02-02 2013-08-08 Board Of Regents Immunogenic adenovirus
WO2013120500A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen
AU2013296919A1 (en) 2012-07-30 2015-01-22 Alex Wah Hin Yeung Cancer vaccine comprises tumor cells, an oncolytic virus vector and/or an immune checkpoint modulator
WO2014037124A1 (en) 2012-09-04 2014-03-13 Bavarian Nordic A/S Methods and compositions for enhancing vaccine immune responses
US9974845B2 (en) 2013-02-22 2018-05-22 Curevac Ag Combination of vaccination and inhibition of the PD-1 pathway
AU2014301777B2 (en) 2013-06-26 2017-03-30 Xlifesc, Ltd. High-stability T-cell receptor and preparation method and application thereof
MX348980B (es) 2013-09-16 2017-07-05 Cemm-Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh Calreticulina mutante para la diagnosis de malignidades mieloides.
US10350275B2 (en) 2013-09-21 2019-07-16 Advantagene, Inc. Methods of cytotoxic gene therapy to treat tumors
WO2015061416A2 (en) 2013-10-23 2015-04-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hla-a24 agonist epitopes of muc1-c oncoprotein and compositions and methods of use
AU2014347004B2 (en) 2013-11-05 2019-08-08 Bavarian Nordic A/S Combination therapy for treating cancer with a poxvirus expressing a tumor antigen and an antagonist and/or agonist of an immune checkpoint inhibitor
IL292510A (en) 2013-11-05 2022-06-01 Cognate Bioservices Inc Combinations of checkpoint inhibitors and therapeutics to treat cancer
AU2014348212C1 (en) 2013-11-18 2018-11-29 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for RNA delivery
CN106029889A (zh) 2013-11-22 2016-10-12 德那翠丝有限公司 表达免疫细胞刺激受体激动剂的腺病毒
UA127337C2 (uk) 2013-11-28 2023-07-26 Баваріан Нордік А/С Рекомбінантний поксвірус для індукції посиленої імунної відповіді та його застосування
US20170106065A1 (en) 2013-12-31 2017-04-20 Bavarian Nordic A/S Combination Therapy for Treating Cancer with a Poxvirus Expressing a Tumor Antigen and an Antagonist of TIM-3
US9884075B2 (en) 2014-01-16 2018-02-06 California Institute Of Technology Domain-swap T cell receptors
ES2738582T3 (es) 2014-02-14 2020-01-23 Immune Design Corp Inmunoterapia del cáncer a través de combinación de inmunoestimulación local y sistémica
CA2941116A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Replicating recombinant adenovirus vectors, compositions, and methods of use thereof
WO2015143221A1 (en) 2014-03-19 2015-09-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer
PL4023249T3 (pl) 2014-04-23 2025-03-10 Modernatx, Inc. Szczepionki z kwasem nukleinowym
ES2851451T3 (es) 2014-05-13 2021-09-07 Bavarian Nordic As Terapia de combinación para tratar cáncer con un poxvirus que expresa un antígeno de tumor y un anticuerpo monoclonal contra TIM-3
KR102499737B1 (ko) 2014-05-13 2023-02-13 버베리안 노딕 에이/에스 종양 항원을 발현하는 재조합 폭스바이러스 및 면역 체크포인트 분자 길항제 또는 효현제로 암을 치료하기 위한 복합 요법
WO2015176033A1 (en) 2014-05-15 2015-11-19 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of lung cancer using a combination of an anti-pd-1 antibody and another anti-cancer agent
US20170106067A1 (en) 2014-06-12 2017-04-20 The Johns Hopkins University Combinatorial immunotherapy for pancreatic cancer treatment
JP2017530114A (ja) 2014-09-26 2017-10-12 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ フラジェリンをコードする組み換えｍｖａによる鼻腔内免疫のための方法と組成物
WO2016087514A1 (en) 2014-12-02 2016-06-09 Cemm - Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh Anti-mutant calreticulin antibodies and their use in the diagnosis and therapy of myeloid malignancies
EP4523756A3 (en) 2015-02-13 2025-05-28 Transgene Immunotherapeutic vaccine and antibody combination therapy
CN107847534B (zh) 2015-04-17 2022-10-04 纪念斯隆凯特琳癌症中心 Mva或mvaδe3l作为抗实体瘤的免疫治疗剂的应用
CN108064176A (zh) 2015-04-22 2018-05-22 库瑞瓦格股份公司 用于治疗肿瘤疾病的含有rna的组合物
WO2016184822A1 (en) 2015-05-15 2016-11-24 Curevac Ag Prime-boost regimens involving administration of at least one mrna construct
US10995140B2 (en) 2015-06-05 2021-05-04 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. GM-CSF/CD40L vaccine and checkpoint inhibitor combination therapy
US20180296663A1 (en) 2015-06-17 2018-10-18 Curevac Ag Vaccine composition
MA42543A (fr) 2015-07-30 2018-06-06 Modernatx Inc Arn épitope peptidiques concatémériques
JP6470872B2 (ja) 2015-08-20 2019-02-13 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 治療用ｈｐｖ１８ワクチン
ES2994611T3 (en) 2015-10-19 2025-01-27 Cg Oncology Inc Methods of treating solid or lymphatic tumors by combination therapy
AU2016341309A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Cancer vaccines
JP2018532801A (ja) 2015-10-30 2018-11-08 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 標的化がん療法
ES2972471T3 (es) 2015-12-01 2024-06-12 Lgc Clinical Diagnostics Inc Materiales de referencia celulares multiplex
US11464839B2 (en) 2015-12-04 2022-10-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and vaccines for inducing immune responses to multiple different MHC molecules
IL261321B2 (en) 2016-02-25 2023-12-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Recombinant mva or mvadele3l expressing human flt3l and use thereof as immuno-therapeutic agents against solid tumors
KR20180133395A (ko) 2016-02-25 2018-12-14 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 암 면역요법을 위한, 인간 flt3l 또는 gm-csf의 발현이 있거나 없으며 티미딘 키나제가 결실된 복제 가능 약독화 백시니아 바이러스
WO2017152042A2 (en) 2016-03-04 2017-09-08 New York University Virus vectors expressing multiple epitopes of tumor associated antigens for inducing antitumor immunity
WO2017162266A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Rna replicon for versatile and efficient gene expression
JP7250520B2 (ja) 2016-04-13 2023-04-03 ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 組換えアルテリウイルスレプリコン系およびその使用
EP3445392A1 (en) 2016-04-22 2019-02-27 CureVac AG Rna encoding a tumor antigen
JP7194594B2 (ja) 2016-05-18 2022-12-22 モデルナティエックス インコーポレイテッド 免疫調節ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの組み合わせ及びその使用
JP2019519516A (ja) 2016-05-18 2019-07-11 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド がんの治療のためのｍＲＮＡ併用療法
SI3458083T1 (sl) 2016-05-18 2023-03-31 Modernatx, Inc. Polinukleotidi, ki kodirajo interlevkin-12 (IL12) in njihova uporaba
CN109890408A (zh) 2016-05-27 2019-06-14 埃特彼塞斯公司 新表位疫苗组合物及其使用方法
EP3468585A2 (en) 2016-06-10 2019-04-17 IO Biotech APS Calr and jak2 vaccine compositions
CN109475613B (zh) 2016-06-14 2024-02-20 匹兹堡大学-属高等教育联邦体系 使癌细胞对胞毒免疫细胞攻击敏感的nkg2d活化配体蛋白表达
RU2745500C2 (ru) 2016-06-20 2021-03-25 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Эффективный и сбалансированный двунаправленный промотор
JP6903120B2 (ja) * 2016-07-15 2021-07-14 エトゥビクス コーポレーション アルファウイルスワクチン接種のための組成物及び方法
CN109715205A (zh) 2016-08-19 2019-05-03 库瑞瓦格股份公司 用于癌症治疗的rna
JP2019526580A (ja) 2016-09-02 2019-09-19 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 抗レトロウイルス処置を受けている対象においてヒト免疫不全ウイルス感染に対する免疫応答を誘発するための方法
ES2845690T3 (es) 2016-09-12 2021-07-27 Targovax Oy Combinación de adenovirus e inhibidores de punto de control para el tratamiento del cáncer
CN110198733B (zh) 2016-09-28 2024-04-30 巴法里安诺迪克有限公司 用于增强痘病毒中转基因的稳定性的组合物和方法
KR102718353B1 (ko) 2016-10-17 2024-10-15 얀센 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 재조합 바이러스 레플리콘 시스템 및 그의 용도
EP3532103B1 (en) 2016-10-26 2025-12-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
JP2020500847A (ja) 2016-11-16 2020-01-16 プライムヴァックス イミュノ−オンコロジー，インク． 癌の処置のための併用免疫療法
JP2020500552A (ja) 2016-11-23 2020-01-16 グリットストーン オンコロジー インコーポレイテッド 新生抗原のウイルスによる送達方法
CA3045650A1 (en) 2016-12-05 2018-06-14 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing gene expression
WO2018107011A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 City Of Hope P53-targeting vaccines and pd-1 pathway inhibitors and methods of use thereof
US20190351040A1 (en) 2017-02-01 2019-11-21 Modernatx, Inc. Rna cancer vaccines
AU2018219862B2 (en) 2017-02-07 2020-09-17 Nant Holding IP, LLC Maximizing T-cell memory and compositions and methods therefor
US11034978B2 (en) 2017-02-09 2021-06-15 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and short promoter for expression of heterologous genes
WO2018161092A1 (en) 2017-03-03 2018-09-07 New York University Induction and enhancement of antitumor immunity involving virus vectors expressing multiple epitopes of tumor associated antigens and immune checkpoint inhibitors or proteins
JP2020514370A (ja) 2017-03-17 2020-05-21 キュアバック アーゲー 組合せ抗癌療法のためのｒｎａワクチン及び免疫チェックポイント阻害剤
CA3058807A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Biontech Us Inc. Protein antigens and uses thereof
WO2018194890A1 (en) 2017-04-19 2018-10-25 University Of Iowa Research Foundation Cancer vaccines and methods of producing and using same
EP3634449A4 (en) 2017-05-08 2021-03-17 Gritstone Oncology, Inc. ALPHAVIRUS NEOANTIGEN VECTORS
WO2018209315A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Vaccinia virus mutants useful for cancer immunotherapy
US11300574B2 (en) 2017-05-26 2022-04-12 University Of Connecticut Methods for treating breast cancer and for identifying breast cancer antigens
WO2018234506A2 (en) 2017-06-21 2018-12-27 Transgene Sa PERSONALIZED VACCINE
ES2906441T3 (es) 2017-07-05 2022-04-18 Nouscom Ag Secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del adenovirus de los grandes simios no humanos, vectores que las contienen y usos de las mismas
JP7298926B2 (ja) 2017-07-12 2023-06-27 ノイスコム アーゲー 癌の治療のためのネオアンチゲンワクチン組成物
FI3652606T3 (fi) 2017-07-12 2023-03-16 Nouscom Ag Jaettuihin tuumorineoantigeeneihin perustuva yleisrokote epästabiilien mikrosatelliitti (msi) -syöpien ennaltaehkäisyyn ja hoitoon
CN111163799A (zh) 2017-07-28 2020-05-15 扬森疫苗与预防公司 用于异源repRNA免疫接种的方法和组合物
CN111050790B (zh) 2017-08-24 2024-07-12 巴法里安诺迪克有限公司 通过静脉内施用重组mva和抗体治疗癌症的组合疗法
US11839655B2 (en) 2017-09-01 2023-12-12 Microvax, Llc Combination cancer therapy
KR102747530B1 (ko) 2017-11-03 2024-12-27 노우스콤 아게 백신 t 세포 인핸서
WO2019094396A1 (en) 2017-11-07 2019-05-16 Nektar Therapeutics Immunotherapeutic combination for treating cancer
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
SG11202006457YA (en) 2018-01-05 2020-08-28 Ottawa Hospital Res Inst Modified orthopoxvirus vectors
WO2019135086A1 (en) 2018-01-06 2019-07-11 Emergex Vaccines Holding Limited Mhc class i associated peptides for prevention and treatment of multiple flavi virus
JP7494117B2 (ja) 2018-01-19 2024-06-03 ヤンセン ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド 組換えレプリコン系を使用する免疫応答の誘導および増強
CN111918660A (zh) 2018-01-24 2020-11-10 复诺健生物科技加拿大有限公司 重组病毒疫苗
EP3743102A1 (en) 2018-01-26 2020-12-02 Nantcell, Inc. Compositions and methods for combination cancer vaccine and immunologic adjuvant therapy
WO2019148109A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Expression of metabolic modulators in tumor microenvironment to improve tumor therapy
US20190367568A1 (en) 2018-02-05 2019-12-05 Nantbio, Inc. Calreticulin and fusion proteins
US11376290B2 (en) 2018-03-14 2022-07-05 Wuhan Boweid Biotechnology Co., Ltd. Recombinant oncolytic virus, synthetic DNA sequence, and application thereof
EP3773649A4 (en) 2018-03-28 2022-02-23 EpicentRx, Inc. PERSONALIZED CANCER VACCINE
WO2019191780A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Arcturus Therapeutics, Inc. Lipid particles for nucleic acid delivery
TWI905535B (zh) 2018-04-23 2025-11-21 美商南特細胞公司 新抗原表位疫苗及免疫刺激組合物及方法
US20210106667A1 (en) 2018-05-03 2021-04-15 Duke University Vaccine compositions and methods for enhanced antigen-specific vaccination
GB201807932D0 (en) 2018-05-16 2018-06-27 Redchenko Irina Compositions and methods for inducing an immune response
AU2019275072A1 (en) 2018-05-23 2021-01-21 Seattle Project Corp. Shared antigens
JP2021524247A (ja) 2018-05-23 2021-09-13 グリットストーン バイオ インコーポレイテッド 免疫チェックポイント阻害剤の共発現ベクター
CA3101454A1 (en) 2018-05-30 2019-12-05 Translate Bio, Inc. Messenger rna vaccines and uses thereof
EP3587581A1 (en) 2018-06-26 2020-01-01 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Formulations for simian adenoviral vectors having enhanced storage stability
WO2020014539A1 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Epicentrx, Inc. Methods and compositions for targeting cancer cells for treatment
GB201812647D0 (en) 2018-08-03 2018-09-19 Chancellor Masters And Scholars Of The Univ Of Oxford Viral vectors and methods for the prevention or treatment of cancer
MX2021003013A (es) 2018-09-15 2021-08-11 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Poxvirus recombinantes para inmunoterapia contra cáncer.
WO2020072371A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 The Wistar Institute Melanoma canine vaccine compositions and methods of use thereof
WO2020073045A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Nantcell, Inc. Cd40 and cd40l combo in an adenovirus vaccine vehicle
JP7555334B2 (ja) 2018-10-05 2024-09-24 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 組み換えｍｖａ、及び免疫チェックポイントアンタゴニストまたは免疫チェックポイントアゴニストの静脈内投与によって、がんを治療する併用療法
US12576143B2 (en) 2018-10-19 2026-03-17 Nouscom Ag Teleost invariant chain cancer vaccine
MA54192A (fr) 2018-11-07 2021-09-15 Modernatx Inc Vaccins à arn contre le cancer
AU2019374874A1 (en) 2018-11-07 2021-06-10 Gritstone Bio, Inc. Alphavirus neoantigen vectors and interferon inhibitors
MX2021005656A (es) 2018-11-15 2021-07-07 Nouscom Ag Seleccion de mutaciones de cancer para la generacion de una vacuna contra cancer personalizada.
CA3119503A1 (en) 2018-11-20 2020-05-28 Bavarian Nordic A/S Therapy for treating cancer with an intratumoral and/or intravenous administration of a recombinant mva encoding 4-1bbl (cd137l) and/or cd40l
KR20210129634A (ko) 2018-12-13 2021-10-28 로드아일랜드하스피틀 Asph 발현 종양의 성장 및 진행 억제
BR112021010611A2 (pt) 2018-12-14 2021-08-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Composições e métodos de vacina de reforço (prime boost) heterólogo
US20220062394A1 (en) 2018-12-17 2022-03-03 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
CN109806390A (zh) 2019-01-07 2019-05-28 康希诺生物股份公司 一种SamRNA疫苗及其制备方法
AU2020208193A1 (en) 2019-01-14 2021-07-29 BioNTech SE Methods of treating cancer with a PD-1 axis binding antagonist and an RNA vaccine
AU2020210614A1 (en) 2019-01-21 2021-08-26 Sanofi Therapeutic RNA and anti-PD1 antibodies for advanced stage solid tumor cancers
TW202102543A (zh) 2019-03-29 2021-01-16 美商安進公司 溶瘤病毒在癌症新輔助療法中之用途
EP3721899A1 (en) 2019-04-08 2020-10-14 China Medical University Combination therapies comprising dendritic cells-based vaccine and immune checkpoint inhibitor
MX2021014525A (es) 2019-05-30 2022-03-17 Gritstone Bio Inc Adenovirus modificados.
WO2020247547A1 (en) 2019-06-03 2020-12-10 Geovax, Inc. Cancer vaccine compositions and methods for use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US12018289B2 (en) 2024-06-25
JOP20220116A1 (ar) 2023-01-30
US20210222133A1 (en) 2021-07-22
KR20220115569A (ko) 2022-08-17
PH12022551208A1 (en) 2023-04-24
CA3161800A1 (en) 2021-05-27
AU2020385683A1 (en) 2022-06-30
CN114980920A (zh) 2022-08-30
CR20220220A (es) 2022-09-20
ECSP22048779A (es) 2022-07-29
SA522432649B1 (ar) 2025-05-29
JP7630507B2 (ja) 2025-02-17
DOP2022000103A (es) 2022-11-30
IL293051A (en) 2022-07-01
WO2021099906A1 (en) 2021-05-27
PE20221182A1 (es) 2022-08-05
CL2022001298A1 (es) 2023-01-13
CO2022008493A2 (es) 2022-07-08
JP2023509571A (ja) 2023-03-09
BR112022009598A2 (pt) 2022-08-16
JOP20220116B1 (ar) 2025-10-01
US20240294884A1 (en) 2024-09-05
MX2022005980A (es) 2022-09-07
NZ789387A (en) 2025-06-27
EP4061405A1 (en) 2022-09-28
UY38961A (es) 2021-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240294884A1 (en) Vaccines based on mutant calr and jak2 and their uses
TWI852977B (zh) 前列腺新抗原及其用途
US20230024133A1 (en) Prostate Neoantigens And Their Uses
US20210261636A1 (en) Neoantigens expressed in multiple myeloma and their uses
US12295997B2 (en) Prostate neoantigens and their uses
US20240254161A1 (en) Neoantigens Expressed In Ovarian Cancer And Their Uses
RU2841311C1 (ru) Неоантигены, экспрессируемые при множественной миеломе, и их применение
HK40085962A (zh) 在卵巢癌中表达的新抗原及其用途
HK40079657A (zh) 基於突变体calr和jak2的疫苗及其用途
EA051127B1 (ru) Неоантигены, экспрессируемые в раке яичника, и их применение
EA048051B1 (ru) Вакцины на основе мутантных calr и jak2 и способы их применения
WO2025158316A1 (en) Ovarian neoantigens and use thereof
HK40055542A (zh) 前列腺新抗原及其用途