LT4557B - Glutamato dehidrogenazės, beta-n-acetilheksozaminidazės ir gama-aktino genų promotoriai bei jų panaudojimas filamentinių grybų ekspresijos, sekrecijos ir antisensinėse sistemose - Google Patents

Glutamato dehidrogenazės, beta-n-acetilheksozaminidazės ir gama-aktino genų promotoriai bei jų panaudojimas filamentinių grybų ekspresijos, sekrecijos ir antisensinėse sistemose Download PDF

Info

Publication number
LT4557B
LT4557B LT98-152A LT98152A LT4557B LT 4557 B LT4557 B LT 4557B LT 98152 A LT98152 A LT 98152A LT 4557 B LT4557 B LT 4557B
Authority
LT
Lithuania
Prior art keywords
chrysogenum
gene
gly
seq
ala
Prior art date
Application number
LT98-152A
Other languages
English (en)
Other versions
LT98152A (lt
Inventor
Jose Luis Barredo-Fuente
Marta Rodriguez-Saiz
Miguel Angel Moreno-Valle
Alfonso J. Collados-De-La-Vieja
Francisco Salto-Maldonado
Bruno Diez-Garcia
Original Assignee
Antibioticos, S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Antibioticos, S.A. filed Critical Antibioticos, S.A.
Publication of LT98152A publication Critical patent/LT98152A/lt
Publication of LT4557B publication Critical patent/LT4557B/lt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01002—Glutamate dehydrogenase (1.4.1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01052—Beta-N-acetylhexosaminidase (3.2.1.52)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Išradimas skirtas Penicillium chrysogenum gdh ir hex genų bei P. chrysogenum ir Acremonium chrysogenum act geno ekspresijos techninei sričiai. Analizuojant šių genų nukleotidų seką, aptikta promotorių sritis, turinti transliacijos inicijavimo vietą, kuri gali būti panaudota sukurti galingus ekspresijos ir sekrecijos vektorius, naudojamus tiek P. chrysogenum, tiek A. chrysogenum ir jų giminingoms rūšims. Be to, šie promotoriai gali būti panaudoti genų ekspresijos blokavimui antisensinėmis konstrukcijomis, Kitų genų ekspresija filamentiniuose grybuose gali būti vykdoma, reguliuojant aukščiau minėtais promotoriais, gaunant padidintą kiekj būdingų antibiotikų ir/arba baltymų.
P. chrysogenum ir A. chrysogenum yra filamentiniai grybai, keliantys pramoninį susidomėjimą dėl jų gebos gaminti atitinkamai peniciliną ir cefalosporiną. Pastarojo dešimtmečio metu buvo žymiai išvystyta genetinės manipuliacijos technika, pritaikoma abiejuose mikroorganizmuose. P. chrysogenum ir A. chrysogenum genetinės manipuliacijos techniką sudaro protoplastų transformavimas vektoriais, kurie turi fleomicino atsparumo geną (toliau vadinamas bleR genu) (Kolar, M. et ai. (1988), Gene 62, 127-134) kaip selektyvią žymę, o taip pat papildomų dominančių nepaliestų genų kopijų ekspresija ir tiriamo geno promotoriaus pakeitimas kitu promotoriumi, kuris gali pagerinti jo ekspresiją. Homologinių genų ekspresija grybuose, tokiuose, kaip P. chrysogenum ar A. chrysogenum, gali būti reguliuojama neigiamai, tuo tarpu, kalbant apie heterologinius genus, yra įmanoma, kad jų promotorius nebus efektyviai atpažintas šiais grybais. Siekiant išvengti šių problemų, buvo identifikuoti ir klonuoti genai, kurie yra ekspresuoti esminiai ir kuriuose ši ekspresija neturi neigiamo katabolinio reguliavimo, toliau vadinami stipriais promotoriais. Bendru atveju, manoma, kad aukštos ekspresijos genai turi signalus promotoriaus srityje, kurie palengvina aukštus transkripcijos lygius ir kurie atlieka pagrindinį vaidmenį funkcijose, vykstančiose pirminiame ląstelės metabolizme. Šie genai yra: genai, kurie koduoja N ADP priklausančią glutamato dehidrogenazę (EC. 1.4.1.4) (toliau vadinamas gdh genu), β-Νacetilheksozaminidazę (EC.3.2.1.52) (toliau vadinamas hex genu) ir γ-aktiną (toliau vadinamas act genu).
Yra ankstesnės nuorodos į gdh, hex ir act genus iš mikroorganizmų, kitokių nei tie, kurie naudojami šiame išradime. Tinkamiausi bibliografiniai šaltiniai yra: (I) grybo Neurosporra crassa gdh geno nukleotidų seka (Kinnaird,
J.H. ir Fincham, J.R.S. (1983), Gene 26, 253-260), o taip pat Aspergillus nidulans grybo gdhA geno ekspresijos reguliavimas (Havvkins, A.R. et ai. (1989), Mol.
Gen. Genet. 418, 105-111), (II) Candida albicans grybo hex1 geno klonavimas ir ekspresija (Cannon, R.D. et ai. (1994), J. Bacteriol. 2640-2647) ir (III) A nidulans grybo act geno charakteristika (Fidel, S. ei ai. )1988), Gene 70, 283-293). P. chrysogenum heterologinių genų ekspresija, naudojant pcbC ar penDE genų promotorius, buvo aprašyta Cantvvell, C.A. ei ai. 1992 m. (Proc. R. Soc. London Ser. B 248, 283-289). Be to, A chrysogenum heterologinių genų ekspresija, naudojant β-izopropilmalato dehidrogenazės (Japonijos patentas Nr. 80295/1989) ir gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenazės genų promotorius (EP A 037622A1/1989) taip pat yra aprašyta.
Genų ekspresijos inaktyvavimas pramoniniuose kamienuose kartais yra reikalingas, siekiant eliminuoti nepageidaujamus fermentų poveikius. Kadangi dėl daugelio pramoninių kamienų chromosomų pasikartojimo laipsnio ploidiškumo lygio labai dažnai yra sunku blokuoti ekspresiją tiesioginiu genų suskaldymu, tenka naudoti sistemas ekspresijos inaktyvinimui, kurios yra nepriklausomos nuo chromosomų pagrindinio skaičiaus pasikartojimo laipsnio lygio. Sukūrus antisensines konstrukcijas, ekspresuotas stiprių promotorių įtakoje, tapo jmanoma nutraukti genų ekspresiją. Tokios rūšies konstrukcijos yra ypatingai naudingos pramoniniuose kamienuose, nes dėl jų chromosomų pagrindinio skaičiaus pasikartojimo laipsnio lygių (Kunkel et ai. (1992) Appl. Microbiol. Biotech. 36, 499-502) yra sunku visiškai inaktyvuoti genus. Yra aprašytas antisensinių konstrukcijų naudojimas blokuoti fermentų veiklą mielėse (Atkins, D. etai. (1994), Biol. Chem. H-S 375, 721-729) ir augaluose (Hamada, T.
(1996), Transgenic research 5, 115-121; John, M.E. (1996) Plant Mol. Biol. 30,
297-306). Hex promotorius pasižymi ypatinga ekstraląstelinio fermento kodavimo sąvybe, kuri leidžia jį panaudoti ekstraiąstelinių baltymų ekspresijai.
Tačiau nėra nuorodų į jokius šaltinius, kuriuose aprašytos arba filamentinių grybų naudojamų šiame išradime genų sekos arba fermentų , kurie sintezuojami ekspresuojant tuos genus, sekos. Taip pat niekur nėra aprašytas grybų genų stipriųjų promotorių panaudojimas genų ekspresijai, sekrecijai ar inaktyvavimui, aprašytas šiame išradime.
Stipriųjų promotorių naudojimas tam tikrų genų padidintai ekspresijai gali iššaukti penicilino ar cefalosporino gamybos pagerinimą ir taip pat naujų antibiotikų, gautų pakeitimo būdu iš pastarųjų, sintezę.
Šiame išradime aprašytas naujas P. chrysogenum ir A. chrysogenum kamienų, galinčių ekspresuoti homologinius ar heterologinius genus, kontroliuojamus promotorių, gavimo būdas. Yra aprašytas promotorių, atitinkančių genus, kurie koduoja P. chrysogenum NADP priklausančią glutamato dehidrogenazę (EC.1.4.1.4) - gdh geno, P. chrysogenum β-Νacetilheksoaminidazę (EC.3.2.1.52) - hex geno ir P. chrysogenum bei A. chrysogenum γ-aktiną - act geno, apibūdinimas ir po to sekantis panaudojimas. Šių promotorių panaudojimas padidintai ekspresuoti genus, susijusius su penicilino ir/arba cefalosporino biosinteze aukščiau minėtuose kamienuose yra vienas iš šio išradimo tikslų. Šie promotoriai taip pat gali būti panaudoti blokuoti genų ekspresiją antisensinių konstrukcijų pagalba,
Šis išradimas yra pagrįstas tuo, kad P. chrysogenum ir A. chrysogenum yra nukleino rūgšties donorai. Turint išgrynintą genominę DNR, buvo sukonstruotos abiejų mikroorganizmų DNR sekų bibliotekos, kaip aprašyta 1 ir 4 pavyzdžiuose, ir buvo atliktas jų skryningas: (I) sintetiniais oligonukleotidais, atitinkančiais N. crassa gdh geną, siekiant klonuoti homologinį P. chrysogenum geną, (II) oligonukleotidų deriniais, sintezuotais pagal β-Νacetilheksoaminidazės fermento amino galo seką, siekiant klonuoti P. chrysogenum hex geną, ir (III) A. nidulans act geno fragmentu, siekiant klonuoti homologinius P. chrysogenum ir A. chrysogenum genus. Klonai, išgryninti jų teigiamos hibridizacijos su atitinkamu mėginiu gebos dėka, vėliau buvo analizuojami, bandant aptikti ieškomus genus.
P. chrysogenum grybo gdh genas buvo identifikuotas 7,2 kb EcoRI fragmente ir dviejuose atitinkamai 2,9 ir 1,5 kb SamHI fragmentuose. DNR srities, turinčios šj geną, restrikcijos diagrama parodyta fig.1. Po to buvo nustatyta 2816 nukleotidų seka (SEQ ID No:1), turinti atvirą skaitymo rėmelį (ORF) su ryškiai išreikštu pirmenybiniu kodono naudojimo pavyzdžiu, kurio ATG transliacijos inicijavimo kodonas buvo aptiktas 922 pozicijoje ir TAA transliacijos beprasmis kodonas buvo aptiktas 2522 pozicijoje. Taip pat buvo aptikti du 159 bp ir 56 bp intronai atitinkamai pozicijose tarp 971-1130 ir 1262-1318. Šis ORF koduoja 49837 Da baltymą, turintį izoelektrinj tašką 6,18, kurio 461 aminorūgščių seka (SEQ ID No:5) turi 72,4% tapatumą su N. crassa fermento NADP priklausančio glutamato dehidrogenazės fermento aminorūgščių seka. Promotoriaus srityje rastos pirimidinu praturtintos zonos, panašios į tas, kurios yra labai ekspresuotuose genuose, o taip pat dvi numanomos TATA sekos (šios sekos aptinkamos tam tikrų grybų promotoriuose nuo 30 iki 50 bp prieš transkripcijos inicijavimo vietą) (Davis, M.A. ir Hynes, M.J. (1991), More Gene manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, California) ir CCAAT seka (kuri aptinkama maždaug 30% eukariotinių genų promotorių nuo 50 iki 200 bp prieš transkripcijos inicijavimo vietą) (Bucher, P. (1990) J. Mol. Biol. 212: 563578). Šis promotorius buvo panaudotas ekspresuoti P. chrysogenum ir A. chrysogenum E. coli geną, kuris koduoja β-galaktozidazę (toliau vadinamas lacZ genu) ir S. hindustanus bleR geną. Tuo tikslu, kaip aprašyta 1 pavyzdyje, buvo sukurtos plazmidės pSKGSu ir pALfleo7 (fig.5). Iš gautų rezultatų padaryta išvada, kad gdh promotorius (toliau vadinamas Pgdh) gali valdyti heterologinių lacZ ir bleR genų ekspresiją tiek P. chrysogenum, tiek A. chrysogenum grybuose, o taip pat ir E. coli.
Antisensinių konstrukcijų, ekspresuojamų nuo stiprių promotorių, sukūrimas leidžia nutraukti genų ekspresiją. Šiuo tikslu buvo sukurta plazmidė pALP888 (fig.5), kaip tai aprašyta 1 pavydžio 1.3 skyriuje. Gauti rezultatai patvirtina galimybę visiškai ar dalinai blokuoti nepageidaujamą fermentų veiklą
P. chrysogenum, naudojant antisensines konstrukcijas, naudojant Pgdh.
P. chrysogenum hex genas buvo identifikuotas 3,2 kb Sacl fragmente ir
3.1 kb Sa/I fragmente. DNR srities, turinčios hex geną, restrikcijos diagrama parodyta fig.2. Tuomet buvo nustatyta 5240 nukleotidų seka (SEQ ID No:2), patvirtinanti dviejų ORF su ryškiai išreikštu preferencinio kodono naudojimo pavyzdžiu egzistavimą, vienas iš jų atitiko hex geną. Hex geno ATG transliacijos inicijavimo kodonas buvo aptiktas 1324 pozicijoje, o TGA terminacijos kodonas -3112 pozicijoje. Šis ORF neturi intronų ir koduoja 66545 Da baltymą, turintį izoelektrinį tašką 5,34, kurio 596 amino rūgščių seka (SEQ ID No:6) turi 49,0% identiškumą su Candida albicans fermento β-Ν-acetilheksozaminidazės aminorūgščių seka. Be to, nustatytoji amino rūgščių seka turi polipeptidus, nustatytus chemiškai iš išgryninto fermento 19-40 ir 99-120 pozicijose. Promotoriaus srityje aptiktos dvi pirimidinu praturtintos zonos, numanoma TATA seka ir CAAT seka. Tuomet šis promotorius buvo naudojamas ekspresuoti S. hindustanus bleR geną P. chrysogenum. Šiuo tikslu, kaip aprašyta 2 pavyzdyje, buvo sukurta plazmidė pALP480 (fig.6). Iš gautų rezultatų padaryta išvada, kad hex promotorius (toliau vadinamas Phex) gali kontoliuoti heterologinio bleR geno ekspresiją P. chrysogenum grybelyje. Be to, faktas, kad fermentas β-Νacetilheksozaminidazė yra baltymas, gausiai sekretuotas P. chrysogenum j kultūrinę terpę, leidžia panaudoti hex geną homologinių ar heterologinių baltymų ekspresijai ir sekrecijai P. chrysogenum ar gimininguose grybuose. Ekspresuojami genai gali būti sulieti su promotoriaus sritimi, turinčia hex geno sekrecijos signalo seką tuo pačiu skaitymo rėmeliu, ar dar jie gali būti sulieti su pilnu hex genu.
P. chrysogenum act genas (toliau vadinamas actPc) buvo identifikuotas
5.2 kb BamHI, 4,9 kb EcoRI ir 5,9 kb Hind\\\ fragmentuose. DNR srities, turinčios actPc geną, restrikcijos diagrama parodyta fig.3. Turint nustatytą 2994 nukleotidų seką (SEQ ID No:3), buvo patvirtintas ORF su ryškiai išreikštu preferencinio kodono naudojimo pavyzdžiu egzistavimas. ATG transliacijos inicijavimo kodonas buvo aptiktas 494 pozicijoje, o TAA beprasmis kodonas 2250 pozicijoje. Šis ORF turi 5 intronus ir koduoja 41760 Da baltymą, turintį izoelektrinį tašką 5,51, kurio 375 aminorūgščių seka (SEQ ID No:7) turi 98,1% identiškumą su A. nidulans γ-aktino baltymo aminorūgščių seka. Promotoriaus srityje aptiktos dvi pirimidimu praturtintos zonos, numanoma TATA seka ir keturios CAAT sekos. Tuomet šis promotorius buvo naudojamas ekspresuoti S. hindustanus grybo bleR geną P. chrysogenum grybe. Šiuo tikslu, kaip aprašyta 3 pavyzdyje, buvo sukurta plazmidė pALPfleol (fig.6). Iš gautų rezultatų padaryta išvada, kad P. chrysogenum act promotorius (toliau vadinamas PactPc) gali valdyti heterologinio bleR geno ekspresiją P. chrysogenum .
A. chrysogenum act genas (toliau vadinamas actAc) buvo identifikuotas 2,4 ir 1,1 kb Sa/I fragmentuose, 3,9 kb Smal fragmente ir 8,7 kb Hind\\\ fragmente. DNR srities, turinčios actAc geną, restrikcijos diagrama parodyta fig.4. Nustatyta 3240 nukleotidų seka (SEQ ID No:4) patvirtino ORF su ryškiai išreikštu preferencinio kodono naudojimo pavyzdžiu egzistavimą. ATG transliacijos inicijavimo kodonas buvo aptiktas 787 pozicijoje, o TAA terminacijos kodonas - 2478 pozicijoje. Šis ORF turi 5 intronus ir koduoja 41612 Da baltymą, turintį izoelektrinį tašką 5,51, kurio 375 amino rūgščiųseka (SEQ ID No:8) turi 98,4% ir 98,1% identiškumą su aminorūgščių sekomis, atitinkančiomis A. nidulans ir P. chrysogenum grybų γ-aktino baltymus. Promotoriaus srityje aptiktos pirimidimu praturtintos zonos ir CAAT seka, tačiau TATA sekos egzistavimas nenustatytas. Tuomet šis promotorius buvo naudojamas ekspresuoti S. hindustanus bleR geną A. chrysogenum. Šiuo tikslu, kaip aprašyta 4 pavyzdyje, buvo sukurta plazmidė pALCfleol (fig.6). Iš gautų rezultatų padaryta išvada, kad A. chrysogenum act promotorius (toliau vadinamas PactAc) gali kontroliuti heterologinio bleR geno ekspresiją A. chrysogenum .
Visais atvejais heterologinio geno ekspresija P. chrysogenum ar A. chrysogenum, reguliuojant grybų promotoriui, buvo pasiekta, suliejant šj geną teisingame skaitymo rėmelyje. Nors lacZ ir bleR genai buvo ekspresuoti kaip pavyzdžiai, panašiu būdu būtų įmanoma ekspresuoti genus, kurie koduoja fermentus, dalyvaujančius penicilino biosintezėje: pcbAB (aaminoadipilcisteinilvalino sintetazė), pcbC (izopenicilino N sintetazė), penDE (acil-CoA:6-APA aciltransferazė), pcl (fenilacetil-CoA ligazė) ir t.t; ar cefalosporino biosintezėje: pcbAB (α-aminoadipilcisteinilvalino sintetazė), pcbC (izopenicilino N sintetazė), cefD (izopenicilino N izomerazė), cefEF (deacetoksicefalosporino C sintazė/hidroksilazė), cefG (deacetoksicefalosporino
C acetiltransferazė) ir t.t. Ekspresuojamas genas gali būti gautas įvairiais būdais: išskirtas iš chromosominės DNR, cDNR sintezuota iš mRNR, sintezuotas chemiškai ir t.t. Pagrindiniai teisingo promotoriaus-geno suliejimo procesai yra aprašyti Sambrook, J. ei ai. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, ir Ausubel et ai. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA.
P. chrysogenum ir A. chrysogenum buvo panaudoti kaip šeimininko kamienai, tačiau gali būti panaudotas bet koks giminingas ar išvestas iš jų kamienas. Būdas, naudojamas protoplastų gavimui ir P. chrysogenum transformacijai, pagrįstas Contoral et ai. 1987 m., (Biotechnology 5: 494-497) ir Diez et ai. 1987 m. (Curr. Genei. 12: 277-282) ir aprašytas 1 pavyzdyje. Protoplastų gavimas ir A. chrysogenum transformacija aprašyti 4 pavyzdyje. Abiem atvejais selektyvia žyme buvo naudojamas antibiotikas fleomicinas, ir plazmidės pALfleo7, pALP480, pALPfleol ar pALCfleol, turinčios bleR geną, ekspresuojamą, atitinkamai reguliuojant, Pgdh, Phex, PactPc ir PacfAc. Tačiau būtų galima panaudoti bet kurią žymę, kuri galėtų selektyviai atskirti transformanto kamienus nuo kitų.
Transformantas gali būti užaugintas kultūrinėje terpėje, turinčioje anglies ir azoto šaltinių, kurie gali būti asimiliuoti. Anglies šaltiniais galėtų būti gliukozė, sacharozė, laktozė, krakmolas, glicerinas, organinės rūgštys, alkoholiai, riebalų rūgštys ir t.t., naudojamos pavieniui ar derinyje. Azoto šaltiniais galėtų būti peptonas, salyklo ekstraktas, mielių ekstraktas, kukurūzų mirkymo skystis, glitimas, karbamidas, amonio druskos, nitratai, NZ-aminai, amonio sulfatas ir t.t., naudojami pavieniui ar derinyje. Neorganinės druskos, kurios gali būti naudojamos kaip kultūrinės terpės komponentai, yra fosfatai (pavyzdžiui, kalio fosfatas), sulfatai (pavyzdžiui, natrio sulfatas), chloridai (pavyzdžiui, magnio chloridas) ir t.t., o geležis, magnis, kalcis, manganas, kobaltas ir t.t. gali būti naudojami kaip jonai. Kultivavimo sąlygos, tokios, kaip inkubacijos temperatūra, kultūrinės terpės pH, aeracija, inkubacijos laikas ir t.t. gali būti pasirinktos ir priderintos prie naudojamų kamienų. Tačiau, kalbant apskritai, fermentacija vykdoma nuo 4 iki 14 dienų anaerobinėmis sąlygomis, esant temperatūrai tarp 20°C ir 30°C, o pH tarp 5 ir 9.
Apibendrinant, galima pasakyti, kad šis išradimas apima: (I) DNR fragmentus, kurie turi P. chrysogenum gdh, hex ir act genų ir A chrysogenum act geno promotorius, (II) plazmides, turinčias savo sudėtyje aukščiau minėtus promotorius kartu su jų transliacijos inicijavimo vieta, (III) plazmides, kuriose yra jklonuotas homologinis ar heterologinis struktūrinis genas ar antisensinis DNR fragmentas, reguliuojamas šiais promotoriais, (IV) P. chrysogenum ar A chrysogenum kamienai, turintys šias plazmides, (V) transformantų kamienus, galinčius ekspresuoti plazmidėje esantį struktūrinj geną ar antisensinę DNR, reguliuojamą promotoriumi, ir (VI) transformantų kamienus, galinčius išskirti homologinius ar heterologinius ekstraląstelinius baltymus, reguliuojamus Phex.
Sekantys pavyzdžiai aprašo išradimą išsamiau, neapribojant jo apimties.
PAVYZDYS
1.1. P. chrysogenum grybo gdh geno klonavimas ir apibūdinimas
Siekiant klonuoti P. chrysogenum grybo gdh geną, fago vektoriuje XGEM12, naudojant nustatytas procedūras, buvo sukurta DNR sekų biblioteka (Sambrook, J. et ai. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Visa grybo DNR (išgryninta Barredo et ai. (1994) Ispanijos, patente P9400934 aprašytuoju būdu) buvo dalinai surestriktuota Sau3A\, ir maždaug 20 kb fragmentai buvo išgryninti sacharozės gradiente (10-40%). Šie fragmentai buvo suliguoti su vektoriumi, kuris buvo prieš tai suskaidytas su BamHI ir išgrynintas, ir tuomet ligavimo mišinys buvo supokuota's in vitro pagal gamintojo instrukcijas, naudojant Gigapack II Gold (Stratagene) sistemą. Supokavimo reakcijos mišinys iš naujo suspenduotas 500 μΙ SM, buvo naudojamas infekuoti E. coli LE392, siekiant titruoti esančių fagų skaičių, ir E. coli NM539 , siekiant nustatyti rekombinantinių fagų procentinį kiekį. E. coli NM539 yra fago P2 lizogeninis štamas ir sukelia tik ližę, kuomet fagas, kuris infekuoja jj, neturi neesminės centrinės srities. Nustatyta, kad fago titras yra E. coli LE392 yra 132 rorornų toro·· j/μΙ (iš viso 66000 ro;roro. d? ·· ,,), o E. coli NM539 - 113 iagoų caroiro /μϊ (iš viso - 56000 . dalelių). Tai reiškė, kad maždaug 85% fagų nešė egzogeninj DNR jtarpą. Būtinų sudaryti užbaigtą DNR sekų biblioteką rekombinantinių fagų skaičius buvo apskaičiuotas pagal lygtį: N=ln(1 -p)/ln(1-f), kur “p” yra pageidaujama tikimybė, “f” - atrenkamo organizmo, esančio rekombinante, genomo proporcija ir “N yra reikalingų rekombinanų skaičius, įvertinant tai, kad P. chrysogenum genomas yra maždaug 30000 kb (Fierro et ai. (1993), Mol. Gen. Genet. 241: 573-578) ir kad supokuotų jtarpų vidurkis yra 18 kb (nepaisant to fakto, kad buvo parinkti maždaug 20 kb dydžiai), buvo gauta P. chrysogenum DNR sekų biblioteka su 99,999% tikimybe gauti rekombinantinius fagus. Po to buvo atlikta eilė teorinių patikrinimų, E. coli NM539 buvo infekuotos, ir visa DNR sekų biblioteka buvo išsėta ant penkių 150 mm skersmens Petri lėkštelių (maždaug 11300 faginių dalelių/Petri lėkštelėje),-surinkta j 50 ml SM, plius 2,5 ml chloroformo ir laikoma 4°C temperatūroje. Tokiu būdu buvo gautas pakankamas ir tipinis paruoštų išsėti bet kuriuo metu rekombinantinių fagų tūris (5300 faginių dalelių/μΙ).
Apie 60000 faginių dalelių buvo paskleista ant trijų 150 mm skersmens Petri lėkštelių ir tuomet perkelta ant nitroceliuliozės filtrų (BA85, 0.45 pm, Schleicher & Schuell). Šie filtrai buvo hibridizuoti, naudojant standartines metodikas (Sambrook, J. et ai. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA), su sintetiniais oligonukleotidais, atitinkančiais N. crassa gdh geną. Antrojo ir trečiojo hibridizavimo ciklų metu buvo išvalyta iš viso 10 teigiamų klonų, ir jų DNR buvo veikiama eile restriktazių ir analizuota Southern blot būdu. Šiuo būdu buvo identifikuotas gdh genas 7,2 kb EcoRI fragmente ir atitinkamai dviejuose 2,9 ir 1,5 kb BamHI fragmentuose. Po to, kai buvo atliktas atitinkamas subklonavimas pBluescript I KS(+) (Stratagene) ir pUC13 plazmidėse, buvo sukurtos plazmidės pALP784 ir pALP785, kurios turi abi 2,9 kb Sau3M-Xba\ fragmento su gdh genu skirtingas orientacijas. DNR srities, turinčios šj geną, restrikcijos diagrama parodyta fig.1.
Siekiant nustatyti gdh geno nukleotidų seką, iš plazmidžių pALP784 ir pALP785 “Erase a base” būdu (Promega) buvo sukonstruota serija klonų ir sekvenuoti didezoksinukleotidų metodu, naudojant “Seguenase bandymų rinkinį (USB); abiem atvejais tai buvo atlikta pagal gamintojo instrukcijas. Gautoji 2816 nukleotidų seka (SEQ ID Νο.Ί) buvo analizuota pagal Geneplot programą (DNRSTAR), patvirtinant ORF su ryškiai išreikštu preferencinio kodono naudojimo pavyzdžiu egzistavimą. ATG transliacijos inicijavimo kodonas buvo aptiktas 922 pozicijoje, ir TAA beprasmis kodonas - 2522 pozicijoje. Taip pat buvo aptikti du 159 bp ir 56 bp intronai atitinkamai pozicijose tarp 971-1130 ir 1262-1318. Šis ORF koduoja 49837 Da baltymą, turintį izoelektrinį tašką 6,18, kurio 461 aminorūgšties seka (SEQ ID No:5) turi 72,4% identiškumą su N. crassa fermento NADP priklausančios giutamato dehidrogenazės aminorūgščių seka.
Promotoriaus srityje aptinkamos įvairios pirimidinu praturtintos zonos, nors esančioji tarp 766-796 pozicijų yra labiausiai ekstensyvi. Šios zonos aptinkamos labai ekspresuotuose genuose ir yra išdėstytos betarpiškai prieš transkripcijos inicijavimo vietą. Be to, čia yra dvi numanomos TATA sekos (konservatyvi seka grybuose yra TATAAA) pozicijose tarp 752 (TATATAAAT) ir 852 (TATAATTT). Šios TATA sekos aptinkamos grybuose nuo 30 iki 50 bp prieš transkripcijos inicijavimo vietą, todėl labai tikėtina, kad autentiška TATA seka yra išdėstytoji 752 pozicijoje, t.y. 42 bp prieš transkripcijos inicijavimo vietą. Maždaug 30% žinomų eukariotinių genų promotoriaus srityje turi CCAAT seką, išdėstytą tarp 50 ir 200 bp prieš transkripcijos inicijavimo vietą. CCAAT seka yra gdh geno promotoriaus srities 691 pozicijoje, t.y. apie 105 bp prieš tikėtiną transkripcijos inicijavimo vietą.
1.2. P. chrysogenum ir A. chrysogenum kontrolinių genų ekspresija gdh promotoriumi.
P. chrysogenum ir A. chrysogenum transformacijos ir transformantų selekcijos procesas buvo atliktas, kaip aprašyta žemiau, priklausomai nuo jų atsparumo antibiotikui fleomicinui. Šiam tikslui buvo būtina sukonstruoti plazmidę pALfleo7, kurios dydis 5,4 kb ir kuri turi S. hindustanus bleR geną, ekspresuojamą nuo Pgdh, kuris yra kaip žymė grybams, chloramfenikolo atsparumo geną kaip žymę E. coli ir plazmidės pBC KS (+) poliiinkerį (Stratagene) .
Nežymiai modifikuota protoplastų gamybos ir P. chrysogenum transformacijos procedūra aprašyta Cantoral et ai. 1987 m. (Biotechnology 5: 494-497) ir Diez et ai. 1987 m. (Curr. Genet. 12: 277-282). Pirmiausia, P. chrysogenum buvo užaugintas PM apibrėžtoje terpėje (Anne, J., (1997), Agricultura 25), pridėjus 10% mielių ekstrakto ir inkubuojant 18-21 vai. 25°C temperatūroje, ir micelis buvo regeneruotas, perfiltruojant per neilono filtrą ir perplaunant 3-5 tūriais 0,9% NaCl. Išdžiovinus tarp popieriaus filtro, jis buvo iš naujo suspenduotas (100mg/ml) protoplastų buferyje. Kuomet micelio suspensija tapo homogeninė, j protoplastų buferį buvo pridėta Caylasa tirpalo (Cayla) (tūrinis santykis - 4 mg/ml) ir inkubuota 3 vai. 25°C temperatūroje, maišant 100 aps/min greičiu. Protoplastų pasirodymas buvo stebimas mikroskopu. Kuomet daugelis iš jų išsilaisvino, jie buvo atskirti nuo micelio, perfiltruojant per neilono filtrą, kurio porų dydis 30 ųm. Protoplastų suspensija buvo perplauta tris kartus 0,7 M KCI tirpalu, centrifuguojant 400 x g tris minutes tarp perplovimų. Nusėdę protoplastai buvo iš naujo suspenduoti 10 ml KCM tirpalo ir, įvertinus jų koncentraciją Thoma kameroje, buvo praskiesta KMC iki 15x108 protoplastų/ml. Po to 100 μΙ šio tirpalo buvo kruopščiai sumaišyta su 1-10 ųg DNR plius 10 μΙ PCM, ir mišinys buvo inkubuotas atšaldytoje vandens vonioje 20 min. Vėliau buvo pridėta 500 ml PCM, ir mišinys buvo inkubuojamas kambario temperatūroje 20 min, po to buvo pridėta 600 μΙ KCM. Transformantai buvo atrinkti pagal gebą augti terpėje su 30 ųg/ml fleomicino, suteiktą fleomicino atsparumo geno, esančio pALfleo7, pALP480 ir pALPfleol plazmidėse. Šiuo tikslu 200 μΙ transformacijos reakcijos mišinio buvo sumaišyta su 5 ml Czapek terpės, pridedant sorbitolio (1 M) ir fleomicino (30 ųg/ml), ir tuomet tai buvo išsėta ant Petri lėkštelių su 5 ml tos pačios terpės. Lėkštelės buvo inkubuotos 25°C temperatūroje iki pasirodant transformantams (4-8 dienas).
Protoplastų gamybos ir A. chrysogenum transformacijos procedūra aprašyta Gutierrez ei ai. (1991), Mol. Gen. Genet. 225: 56-64. Pirmiausia, A. chrysogenum kamienas buvo auginamas MMC apibrėžtoje terpėje 20-24 vai. 28°C temperatūroje, ir micelis buvo regeneruotas, perfiltruojant per neilono filtrą ir perplaunant 3-5 tūriais 0,9% NaCl. Išdžiovinus jj tarp filtro popieriaus, jis buvo iš naujo suspenduotas (50 mg/ml) protoplastų buferyje. Kuomet micelio suspensija tapo homogeninė, į ją buvo pridėta DTT iki 10 mM galutinės koncentracijos ir inkubuota 1 vai. 28°C temperatūroje, maišant 150 aps/min greičiu. Po to ji buvo centrifuguota 12000xg 15 min. ir nuosėdos buvo iš naujo suspenduotos 30 ml protoplastų buferio. Vėliau j protoplastų buferj buvo pridėta Caylasa tirpalo (Cayla) (tūrinis santykis - 4 mg/ml) ir jis buvo inkubuotas 3 vai. 25°C temperatūroje, maišant 100 aps/min greičiu. Protoplastų pasirodymas buvo stebimas mikroskopu. Kuomet daugelis iš jų išlaisvino, jie buvo atskirti nuo micelio, perfiltruojant per neilono filtrą, kurio porų dydis 25 μιτι. Protoplastų suspensija buvo perplauta tris kartus 0,7 M KCI tirpalu, centrifuguojant 1000xg tris minutes tarp perplovimų. Nusėdę protoplastai buvo iš naujo suspenduoti 10 ml NCM buferio ir įvertinus jų koncentraciją Thoma kameroje, buvo praskiesta KMC iki 1-5x108 protoplastų/ml. Po to 100 μΙ šio tirpalo buvo kruopščiai sumaišyta su 1-10 μς DNR ir mišinys buvo laikomas atšaldytoje vandens vonioje 20 min. Vėliau buvo pridėta 1 ml CCM, ir mišinys buvo inkubuotas kambario temperatūroje 20 min. Mišinys buvo centrifuguotas 1,000xg 5 minutes, ir nuosėdos buvo iš naujo suspenduotos 800 μΙ NCM buferio. Transformantai buvo atrinkti pagal gebą augti terpėje su 10 gg/ml fleomicino, suteiktą fleomicino atsparumo geno, esančio pALfleo7 ir pALCfleol plazmidėse. Šiuo tikslu 200 μΙ transformacijos reakcijos mišinio buvo sumaišyta su 5 ml TSA terpės, pridedant sacharozės (0,3 M) ir fleomicino (10 μg/ml), ir tuomet tai buvo išsėta ant Petri lėkštelių su 5 ml tos pačios terpės. Lėkštelės buvo inkubuotos 28°C temperatūroje iki pasirodant transformantams (5-8 dienas).
Gauti transformantai buvo analizuoti, siekiant nustatyti (I) DNR, atitinkančios transformacijoje naudotą plazmidę, buvimą, (II) transkripto, atitinkančio kontrolinį geną, egzistavimą ir (III) fermentinį aktyvumą, gautą ekspresuojant geną. Visa DNR buvo gauta pagal sąlygas, aprašytas Barredo et ai. 1994 m. (Ispanijos patentas P9400931), ir tuomet ji buvo analizuota Southern blot būdu, aprašytu Sambrook et ai. 1989 m. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Visa totalinė RNR buvo išgryninta aprašytuoju Ausubel et ai. 1987 m. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA) būdu. Gautoji RNR buvo laikoma išsodinta etanolyje -20°C temperatūroje. Norint ją panaudoti, ji buvo regeneruota, centrifuguojant 10000xg 4°C temperatūroje 20 min. RNR molekulių atskyrimas pagal jų molekulių dydį buvo atliktas agarozėsformaldehido elektroforeze. Po to DNR buvo perkelta ant nitroceliuliozės filtro ir hibridizuota su pageidaujamu mėginiu, visa tai atliekant Sambrook ei ai. 1989 m. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) aprašytuoju būdu. Hibridizavimo juostų atsiradimas parodė transkriptų egzistavimą ir, tuo būdu, gebą ekspresuoti bakterinį geną grybe-šeimininke: P. chrysogenum ar A chrysogenum. Fermentinis β-galaktozidazės aktyvumas transformantuose buvo įvertintas Sambrook etai. 1989 m. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) aprašytuoju būdu. Fleomicino atsparumo geno ekspresija buvo įvertinta pagal atsparumo lygj, suteiktą P. chrysogenum ar A. chrysogenum Czapek kietojoje terpėje po 7 dienų inkubavimo 25°C temperatūroje.
1.2.1. E. coli lacZ geno ekspresija P. chrysogenum ir E. coli, reguliuojant Pgdh.
E. coli lacZ genas buvo sulietas transliaciškai su Pgdh, siekiant ekspresuoti jį P. chrysogenum. Tuo tikslu lacZ genas buvo subklonuotas j pML1 plazmidės (Carramolino etai. 1989, Gene 77: 31-38) EcoRI ir Sa/I kirpimo vietas sukuriant, plazmidę pMLac. Po to Pgdh buvo įklonuotas tarp pMLac EcoRI ir SmaI kirpimo vietų, sukuriant plazmidę pSKG (fig.5). Galiausiai, sulfonamido atsparumo genas (Carramolino et ai. 1989, Gene 77: 31-38) buvo įklonuotas j plazmidės ties pSKG EcoRI kirpimo vieta, sukuriant plazmidę pSKGSu (fig.5). P. chrysogenum transformantuose su plazmidė pSKGSu, atrinktuose pagal jų sulfonamidinį atsparumą, buvo atliktos analizės plazmidės buvimui nustatyti Southern blot būdu ir transkripto, atitinkančio lacZ geną, egzistavimui nustatyti Northern blot būdu. Tuomet buvo išmatuotas fermentinis β-galaktozidazės aktyvumas transformantuose, kurie buvo pozityvūs dviejose ankstesnėse analizėse. Transformantai efektyviai ekspresavo E. coli lacZ geną, ir buvo pastebėta, kad β-galaktozidazės aktyvumo lygiai buvo aukštesni tuose transformantuose, kurie turėjo plazmidės, integruotos į jų genomą, kopiją, nei pavieniuose transformantuose, kurie ekspresavo lacZ geną, reguliuojamą triptofano C geno promotoriumi (trpC).
Plazmidė pSKG buvo įterpta į E. coli DH5a (Δ/acZ), siekiant išsiaiškinti ar P. chrysogenum grybo Pgdh taip pat galėjo reguliuoti lacZ geno ekspresiją E. coli. Gautieji transformantai pasižymėjo geba generuoti mėlynąsias kolonijas po dešimties dienų inkubavimo 25°C temperatūroje LB terpėje, į kurią buvo pridėta izopropil-p-galaktozidazės (IPTG) ir 5-brom-4-chlor-3-indolil-3-D-galaktozidazės (X-gal). Šis rezultatas patvirtino, kad Pgdh-lacZ darinys ekspresuoja βgalaktozidazės fermentinį aktyvumą E. coli, nors ne taip efektyviai kaip endogeninis E. coli lacZ genas.
1.2.2. S. hindustanus bleR geno ekspresija P. chrisogenum ir A. chrisogenum, reguliuojant Pgdh.
BlęR genas be jo promotoriaus srities buvo gautas iš plazmidės pUT737 (Millaney ei ai. (1985), Mol. Gen. Genet. 199; 37-45) kaip 1100 bp Nco\-Apa\ fragmentas. Po to šis fragmentas buvo subklonuotas į plazmidę pUT713 (prieš tai ją paveikus su Nco\-Apa\) gaunant plazmidę pALfleoS. Pgdh buvo iškirptas iš pALP25 kaip 726 bp BcoRI-BamHI fragmentas, kuris po to buvo subklonuotas į plazmidę pALfleo5 (prieš tai ją paveikus su BcoRI-fiamHI), siekiant sukurti pALfleo6. Šios pastarosios plazmidės dydis yra 4,2 kb, ji turi bleR geną, ekspresuojamą, reguliuojant Pgdh, ir ampicilino atsparumo geną kaip žymę E. coli. Siekiant pakeisti pastarąją žymę chloramfenikolio atsparumo genu, 1900 bp EcoP\-Not\ fragmentas, turintis Pgdh, bleR ir trpC geno terminatorių (TfrpC), buvo išskirtas iš pALfleo6 ir su plazmidę pBC KS (+) (Stratagene), paveikta su 5coRI-/Vofl. Taip buvo sukurta plazmidė pALfleo7 (fig.5), kurios dydis yra 5,4 kb ir kuri turi S. hindustanus bleR geną, reguliuojamą Pgdh, kaip grybų selekcijos žymę, chloramfenikolo atsparumo geną kaip E.coli selekcijos žymę ir plazmidės pBC KS (+) polilinkerį. Nukleotidų sekos nustatymas suliejimo srityje tarp Pgdh ir bleR patvirtino pastarojo geno išsidėstymą teisingame skaitymo rėmelyje.
P. chrysogenum ir A. chrysogenum transformacijos buvo atliktos plazmidė pALfleo7, transformantai buvo atrinkti pagal jų atsparumą atitinkamai gg/ml ir 10 ųg/ml koncentracijos fleomicinui. Po to maksimalus transformantų fieomicino atsparumo lygis buvo nustatytas kietoje terpėje. Kai kurie iš jų pasižymėjo geba augti didesnėje nei 100 pg/ml fieomicino aplinkoje. Transformantai, parinkti pagal jų atsparumą fleomicinui, buvo analizuoti, siekiant nustatyti plazmidės buvimą Southern blot būdu ir transcripto, atitinkančio bleR geną, egzistavimą - Nothern blot būdu; abiem atvejais gauti teigiami rezultatai. Šie rezultatai patvirtino galimybę ekspresuoti heterologinius genus P. chrysogenum ir A. chrysogenum grybuose, reguliuojant Pgdh.
Plazmidė pALfleoZ buvo įterpta į E. coli, siekiant sužinoti ar P. chrysogenum grybo Pgdh taip pat gali reguliuoti bleR geno ekspresiją E. coli. Gautieji transformantai pasižymėjo geba augti LB, turinčioje 0,2 pg/ml fieomicino, tuo tarpu kai maksimali fieomicino slopinimo koncentracijai E. coli yra mažiau kaip 0,025 pg/ml. Šis rezultatas patvirtino, kad Pgdh buvo ekspresuotas E. coli, nors ne taip efektyviai kaip P. chrysogenum. Transformantas E. coli DH5a su plazmidė pALfleo7 buvo patalpintas j Spanish Collection of Type Cultures (CECT) su registracijos numeriu CECT4849. Kitos plazmidės, tokios, kaip pALP784 ir pALP785, gali būti gautos iš deponuotos plazmidės paprasčiausiai pasirenkant 2,9 kb Sau3AI-Xbal fragmentą, hibridizuojant su gdh geno promotoriumi, esančiu pALfleoZ sudėtyje, ir subklonuojant jį atitinkamai pBluescript I KS (+) ar pUC13.
1.3. Antisensinė ekspresija P. chrysogenum ir A. chrysogenum reguliuojama gdh promotoriumi.
Genų ekspresijos inaktyvinimas pramoniniuose kamienuose kartais yra reikalingas, siekiant eliminuoti nepageidaujamus fermentų poveikius. Kadangi dėl daugelio pramoninių kamienų chromosomų pasikartojimo laipsnio ploidiškumo lygio labai dažnai yra sunku blokuoti ekspresiją tiesioginiu genų suskaldymu ir tenka naudoti sistemas ekspresijos inaktyvinimui, kurios yra nepriklausomos nuo chromosomų pasikartojimo laipsnio lygio. Sukūrus antisensines konstrukcijas, ekspresuotas reguliuojant stipriems promotoriams, tapo įmanoma nutraukti genų ekspresiją.
Žemiau aprašytas Pgdh panaudojimo inaktyvuoti ekspresiją geno, kuris koduoja P. chrysogenum fenilacetato-2-hidroksilazės (pahA), ekspresiją pavyzdys. Pirmiausia, buvo sukurta plazmidė pALP, turinti Pgdh ir TtrpC, sulietus per vieną BamHI kirpimo vietą. Plazmidė pALP873 buvo paveikta su BamHI, jos galai buvo užpildyti DNR polimerazės I Klenow fragmentu, ir ji buvo suliguota su 1053 bp pahA geno cDNR fragmentu, gautu iš plazmidės pALP555 veikiant ją BcoRV. Gautoji plazmidė, pavadinta pALP874, buvo atrinkta, nes ji turėjo antisensinj pahA geno fragmentą, giminingą Pgdh. Iš .šios plazmidės buvo išskirtas 2,5 kb BcoRI-Xbal fragmentas, turintis antisensinę kasetę, užpildytą veikiant Klenow fragmentu ir subklonuotą j plazmidės pALfleo7 BcoRV kirpimo vietą, sukuriant plazmidę pALP888. Pastaroji plazmidė pasižymi tuo, kad jos dydis yra 7,9 kb ir ji turi (I) pahA geno, reguliuojamo Pgdhl, antisensinę kasetę, (II) bleR geną kaip selekcijos žymę grybuose, (III) chloramfenikolo atsparumo geną kaip žymę E. coli, ir (IV) plazmidės pBC KS (+) polilinkerj.
Buvo vykdoma P. chrysogenum transformacija plazmidė pALP888, ir transformantai atrenkami pagal jų atsparumą 30 ųg/ml koncentracijos fleomicinui. Maždaug 20% atrinktų transformantų pasižymėjo mažesne fenilacto rūgšties oksidavimo geba, kai kurie iš jų neturėjo šio aktyvumo aptinkamų lygių. Šie transformantai buvo analizuoti, siekiant nustatyti plazmidės buvimą Southern blot būdu ir antisensinio transkripto, atitinkančio pahA geną, egzistavimą Nothern blot būdu, naudojant oligonukleoditą, atitinkantį koduojančią grandinę, kaip mėginį. Abiem atvejais gauti teigiami rezultatai, patvirtinantys galimybę visiškai ar dalinai blokuoti nepageidaujamą fermentų aktyvumą P. chrysogenum, naudojant antisensines konstrukcijas. Šie rezultatai gali būti ekstrapoliuoti pritaikyti giminingiems filamentiniams grybams ir bet kokiam fermentų aktyvumui, naudojant bet kurį promotorių, aprašytą šiame išradime (Pgdh, Phex, PactPc ir PacfAc), ar bet kurį kitą turimą promotorių.
PAVYZDYS
2.1. P. chrysogenum hex geno klonavimas ir apibūdinimas.
P. chrysogenum gautame pramoninės fermentacijos metu gaminant peniciliną G, buvo aptiktas pagrindinis baltymas, kuris po išgryninimo ir apibūdinimo pasirodė esąs fermentas β-Ν-acetilheksozaminidazė. Išgryninto baltymo amino galo aminorūgščių seka buvo nustatyta Edman skaidymo būdu, ir gautos dvi skirtingos sekos:
(A) Ala-Pro-Ser-Gly-lle-His-Asn-Val-Asp-Val-(His)-Val-Val-(Asp)-Asn-(Asp)-Ala(Asp)-Leu-Gln-Tyr-(Gly) (B) Val-Gln-Val-Asn-Pro-Leu-Pro-Ala-Pro-(Arg)-(Arg)-lle-(Thr)-???-(Gly)-(Ser)(Ser) - (G ly) - (Pro) - (IIe/Thr) -???- (Vai)
Pagal šias sekas ir įvertinant kodono naudojimo kryptį, kuri egzistuoja keliuose P. chrysogenum genuose, buvo suprojektuotos sekančios sintetinių oligonukleotidų kombinacijos:
(I) 5’ TCGACGACGTGSACGTCSACGTTGTGGATGCC 3’ (II) 5' CCGTAYTGSAGGTCRGCGTCGTTGTCGACGAC 3’ (III) 5’ GGGGCVGGSAGVGGGTTGACYTG 3’
P. chrysogenum grybo hex genas buvo klonuotas, naudojant DNR sekų biblioteką ir būdus, aprašytus 1 pavyzdyje. Buvo išgryninta iš viso 11 teigiamų klonų, jų DNR buvo paveikta keliomis restriktazėmis ir analizuota Southern blot būdu. Šiuo būdu hex genas buvo identifikuotas 3,2 kb Sacl ir 2,1 kb Sali fragmentuose. Sali fragmento subkionavimas pBC KS (+) plazmidėje abiejomis orientacijomis davė plazmidės pALP295 ir pALP303. DNR srities, turinčios hex geną, restrikcijos diagrama parodyta fig.2.
Siekiant nustatyti hex geno nukleotidų seką, buvo panaudotos aukščiau minėtos plazmidės pALP295 ir pALP303, o taip pat pALP319 ir pALP461 (abi 2,8 kb BamHI fragmento orientacijos), pALP388 ir pALP389 (abi 2,4 kb Sali fragmento orientacijos) bei pALP377 ir pALP378 (abi 1,2 kb Psfl fragmento orientacijos) (fig.2). Iš šių plazmidžių “Erase a base (Promega) būdu buvo sukonstruoti keli klonai ir sekvenuoti didezoksinukleotidų būdu, naudojant “Seąuenase” bandymų rinkinį (USB), abiem atvejais pagal gamintojo instrukcijas. Gautoji 5240 nukleotidų seka (SEQ ID No:2) buvo analizuota Geneplot programa (DNRSTAR), patvirtinant dviejų ORF su ryškiai išreikštu preferencinio kodono naudojimo pavyzdžiu egzistavimą. Hex geno ATG transliacijos inicijavimo kodonas buvo aptiktas 1324 pozicijoje, o TGA beprasmis kodonas - 3112 pozicijoje. Šis ORF neturi intronų ir koduoja 66545 Da baltymą, turintį izoelektrinj tašką 5,34) kurio 596 aminorūgščių seka (SEQ ID No:6) turi
49,0% identiškumą su Candida albicans fermento β-Ν-acetilheksozaminidazės aminorūgščių seka. Be to, 19-40 ir 99-120 pozicijose nustatyta aminorūgščių seka turi aminorūgščių sekas, nustatytas chemiškai iš išgryninto fermento. Proteazės atpažinimo vieta (Lys-Arg) atsiranda pozicijose, esančiose betarpiškai greta aukščiau aprašytos aminorūgščių sekos (A) (aminorūgštys 97-98).
Promotoriaus srityje tarp 1106-1128 ir 1182-1200 pozicijų aptinkamos dvi pirimidinu praturtintos zonos, numanoma TATA seka - 1258 (ATAAATA) pozicijoje ir C AAT seka - 1163 pozicijoje.
2.2. S. hindustanus bleR geno ekspresija P. chrysogenum, reguliuojama Phex.
(I) P. chrysogenum transformacijos ir transformantų atrinkimo, (II) DNR analizės, (III) RNR analizės ir (IV) fermentų matavimų procesai buvo atlikti, kaip aprašyta 1 pavyzdžio 1.2 skyriuje.
Siekiant ekspresuoti bleR geną, reguliuojamą Phex, pirmiausia buvo sukonstruota Nco\ kirpimo vieta prieš ATG kodoną, kuris koduoja hex geno inicijatorių metioniną. Tai buvo atlikta PRO dėka, naudojant sekančius oligonukleotidus kaip pradmenis:
5’ CTCCATGGTGATAAGGTGAGTGACGATG 3'
5’ GTAAAACGACGGCCAGTG 3’ (pradmuo-20)
PRC dėka gautasis DNR fragmentas buvo subklonuotas abiejose orientacijose plazmidės pBC KS (+) (Stratagenę) SmaI kirpimo vietoje, sukuriant pALP427 ir pALP428. Abiejų plazmidžių intarpai buvo sekvenuoti, naudojant bandymų rinkinius “Erase a base” (Promega) ir “Sequenase (USB), abiem atvejais pagal gamintojo instrukcijas. Tokiu būdu buvo parodyta, kad gautasis Phex neturėjo mutacijų ir turėjo Nčo\ kirpimo vietą prieš ATG, kuris koduoja baltymo iniciatorių metioniną.
Plazmidė pALP427 buvo pasirinkta bleR geno subklonavimui atlikti. bleR genas be promotoriaus srities buvo gautas iš plazmidės pUT737 (Mullaney et ai.
(1985), Mol. Gen. Genet. 199: 37-45) kaip 1100 bp Nco\-Apal fragmentas. Po to šis fragmentas buvo subklonuotas plazmidėje pALP427 (turinčioje Phex), prieš tai sukarpytoje su Nco\-Apa\, gaunant plazmidę pALP480 (fig.6). Šios pastarosios plazmidės dydis yra 5,4 kb, ji turėjo bleR geną, ekspresuojamą, reguliuojant Phex, trpC geno terminatorių už bleR geno, chloramfenikolio atsparumo geną kaip žymę E. coli ir plazmidės pBC KS (+) polilinkerj. Nukleotidų sekos nustatymas suliejimo srityje tarp Phex ir bleR patvirtino pastarojo geno išsidėstymą teisingame skaitymo rėmelyje.
P. chrysogenum transformacijos buvo atliktos plazmidė pALP480, atrenkant transformantus pagal jų atsparumą 30 ųg/ml koncentracijos fleomicinui. Po to maksimalus transformantų fleomicino atsparumo lygis buvo nustatytas kietoje terpėje, kai kurie iš jų pasižymėjo geba augti, esant didesnei nei 100 ųg/ml fleomicino koncentracijai. Transformantai, atrinkti pagal jų fleomicino atsparumą, buvo analizuoti Southern blot būdu, siekiant nustatyti plazmidės buvimą, ir Nothern blot būdu - siekiant nustatyti transkripto, atitinkančio bleR geną, egzistavimą; abiem atvejais gauti teigiami rezultatai. Šie rezultatai patvirtino heterologinių genų ekspresavimo P. chrysogenum galimybę, reguliuojant Phex. Transformantas E. coli DH5a su plazmidė pALP480 buvo deponuotas Spanish Collection of Type Cultures (CECT) su registracijos numeriu CECT4852. Plazmidės pALP295, pALP319, pALP377 ir pALP388 gali būti gautos iš deponuotos plazmidės tiesiog parenkant atitinkamai 2,1 kb Sa/I, 2,8 kb BamHI, 1,2 kb Psil ir 2,4 kb Sa/I DNR fragmentus, hibridizuojant su hex geno, esančio plazmidėje pALP480, promotoriumi ir po to subklonuojant juos pBluescript I KS (+).
2.3. P. chrysogenum ekstraląstelinė baltymų gamyba, naudojant hex geną.
Fermentas β-Ν-acetilheksozaminidazė yra baltymas, gausiai sekretuojamas P. chrysogenum j kultūrinę terpę pramoniniuose fermentatoriuose penicilino G gamybos metu. Šio fermento geba būti sekretuotam leidžia panaudoti hex geną homologinių ar heterologinių baltymų ekspresijai ir sekrecijai P. chrysogenum ar gimininguose filamentiniuose grybuose.
Fermentas turi sekrecijos signalo seką, sudarytą iš sekančių aminorūgščių: Met-Lys-Phe-Ala-Ser-Val-Leu-Asn-Val-Leu-Gly-Ala-Leu-Thr-AlaSer-Ala (SEQ ID No:6 aminorūgštys nuo 1 iki 18). Paprastai, signaliniai peptidai turi tris konservatyvius struktūrinius domenus (Takizavva, N. et ai. (1994)
Recombinant mikrobes for industrial and agricultural applications, Murooka, Y. and Imanaka, T. (eds), Marcei Dekker, Ine. New York): (I) teigiamai įkrautą amino galo sritį, vadinamą “n, kuri paprastai turi nuo 1 iki 5 liekanų ir yra reikalinga efektyviam baltymo pernešimui per membraną (Met-Lys), (II) hidrofobinę sritį, vadinamą “h”, sudarytą iš 7-15 liekanų (Phe-Ala-Ser-Val-LeuAsn-Val-Leu) ir (III) polinę sritį karboksilo gale, vadinamą “c, sudarytą iš 3-7 liekanų (Gly-Ala-Leu-Thr-Ala-Ala-Ser-Ala). Ląstelės viduje susintetintas prebaltymas subręsta, atskylant dviems bazinėms liekanoms (Lys-Arg, SEQ ID No:6 aminorūgštys 87 ir 98), gaunant subrendusį baltymą.
įmanomi du variantai baltymų ekspresijai ir sekrecijai pradėti, naudojant hex geną: (I) promotoriaus srities, turinčios sekrecijos signalo seką, suliejimas su ekspresuojamo geno kodavimo sritimi skaitymo rėmelyje, ir (II) pilno hex geno suliejimas su ekspresuojamo geno kodavimo sritimi skaitymo rėmelyje. Naudojant standartinius molekulinės biologijos metodus (Sambrook, J. et ai. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Colg Spring Harbor, New York, USA; Ausubel et ai. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA), bet kuris šios srities specialistas sugebėtų panaudoti promotorių, turintį hex geno ar kito užbaigto geno sekrecijos seką, baltymų ekspresijai ir sekrecijai P. chrysogenus ar gimininguose filamentiniuose grybuose.
PAVYZDYS
3.1. P. chrysogenum act geno klonavimas ir apibūdinimas.
P. chrysogenum act genas buvo klonuotas, naudojant DNR sekų biblioteką ir metodus, aprašytus 1 pavyzdyje. Šiuo atveju hibridizacija buvo atlikta su 888 bp Nco\-Cla\ fragmentu, kurio kilmės šaltinis yra A. nidulans grybo act genas (Fidel ei ai. (1988), Gene 70: 283-293). Iš viso buvo išgryninta 10 teigiamų klonų, jų DNR po to buvo suskaidyta keliomis restriktazėmis ir analizuota Southern blot būdu. Tokiu būdu 5,2 kb EamHI, 4,9 kb EcoRI ir 5,9 kb Hind\\\ fragmentuose buvo identifikuotas act genas. Hindttl fragmentas buvo subklonuotas abiejose orientacijose plazmidėje pBluescript I KS (+) (Stratagene), sukuriant plazmidės pALP298 ir pALP299. EcoRI fragmento subklonavimas abiejose orientacijose plazmidėje pBluescript I KS (+) (Stratagene) sukuria plazmides pALP315 ir pALP316. DNR srities, turinčios act geną, restrikcijos diagrama parodyta fig.3.
Siekiant nustatyti act geno nukleotidų seką, buvo panaudotos aukščiau minėtos plazmidės pALP315 ir pALP316. Iš šių plazmidžių buvo sukonstruoti keli klonai “Erase a base” (Promega) būdu ir tuomet sekvenuoti dideoksinukleotidų būdu, naudojant “Sequenase” bandymų rinkinį (USB), abiem atvejais pagal gamintojo instrukcijas. Gautoji 2994 nukleotidų seka (SEQ ID No:3) buvo analizuota pagal Geneplot programą (DNRSTAR), patvirtinant ORF su ryškiai išreikštu preferencinio kodono panaudojimo pavyzdžiu egzistavimą. Act geno ATG transliacijos inicijavimo kodonas buvo aptiktas 494 pozicijoje, o TAA beprasmis kodonas - 2250 pozicijoje. Šis ORF turi 5 intronus 501-616, 649-845, 905-1046, 1078-1180 ir 1953-2021 pozicijose ir koduoja 41760 Da baltymą, turintj izoelektrinj tašką 5,51, kurio 375 aminorūgščių seka (SEQ ID No:7) turi 98,1% identiškumą su A. nidulans γ-aktino baltymo aminorūgščių seka. Promotoriaus srityje tarp 356-404 ir 418-469 pozicijų aptiktos dvi ekstensyvios pirimidinu praturtintos zonos, 259 pozicijoje (TATAAAAAT) numanoma TATA seka ir keturios CAAT sekos 174, 217, 230 ir 337 pozicijose.
3.2. P. chrysogenum bleR geno ekspresija, reguliuojant PactPc.
Siekiant ekspresuoti b/eR geną, reguliuojamą PactPC, pirmiausia, prieš ATG kodono, kuris koduoja hex geno inicijatorių metioniną, buvo sukonstruota Ncol kirpimo vieta. Tai buvo atlikta PCR pagalba, naudojant sekančius oligonukleotidus kaip pradmenis:
5’ CTCCATGGTGACTGATTAAACAAGGGAC 3’
5' GTAAAACGACGGCCAGTG 3’ (pradmuo -20)
PRC pagalba gautasis DNR fragmentas buvo subklonuotas plazmidės pBC KS (+) (Stratagene) Smal kirpimo vietoje abiejose orientacijose, sukuriant pALPacfl ir pALPacf2. Abiejų plazmidžių intarpai buvo sekvenuoti, naudojant bandymų rinkinius “Erase a base” (Promega) ir “Sequenase (USB), abiem atvejais pagal gamintojo instrukcijas. Šiuo būdu buvo parodyta, kad gautoji
PactPc neturėjo mutacijų ir turėjo Nco\ kirpimo vietą prieš ATG, kuris koduoja baltymo inicijatorių metioniną.
PALPacil buvo plazmidė, parinkta atlikti bleR geno subklonavimą. bleR genas be jo promotoriaus srities buvo gautas iš plazmidės pUT737 (Mullaney et ai. (1985), Mol. Gen. Genet. 199: 37-45) kaip 1100 bp Nco\-Apa\ fragmentas. Tuomet šis fragmentas buvo subklonuotas plazmidėje pALPacil (nešančioje PactPc), prieš tai suskaidytoje su Nco\-Apa\, gaunant plazmidę pALfleol (fig.6). Ši pastaroji plazmidė turi bleR geną, ekspresuojamą, reguliuojant PactPc, trpC geno terminatorių už bleR geno, chloramfenikolio atsparumo geną kaip žymę E. coli ir plazmidės pBC KS (+) polijungtuvą. Suliejimo srities tarp PactPc ir bleR sekvenavimas patvirtino pastarojo geno įstatymą teisingame skaitymo rėmelyje.
P. chrysogenum transformacijos buvo atliktos plazmidė pALPfleol, atrenkant transformantus pagal jų atsparumą 30ųg/ml koncentracijos fleomocinui. Po to maksimalus transformantų fleomicino atsparumo lygis buvo nustatytas kietoje terpėje; kai kurie iš jų pasižymėjo geba augti didesnėje nei 100 ųg/ml fleomicino aplinkoje. Transform antai, parinkti pagal jų fleomicino atsparumą, buvo analizuoti, siekiant nustatyti plazmidės buvimą Southern blot būdu ir transcripto, atitinkančio bleR geną, egzistavimą - Nothern blot būdu; abiem atvejais gauti teigiami rezultatai. Šie rezultatai patvirtino galimybę ekspresuoti heterologinius genus P. chrysogenum, reguliuojant PactPc. Transformantas E. coli DH5a su plazmidė pALP315 buvo deponuotas Spanish Collection of Type Cuitures (CECT) su registracijos numeriu CECT4851. Plazmidė pALP316 gali būti gauta iš deponuotos plazmidės pALP315, paprasčiausiai subklonuojant pALP315 intarpą pBluescript I KS (+) EcoR\ kirpimo vietoje priešingoje orientacijoje.
PAVYZDYS
4.1. P. chrysogenum act geno klonavimas ir apibūdinimas.
Siekiant klonuoti A. chrysogenum gdh geną, buvo sukurta DNR sekų biblioteka fago ZGEM12 vektoriuje, kaip aprašyta 1 pavyzdžio 1.1 skyriuje.
Gautasis fago titras buvo 50 faginių dalelių/μΙ (iš viso 20000 faginių dalelių) E.
coli LE392 ir 41 faginė dalelė/μΙ (iš viso 20500 faginių dalelių) E. coli NM539. Tai reiškė, kad maždaug 82% fagų nešė egzogeninj DNR fragmentą ir kad A. chrysogenum DNR sekų biblioteka gauta su 99,999% tikimybe. Po šių teorinių patikrinimų E. coli NM539 buvo infekuotos, ir visa DNR biblioteka buvo išsėta ant trijų 150 mm skersmens Petri lėkštelių (maždaug 7000 faginių dalelių/Petri lėkštelėje), surinkta į 50 ml SM plius 2,5 ml chloroformo ir laikoma 4°C temperatūroje. Šiuo būdu buvo gautas pakankamas ir reprezentatyvus rekombinantinių fagų tūris (2100 faginių dalelių/μΙ), paruoštas išsėti bet kuriuo metu.
Maždaug 20000 faginių dalelių buvo paskirstyta ant dviejų 150 mm skersmens Petri lėkštelių ir po to perkelta ant nitroceliuliozės filtrų (BA85, 0,45 μιτι, Schleicher & Schuell). Šie filtrai buvo hibridizuoti, naudojant standartines metodikas (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA), su 888 bp Nco\-Cla\ fragmentu, atitinkančiu A. nidulans act geną. Iš viso buvo išgryninti 5 teigiami klonai, ir tuomet jų DNR buvo suskaidyta keliomis restriktazėmis ir analizuota Southern blot būdu. Tokiu būdu 8,7 kb Hind\\\ fragmente buvo identifikuotas act genas. Šis fragmentas buvo subklonuotas abiejose orientacijose plazmidėje pBluescript I KS (+) (Stratagene), sukuriant plazmidės pALC52 ir pALC53. DNR srities, turinčios act geną, restrikcijos diagrama parodyta fig.4.
Aukščiau minėtosios plazmidės pALC52 ir pALC53 buvo panaudotos nustatyti act geno nukleotidų sekai, Iš šių plazmidžių “Erase a base (Promega) būdu buvo sukonstruoti keli klonai ir sekvenuoti didezoksinukleotidų būdu, naudojant “Seąuenase bandymų rinkinį (USB), abiem atvejais pagal gamintojo instrukcijas. Gautoji 3240 nukleotidų seka (SEQ ID No:4) buvo analizuota pagal Geneplot programą (DNRSTAR), patvirtinant ORF su ryškiai išreikštu preferencinio kodono naudojimo pavyzdžiu egzistavimą. Act geno ATG transliacijos inicijavimo kodonas buvo aptiktas 787 pozicijoje, o TAA beprasmis kodonas - 2478 pozicijoje. Šis ORF turi 5 intronus 794-920, 952-1123, 11801289, 1321-1410 ir 2183-2249 pozicijose ir koduoja 41612 Da baltymą, turintį izoelektrinj tašką 5,51, kurio 375 aminorūgščių seka (SEQ ID No:8) turi 98,4% ir 98,1 % identiškumą su attinkamai A. nidulans ir P. chrysogenum γ-aktino baltymų aminorūgščių sekomis. Promotoriaus srityje tarp 607-654 pozicijų aptikta pirimidinu praturtinta zona, numanoma TATA seka 747 pozicijoje (TTATAAAA) ir
CAAT seka 338 pozicijoje.
4.2. P. chrysogenum bleR geno ekspresija, reguliuojant PacfAc.
Siekiant ekspresuoti bleR geną, reguliuojant PactAc, buvo sukonstruota plazmidė pALCfleol (fig.6), turinti bleR geną, ekspresuojamą, reguliuojant PacfAc, trpC geno terminatorių už bleR geno, chloramfenikolio atsparumo geną kaip žymę E. coli ir plazmidės pBC KS (+) poliiinkerį.
Iš plazmidės pUT737 buvo gautas bleR genas be jo promotoriaus srities (Mullaney et ai. (1985), Mol. Gen. Genet. 199: 37-45) kaip 1100 bp Nco\-Apa\ fragmentas. Tuomet šis fragmentas buvo sulietas skaitymo rėmelyje su PactPc, ir pasinaudota tuo, kad act genas turi Nco\ kirpimo vietą prieš ATG, kuris koduoja baltymo inicijatorių metioniną. Tuo tikslu plazmidėje pALCactl (turinčioje PactAc) buvo jklonuotas bleR genas, prieš tai suskaidytas su Nco\Apa\, gaunant plazmidę pALCfleol (fig.6). Suliejimo srities tarp PactAc ir bleR geno sekvenavimas patvirtino pastarojo geno išsidėstymą teisingame skaitymo rėmelyje.
P. chrysogenum transformacijos buvo atliktos plazmidę pALCfleol, atrenkant transformantus pagal jų atsparumą 10pg/ml koncentracijos fleomocinui. Po to maksimalus transformantų fleomicino atsparumo lygis buvo nustatytas kietoje terpėje; kai kurie iš jų pasižymėjo geba augti didesnėje nei 30 pg/ml fleomicino aplinkoje. Transformantai, atrinkti pagal jų atsparumą fleomicinui, buvo analizuoti, siekiant nustatyti plazmidės buvimą Southern blot būdu ir transcripto, atitinkančio bleR geną, egzistavimą - Nothern blot būdu; abiem atvejais gauti teigiami rezultatai. Šie rezultatai patvirtino galimybę ekspresuoti heterologinius genus A. chrysogenum, reguliuojant PacfAc. E. coli DH5a transformantas su plazmidę pALC52, turinčia act geną, buvo deponuotas Spanish Collection of Type Cultures (CECT), registracijos numeris - CECT4850. Plazmidė pALC53 gali būti gauta iš deponuotas plazmidės pALC52, paprasčiausiai subklonuojant pALC52 intarpą pBluescript I KS (+) Hind\\\ kirpimo vietoje priešingoje orientacijoje.
Intarpų, esančių deponuotose plazmidėse, naudojant E. coli kaip šeimininką, įterpimas j aktinomicetus Penicillium, Aspergillus, Acremonium ar Saccharomyces, yra tik technikos ir tinkamiausių vektorių, būtinų šios generacijos ar šeimų transformacijai, pasirinkimo reikalas.
Išsamus brėžinių aprašymas
Fig.1 - P. chrysogenum gdh geno, koduojančio NADP priklausančios glutamato dehidrogenazės fermento aktyvumą (EC. 1.4.1.4), restrikcijos diagrama.
Fig.2 - P. chrysogenum hex geno, koduojančio β-Νacetilheksozaminidazės fermento aktyvumą (EC.3.2.1.52), restrikcijos diagrama.
Fig.3 - P. chrysogenum act geno, koduojančio γ-aktiną, restrikcijos diagrama.
Fig.4 - A. chrysogenum act geno, koduojančio γ-aktiną, restrikcijos diagrama.
Fig.5 - E. coli lacZ geno, S. hindustanus bleR geno ir P. chrysogenum pahA geno ekspresijos P. chrysogenum ir/arba A chrysogenum, reguliuojant promotoriui Pgdh, vektoriai.
Fig.6 - S. hindustanus bleR geno ekspresijos P. chrysogenum ir/arba A. chrysogenum, reguliuojant promotoriams Phex, PactPc, PactAc, vektoriai.
SEKŲ SĄRAŠAS
BENDRA INFORMACIJA
PAREIŠKĖJAS:
PAVADINIMAS: ANTIBIOTICS, S.A.U.
GATVĖ: Avda de Burgos, 8-A
MIESTAS: Madridas
VALSTIJA AR PROVINCIJA: Madridas
ŠALIS: Ispanija
PAŠTO KODAS: 28036
TELEFONAS: 91-3841200
FAKSAS: 91-3841220
PAVADINIMAS: “GLUTAMATO DEHIDROGENAZĖS, β-N-ACETILHEKSOZAMINIDAZĖS IR γ-ΑΚΓΙΝΟ GENŲ PROMOTORIAI BEI JŲ PANAUDOJIMAS FILAMENTINIŲ GRYBŲ EKSPRESIJOS, SEKRECIJOS IR ANTISENSINĖSE SISTEMOSE”.
SEKŲ SKAIČIUS: 8
KORESPONDENCIJOS ADRESAS:
ADRESAS: ANTIBIOTICS, S.A.U.
GATVĖ: Avda de Burgos, 8-A MIESTAS: Madridas VALSTIJA AR PROVINCIJA: Madridas ŠALIS: Ispanija
PAŠTO KODAS: 28036
KOMPIUTERIZUOTA FORMA:
LAIKMENA: 3,5” DISKAS KOMPIUTERIS: PC OPERACINĖ SISTEMA: WINDOWS PROGRAMA: WORD
INFORMACIJA APIE ADVOKATĄ/AGENTĄ:
VARDAS. PAVARDĖ: ALBERTO DE ELZABURU REGISTRACIJOS NUMERIS: 232/1 ADRESAS: Miguel Angel, 21
28010-Madridas
TELERYŠIŲ INFORMACIJA:
TELEFONAS: 3085900 FAKSAS: 3193810
TELEKSAS AR ELEKTRONINIS PAŠTAS: elzaburu@elzaburu.es
INFORMACIJA APIE SEQ ID No:1 SEKOS CHARAKTERISTIKOS
ILGIS: 2816 pagrindinės poros TIPAS: nukleotidai GIJŲ SKAIČIUS: 2 TOPOLOGIJA: linijinė
MOLEKULĖS TIPAS: genominė DNR
HIPOTETIŠKA: ne
ANTISENSINE: ne
KILMĖS ŠALTINIS: Penicillium chrysogenum TIESIOGINIS ŠALTINIS: plazmidės pALP784 ir pALP785 POZICIJA GENOME: nežinoma
YPATYBĖ:
PAVADINIMAS/RAKTAS: koduojanti seka VIETA: jungtis (922...970, 1131...1261, 1319...2521)
YPATYBĖ:
PAVADINIMAS/RAKTAS: intronas VIETA: 971...1130
YPATYBĖ:
PAVADINIMAS/RAKTAS: intronas VIETA: 1262...1318
YPATYBĖ:
KITA INFORMACIJA: gdh genas
SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No:1 gatcgccctt tatgggatag tgggcacctc acaoaocctg CAGCCGAGTC AAATTGCCGA fio ACTTGGCAGT TGGTGGCGGA GAACTCOAGA TTTTAITTGC tflTIAl'lTCC TTTATTTCGA 12 o ttttagtttt cctatttttc ctattttgct tgattccatc caactteata ggatactact na TCATAATAGG TCGATCATAG TACAAGCACC AACTCCTCGC ATCATGCATT TTCTGOGGTT 240 CGAATTCTTT ACTTAGACTA AOOT1 ΓΠΐϊ CAOCCTCCTA AIAAACTACC TAGGTAGGTT 300 AAATTTACTT TTTAACATTT TATTTATTCA GAAGATTGTC GGAGAGGACC GATCCOAAGG 360 ACACGAATTC AACKCGGAAG GGATATTAGG GACAAGGAAG ATTTAOOGAT AAAAAAACGA 420 GCTGTGATTC ATGGGAAGCT ΤΑΑΑΟΤσΓΑΟ TAATGAAGGT OAIOGGACCA AAAOGKOTOJ 490 GAGAGATAAG CCAAAITCTG TGCAAATTCT GTGACCTIAA ACCAIAAGAT AACATTCTTC 540 CCGCCCCGAA CTTCGGACGT TCTTCCCACG GAAACCCAAA TCATTGOGTT TCATCGATTC «00 TCTTGGATCT TTATCCTAAT TCCCCGTCCA ACCTGCTCTT GGGGATTATT GTCGAjCTTGT 6«0 ACGCCCATTA ACCCATCTCC CGTCTTCCCT CCAAICAATC CCGGATTCTC TCGTCCCACT 720 CCGGCTTCGA CTCTCTCTCT CTCCACATCT CTATAIAATT CTACACTCCC CCATCCCATT 760 CTTTTCTTCT CTTCTCATCT ACTCTCTTGA ATCTCAAITC TCTTAATACT CTCTCTGCTC B40
TTGTCTTTAT TTAIAATTTA TTAGATCACT GCTTAGCATT GATCTACTTA CCTAAAAGCA 900
GAGTTAACAG TACCGGCCGA A ATG ATG CAA AAC CTT CCC TTC GAG CCT GAG 9S1
Met Mac Gln Aan Leu Pro Ph· Glu Pro Glu
5 10
TTC GAC CAG GCC TAC AAG G GTATCTCTCT ΤΤΤΑΑΤΤΠΤ CCCTTTCTTA TTTCAA 100« Phe Glu Gln Ala Tyr Lys
TTCCATATCa TCCAIATCAC ACACTATTTC CCGACTCAAT TCCTTTACCC ATCGGCATCT 10CS TCCCGGCCTT TGGCTCCACC GGCGGCATAA TTTCGGOTTG ACTCAGCTAA CAATCCCGAA 1125 ACAG AG CTC GCC TCC ACT CTC GAG AAC TCC ACT CTT TTC CAG AAG AAG 1174
Glu Leu Ala Ser Thr Leu Glu Asn Ser Thr Leu Ph« Gln Lys Lys
20 25 30
CCC GAG TAC CGC AAG GCT CTT CAG CTC GTC TCT GTC CCC GAG CGT GTT 1322
Pro Glu Tyr Arg Lys Ala Lea Gln Vai Vai Ser Vai Pro Glu Arg Vai
35 40 45
ATT CAG TTC CGT CTT CTC TGG GAA GAT GAC AAA GGC CAG GTAAGACCTT 1271
Ile Gln Phe Arg Vai Vai Trp Glu Asp Aap Lys Gly Cln
30 55 CO
^1»· A 4 L 132*7 Vai Gln Ile
AAC CGT GGA TAC CGT CTC CAG TTC AAC TCC GCT CTT GGC CCC TAC AAG 1375
Asn Arg Gly Tyr Arg Vai Gln Phe Aan Sar Ala Leu Gly Pro Tyr Lys
65 70 75
ggt ggc ctc caa TTC CAC CCC ACG GTG AAC CTT TCC ATC CTC AAG TTC 142 3
Gly Gly Leu Arg Phe Ris Pro Thr Vai Aan Leu Ser Ile L«u Lys Phe
30 85 90 95
CTC GOT TTC GAG CAG ATC TTC AAG AAT GCC CTC ACC GGC CTG AAC ATG 1471
Leu Gly Phe Glu Gln 11« Phe Lys Aan Ala Leu Thr Gly Leu Asn M«c
100 105 110
GGC GGT GGT AAG GGT GGA TCC GAC TTC GAC CCC AAC CGC AAG ACC GAT 1519
Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Thr Aap
115 120 125
AAC GAG ATC CGC CGC TTC TCT GTC TCC TTC ATG ACC GAG CTG TGC AAG 15S7
Aid Glu Xle Arg Arg Phe Cys Vai Ser Phe Kec Thr Glu Leu Cys Lys
130 13S 140
CAC ATC GGT GCC GAC ACC GAT GTT CCC GCC GCT GAT ATC GCT GTG ACC 1615
His Ile Gly Al* Asp Thr Aap Vai Pro Ala Gly Asp Ile Gly Vai Thr
14 5 .150 155
W3C CGC GAG GTT GGT ttc ATG TTC GGC CAG TAC AAG AAG ATC CGC AAC 1663
Gly 160 Arg Glu Vai Gly Phe 165 M«C Ph· Gly Gln Tyr 170 Lys Lya Ile Arg Asn 175
CAG TGG GAG GGT GTC CTC ACC GGT AAG GCT GGC AGC TGG GCT GCT TCC 1711
Gln Trp Glu Gly Vai 180 Leu Thr Gly Lys Gly IBS Gly Ser Trp Gly Gly 190 s ar
CTC ATC ccc CCC CAS GCC ACC CGC TAC GGT CTC CTC TAC TAC GTC GAG 1753
Leu Ile Arg Pro 195 Glu Ala Thr Gly Tyr 200 Oly Vai Vai Tyr Tyt- aOS Vai Glu
CAC ATC ATC CAS CAC GCC mcc GGC GGC AAG GAA TCC TTC GCT GCT AAG 1807
Hxs Mot Ile 210 Gln Uis Ala Ser Gly 215 Gly Ly- Glu Ser Phe 220 Ala Gly Lys
CGC GTC GCC ATC TCC GGT TCC GGA AAC GTC GCC CAG TAC GCC GCT CTC 1855
Arg Vai 22S Ala Ile Ser Gly Ser 230 Gly ASU Vai Ala Gln 235 Tyr Ala Ala Leu
AAG GTC ATC GAG CTC GGT GGC TCC GTC ATC TCC CTC TCC GAC TCC CAG 1903
Lys 24 0 Vai ile Glu Leu Gly 245 Gly Ser Vai Σ1· Ser 2S0 Leu Ser Asp ser Gln 2S5
GGT GCT CTC GTC CTG AAC GGC GAG GAG GGC TCC TTC ACC GCT □AG GAG 1351
Gly Ala Leu vai Leu 260 Aan Gly Glu Glu Gly 265 Ser Phe Thr Ala Glu 270 Glu
ATC AAC ACC ATC GCT GAG ATC AAG GTC CAG CGC AAG CAG ATC GCC GAG 1939
11c Aan Thr Ile 275 Ala Glu Ile Lys vai 2B0 Gln Arg Lys Gln Ile 2B5 Ala Siu
CTC GCT ACC CAG GAC CCC TTC AGC TCC AAG TTC AAG TAC ATC CCC GCT 2047
Leu Ala Thr 2 90 Gln Asp Ala pne Ser 295 Ser Lys Phe Lys Tyr 300 Ile Pro Gly
GCC CGC CCC TGO ACC AAC ATC GCC GGC CGC ATC GAT CTC GCT CTC CCC 209S
Ala Arg 303 Pro Trp Thr Aan Tie 310 Ala Gly Arg Ile A·? 31S Vai Ala Leu Pro
TCC GCC ACC CAG AAC GAG GTC TCC GGC GAT GAG GCC AAG CCT CTC ATC 2143
Ser 320 Ala Thr Gln Asn Glu 325 Vai Ser Gly Asp Glu 330 Ala Lys Ala Leu 11· 335
CiCC GCT GGC TGC AAG TTC ATC GCT GAG GGC TCC AAC ATG GGT TCC ACC 2191
Ala Ala Gly Cys Lys 340 Phe Lle Ala Glu Gly 345 Ser ASO Met Gly Ser 390 Thr
caq GAG GCT ATC GAT CTC TTC GAG GCC CAC CGT GAT GCC AAC CCT GGT 2239
Gln Glu Ala Ile 355 ASp vai Phe Glu Ala 360 KIS Arg Asp Ala Asn 365 Pm Gly
GCC GCT GCC ATC TGG TAC GCC CCT GGT AAG CCC GCC AAC GCT GCT GGT 2287
Ala Ala Ala 370 Ile Tr? Tyr Ala Pro 375 Gly Lys Ala Ala Asn 3B0 Ala Gly Gly
GTT GCC GTC TCT GGT CTC GAG ATG GCC CAG AAC TCT GCC CCT GTC AAC 233S
vai Ala 385 vai ser Gly Leu Glu 390 Met Ala Gln Asą ser 39S Ala Arg Vai Aan.
TGG TCC CGT GAG GAG GTT GAC TCC CCT CTT AAG AAG ATT ATG GAG GAC 2383
Trp 400 Ser Arg Glu Glu. Vai 40S Asp Ser Arg Leu Ly. 410 Lys Ile Mec Glu Asp «IS
TGC TTC AAC AAC GGT CTC. •TCT ACT GCT AAG GAG TAT CTC ACC CCT GCT 2431
Cys Pte Asn Asn Gly 420 Leu Ser Thr Ala Lye 425 Glu Tyr Vai Thr Pro 430 Ala
m n n·· ΓΙΠΗΒ nm na one n·· nrrt ΠΠΓ Trr nnr TlTT rrr ΓΓΤ ΤΤΓ 7(178 * ·» « e»
SJ A A Ui * U U X U. 1U VsS-A <JU\< A 4^«· «•a e A A A W
Glu Gly vai Leu 435 Pro Ser Leu vai Ala 440 Gly Ser Am n Ile Ala 445 Oly Phe
A-CC AAG GTC GCT GAG GCC ATG AAC GAG CAC GGT GAC TGG TGG TAAATTAGTC Thi· Lys Vai Ala Glu Al* Met Lys Glu His Gly Asp Trp Trp
450 455 460
GCATCCCCAT TTATTCTGGG AGGTCTTCTG TGACGATTTC TGTCCTCTCT TAAGGAGACG CAGCTTTGAT GCATTTTCTT TTCATTTAAA TACCTTTTTA CCCTTTTTGT CAAGCGGGTT ACGGATAGAC GCGCTTGGTT TTCTCCACTG TTGCATTCGA TTOATATCCC CACTTGAGCA . CCGCTGTTTG TTTTGGTTCT GCACTTGGGA CTGTCATGAT GATAATOAGA TACAATGAAT AACTTAAAAA TAATTGTGTG GTCTCGTAAA GTTGTAAACT CTAGA
INFORMACIJA APIE SEQ ID No:2
SEKOS CHARAKTERISTIKOS ILGIS: 5240 bazių porų TIPAS: nukleotidai GIJŲ SKAIČIUS: 2 TOPOLOGIJA: linijinė
MOLEKULĖS TIPAS: genominė DNR
HIPOTETIŠKA: ne
ANTISENSINĖ: ne
KILMĖS ŠALTINIS: Penicillium chrysogenum
TIESIOGINIS ŠALTINIS: plazmidės Palp295 ir pALP388
POZICIJA GENOMOJE: nežinoma
YPATYBĖ:
PAVADI N IMAS/RAKTAS: koduojanti seka
VIETA: 1324...3111
KITA INFORMACIJA: hex genas
SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No:2
GTCGACZTCG CAACAGTCGA GAAGCACCCC CCCTATCTCG CCCGCACCCG GGTAACCGGC CTAGTAACCC AGGGTACCAA TCCCGAAGCC GTCCACCTAG ACCGGGAAGA ACCCAAOCCC ATCACASCCC CCACACGCC3 CCCCCTCCAC CCAGCCCGCT ACAjGCAACAT GCCGGTGATT GCCGGCTGTG GCGCCGCCTC AACCCGTGAG ACCATCCAAT TCTGCCAGGA CTCCGGCGČA GCACGCCCCG ACCCTCTCCT CGTGCTCCCA CCCAGCTACT ACAAOTCCCT CGTGAGCACC GAGTCCATGC ACGCCCACTT CCGGGCTCTC GCCGATGCCT CGCCCGTCCC TGTCCTCATC TACAACTTCC CCCCCCTCCA GTCCGGCCTC GATCTCAGCT CAGATGATAT CTTAaCTCTC GCAGAACACC CCAATATCAT CGCCTGTAAG CTCACGTGCG GCAACAOGGG TAAGTTGGCT CGTGTTGCGG CGGCCAAGCC GGATTTCTTG ACTTTTGCTC GCTCCGCCGA TTTCACCCTG CAGACGCTGG TTGTTGGTCG CCCGGCGATT ATCGGTGGCG TGGCTAACAT GATTCCTCGC TCGTGTGTGC GTCTGATGGA GTTGTA.TCGT GCTCaGAACG TTCAGGAGGC GCAGAAGGTG CAGGCTATTG TTGCGCGCGC TGACTGGGCT GCTATCCATG GTGGCTTTAT CGCTGTTAAG ACGGGCCTCC AAGCCTACCA CGGTTACGGT GGTCTTCCTC GGCCGCCTTG TGTCGTGCCT TCTGCTAAGG ATGCGGCAGC CATTCAGGAG GAGTTCCGGC AfiGGAATGGA CCTGCAGAAG
2531
2591
2651
2711
2771
281«
120 ISO 240 300 3 60 420 400 540 i 00 660 720 7B0 ' 840
TCGTTGGAGT CCTAATGGAT ATAGTAGATT AAATCATGAT TACCAGAGAT CCCATGTCGA 900 GATTTCTATT CCTTTCCAGG GGTtTTCCAG GGGTTTTCCA GAIGiiiiCC AGGTGTTTTC 960 CAAATGTTTC AGOTTGCTTC ATAGATCGAC AGACCGGTGT GACTCTGTCA TTTGCCAGTA 1020 catcccgaga tcccgtagct ttccccctct rniTuiUi'A atatttūfitg ttatatggga iobo cttcaagttg catctagagg ttgcactctc tctctctctc tttcccttga attatttgag 1140 TecsACCTCrciTxoiraJrrc«»«JDrerJ©w»GCT uil-mWrr ccccrrcccc 1200 AGGGTTGCAT CCTGGCCCaT TCCCCATTCC GATGAAAGAT CGACAATGCA GCTAAACATA 1260 AATACTTCTG CTTATCTCCT GGCCACAGTT TCTCTACTTT TCATCGTCAC TCACCTTATC 1320
AAC ATG Met 1 AAO TTC GCC TCC CTC TTG AAT GTG v«i CTC LeU 10 GGG GCC CTG ACG Gly Al* Leu ThX' CCT Ala 15 1368
Lys Phe Al* Ser 5 Vai Leu Aan
GCG TCC GCC CTC CAA CTG AAT CCA CTT CCC GCC CCC CGT AAC ATC ACC 1415
Al* Ser Al* Vai Gln V*1 Acn. Pro Leu Pro Ala Pro Arg Aan Ile Thr
20 25 30
TGG GGA TCC TCC GGT CCA ATC CAA GTC AAC AAC TTG AAT CTC AAC GGT 1464
Trp Gly Ser Ser Gly Pro Ile Gln V*1 Asn Asn Leu Ann Leu Aan Gly
35 40 45
CCT CAC TCC CCT TTG CTC ACT CAA GCT TGG GAG CGA GCA TGG GAA ACC 1512
Pro Kis Ser Pro Leu Leu Thr cm Ala Trp Glu Arg Ala Trp Glu Thr
50 SS 40
ATC ACC ACC . CTG CAA TGG GTT CCT GCT GCT GTT GAA TCC CCA ATC GCC 1560
Ile Thr Tfcr Leu G1O Trp Vai Pro Al* Al* Vai Glu ser Pro Ile Al*
€5 70 73
TCC TAT CCC GCC TTC CCC ACC Ten ACC CCT GTC TCC TCT GCC CCC AAG 1608
Ser Tyr Pro Ala Phe Pro Thr ser Thr Pro Vai Ser Ser Ala Pro Ly*
eo 85 90 95
CCC AAA CCC GCG CCC TCC GGA ATC CAT AAC CTC GAT GTT CAT GTG GTG 1656
Al» Lys A* g Ala Pro Ser Gly Ile His Asn Vai Asp Vai bis vii V»1
100 tos 110
GAC AAC GAT GCC GAT CTC CAA TAC CCT CTC CAT CAA TCC TAT ACA CTG 1704
Asp Asn Asp Ala Asp Leu Gln Tyr Gly vai Asp Glu Ser Tyr Thr Leu
115 120 125
CTA GTG AGC GAT GGT GGC ATC AG^a ATC AAT TCT CAG ACG CTC TGG GGT 1752
vai Vai ser Agp Giy Gly Ile Arg Ile Asn Ser Gln t h r Vai Trp Gly
130 135 140
CTG TTG CAC GCA TTC ACC ACC CTG CAG CAG ATT ATC ATC TCG GAT GGG 1800
Vai Leu Gln Al* Phe Thr Thr Leu Gln Gln Ile Ile Ile Ser Asp Gly
HS 150 155
AAC CCC GCT TTG ATC ATT GAA CAG CCC GTC AAG ATC AAG GAT GCC CCG 1848
Lys Gly Gly Leu Ile Ile Glu Gln Pro Vai Lys Ile Ly. Asp Ala Pro
160 1GS 170 175
CTG TAC CCC CAT CGT GGT ATC ATG ATA GAC ACC GGG CCC AAC TTC ATT 1B96
Leu Tyr Pro His Aru Gly Ile Met Ile Asp Thr Gly Arg Aan Phe Ile
100 IBS 190
ACC GTT CGC AAG CTC CTT GAG CAG ATC GAC GGT ATG GCC CTG TCC AAG 1944
Thr Vai Arg Lys Leu Leu Glu Gln Ile Ąxp Gly Met Al* Leu Ser Lys
195 200 205
CTC AAT GTT CTC CAC TGG CAC TTG GAC GAT TCT CAG TCG TCG CCC ATC 1992
Leu Asn Vai Leu His Trp His Laru Aap Asp Ser Gln Ser Trp Pro Met
210 215 220
CAC ATG AGC TCC TAC CCG GAG ATC ACC AAA GAT GCT TAC TCG CCT CGC 2040
Gln Met Ser ser Tyr Pro Glu Met Thr Lys A*p Ala Tyr Ser Pro Arg
225 230 235
GAA ATC TAC ACC CAG CAC CAC ATG CGC a· >4*» GTG ATT GCC TAC GCA CGC * 2088
Glu Ile Tyr Thr Glu His A* p Met Arg Arg Vai Ile Al* Tyr Ala Arg
240 245 250 2SS
CCG CGA GCT GTC CGC OTC ATC CCC GAG GTC GAC ATG CCC ccc CAC TCA 3136
Al* Aro Gly V*1 Arg 260 Vai 21a Pro Glu vai 2(5 Aap Met Pro Ala Ūla 270 Ser
ccc Τ*^*0 ccc TCC CAG CAo CTC GAC CCG GAG ATC GTG GCA TCT GCC GAA 2154
Aii £«je Cly Trp 27S Cln Cln Vai Αβρ Pro 2S0 Glu lle Vai ala cys 285 Ala GlU
TCC TCG TGG TCG AAC OAC CTT TGG GCC GAG CAC ACC GCC CTC CAG CCG 2232
Ser Trp Trp 290 Sar Asn Αβρ Vai Trp 255 Ala Glu Hla Thr Ala 300 Vai Gln Pro
AAC CCT OOC CAC CTC GAC ATT ATC TAC CCC AAG ACC TAC GAA GTT CTC 2280
A«n Pro 305 Gly Gln Leu Aap lle 310 lle Tyr Pro Lya Thr 315 Tyr Glu Vai Vai
AAC AAT GTC TAC CAG GAA ttc TCT CGC ATC TTC AGC GAC AAC TTG TTC 2328
Α6Λ 320 Aan Vai Tyr Gln Glu 325 Lau Sar Arg Tie Pha 330 Ser Aap Aan Leu Phe 335
CAC GTT GGT GCA GAC GAG ATC CAG CCC AAC TGC TAC AAC TAC AGC ACC 2376
Ηχο v»l Cly Ala Aap 340 Siu lle Cln Pro Aan 345 Cys Tyr Asn Tyr Ser 350 Thr
CAT ATC ACT AAC TGO TTT GCC GAG GAT ccc rca CGC ACC TAC AAC GAC 2424
Kis 21« Thr Lya 355 «r —_ • *P Phe Ala Glu Asp 360 Pro Ser Arg Thr Tyr 3(5 Aan Asp
CTT GCC CAG TAC TGG GTT GAC CAT TCC ATG CCC ATC TTC CCT ACT CTC 2472
L±U Ala □ ln 370 Tyr Trp Vai A»p His 375 s«r Met Pro Jie Phe 380 Arg Ser Vai
GCC GAC CAC CSC CGT CTT ATC ATG TGG GAG GAC ATA GCT ATC GCC ACT 2520
Gly Asp 39S His Arg Arg Leu «e e 390 Mec Trp Glu Asp lle 395 Ala lle Ala Thr
GAA AGC GCC CAC GAC CTC cce AAA OAC GTC ATC ATG CAG ACC TGG AAC 2548
Glu 400 Sar Ala Mis Aap v*l 405 Pro Lys Asp Vai lle 410 Met Gln Thr Trp Aan 415
AGC CGC GAC GGT GAG GCT AAC ATC AAG AAA CTC ACC TCC GCC GGC TAC 2616
Srr Gly Glu Gly Glu 420 Gly Aen lle Lys Lys 425 Leu Thr Ser Ala Gly 430 •^yr
GAC 3TT GTC GTT TCG ACC TCC GAT TTC CTC TAC CTC GAC TGC GGG CGC 2664
Asp Vai Vai Vai 435 Ser Thr Ser ACp Phe 440 Leu Tyr Leu Aap Cys 445 Gly Arg
ooc GGC TAT GTC ACC AAC GAC GCC CGC TAC AAC GTG CAG AGC AAC ACC 2712
Gly Gly Tyr 450 Vai Thr Asu Aep Ala 455 Arg Tyr Asu Vai Gln 460 Ser Aan Thr
GAC GGC GGA GTG AAC TTC AAC TAC CGC GGC GAC GGT GGC TCC TCG TGC 2760
Ayp Gly 455 Gly Vai Asn Phe Aan *70 Tyr Cly Gly Asp Gly 475 Gly Ser Trp Cys
GCC ccc TAC AAG ACC TGG CAG CGC ATC TAC GAC TAC GAC CTC ACG 2809
Al» 490 Pro Tyr Lye Thr Trp 485 Gln Arg lle Tyr Asp 490 Tyr Asp Phe Leu Thr 49S
AAT CTC ACT TCC TCC GAA GCG AAG CAC ATT ATC GGC GCC GAG GCT CCT 2956
A»n Leu Thr Ser ser 500 Siu Ala Lys Uis lle 505 lle Gly Ala GlU Ala 510 Pro
TTG TGC TCG GAG CAG GTC GAC GAT CTC ACC CTC TCC AGC GTG TTC TGG 2904
Leu Trp Ser Glu SIS Gln Vai A»P Asp vai 520 Thr Vai Ser Ser Vai S2S Phe Trp
CCT CGC CCT GCT GCT CTG GGT GAG CTT GTC TGG TCT GGT AAC CGT GAC 2952
Pro Arg Ala 530 Ala Ala Lau Gly Glu 333 Leu Vai Trp Sar Cly 540 Asn Arg Asp
GCT GCG GGT AGA AAG CCT ACC ACC AGC CTT ACT CAG CGT ATT CTC AAC 3000
Ala Ala 545 Gly Arg Lys Arg Thr 530 Thr Ser phe Thr Gln 555 Arg Jie Leu Aan
TTC CGT OAA TAC CTC w77 GCC AAT GGT GTG atg GCT ACT GCT CTT GTG
Phe Arg Glu Tyr Leu Vii ALi Asn Gly Vii Met Ali Thr Ala Leu Vii
560 565 570 S75
CCc AAG TAT TGT CTG CAG CAC CCT CAT GCT TGC GAC CTC TAT AAA AAC
Pro Ly. Tyr Cy· Leu Gln Bis Pro Hi· Ali Cy. Aip Leu Tyr Lys Asą
580 sas 590
CAO ACT GTA ATG TCT TGATTGTGGT TAAGCTGGAC TGCTAGTOAG CCTTACAACT 3151 Gln Thr Vsl Met Sės
595 aCC'lCTTCCT CTGTATATAC TTATTCTATC TTCGATACCC AAITCCATTG GAATTTCTTC 3311 CAGGATACAT OTCCCTGATC AGTATACCAT TTCACGTCCA CAITCAATCT TCAGCAACAC 3271 GAATTTATCC KAACCAATCA CCACCCTAOA TCTACCACAA CACTACCTTT ATACATATCT 3331 acttgatacc caatcccatt ccaaccaggc gcaaaacgcg tocccaotcc aaatcaaaat 3391 CAGCCCCCCG AOCCCAACCC TCTCCACATA TCCAIACCCT AATCAAAATC ACCTTAATCT 3451 AAACAAATCC ATCACGCCCA AGGACCCCAC AGACCTCCCC TTCCCAACCC ACCCAGTCCA 3 S11 CCTCCACAAA CCAAACCCCA AKTCAGAACT GCCGTGCAAC TCTCCGTCTT AGAACTCGCC 3571 CTTCGGTCCC GTCCCOAACT TAGATGGGCT TCGGGACGGC TTGCTOTATG CACTATGCAT 3631 CTACTACCCA GTACOCCOTA CACATGTAGT AGGGOATATA TGTATGTACT ATGTACGCAT 3691 GTTCGAGTAC GCAGTACGTA GTGTGGCATG CAGGTCAGCT AGCATTGGCA GTAGCATATA 3751 CGGCATAACC TACOCTATGC ATCTAATATT CITCGGTATA TACCACATGG TACGGAATTA 3 B11 GATGCAATAC ATGTACATGT ACATGTGCAT ACCTAGGTAC AAAGTGAATC TCGTTATTGT 3571 ATGTCTAGTC CTCTATAAGT CTAGTCCCAT GTCATATATA CAAGCCCATA CCOCATCGGA 3931 GCAAACCAGC CCATTCAOAC ATCCCTGCTC GAAACCCAGT CTACGGATTG AOACCGGGCT 3991 GAGCTCGGGT TTGGGTGTTG CTGCATGCGT ACGCCTACAT ACSTASGCOG ATATCTTGCA 4051 CAGGATGCAG GGAATGACAA ATTGACGAAT TGAGAAATAC GCGAGTOGT? ACATCTTAAT 4111 TCTCGTTCGG GATGTTTATG TTTACCTAGG TATACTGGC7 GGGGGGTCGT CATACACGTG 4171 GGAATTTGTG CCAATCTGTC AOTGGCCAGG TCCMOTTTO ATTTATATGT TTCGGATGOO 4231 GATOGTCAAT GGGTATTCCA AGGAOOATGT ATCATCTGCT TTACACCCTC CCTTGCCTGG 4291 OATTTGGATT GAATTCTTCT TTCCACGTCG ATGTAGATTC TTCCCCGOAG CTATTCGGGT 43Si ACAACCCTGG CTTCCATATA TCATGTOTCC ATACTAAOTA CAGACGCTTC GATTTCCGGT 4411 GCTOCGAGTA GATCGGGAAC TGATCTCCCA TGTCTGTACA CGAAGGGTTG TACAAGCACG 4471 CGGTCCTTCT GCGTAACCGG TIGTTTATGT TATTGGATTT GGTATTCGTC TAATATGCAT 4 531 GATTTGGGAT AAOCTTCTAT CCTGGGAATG GGTGCTTGST ATAGTTCAGC CTAGTACTTC 4591 G7CT7C7ATG TGATATTTCC AAAATAGTAG TTTTCSOTAA CTATATCTCC TACCTTTGAC 4 651 TTTGG i I IG I GOTTTACGTC TTACCTGGCG TTTAGAGGGA GOGATACGTT TCTOTAtCAC 4711 CGTCGTGTTT CAACGTGGAT CCGGGTCCTT TCCCTGATAT ATATCTTGGC TTATCTTTCG 4771 TGCCGTAGTG CGCCTTCGTA TAATGCATGT CTGCTATATC ATACGGCATT AGTOACTGGG 4631 ACGTTGAGGT COAGCTTGGT TTGAGGTTAC ATATATTGAG CCAAAAIGGT CGAAAATATA 4 891 TATCAACATT GCCAAAACAG AACTTCATTC CTTGOATGCC ATGCCAAAIT GCTAATACGT 4951 CTTGATCTTA CTCTGACTCC TATCTCATCT CACCriGGIT ATTCGTTACA CAGCATTAAC S 011 CCCAAGAACC AGGTATAGTC TGATCGTGGA TGTGOGCCAC GACAAAATAG AAGGTCTCGT 5071 GTTTAGGGCG ACGAATCTGG CACTGCKTTC CAGACGGGCC TGCGGAGAAT TTGCAOCATT 5131 TTATATCTAC ATGGTTGTTC CCTGGTGTGT GTGGG7GTTT CATGATATAT CCTGGTCGAT 5191 TCTGAC2TGC GTATGTA7CS CTGGAAAGGC TCGTAGGGGC TGCGTCGAC 5240
INFORMACIJA APIE SEQ ID No:3
SEKOS CHARAKTERISTIKOS ILGIS: 2994 bazių poros TIPAS: nukleotidai GIJŲ SKAIČIUS: 2 TOPOLOGIJA: linijinė
MOLEKULĖS TIPAS: genominė DNR
HIPOTETIŠKA: ne
ANTISENSINĖ: ne
KILMĖS ŠALTINIS: Penicillium chrysogenum
TIESIOGINIS ŠALTINIS: plazmidės pALP315 ir pALP316
POZICIJA GENOMOJE: nežinoma
YPATYBĖ:
PAVADINIMAS/RAKTAS: koduojanti seka
VIETA: jungtis (494...500, 617...647, 846...901,
1181...1952,2022...2249)
YPATYBĖ:
PAVADINIMAS/RAKTAS: intronas VIETA: 501...616
YPATYBĖ:
PAVADINIMAS/RAKTAS: intronas VIETA: 648...845
YPATYBĖ:
PAVADINIMAS/RAKTAS: intronas VIETA: 902...1046
YPATYBĖ:
PAVADINIMAS/RAKTAS: intronas VIETA: 1078...1180
YPATYBĖ:
PAVADINIMAS/RAKTAS: intronas VIETA: 1953...2021
YPATYBĖ:
1047...1077,
KITA INFORMACIJA: act genas SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No:3
GAATTCAGCA GCCTACGGAG TCCATAAGAC ACCAAGACAC AOCCATTOHA ΤΟβλΖΤΧΧλΤ «0 ATGCCATGTA TOCCTOACAA TGCTCrATAA CTACTCTAAT ACAA3GTAAA CCCCCAACCC 120 GGTCAAGGTA CūXw*TCCCO CCOTACCCAA AJUSGOTCCCC AAOAA3CTCC ACOCAASACT 140 rmOCTACA CMTCAAGGA ATCCAACTOA OAAATTCAAT GAACATCAAC AATASTTCTG 240 CCTTATAATC TTTATAAffTA TAAAAATCAG AAAGAGAATT A3A.TACAAAA GGGTAOATCT 300 GGAGGGGGTT CAOAOTTAAG GCCTCAGGCA GGCOCACAAT CCCAGCCATC ACAAACCCCT 360 ctccactctt ccctctctct (.ιι,χ iwrj« ttcctttctc CCCTAATCCC AACTATATCC 420
CCTCTAACCT CTTTCCATCT TTCTTTTCTT TTTTCCCCTC TTCTCCCCTA AGTCCCTTGT 4(0 TTAATCACTC ACA ATO GAG G GTATGTTAIT CCACTTCTŪG CCACATCAGC AGC7TCCC 538
Met Glu 1
CGGAAGCTCC CCCCCCTGTT GGCCACAGCT TCGATTCCAT ATTTGCGAAT GACAACTAAC SS8 CCGTATATCT CATTAIAG AA GAA CTT GCT GCT CTC GTC ATC GAC AAT GG €47
OlU Glu Vai Ale Al* Leu Vai Ile Aap Asn Gly 5 10
CTAICT3CTA TACTTTTCCC COGACCTTCT OGCTTCTCTT GCCCTCCCCA ACTCAGCCCC 707 GGTCGCAGTC GTTGCCACCC CTAATCCGCC CGCOACGGCA GATGGAATCC ATCCCAATGG 767 CTTTCCATCT CGCTCCACAA CTACCAGAGG GTGATCCAAA GACTACAAGA ACTATGATAC 827 TOATTATTTO COATATAO T TCG GGT ATG TGT AAG GCC GOT TTC GCC GCT GAC 875
Sar Oly Het Cye Lya Al* Gly Phe Ala Gly Aap H 20
GAC GCA CCA CGA GCT GTT TTC C GTAACTCCA ACCCCACAGA ATATGACACC 930
Asp Ala Pro Arg Ala Vai Phe 2S 30
CCTCCTGTOC GAAGGCCGCC ATCCCACCAA CCCTTOCGTC GGATGGCTTC CCCTCTTTTG 990 CTTCGCTAOG AOGAACCTGG AACCTAGGAA ATCAAATAAC TGACAAAATT CAACAG 104«
CT TCC ATT GTC GGT CGT CCC CGC CAC CAT GG GTAAATGATC CCCCCTTTTT 1097 Pro S«r Ile Vai Gly Arg Pro Arg Hia Ki» Cly
40 tttcccgctc gtttcggctg tatacgctat acgcagccaa tttoatccct AATGAACCAA lis7
AAAGAATACT AACATGGGCG CAG T ATT ATG ATT GGT ATG GGT CAG AAG GAC 1200
Ile Met Ile 45 Gly Met Gly Gln Lys Aap SO
TCG TAC GTT GGT GAT GAG GCA CAG TCG AAG CCT GCT ATC CTC ACG CTC 1256
Ser Tyr vai Gly Aap Glu Ala GI» 55 Ser 60 Lya Arg Cly Ile Leu 65 Thr Leu
CGT TAC CCT ATT GAG CAC GGT CTT GTC ACC AAC TGG GAC GAC ATO GAG 1304
Arg Tyr Pro Ile Glu Hia Gly v*l 70 75 vai Thr Asn Trp Asp Aap 00 Met Glu
AAG ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAC GAG CTC CGT GTT GCC CCC GAA 1352
Lys Ile 65 Trp Sis Kis Thr Phe Tyr 90 Aan Glu Leu Arg 95 Vai Ala Pro Glu
GAG CAC CCC ATT CTC TTG ACC GAA GCT CCC ATC AAC CCC AAG TTC AAC 1400
Glu Kis 100 Pro Ile Leu Leu Thr Glu 109 Ala Pro Ile Asn 110 Pro Lya Phe Asn 115
CGT GAG AAO ATG ACC CAG ATC CTG TTC GAG ACC TTC AAC GCC CCC GCC 1440
Arg Glu Lys Met Thr Gln Ha Vai 120 Phe Glu 125 Thr Phe Asn Ala Pro Ala 120
TTC TAC GTC TCC ATC CAG GCC GTT CTG TCC CTG TAC GCC TCC GGT CGT 1496
Phe Tyr Vai Ser Ile Gln Ala Vai 135 Lt U 140 Ser Leu Tyr Ala Ser 14S Gly Arg
ACC ACT GOT ATC GTT CTC GAC TCC GCT GAC GGT CTC ACC CAC CTC CTC 1544
Thr Thr cly Ils Vii Leu Aap Ser ISO 153 Gly Aap Cly Vai Thr Hia 160 Vai Vai
CCC ATC TAC GAG GGT TTC TCT CTG CCC CAC GCT ATC TCG CGT CTC GAC 1S92
Pro Tie 165 Tyr Glu Gly Phe Ser Leu 17 0 Pro Hia Ala Ile 17S Ser Arg Vai Aap
ATG GCT GGC CGT OAT CTG ACC GAC TAC CTG ATS AAG ATC CTC GCT GAG 1640
Met Ala 100 Gly Arg Aap Leu Thr Aap IBS Tyr Leu Met Lya 190 Ile Leu Ala Glu 195
COT GGT TAC ACT TTC TCC ACC ACC GCC GAG CGT GAA ATC GTC CCT GAC 1608
Arg Gly Tyr Thr Phe 5er Thr Thr 200 Ala Glu 205 Arg Glu Ile Vai Arg Asp 210
ATC AAG GAG AAG CTT TGC TAC GTC GCC CTC GAC TTC GAG CAG GAG ATC 1736
Ile Ly· Glu Lys Lau 21S Cya Tyr Vai Ala Lau Arp Phe Glu Gln Glu 11· 220 225
CAG AGC GCT TCC CAG AGC TCC AGC CTC GAG AAG TCC TAC GAG CTT CCC 1784
Cln Thr Ala Sės Gln 230 Ser Ser Ser 23S Leu Glu Lys Ser Tyr Glu Leu Pro 240
GAT GGA CAG GTC ATC ACT ATT GGC AAC GAG CGC TTC CGT GCT CCT GAG 1832
Aap Gly 245 Gln vai Ile Thr Ile Gly 250 Asn Glu Arg Phe Arg Ala Pro Glu 255
GCT CTG TTC CAO CCT AAC GTT CTT GGC CTC GAG TCT GGC GGT ATC CAC 1090
Al* Leu 250 Phe Gln Pro Asn Vai Leu 255 Gly Leu Glu Ser Gly Gly Ile His 270 275
GTC ACC ACC TTC AAC TCC ATC ATG AAG TGT GAT GTT GAT GTC CGT AAG 1928
Vai Thr Thr Phe Aan 280 Ser Ha Mes Lys Cys Aap Vai Asp Vai Arg Lys 285 290
GAT CTC Aep Lau TAC GGC AAC Tyr aly Aan 295 ATT GTC ATG Ils Vai Mae CTAAGAAAAA AflCCTCCAGA GCTGATGTTG 1982
CGCAAAOATC CCCACTAACA TACAACTCCT TTTTTTTAG TCT GOT GGT ACC ACC 2035
ser Gly Gly Thr Thr 300
ATG TAC CCC GOT ATC TCC GAC CGT ATG CAG AAG GAG ATC ACT GCT CTT 2084
sMec Tyr Pro Gly Ile Ser Aap Arg Kec Gln Lys Glu Ile Thr Ali Leu
30S 310 315 320
GCT CCT TCT TCC ATG AAG GTC AAG ATC ATC GCT CCC CCC GAG CGC AAG 2132
Ala Pro Ser Ser Met Lys vai Ly· Ile Ile Al* Pro Pro Glu Arg Lys
323 330 335
TAC TCC GTC TGG ATC GGT GGA TCC ATT CTC GCC TCC CTG TCG ACC TTC 2180
Tyr Ser Vai Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Al* Ser Leu Ser Thr Phe
340 345 3S0
CAG CAG ATG TGG ATC TCC AAG CAG GAG TAC GAC GAG AGC GGT CCT TCC 2228
Gln Gln Kst Trp He Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ser Gly Pro Ser
ATC 3S5 CGC AAG TGC 360 365
L» JI CAC 4TV iAAULŪJii 2279
Ile Vai Kis Arg Lys Cys Phe
370 375
TTCGCTCGTA CTTTCCTGGT GTATCAAAAA GCAGGATGGA GGCACTGGTG GATTGCAAGC 2339 GTTGTTGGAC TCGCATTA.TC AAGCGGATAG CCTGAAAATG GAATCTCGAT TTTAGTGGAA 2399 TAOAOTCGCT Cul 11 l'Ci'l 1' TTGTTACTCT TTACCTTACT CTTTACTCGA TCTCTATCCA 2459 TCCATTTCTG CTTTGAACCA TTTCACCTTT ACTCCATCTT TTTCCCTTTC CTCATTCGAA 2519 TCCGCTCTCC CGTCCACCTC TCTCATTCCT TTGCCTGGAC CCCTCTCTCG CGATGCGGCA 2579 TCAACAOTCT ACCTGTAGGG CAAGGATGTA TATGGAGTTG GTTGOCTATA GGGATTAOGT 2539 TGCGTTGTCC TTTTCCACGT CTTCTACCTC ΤΠσΓΓΠΚ CCCCTT3CGT TGTCTTCAAC 2599 TAAACTGCCC TTCTCCGTAO CTTTTAACGT GACTTTGACT TCAAATATTC CACTGGTTCC 2759 TTGTATTCTG CTAGAAACGC TGGTTCAACC CTTCTTGAAT GTCTTCTATG TCCAACATCT 2819 ACAAOACGTA TCCGAOAAGA CAACAAAAAO GCTCTGAGGA AAGTCTACTA AAAACTTGGC 2879 cAaaccaaAT taggcctttg tcatggttat tgtactgtca ttcgaicagt ccatattgat 2939 ATTCTGCGAA TATGTAGGCT GACOAGATAA ATGGCACGCA TTGCGTCTGT ATCTT 2994
INFORMACIJA APIE SEQ ID No:4 SEKOS CHARAKTERISTIKOS
ILGIS: 3240 bazių porų TIPAS: nukleotidai GIJŲ SKAIČIUS: 2 TOPOLOGIJA: linijinė
MOLEKULĖS TIPAS: genominė DNR HIPOTETIŠKA: ne
ANTISENSINE: ne
KILMĖS ŠALTINIS: Penicillium chrysogenum
TIESIOGINIS ŠALTINIS: plazmidės pALC52 ir pALC53
POZICIJA GENOME: nežinoma
YPATYBĖ:
PAVADINIMAS/RAKTAS: koduojanti seka
VIETA: jungtis (787...793, 921...951, 1124...1179, 1290...1320,
1411...2182,2250...2477)
YPATYBĖ:
PAVADINIMAS/RAKTAS: intronas VIETA: 794...920
YPATYBĖ:
PAVADINIMAS/RAKTAS: intronas VIETA: 952...1123
YPATYBĖ:
PAVADINIMAS/RAKTAS: intronas VIETA: 1180...1289
YPATYBĖ:
PAVADINIMAS/RAKTAS: intronas VIETA: 1321...1410
YPATYBĖ:
PAVADINIMAS/RAKTAS: intronas VIETA: 2183...2249
YPATYBĖ:
KITA INFORMACIJA: act genas
SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No:4
GCCAGGCTGG CACCGGCC1G CCTTCATGCG AGATOCCTAC TCCTACTATG CCTACAGGTA 60 TGGGCTTTCC GCCTGTCGTC AGCTTGCGAC CGCGCGGCTO CTOACGACCC AAGGCAAGCT 120 GŪTAACAIGG CGGCACGAAA TTTCTCTCTC CCTCCTCGTC CTCITCGTGT GGAfiGGGTAC 1BQ GAGTGCAGGT ATCATCCCAC GGCAGAfiGAG TCACOGAGCC TCTOCOU'rTO GCACCAGTAC 240 TC2ZACGASTA CTCGTACTGT AGGTGCAGCG ACTGTGCTGG TACTGCTAGO TGGAĄTTCGG 3 00 TCCAGCAGGC ATGCAGCTCC CAOCCACCGT CGTTAACCAA TCAfiTTAAAC CAGCAACGCA 360 ACCCGCCCCC GmiTTCTCC CAOAAATTTG GGCGGTGTOO TGCCCCCAGT CCČTGTTGCC 420 CGCCCTTGTC TGGTCGCCTA CACGCTGCAC CACAGGTAAC AACACCCCGC CCCAOGTCCT 4B0
TGTAGGTGCC CAGTGAGTGC CCGGTGCCCA CAAGTTTCTC GTGGCATCCA CTCGCGOACT 540
TGGAAGCCCA TCAGTGATGC TTCCCTCCTT TCCCCCTCCA CAICTCACTC AGCTCACGCA 400
AGCCAACCCT CTCTCCCCCC GTCTCCATTC CATCTTCTTC TCTCCACOAC CCTTAAGAGT 660
CCCTCCTGCT CACGTCGACC ATCC7TCGCT CCCAGCCCCA CGAGATCTGC ATCOTCTGGG 720
CTTCTTGACA CTCTGTCATT TCTTCCTTAT AAAACCTCTT TACCGCTCTT CCCGTAATCC 780
GACGCC ATG GAG G GTACGTGTCC CCGCAACGCA CTCCCGCTTC CCCTACTACC CCTA 837
Mac Glu 1
TCCCGC ATCCACACGG CGCCGCGATG CCTAGCCATC GCOAGOGTCC ATCGCAACGA CTT «94 GCCTAAC TCTTCTTCGC TTCACAG AG GAG GTC GCC GCC CTC GTT ATC GAC )i6
Olų Glu Vai Ala Ala Leu Vai Ile Asp 5 10
AAT GG GTAAGCTCGC CCGCTGTCTC ACCGACATCC ATCGTCCCCC TGGCCTCTGT 10 01
Asu Gly
COAGATCGGA GCCTCCAGGG GTCCCTTCGA CGAGC0C3TC GATTGCCAAA ATCCAACGAG 1061
ATCGG5CCAT ACTGAGCCGA CACTCGTGTG TTTTCTGCAC ATtAGCACTG ACTTGATTCT 1121
AC T TCG GGT ATG TGC AAG GCC GGT TTC GCC GGT CAT GAT CCT CCC CGA 11S9 sėt Gly Mec Cys Lys Al* Gly Pha Al* Gly Aap Asp Al* Pro Arę
20 35
GCT GTT TTC C GTAAGTACCC CACTTCCACC CGTCGAGCTC CCCAATTGTC CACCGCCAGG 1229 Ala V*1 Phe
OCGAGAAGGG ŪGCAGAACGG GGCAAACTGC ATCGCAAACA TGGCTAATTC CATGCGACAG 12· 9 CG TCC ATT GTC GOT CGT CCC CGC CAC CAT GG GTAAGTTTCC GGCCCCAGCC 1340
Pro Ser Ile Vai Gly Arg Pro Arg His His Gly
40
GACACCTCTC ACCCCCCCCC GGOGGGCTCC TAAGCCAGTC AGCGCTGGTT CIGACCGCTG 1400 GATACTATAG C ATC ATG ATC GGC ATG GGC CAG AAG GAC TCG TAC GTC GGT 1450
11« Mes ile aly Mac Gly Gln Lys Asp Ser Tyr Vai Gly 45 50 55
GAC GAG GCT CAC TCC Αλα CGT GGT ATC CTC ACC CTG CGC TAC CCC ATT 1498
Aep Glu Ala Gln ser 40 Lys Arg Gly Ile Leu 45 Thr Leu Arg Tyr Pro 70 Ile
GAG CAC GGT GTT GTC ACC AAC TGG GAC GAC ATG GAG AAG ATC TGG CAC 1546
Glu Kis Gly Vai 75 Vai Thr Asn τη? Asp 80 Aap Μβϊ Glu Lys Ile 85 Trp Kis
CAC ACC TTC TAC AAC GAG CTG CGT GTT GCC CCC GAG GAG CAC CCG GTC 1594
His Thr Phe 90 Tyr Asn Glu Leu Arg »5 Vai Al* Pro Glu Glu 100 Kis Pro vai
CTG CTC ACC GAG GCG CCC ATC AAC CCC AAG TCC AAC CGT GAG AAG ATG 1642
Leu Leu 105 Thr Glu Ala Pro ile 110 Asn Pro Lye Ser Aan 115 Arg Glu Lys Mes
ACC CAG ATC CTC TTC GAG ACC TTC AAC CCC CCT GCC TTC TAC CTC TCC 1690
ihr 12 0 Gln Ile Vai Phe Glu 125 Thr Phe Aan Ala Pro13 0 Ala Phe Tyr Vai Scr 135
ATC CAG GCC CTC CTG TCA CTG TAC GCC TCC GGC CGT ACG ACC GGT ATC 1738
Ile Gln Ala Vai Leu 140 Ser Leu Tyr Ala ser 145 Gly Arg Thr Thr Gly ISO Ile
GTC CTG GAC TCT GGT GAT GGT GTC ACC CAC GTT GTC CCC ATC TAC GAG 1786
Vai Leu Asp Ser 155 Gly Asp Gly Vai Thr 140 Kis Vai Vai Pro Ile 145 Tyx Glu
GGT TTC GCC CTG CCC CAC GCC ATT' GCC CCT GTC GAC ATG GCT GGT CGT 1834
Gly Phe Al* 17 0 Leu Pro Kis Ala Ile 175 Ala Arg Vai Asp Mec 180 Ala Gly Arg
GAT CTC ACC GAC TAC CTC ATG AAG ATC CTG GCC GAG CGC GGC TAC ACC 1882
Aap Leu 185 Thr Asp Tyr Leu Met 190 Lys ile Lr«U Ala Glu 195 Arg Cly Tyr Thr
rrc tcc acc acc gcc oms cgt gag kts ere cgt gac atc aag cag aag 1930
Phe Sec The The Al* Olų Arg Glu Ile V*1 Arg Aep Ile Ly· Olų Ly·
200 205 210 215
CTC TOC TAC GTC GCC CTC GAC TTC GAG CAG CAG ATC CAG ACT GCC GCC 1978
Leu Cys Tyr V*1 Al* Leu Aep Phe Glu Gln Glu Ile Gln Thr Al* Al*
220 22S 230
CAG AGC TCC AGC CTG GAG AAO TCC TAC GAG CTT CCC GAC GGC CAG GTC 2026
Gln Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr Glu Leu Pro A*p Gly Gln Vai
235 240 245
ATC ACC ATT GGC AAT GAG COC TTC CCT GCT CCC GAG GCT CTC TTC CAG 2074
Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Ph* Arg Al* Pro Glu Al* Leu Phe Gln
250 2SS 260
CCC TCC GTC CTG GGT CTC CAC AGC GGC GCC ATC CAC GTC ACC ACC TTC 2122
Pro Ser Vai Leu Gly Leu Glu Ser Gly Gly Ii* Bi· V*1 Thr Thr Phe
265 270 275
AAC TCC ATC ATG AAG TCC GAC GTC CAT GTC CGT AAC CAT CTG TAC GGC 2170
Aan Ser Ile Met Ly* Cys Asp v*l Asp V*1 Arg Ly* Aep Leu Tyr Gly
280 285 290 295
AAC ATT CTC ATC GTAAGTCAGA TGCCGOGCCT GGAAGAjCACC TCATTTAOGA TCT 2225
Asn Ile Vai Met
TGCTAAC ACCAATTTTT TTTTTAC TCT GCT GGT ACC ACC ATG TAC CCT GGC 2276
Ser Gly Gly Thr Thr Met Tyr Pro Gly 300 305
CTC TCT CAC CGT ATC CAG AAG GAG ATC ACT GCT CTT GCT CCT TCT TCC 2324
Leu Ser Asp Arg Met Gln Lys Glu Ile Thr Ala Leu Ala Pro ser ser
310 31S 320
ATG AAG GTC AAG ATC ATT GCT CCC CCG GAG COC AAG TAC TCC CTC TGG 2372
Met Ly* Vai Lye Ile Ile Al* Pro Pro Glu Arg Ly* Tyr Ser V*1 Trp
325 330 335 340
ATC GCT GGT TCC ATT CTG GC3 TCT CTG TCC ACC TTC CAG CAG ATG TGG 2420
Ile Gly Gly Ser ii* leu Al* s*r Lau Ser Thr Phe Gln Gln Mec Trp
345 350 355
ATC TCG AAG CAG GAG TAC GAC GAG AGC GGC CCC TCC ATC GTC CAC CGC 2468
Ile Ser Lys ain clu Tyr A*p Glu Ser Gly Pro Ser Ile Vai Hii Arg
360 365 370
AAG TGC TTC TAAGGTATGT TCTCCTCGGG AAGCCOGATA CCCGAATCTA AGOTTGACAG 2527 Lys Cys Phe
37S
CTTCGAAAAG ACAAGGCAAC CGGCCAGAAC CAAATCCTTC CACCCTCCSC AAAAGAACGC 2S87
CAAGATCTCG GACTCGCTGG CGACCGATCC AACCTCTACT CACGTGCGCG CCTATCCCAC 2647
TCAAGTCTCA TATTTACGAA AAGTTATTTC ACATGGTCAG GCGGTGGTGC GCGTTGCCTT 2707
TTCTCGCAAC AGACATGACG GCGGCCACTT TTGTAGTCGG ATGCGTTTAG GGATGCGAGC 2767
CTAGGGGTCT AGGAAGCTGA OGTTGATATA CAATAACTTT TTTTGCTTTC CCTTCTAGAC 2827
TCGTTCAATG GGAAGACCTG ACGGAATCGC TTGGCTCTCT AATAGCCAGC TTGATCAGGC 2867
GAGTCGGGTT GTTOTCTTTC GATGTTGASA GCTGCACCAG CGTATCTCTA TGGCCGAGCT 2947
AGGTATTATG GTCTCCTATT TGCAACACTA GAGCTCGCTT GCTCCTTTTT ACCAGCACTG 3 007
TCCTCTGCCA TGCCGCGGCT CCGACTCTCG TCTūGCTTCT CAGACCCTGC CTCGTCAATA 3 067
CTATTATCCC CCCTACTAAC CTCCGCACTA aCCOGTTCTT TGTCCTCCTC CTGCTCGCCG 3127
ATGAGCTTCC TGTACTTGCG CCTCTTCTTC CTGTCGGCGC TGGCAGCCCT CTTCTGCTTG 3187
ATGCGCCCGA CCATGGCGGA CCGGCTCTGC TCCCCGTTGA GCAGCTCGTC GAC 3240
INFORMACIJA APIE SEQ ID No:5
SEKOS CHARAKTERISTIKOS ILGIS: 461 aminorūgštys TIPAS: aminorūgštys GIJŲ SKAIČIUS: 1 TOPOLOGIJA: linijinė
MOLEKULĖS TIPAS: peptidas
KILMĖS ŠALTINIS: Penicillium chrysogenum
YPATYBĖ:
KITA INFORMACIJA: fermento glutamatodehidrogenazės (EC.1.4.1.4) aminorūgščių seka, molekulinė masė 49837 Da.
SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No:5
Met Met Gln Aan Leu Pro Phe Glu Pro Glu Phe Glu Gln Ala Tyr
1 5 10 15
Lys Glu Leu Ala Ser Thr Leu Glu Asn Ser Thr Leu Phe Gln Lys
20 25 30
Lys Pro Glu Tyr Arg Lys Ala Leu Gln Vai Vai Ser Vai Pro Glu
35 40 45
Arg Vai Ile Gln Phe Arg Vai Vai Trp GlU Asp Aap Lys Gly Gln
50 55 60
Vai Gln Ile Asn Arg Gly Tyr Arg Vai Gln Phe Asn Ser Ala Leu
65 70 75
Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Leu Arg Phe Kis Pro Thr Vai Asn Leu
SO 85 90
Ser Ile 'Leu Lys Phe Leu Gly Phe Glu Gln Ile Phe Lys Asn Ala
95 100 105
Leu Thr Gly Leu Asn Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly Ser Asp Phe
110 115 120
Asp Pro Lys Gly Lys Thr Asp Asn Glu Ile Arg Arg Phe Cys vai
125 130 135
Ser ?he Met Thr Glu Leu Cys Lys HiS Ile Gly Ala Asp Thr Asp
140 145 150
vai Pro Ala Gly Asp Ile Gly Vai Thr Gly Arg Glu Vai Gly Phe
155 160 165
Mec Phe Gly Gln Tyr Lys Lys Ile Arg Asn Gln Trp Glu Gly Vai
170 175 1B0
Leu Thr Glv Lys Gly Gly Ser Trp Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro
185 190 195
Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Vai Vai Tyr Tyr Vai Glu Kis Met Ile
200 205 210
Gln Mis Ala Ser Gly Gly Lys Glu Ser Phe Ala Gly Lys Arg Vai
215 220 225
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Aan vai Al· Gln Tyr Ala Ala Leu Lya
Vai 230 235 240
Ile Glu Leu Gly Gly Ser Vai Ile Ser Leu Ser Asp Ser Gln
245 250 255
Gly Ala Leu vai Leu Asn Gly Glu Glu Gly Ser Phe Thr Ala GlU
260 265 270
Glu Ile Asn Thr Ile Ala Glu Ile Lys Vai Gln Arg Lys Gln Ile
275 2B0 2S5
Ala Glu Leu Ala Thr Gln Asp Ala Phe Ser Ser Lya Phe Lys Tyr
290 295 300
Ile Pro Gly Ala Arg Pro Trp Thr Aan Ile Ala Gly Arg Ile Asp
305 310 315
Vai Ala Leu Pro Ser Ala Thr Gln Asn Glu Vai Ser Gly Asp Glu
320 325 330
Ala Lys Ala Leu Ile Ala Ala Gly cys Lys Phe Ile Ala GlU Gly
335 340 345
Ser Asn Met Gly Ser Thr Gln Glu Ala Ile Asp Vai Phe Glu Ala
3S0 355 360
His Arg Asp Ala Asn Pro Gly Ala Ala Ala Ile Trp Tyr Ale Pro
365 370 375
Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Vai Ala Vai Ser Gly Leu Glu
380 385 390
Met Ala Gln Asn. Ser Ala Arg Vai Aan Trp Ser Arg Glu Glu Vai
395 400 405
Asp Ser Arg Leu Lys Lys Ile Met Glu Asp Cys Phe Asn Asn Gly
410 415 420
Leu Ser Thr Ala Lys GlU Tyr Vai Thr Pro Ala Glu Gly Vai Leu
425 430 435
Pro Ser Leu Vai Ala Gly Ser Asn Ile Ala Gly Phe Thr Lys Vai
440 445 450
Ala Glu Ala Met Lys Glu His Gly Asp Trp Trp
455 460
INFORMACIJA APIE SEQ ID No:6
SEKOS CHARAKTERISTIKOS ILGIS: 596 aminorūgštys TIPAS: aminorūgštys GIJŲ SKAIČIUS: 1 TOPOLOGIJA: linijinė
MOLEKULĖS TIPAS: peptidas
KILMĖS ŠALTINIS: Penicillium chrysogenum
YPATYBĖ:
KITA INFORMACIJA: fermento β-Ν-acetilheksozaminidazės (EC.3.2.1.52) aminorūgščių seka, molekulinė masė 66545 Da.
SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No:6
Met 1 . Lys Phe Ala Ser 5 Vai Leu Asn vai Leu 10 Gly Ala Leu Thr Ala 1S
Ala. Ser Ala Vai Gln 20 Vai Asn Pro Leu Pro 25 Ala Pro Arg Asn Ile 30
Thr Trp Gly Ser Ser 35 Gly Pro Ile Gln Vai 40 Asn Asn Leu Asn Leu 45
Asn Gly Pro His Ser 50 Pro Leu Leu Thr Gln SS Ala Trp Glu Arg Ala 60
Trp Glu Thr Ile Thr 65 Thr Leu Gln Trp Vai 70 Pro Ala Ala Vai Glu 75
ser Pro Ile Ala Ser SO Tyr Pro Ala Phe pro 85 Thr Ser Thr Pro Vai 90
Ser ser Ala Pro Lys 95 Ala Lys Arg Ala Pro 100 Ser Gly Ile His Asn 105
Vai Asp Vai His Vai 110 vai Asp Asn Asp Ala 115 Afip Leu Gln Tyr Gly 120
vai Asp Glu Ser Tyr 125 Thr Leu Vai Vai Ser 130 Aep Gly Gly Ile Arg 135
Ile Asn Ser Gln Thr 140 Vai Trp Gly Vai Leu 145 Gln Ala Phe Thr Thr ISO
Leu Gln Gln Ile Ile 155 Ile Ser Asp Gly Lys 160 Gly Gly Leu Ile Ile 165
Siu Gln Pro Vai Lys 170 Ile Lys ASp Ala Pro 175 Leu Tyr Pro His Arg 180
Gly Ile Met Ile Asp 185 Thr Gly Arg Asn Pbe 190 Ile Thr Vai Arg Lys 195
Leu Leu Glu Gln Ile 200 Asp Gly Met Ala Leu 205 Ser Lys Leu Asn Vai 210
Lsu His Trp Eis Leu 215 Asp Asp Ser Gln Ser 220 Trp Pro Met Gln Met 225
Ser Ser Tyr Pro Glu 230 Met Thr Lys A&p Ala 235 Tyr Ser Pro Arg GlU 240
Ile Tyr Thr GlU His 245 Asp Met Arg Arg Vai 250 Ile Ala Tyr Ala Arg 255
Ala Arg Gly Vai Arg 260 Vai Ile Pro Glu vai 265 A2p MCt Pro Ala His 270
Ser Ala Ser Gly Trp 275 Gln Gln vai Asp Pro 280 Glu Ile Vai Ala cys 285
Ala Glu Ser Trp Trp 290 Ser Asn Asp vai Trp 295 Ala Glu His Thr Ala 300
Vai Gln Pro Asn Pro 305 Gly Gln Leu Asp Ile 310 Ile Tyr Pro Lys Thr 315
Tyr Glu Vai Vai Asn 320 Asn Vai Tyr Gln Glu 325 Leu Ser Arg Ile Phe 330
Ser Asp Asn Leu Phe 335 His Vai Gly Ala Asp 340 Glu Ile Gln Pro Asn 345
Cye Tyr Asn Tyr Ser 350 Thr His Ile Thr Lys 355 Trp Phe Ala Glu ASp 360
Pro Ser Arg Thr Tyr 36S Asn Aep Leu Ala Gln 370 Tyr Trp Vai Asp His 375
Ser Met Pro Ile Phe 380 Arg Ser Vai Gly Asp 385 His Arg Arg Leu Met 3 90
Met Trp Glu Asp Ile Ala Ile Ala Thr Glu Ser Ala Η1» Asp Vai
395 400 405
Pro Lys Asp vai ile Met Gln Thr Trp Asn Ser Gly GlU Gly Glu
410 415 420
Gly Asn Ile Lys Lys Leu Thr Ser Ala Gly Tyr Asp Vai Vai Vai
425 430 435
Ser Thr Ser Asp Phe Leu Tyr Leu Asp Cys Gly Arg Gly Gly Tyr
440 445 450
v*l Thr Asn Asp Ala Arg Tyr Asn Vai Gln Ser Asn Thr Asp Gly
455 460 465
Gly Vai Asn Phe Asn Tyr Gly Gly Asp Gly Gly Ser Trp cys Ala
470 475 480
Pro Tyr Lys Thr Trp Gln Arg Ile Tyr ASp Tyr Asp Phe Leu Thr
495 490 495
Asn Leu Thr Ser Ser Glu Ala Lys Bis Ile ile Gly Ala Glu Ala
500 505 510
Pro Leu Trp Ser Glu Gln Vai ASp Asp Vai Thr Vai Ser Ser Vai
515 520 52S
Phe Trp Pr<> Arg Ala Ala Ala Leu Gly Glu Leu Vai Trp Ser Gly
530 535 540
Asn Arg Asp Ala Ala Gly Arg Lys Arg Thr Thr Ser Phe Thr Gln
545 550 555
Arg Ile Leu Asn Phe Arg Glu Tyr Leu vai Ala Asn Gly Vai Met
550 565 S70
Ala Thr Ala Leu Vai Pro Lys Tyr cys Leu Gln His Pro His Ala
575 590 S85
Cys -Asp Leu Tyr Lys Asn Gln Thr vai Met Ser
590 595
INFORMACIJA APIE SEQ ID No:7
SEKOS CHARAKTERISTIKOS ILGIS: 375 aminorūgštys TIPAS: aminorūgštys GIJŲ SKAIČIUS: 1 TOPOLOGIJA: linijinė
MOLEKULĖS TIPAS: peptidas
KILMĖS ŠALTINIS: Penicillium chrysogenum
YPATYBĖ:
KITA INFORMACIJA: γ-aktino baltymo, kurio molekulinė masė 41760 Da aminorūgščių seka.
SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No:7
Met 1 Glu Glu Glu Vai 5 Ala Ala Leu Vai Ile 10 Asp Asn Gly Ser Gly 15
Met Cys Lys Ala Gly 20 Phe Ala Gly Asp Asp 25 Ala Pro Arg Ala Vai 30
Phe Pro Ser Ile Vai 35 Gly Arg Pro Arg His 40 Hia Gly Ile Met Ile 45
Gly Mat Gly Gln Lys SO Asp Ser Tyr Vai Gly 55 Asp Glu Ala Gln Ser 60
Lys Arg Gly Ile Leu 65 Thr Leu Arg Tyr Pro 70 Ile Glu His Gly Vai 75
Vai Thr Asn Trp Asp B0 Asp Met Glu Lys Ile 05 Trp His His Thr Phe 90
Tyr Asn Glu Leu Arg >5 Vai Ala Pro Glu Glu 100 Hia Pro Ile Leu Leu 105
Thr Glu Ala Pro Ile 110 Asn Pro Lya Phe Aan 115 Arg Glu Lys Met Thr 120
Gln Ile Vai Phe Glu 125 Thr Phe Asn Ala Pro 130 Ale Phe Tyr Vai Ser 135
Ile Gln Ala Vai Leu 140 Ser Leu Tyr Ala Ser 145 Gly Arg Thr Thr Gly 150
11« Vai Leu Asp Ser 155 Gly Asp Gly Vai Thr 160 His Vai Vai Pro 11« 165
Tyr Glu Gly Phe Ser 170 Leu Pro His Ala Ile 17S Ser Arg Vai Asp Met 1Θ0
Ala Gly Arg Asp Leu įas Thr ASp Tyr Leu Mec 190 Lys Ile Leu Ala Glu 195
Arg Gly Tyr Thr Phe 200 Ser Thr Thr Ala Glu 205 Arg Glu Ile vai Arg 210
Asp Ile Lys Glu Lys 215 Leu Cys Tyr vai Ala 220 Leu Asp Phe Glu Gln 225
Glu Ile Gln Thr Ala 230 Ser Gln Ser Ser ser 235 Leu Glu Lys Ser Tyr 240
Glu Leu Pro Asp Gly 245 Gln Vai Ile Thr Ile 250 Gly Asn Glu Arg Phe 25S
Arg Ala Pro Glu Ala ISO Leu Phe Gln Pro Asn 265 vai Leu Gly Leu Glu 270
Ser Gly Gly Ile His 275 Vai Thr Thr Phe Asn 2B0 Ser Ile Met Lys Cys 205
Asp Vai Asp Vai Arg 230 Lys Asp Leu Tyr Gly 295 Aan Ile Vai Met Ser 300
Gly Gly Thr Thr Met 305 Tyr Pro Gly Ile Ser 310 Asp Arg Met Gln Lys 315
Glu Ile Thr Ala Leu 320 Ala Pro ser Ser Met 325 Lys Vai Lys Ile Ile 330
Ala Pro Pro Glu Arg 335 Lys Tyr Ser Vai Trp 340 Ile Gly Gly Ser Ile 345
Leu Ala Ser Leu ser 350 Thr Phe Gln Gln Met 355 Trp Ile Ser Lys Gln 360
Glu Tyr Asp Glu ser 365 Gly Pro Ser Ile Vai 370 His Arg Lys Cys Phe 375
INFORMACIJA APIE SEQ ID No:8
SEKOS CHARAKTERISTIKOS
ILGIS: 375 aminorūgštys
TIPAS: aminorūgštys
GIJŲ SKAIČIUS: 1
TOPOLOGIJA: linijinė MOLEKULĖS TIPAS: peptidas KILMĖS ŠALTINIS: Acremonium chrysogenum YPATYBĖ:
KITA INFORMACIJA: γ-aktino baltymo, kurio molekulinė masė 41612 Da aminorūgščių seka.
SEKOS APRAŠYMAS: SEQ ID No:8
Met 1 Glu Glu Glu Vai 5 Ala Ala Leu Vai Ile 10 Asp Asn Gly Ser Gly 15
Met Cys Lys Ala Gly 20 Phe Ala Gly Asp Asp 25 Ala Pro Arg Ala Vai 30
Phe Pro Ser Ile Vai 35 Gly Arg Pro Arg Uis 40 His Gly Ile Met Ile 45
Gly Met Gly Gln Lys 50 Asp Ser Tyr Vai Gly 55 Asp Glu Ala Gln Ser 60
Lys Arg Gly Ile Leu €5 Thr Leu Arg Tyr Pro 70 Ile Glu Kis Gly Vai 75
Vai Thr Asn Trp Asp 80 Asp Met Glu Lys Ile 65 Trp His Kis Thr Phe 90
Tyr Asą Glu Leu Arg 95 Vai Ala Pro Glu Glu 100 His Pro Vai Leu Leu 105
Thr Glu Ala Pro Ile 110 Asn Pro Lys 5er Asu 115 Arg Glu Lys Met Thr 120
Gln Ile Vai Phe Glu 125 Thr Phe A*a Ala Pro 130 Ala Phe Tyr Vai Ser 13S
Ile Gln Ala Vai Leu 140 ser Leu Tyr Ala Ser 145 Gly Arg Thr Thr Gly 150
Ile Vai Leu Asp ser 155 Gly Asp Gly Vai Thr 160 HiE Vai Vai Pro Ile 165
Tyr GlU Gly Phe Ala 170 '.Leu Pro His Ala Ile 175 Ala Arg Vai Asp Met 180
Ala Gly Arg Asp Leu 185 Thr ASp Tyr Leu Met 190 Lys Ile Leu Ala Glu 195
Arg Gly Tyr Thr Phe 200 Ser Thr Thr Ala Glu 205 Arg Glu Ile Vai Arg 210
A>p 11« Ly» Glu Lys 215 Leu Cys Tyr Vai Ala 220 Leu Asp Pha Glu Gln 225
Glu Ile Gln Thr Ala 230 Ala Gln Ser Ser Ser 235 Leu Glu Lys Ser Tyr 240
Glu Leu Pro Asp Gly 245 Glu Vai Ile Thr Ile 250 Gly Asn Glu Arg Phe 255
Arg Ala Pro Glu Ala 260 Leu Phe Gln Pro Ser 265 Vai Leu Gly Leu Glu 270
Ser Gly Gly Ile Kis 275 vai Thr Thr Phe Asn 280 Ser Ile Met Lys Cys 265
A.p Vai Aep Vai Arg 290 Lys Asp Leu Tyr Gly 29S Asn Ile Vai Met Ser 300
OI y Gly Thr Thr Met 305 Tyr Pro Gly Leu Ser 310 Asp Arg Met Gln Lys 31S
Glu Ile Thr Ala Leu 320 Ala Pro ser Ser Met 325 Lys Vai Lys Ile Ile 330
Ala Pro Pro Asp Gly 335 Lys Tyr Ser Vai Trp 340 Ile Gly Gly Ser Ile 345
Leu Ala Ser Leu Ser 350 Thr Phe Gln Gln Met 355 Trp Ile Ser Lys Thr 360
Glu Tyr Asp Glu Glu 365 Arg Pro Ser Ile Vai 370 Kis Arg Lys Cys Phe 375

Claims (42)

  1. IŠRADIMO APIBRĖŽTIS
    1. Genų ekspresijos padidinimo arba blokavimo mikroorganizmuose būdas, besiskiriantis tuo, kad genų, dalinių genų sekų arba DNR fragmentų ekspresiją minėtuose mikroorganizmuose vykdo kontroliuojant Penicillium chrysogenum gdh geno promotoriumi.
  2. 2. Genų ekspresijos padidinimo arba blokavimo mikroorganizmuose būdas, besiskiriantis tuo, kad genų, dalinių genų sekų arba DNR fragmentų ekspresiją minėtuose mikroorganizmuose vykdo kontroliuojant Penicillium chrysogenum hex geno promotoriumi.
  3. 3. Baltymų ekstraląstelinės ekspresijos mikroorganizmuose būdas, b e siskiriantis tuo, kad minėtuose mikroorganizmuose ekspresuojamą geną sulieja su Penicillium chrysogenum hex genu.
  4. 4. Genų ekspresijos padidinimo arba blokavimo mikroorganizmuose būdas, besiskiriantis tuo, kad genų, dalinių genų sekų arba DNR fragmentų ekspresiją minėtuose mikroorganizmuose vykdo kontroliuojant Penicillium chrysogenum act genu.
  5. 5. Genų ekspresijos padidinimo arba blokavimo mikroorganizmuose būdas, besiskiriantis tuo, kad genų, dalinių genų sekų arba DNR fragmentų ekspresiją minėtuose mikroorganizmuose vykdo kontroliuojant Acremonium chrysogenum act genu.
  6. 6. Būdas pagal 1-5 punktą, besiskiriantis tuo, kad transformuotas mikroorganizmas yra eukariotas, išskyrus žmogų, geriausia Penicillium, Aspergillus arba Acremomonium.
  7. 7. Būdas pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad geriausias naudojamas mikroorganizmas yra Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans arba Acremomonium chrysogenum.
  8. 8. 2811 bp DNR darinys, išskirtas iš P. chrysogenum, apribotas Sau3AI ir Xbal restriktazių kirpimo vietomis, turintis gdh geno promotorių.
  9. 9. 7737 bp DNR darinys, išskirtas iš P. chrysogenum, apribotas BamHl ir Sacl restriktazių kirpimo vietomis, turintis hex geno promotorių.
  10. 10. 4947 bp DNR darinys, išskirtas iš P. chrysogenum, apribotas Bglil ir EcoRI restriktazių kirpimo vietomis, turintis act geno promotorių.
  11. 11. 8650 bp DNR darinys, išskirtas iš A. chrysogenum, apribotas dviem Hindlll restriktazių kirpimo vietomis, turintis act geno promotorių.
  12. 12. DNR seka, identifikuota kaip SEQ No:1, turinti P. chrysogenum gdh geną.
    geną.
    geną.
  13. 13. DNR seka, identifikuota kaip SEQ No:2, turinti P. chrysogenum hex
  14. 14. DNR seka, identifikuota kaip SEQ No:3, turinti P. chrysogenum act
  15. 15. DNR seka, identifikuota kaip SEQ No:4, turinti A. chrysogenum act geną.
  16. 16. Nukleotidų sekos, besiskiriančios tuo, kad restrikcijos sąlygomis jos gali būti hibridizuojamos su DNR dariniais pagal 8-15 punktą.
  17. 17. Aminorūgščių seka, identifikuota kaip SEQ ID No:5, atitinkanti P. chrysogenum fermentą glutamatdehidrogenazę.
  18. 18. Aminorūgščių seka, identifikuota kaip SEQ ID No:6, atitinkanti P. chrysogenum fermentą β-Ν-acetilheksozaminidazę.
  19. 19. Aminorūgščių seka, identifikuota kaip SEQ ID No:7, atitinkanti P. chrysogenum baltymą y-aktiną.
  20. 20. Aminorūgščių seka, identifikuota kaip SEQ ID No:8, atitinkanti A. chrysogenum baltymą y-aktiną.
  21. 21. Vektoriai, turintys DNR darinius pagal 8-16 punktus arba jų fragmentus.
  22. 22. Vektoriai pagal 21 punktą, besiskiriantys tuo, kad juos sudaro plazmidė.
  23. 23. Vektoriai pagal 22 punktą, besiskiriantys tuo, kad juos sudaranti plazmidė yra pALP784, pALP785 ir pALfleo7.
  24. 24 Vektoriai pagal 22 punktą, besiskiriantys tuo, kad juos sudaranti plazmidė yra pALP295, pALP319, pALP377, pALP388 ir pALP480.
  25. 25. Vektoriai pagal 22 punktą, besiskiriantys tuo, kad juos sudaranti plazmidė yra pALP315 ir pALP316.
  26. 26. Vektoriai pagal 22 punktą, besiskiriantys tuo, kad juos sudaranti plazmidė yra pALC52 ir pALC53.
  27. 27. Transformuotų organizmų, išskyrus žmogų, su padidinta homologinių arba heterologinių genų ekspresija gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad į jį įeina tokios operacijos:
    a) vektorių, kurie turi pilnas arba dalines SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3 arba SEQ ID No:4 arba jų rekombinantinius DNR darinius, konstravimas:
    b) vektorių įvedimas į šeimininkų, išskyrus žmogų, organizmus, gaunant transformuotus organizmus, kurie ekspresuoja homologinius arba heterologinius genus:
    c) transformuotų organizmų, pasižyminčių padidinta homologinių arba heterologinių genų ekspresija, lyginant su netransformuotais kontroliniais organizmais, atrinkimas.
  28. 28. Transformuotų organizmų, išskyrus žmogų, sugebančių gaminti ekstraląstelinius baltymus, gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad į jį įeina tokios operacijos:
    a) vektorių, turinčių pilną arba dalinę SEQ ID No:2 arba jos rekombinantinius DNR darinius, konstravimas;
    b) vektorių įvedimas į šeimininkų, išskyrus žmogų, organizmus, gaunant transformuotus organizmus, kurie ekspresuoja ir sekretuoja bent vieną baltymą;
    c) transformuotų organizmų, galinčių sekretuoti bent vieną baltymą aukštesniu lygiu nei netransformuoti kontroliniai organizmai, atrinkimas.
  29. 29. Transformuotų organizmų, išskyrus žmogų, su antisensine genų ekspresija, pilnai arba dalinai blokuojant jų aktyvumą, gavimo būdas, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad į jį įeina tokios operacijos:
    a) vektorių, turinčių pilnas arba dalines SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3 arba SEQ ID No:4 arba jų rekombinantinius DNR darinius, konstravimas:
    b) vektorių įvedimas į šeimininkų, išskyrus žmogų, organizmus, gaunant transformuotus organizmus su antisensine genų ekspresija;
    c) transformuotų organizmų, pasižyminčių visiškai arba dalinai blokuota genų ekspresija, lyginant su netransformuotais kontroliniais organizmais, atrinkimas.
  30. 30. Transformuotų organizmų gavimo būdas pagal 27 ir 29 punktus, b e siskiriantis tuo, kad jame naudoja vektorius pagal 21-26 punktus arba iš jų gautus vektorius.
  31. 31. Transformuotų organizmų gavimo būdas pagal 28 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad jame naudoja vektorius pagal 24 punktą arba iš jų gautus vektorius.
  32. 32. Transformuotų organizmų gavimo būdas pagal 27-31 punktus, besi skiriantis tuo, kad jame šeimininko organizmas yra eukariotas, išskyrus žmogų, geriausia Penicillium, Aspergillus arba Acremomonium.
  33. 33. Būdas pagal 32 punktą, besiskiriantis tuo, kad jame geriausias mikroorganizmas yra Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans arba Acremomonium chrysogenum.
  34. 34. Transformuotų organizmų gavimo būdas pagal 27-31 punktus, bes i s k i r i a.n t i s tuo, kad jame šeimininko organizmas yra prokariotas, geriausia Escherichia coli arba aktinomicetas.
  35. 35. Transformuoti organizmai, išskyrus žmogų, besiskiriantys tuo, kad j juos yra įvestos DNR sekos pagal 8-16 punktus, dalinai arba pilnai jeinančios j vektorius pagal 21-26 punktus, gaunami 27-34 punktuose aprašytais būdais.
  36. 36. Transformuotas organizmas pagal 35 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra prokariotas, geriausia Escherichia coli arba aktinomicetas.
  37. 37. Transformuotas organizmas pagal 35 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra eukariotas, geriausia Penicillium, Aspergillus arba Acremomonium.
  38. 38. Transformuotas organizmas pagal 36 punktą, besiskiriantis tuo, kad geriausiu atveju jis yra Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans, Acremomonium chrysogenum arba Saccharomyces cerevisiae.
  39. 39. Organizmas pagal 36 punktą, besiskiriantis tuo, kad jis yra grynas kamienas, būtent CECT4849, CECT4852, CECT4851 arba jų mutantai ir jų transformuoti dariniai.
  40. 40. Transformuotų organizmų pagal 35-39 punktus panaudojimas antibiotikų gamybai.
  41. 41. Transformuotų organizmų pagal 35-39 punktus panaudojimas penicilino gamybai.
  42. 42. Transformuotų organizmų pagal 35-39 punktus panaudojimas cefalosporinų gamybai.
LT98-152A 1997-03-05 1998-10-23 Glutamato dehidrogenazės, beta-n-acetilheksozaminidazės ir gama-aktino genų promotoriai bei jų panaudojimas filamentinių grybų ekspresijos, sekrecijos ir antisensinėse sistemose LT4557B (lt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES009700482A ES2127697B1 (es) 1997-03-05 1997-03-05 Promotores de los genes glutamato deshidrogenasa, beta-n-acetilhexosaminidasa y gamma-actina y su utilizacion en sistemas de expresion, secrecion y antisentido de hongos filamentosos.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
LT98152A LT98152A (lt) 1999-06-25
LT4557B true LT4557B (lt) 1999-10-25

Family

ID=8298517

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
LT98-152A LT4557B (lt) 1997-03-05 1998-10-23 Glutamato dehidrogenazės, beta-n-acetilheksozaminidazės ir gama-aktino genų promotoriai bei jų panaudojimas filamentinių grybų ekspresijos, sekrecijos ir antisensinėse sistemose

Country Status (17)

Country Link
US (2) US6300095B1 (lt)
JP (1) JP2000509613A (lt)
KR (1) KR20000065202A (lt)
CN (1) CN1219200A (lt)
AU (1) AU6101198A (lt)
CA (1) CA2253250A1 (lt)
CZ (1) CZ353598A3 (lt)
EE (1) EE9800381A (lt)
ES (3) ES2127697B1 (lt)
HU (1) HUP0000870A3 (lt)
IL (1) IL126647A0 (lt)
LT (1) LT4557B (lt)
LV (1) LV12264B (lt)
PL (1) PL329722A1 (lt)
SK (1) SK149598A3 (lt)
WO (1) WO1998039459A1 (lt)
ZA (1) ZA981896B (lt)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6610839B1 (en) * 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
US6777203B1 (en) * 1997-11-19 2004-08-17 Geron Corporation Telomerase promoter driving expression of therapeutic gene sequences
ES2127697B1 (es) * 1997-03-05 2000-03-16 Antibioticos Sau Promotores de los genes glutamato deshidrogenasa, beta-n-acetilhexosaminidasa y gamma-actina y su utilizacion en sistemas de expresion, secrecion y antisentido de hongos filamentosos.
US7378244B2 (en) * 1997-10-01 2008-05-27 Geron Corporation Telomerase promoters sequences for screening telomerase modulators
ES2143408B1 (es) * 1998-04-02 2000-12-01 Urquima Sa Promotor y construcciones para expresion de proteinas recombinantes en hongos filamentosos.
WO2000052176A1 (de) * 1999-03-03 2000-09-08 Cilian Ag β-HEXOSAMINIDASE SOWIE DIESE KODIERENDE DNA-SEQUENZ AUS CILIATEN UND DEREN VERWENDUNG
US20090104165A1 (en) * 2004-09-22 2009-04-23 Bioworks, Inc. Transgenic strains of trichoderma and their use in biocontrol
EP1801221A1 (en) * 2005-12-22 2007-06-27 Sandoz AG Promoter sequences
CN102127546B (zh) * 2010-11-24 2012-10-24 山东农业大学 一种骨骼肌特异性actin启动子及其应用
CN116004892B (zh) * 2022-10-31 2025-04-29 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 一种香蕉灰纹病菌的pcr检测引物及检测方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8508800D0 (en) * 1985-04-04 1985-05-09 Glaxo Group Ltd Microbiological process
FI864473L (fi) * 1985-11-20 1987-05-21 Panlabs Inc Sammansatta yttryckskassetter foer fungaltransformering.
ES2127697B1 (es) * 1997-03-05 2000-03-16 Antibioticos Sau Promotores de los genes glutamato deshidrogenasa, beta-n-acetilhexosaminidasa y gamma-actina y su utilizacion en sistemas de expresion, secrecion y antisentido de hongos filamentosos.

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOHN ME: "Structural characterization of genes corresponding to cotton fiber mRNA, E6: reduced E6 protein in transgenic plants by antisense gene", PLANT MOL BIOL., 1996, pages 297 - 306
KINNAIRD JH, FINCHAM JR.: "The complete nucleotide sequence of the Neurospora crassa am (NADP-specific glutamate dehydrogenase) gene.", GENE, 1983, pages 253 - 260, XP023542610, DOI: doi:10.1016/0378-1119(83)90195-6
KOLAR M. ET AL.: "Transformation of Penicillium chrysogenum using dominant selection markers and expression of an Escherichia coli lacZ fusion gene", GENE, 1988, pages 127 - 134, XP023544459, DOI: doi:10.1016/0378-1119(88)90586-0
KUNKEL, W. ET AL.: "Genetic instability of industrial strains of Penicillium chrysogenum", APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL, 1992, pages 499 - 502

Also Published As

Publication number Publication date
US6300095B1 (en) 2001-10-09
ES2149706B1 (es) 2001-05-16
KR20000065202A (ko) 2000-11-06
LT98152A (lt) 1999-06-25
ES2149707A1 (es) 2000-11-01
CZ353598A3 (cs) 1999-02-17
ES2149706A1 (es) 2000-11-01
US6558921B1 (en) 2003-05-06
EE9800381A (et) 1999-04-15
ZA981896B (en) 1998-09-14
CN1219200A (zh) 1999-06-09
PL329722A1 (en) 1999-04-12
LV12264A (lv) 1999-04-20
AU6101198A (en) 1998-09-22
HUP0000870A3 (en) 2001-09-28
IL126647A0 (en) 1999-08-17
WO1998039459A1 (es) 1998-09-11
ES2149707B1 (es) 2001-05-16
LV12264B (en) 1999-10-20
ES2127697A1 (es) 1999-04-16
SK149598A3 (en) 2000-03-13
ES2127697B1 (es) 2000-03-16
HUP0000870A2 (en) 2000-07-28
CA2253250A1 (en) 1998-09-11
JP2000509613A (ja) 2000-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kimura et al. Cloning of the blasticidin S deaminase gene (BSD) from Aspergillus terreus and its use as a selectable marker for Schizosaccharomyces pombe and Pyricularia oryzae
US20080213901A1 (en) Methods for producing heterologous polypeptides in trichothecene-deficient filamentous fungal mutant cells
JP2012504390A (ja) 糸状菌細胞におけるポジティブ及びネガティブ選択遺伝子の使用方法
NO316742B1 (no) Biologisk fremgangsmate for fremstilling av 7-ADCA
LT4557B (lt) Glutamato dehidrogenazės, beta-n-acetilheksozaminidazės ir gama-aktino genų promotoriai bei jų panaudojimas filamentinių grybų ekspresijos, sekrecijos ir antisensinėse sistemose
HU212767B (en) One-step process for producing 7-aminocephem compound or salts thereof, expression vector and microorganism for this purpose
JP2002515252A (ja) 糸状菌変異体細胞においてポリペプチドを生産するための方法
JP5297656B2 (ja) 新規枯草菌変異株及びタンパク質の製造方法
CA2045839C (en) Cloned n-methylhydantoinase
CA2365092A1 (en) Sorbitol dehydrogenase, gene encoding the same and use thereof
EP1174499B1 (en) Novel amidase gene
CA2045838A1 (en) Cloning and overexpression of glucose-6-phosphate dehydrogenase from leuconostoc dextranicus
EP0302838B1 (en) Cloning of the gene coding the isoamylase enzyme and its use in the production of said enzyme
US6903193B1 (en) Methods for producing heterologous polypeptides in trichothecene-deficient filamentous fungal mutant cells
JP4860820B2 (ja) シクロヘキサデプシペプチド欠損細胞におけるポリペプチドの産生方法
US5385841A (en) PO438, a new calcium-regulated promoter
AU782525B2 (en) Regulatory sequences functioning in filamentous fungi
JP2010022334A (ja) 立体選択性を有するニトリルヒドラターゼ遺伝子
JP2000093182A (ja) 真菌防除方法
EP3676370B1 (en) Compositions and methods using methanotrophic s-layer proteins for expression of heterologous proteins
MXPA98009198A (en) PROMOTERS OF THE GENES GLUTAMATE DESHYDROGENASE,&amp;bgr;-N-ACETYLHEXOSAMINIDASE AND$b(g)-ACTINE, AND THEIR USE IN SYSTEMS OF EXPRESSION, SECRETION AND ANTI-SENS IN FILAMENTARY FUNGI
RU2202616C2 (ru) Способ получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты, вектор экспрессии, рекомбинантный штамм
JPH05192162A (ja) Ｄｎａおよびその用途
JPH08214884A (ja) 新規なグリセロールキナーゼをコードするｄｎａ及び該ｄｎａを保有する実質的に純粋な微生物
JPH01101887A (ja) リンゴ酸酵素をコードするｄｎａ，該ｄｎａを含む組み換え体ｄｎａおよび該組み換え体ｄｎａにより形質転換された微生物

Legal Events

Date Code Title Description
MM9A Lapsed patents

Effective date: 20010305