JP2000509613A - 遺伝子グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、β―Ｎ―アセチルヘキソサミニダーゼ及びγ―アクチンのプロモーター並びにそれらの糸状菌発現、分泌及びアンチセンスシステムにおける使用 - Google Patents

遺伝子グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、β―Ｎ―アセチルヘキソサミニダーゼ及びγ―アクチンのプロモーター並びにそれらの糸状菌発現、分泌及びアンチセンスシステムにおける使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、遺伝子グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、β−アセチルヘキソサミニダーゼ及びγ−アクチンのプロモーター並びに糸状菌の発現、分泌及びアンチセンスのシステムにおけるそれらの使用に関する。本発明は、Ｐ．キリソゲヌム及びＡ．キリソゲヌム並びに関連種のために役立つ発現及び分泌の能力のあるベクターの作製のために用いることができる、（Ｉ）ペニシリウム・キリソゲヌムのNADP依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EC．１．４．１．４）、（II）ぺニシリウム・キリソゲヌムのγ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（EC．３．２．１．52）及び（III）ペニシリウム・キリソゲヌム及びアクレモニウム・キリソゲヌムのγ−アクチンをコードする遺伝子のプロモーターの使用にも関する。該プロモーターは、アンチセンス構造を通して遺伝子発現を遮断するのに用いることもできる。上述のプロモーターの制御下において、糸状菌内で他の遺伝子の発現を行い、それによりそれに固有の抗生物質及び／又はタンパク質の生産を増加させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ及 びγ−アクチンのプロモーター並びにそれらの糸状菌発現、分泌及びアンチセン スシステムにおける使用 発明の分野 本発明は、ペニシリウム・キリソゲヌム(Penicillium chrysogenum)のgdh及びhex 遺伝子の、並びにＰ．キリソゲヌム（P ．chrysogenum）の及びアクレモニウ ム・キリソゲヌム（Acremonium chrysogenum）のact遺伝子の発現の技術分野に 関する。該遺伝子のヌクレオチド配列の分析から、転写開始部位を含み、そして Ｐ．キリソゲヌム及びＡ．キリソゲヌム並びに関連種のために役立つ強力な発現 及び分泌ベクターを作製するのに用いることができるプロモーター領域の存在が 予想される。更に、これらのプロモーターは、アンチセンス構成物により遺伝子 発現を遮断するのに用いることができる。糸状菌中の他の遺伝子の発現は、それ に固有の抗生物質及び／又はタンパク質の生産量を増加させると共に、上述のプ ロモーターの制限下で行うことができる。 先行技術 Ｐ．キリソゲヌム及びＡ．キリソゲヌムは、それらの各々ペニシリン及びセフ ァロスポソンを生産する能力により、工業的に関心のある糸状菌である。ここ数 10年の間、両方の微生物に適用できる遺伝子操作技術のかなりの進展があった。 Ｐ．キリソゲヌム及びＡ．キリソゲヌムの遺伝子操作のための技術は、選択マー カーとしてフレオマイシン耐性遺伝子（以後、bleR遺伝子と呼ぶ）（Kolar,M ら（1988），Gene 62，127-134）を用いるベクターでのプロトプラストの形質転 換、並びに関心の遺伝子の付加的な完全な複数の発現及びその発現を改良するこ とができる他のプロモーターによる問題の遺伝子のプロモーターの置換を含む。 真菌、例えばＰ．キリソゲヌムＡ．キリソゲヌムにおける同種遺伝子の発現はネ ガティブ（負）に制御することができるが、異種遺伝子の場合、それらのプロモ ーターが前記真菌により有効に認識され得ることが可能である。これらの問題を 避ける目的で、構成的に発現される遺伝子であって、該発現が、好ましくは、負 の代謝制御を示さない遺伝子、即ち以後強力プロモーターと呼ぶものを同定し、 クローン化した。一般に、高発現遺伝子は、高転写レベルを容易にしそして一次 細胞代謝に関連する機能において根本的な役割を果たすプロモーター領域内にシ グナルを有することが考えられる。これらの遺伝子は、NADP依存性グルタミン酸 デヒドロゲナーゼ（EC．１．４．１．４）（以後、gdh遺伝子と呼ぶ）、β−Ｎ −アセチルヘキソサミニダーゼ（EC．３．２．１．52）（以後、hex遺伝子と呼 ぶ）及びγ−アクチン（以後、act遺伝子と呼ぶ）をコードする遺伝子を含む。 本発明に用いられる微生物以外の微生物からのgdh，hey及びact遺伝子の先行 文献がある。最も関連のある文献は、（Ｉ）真菌ニューロスポラ・クラッサ(Neu rospora crassa )のgdh遺伝子のヌクレオチド配列（Kinnaird，J．H．及びFincha m，J．R．S．(1983)，Gene 26，253-260）並びにアスペルギルス・ニジュランス （Aspergillus nidulans）のgdhA遺伝子の発現の制御(Hawkins，A．R.ら、(1989 )，Mol-Gen-Genet-418，105-111)，(II)カンジダ・アルビカンス（Candida albi cans）のhex1遺伝子のクローニング及び発現(Cannon，R．D．ら（1994），J．Ba cteriol．2640-2647)並びに(III)Ａ．ニジュランスのact遺伝子のキャラクタリ ゼーション（Fidel, Sら（1988，Gene 70，283-293）を含む。pcbC又はpenDE遺伝子のプロモーターを 用いるＰ．キリソゲヌム中の異種遺伝子の発現は、Cantwell，C．A．ら(1992，P roc．R．Soc．London．Ser．B 248，283-289)により記載される。更に、β−イ ソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（日本特許公開公報第80295/1989号 ）及びグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（欧州特許出願03 76226A1/1989）のプロモーターを用いるＡ．キリソゲヌムにおける異種遺伝子の 発現も開示されている。 工業株における遺伝子発現の不活性化は、不要な酵素活性の除去のために時々 、必要である。多くの工業株の倍数性のレベルは多くの場合、直接の遺伝子破壊 により発現を遮断するのを困難にする。強力なプロモーターの制御下で発現され るアンチセンス構成物の開発は遺伝子発現の妨害を可能にする。この型の構成物 は、それらの，499-502)が完全な遺伝子不活性化を得るのを困難にするという事実のため、工 業株において特に役立つ。酵素活性を遮断するためのアンチセンス構成物の使用 は、イースト(Atkins，Dら(1994)，Biol．Chem．H-S 375，721-729)及び植物(Ha mada，T．(1996)，Transgenic Research 5，115-121；John，M．E．(1996)Plant Mol．Biol．30，297-306)において開示されている。hexプロモーターは、細胞 外タンパク質の発現のために用いることができる細胞外酵素をコードするという 特別の特徴を有する。 しかしながら、本発明に用いられる糸状菌の遺伝子配列又はその発現により合 成される酵素の配列を記載する先行技術文献はない。また、発現、分泌又は遺伝 子発現の不活性化のために本発明に記載される真菌の遺伝子の強力なプロモータ ーの使用の、前記先行技術におけるいずれの記載もない。 発明の詳細な記載 特定の遺伝子を過剰発現するための強力なプロモーターの使用は、ペニシリン 又はセファロスポリンの生産における改良を、及びそれらから得られる新しい抗 生物質の合成を導くことができる。 本発明は、強力なプロモーターの制御下で同種又は異種遺伝子を発現する能力 を有するＰ．キリソゲヌム及びＡ．キリソゲヌムの株を得るための新しい方法を 記載される。Ｐ．キリソゲヌムのNADP依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（EC ．１．４．１．４）−gdh遺伝子−、Ｐ．キリソゲヌムのβ−Ｎ−アセチルヘキ ソサミニダーゼ（EC．３．２．１．52）−hex遺伝子−並びにＰ．キリソゲヌム 及びＡ．キリソゲヌムのγ−アクチン−act遺伝子−をコードする遺伝子に対応 するプロモーターのキャラクタリゼーション及び後の使用が記載される。上述の 株におけるペニシリン及び／又はセファロスポリンの生合成に関連する遺伝子を 過剰発現するための前記プロモーターの使用は本発明の目的の１つである。これ らのプロモーターは、アンチセンス構成物により遺伝子発現を遮断するのにも用 いることができる。 本発明は、核酸ドナーとしてのＰ．キリソゲヌム及びＡ．キリソゲヌムに基づ く。ゲノムDNAを精製した後、両方の微生物のDNAライブラリーを、実施例１及び ４に記載されるように作製し、それらを、（Ｉ）Ｐ．キリソゲヌムの同種遺伝子 をクローン化するためのＮ．クラッサ(N ．crassa)のgdh遺伝子に対応する合成オ リゴヌクレオチド、（II）Ｐ．キリソゲヌムのhex遺伝子をクローン化するため の酵素β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼのアミノ末端配列に基づいて合成し たオリゴヌクレオチドの組合せ並びに（III）Ｐ．キリソゲヌム及びＡ．キリソ ゲヌムの同種遺伝子をクローン化するためのＡ．ニジュランスのact遺伝子のフ ラグメントでスクリーニ ングした。対応するプローブとの正の（positive）ハイブリダイゼーションを行 う能力により精製されたクローンを次に分析し、求める遺伝子の存在を決定した 。 Ｐ．キリソゲヌムのgdh遺伝子を、7.2kb EcoR Ｉフラグメントにおいて、並び に各々2.9及び1.5kbの２つのBamH Ｉフラグメントにおいて同定した。それを含む DNA領域の制限地図を図１に示す。次に、そのATG翻訳開始コドンが位置922にお いて見い出されTAA翻訳終止コドンが位置2,522において見い出される極めて著し い優位コドン用法パターンと共に、オープンリーディングフレーム(ORF)を含む2 ,816ヌクレオチド配列（配列番号：１）を決定した。159bp及び56bpの２つのイ ントロンの存在も、各々971-1130及び1262-1318の位置の間で決定した。前記ORF は、6.18の等電点で49,837Daのタンパク質をコードし、その461アミノ酸配列（ 配列番号：５）はＮ．クラッサ(N ．crassa)のNADP依存性グルタミン酸デヒドロ ゲナーゼ酵素のアミノ酸配列と72.4％の同一性を有する。そのプロモーター領域 において、高度に発現される遺伝子内に現れるものに似たピリミジンの豊富なゾ ーン、並びに２つの推定されるTATAボックス（このボックス）は、転写開始の部 位から上流30〜50bpの真菌の特定のプロモーター内に見い出される）(Davis，M ．A．及びHynes，M．J．(1991)，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，San Diego，California)及びCCAATボックス（転写開始の部位から上流5 0〜200bpの真核生物遺伝子のプロモーターの約30％内に見い出される）(Bucher ，P．(1990)J．Mol．Biol．212：563-578)が見い出される。次にこのプロモータ ーを、Ｐ．キリソゲヌム及びＡ．キリソゲヌム内で、β−ガラクトシダーゼをコ ードする大腸菌遺伝子（以後、lacZ遺伝子と呼ぶ）及びＳ．ヒンドゥスタヌス(S ．hindusanus )のbleR 遺伝子を発現させるのに用いた。プラス ミドpSKGSu及びpALfleo７（図５）を、実施例に記載されるように、この目的の ために作製した。得られた結果から、gdhプロモーター（以後、Pgdhと呼ぶ）は 、Ｐ．キリソゲヌム及びＡ．キリソゲヌム並びに大腸菌においても異種lacZ及びbleR 遺伝子の発現を制御することができると予想される。 強力なプロモーターの制御下で発現されるアンチセンス構成物の開発は、遺伝 子発現の妨害を可能にする。実施例１のセクション1.3に記載されるように、こ の目的のために、プラスミドpALP888（図５）を作製した。得られた結果は、Pgd h を用いるアンチセンス構成物の使用によりＰ．キリソゲヌムにおいて不要な酵 素活性を全体的又は部分的に遮断する可能性を確認する。 Ｐ．キリソゲヌムのhex遺伝子を、3.2kb Sac Ｉフラグメントにおいて及び2.1 kb Sal Ｉフラグメントにおいて同定した。hex遺伝子を含むDNA領域の制限地図 を図２に示す。次に、5,240ヌクレオチド配列（配列番号：２）を決定し、その １つがhex遺伝子に適合した極めて著しく優位コドン用法パターンと共に２つのO RFが存在することを確認した。hex遺伝子のATG翻訳開始コドンは位置1,324にお いて見い出され、そしてTGA終止コドンは位置3,112において見い出された。前記 ORFはイントロンを有さず、5.34の等電点である66,545Daのタンパク質をコード し、その596アミノ酸配列（配列番号：６）はカンジダアルビカンス（Candida a lbicans ）のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼのアミノ酸配列と49.0％の同 一性を有する。更に、その予想されるアミノ酸配列は、位置19-40及び99-120に おいて、精製された酵素から化学的に決定されたポリペプチドを含む。そのプロ モーター領域において、２つのピリミジンの豊富なゾーン、予想されるTATAボッ クス及びCAATボックスが見い出される。次にこのプロモーターを、Ｐ．キリソゲ ヌムにおいてＳ． ヒンドゥスタヌス(S ．hindutanus)のbleR遺伝子を発現させるのに用いた。プラ スミドpALP480（図６）を、実施例２に記載されるように、この目的のために作 製した。得られた結果から、hexプロモーター（以後、Phexと呼ぶ）はＰ．キリ ソゲヌム内での異種bleR遺伝子の発現を制御することができることが予想される 。更に、酵素β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、Ｐ．キリソゲヌムにより その培養培地に豊富に分泌されるタンパク質であるという事実は、Ｐ．キリソゲ ヌム又は関連糸状菌内での同種又は異種のタンパク質の発現及び分泌のためにhe x 遺伝子を用いることを可能にするる発現されるべき遺伝子は、hex遺伝子の分泌 シグナル配列を含むプロモータほ領域と、読み枠内で融合させることができ、又 はそれらは完全なhex遺伝子と読み枠内で融合させることができる。 Ｐ．キリソゲヌムのact遺伝子（以後、actPcと呼ぶ）を、5.2kb BamH Ｉフラグ メント、4.9kb EcoR Ｉフラグメント及び5.9kB HindIIIフラグメントにおいて同 定した。actPc遺伝子を含むDNA領域の制限地図を図３に示す。2,994ヌクレオチ ド配列（配列番号：３）を決定した後、極めた著しく優位なコドン用法パターン でのORFの存在を確認した。ATG翻訳開始コドンは位置494において見い出され、 そしてTAA終止コドンは位置2,250において見い出された。前記ORFは５つのイン トロンを有し、そして5.51の等電点を有する41,760Daのタンパク質をコードし、 その375アミノ酸配列（配列番号：７）はＡ．ニジュランスのγ−アクチンタン パク質のアミノ酸配列と98.1％の同一性を有する。そのプロモーター領域におい て、２つのピリミジンの豊富なゾーン、予想されるTATAボックス及び４つのCAAT ボックスが見い出される。次にこのプロモーターを、Ｐ．キリソゲヌムにおいて Ｓ．ヒンドゥスタヌスのbleR遺伝子を発現させるのに用いた。この目的のため、 実施例３に記載されるように、 プラスミドpALPfleo１（図６）を作製した。得られた結果から、Ｐ．キリソゲヌ ムのactプロモーター（以後、PactPcと呼ぶ）は、Ｐ．キリソゲヌム内で異種bleR 遺伝子の発現を制御することができることが予想される。 Ａ．キリソゲヌムのact遺伝子（以後、actAcと呼ぶ）を、2.4及び1.1kbのSal Ｉ フラグメント、3.9kb Sma Ｉフラグメント及び8.7kb HindIIIフラグメントに おいて同定した。actAc遺伝子を含むDNA領域の制限地図を図４に示す。決定した 3,240ヌクレオチド配列（配列番号：４）は、極めて著しく優位なコドン用法パ ターンでのORFの存在を確認した。ATG翻訳開始コドンは位置787において見い出 され、TAA終止コドンを位置2,478において見い出された。前記ORFは５つのイン トロンを含み、5.51の等電点を有する41,612Daのタンパク質をコードし、その37 5アミノ酸（配列番号：８）は、Ａ．ニジュランス及びＰ．キリソゲヌムのγ− アクチンタンパク質に対応するアミノ酸配列と各々98.4％及び98.1％の同一性を 有する。プロモーター領域において、ピリミジンの豊富なゾーン及びCAATボック スが見い出され、TATAボックスの存在は観察されない。次に２つのプロモーター を、Ａ．キリソゲヌム内でＳ．ヒンドゥスタヌスのbleR 遺伝子を発現させるのに 用いた。プラスミドpALCfleo１（図６）を、この目的のため、実施例４に記載さ れるように作製した。得られた結果から、Ａ．キリソゲヌムのactプロモーター （以後、PactAcと呼ぶ）はＡ．キリソゲヌム内の異種bleR 遺伝子の発現を制御す ることができると予想される。 全ての場合において、真菌プロモーターの制御下におけるＰ．キリソゲヌム又 はＡ．キリソゲヌム内での異種遺伝子の発現を、前記遺伝子を正確な読み枠内で 融合することにより行った。lacz 及びbleR 遺伝子を一例として発現させたが、ペ ニシリンの生合成に関 連する酵素をコードする遺伝子：pcbAB(α−アミノアジピル−システイニル−バ リンシンセターゼ)、pcbC（イソペニシリンＮシンターゼ）、penDE(アシル−CoA ：６−APAアシルトランスフェラーゼ)、pcl(フェニルアセチル−CoAリガーゼ)等 ；又はセファロスポリンの生合成に関連する酵素をコードする遺伝子：pcbAB(α −アミノアジピル−システイニル−バリンシンセターゼ)、pcbC（イソペニシリ ンＮシンターゼ）、cefD（イソペニシリンＮイソメラーゼ）、cefEF(デアセトキ シセファロスポリンＣシンターゼ／ヒドロキシラーゼ)、cefG（デアセチルセフ ァロスポリンＣアセチルトランスフェラーゼ）等を同様に発現させることが可能 であろう。発現されるべき遺伝子は、異なる方法：染色体DNAからの単離、mRNA からのcDNA合成、化学的合成等により得ることができる。正確なプロモーター− 遺伝子融合のための基本的な方法は、Sambrook，Ｊら（Molecular Cloning：A L aboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA，and Ausubel et al．(1987)，Current Protocols in Molecular Bi ology，John Wiley & Sons，New York，USA）に記載される。 宿主株としてＰ．キリソゲヌム及びＡ．キリソゲヌムを用いたが、いずれかの 関連する株又はそれら由来の変異株を用いることができる。プロトプラストの生 産及びＰ．キリソゲヌムの形質転換のために用いる方法は、Cantoralら(1987，B iotechnology ５：494-497)及びDiezら(1987，Curr．Genet．12：277-282)によ り記載される方法に基づき、実施例１に記載される。プロトプラストの生産及び Ａ．キリソゲヌムの形質転換は実施例４に記載される。両方の場合、使用は、選 択マーカーとしての抗生物質フレオマインシ並びに各々Pgdh，Phex，PactPc及びPactAc の制御下で発現されるbleR 遺伝子のキャリアーであるプラスミドpALfleo ７，pALP480，pALPfl eo１又はpALCfleo１からなった。しかしながら、形質転換株を他のそうでないも のから選択的に分離することができるいずれかのマーカーを用いることが可能で あろう。 形質転換体は、同化され得る炭素及び窒素源を含む培養培地中で増殖させるこ とができる。炭素源の例は、単独で又は組み合わせて用いられる、グルコース、 スクロース、ラクトース、デンプン、グリセリン、有機酸、アルコール、脂肪酸 等である。窒素源の例は、単独で又は組合わせて用いられる、ペプトン、モルト 抽出液、イースト抽出液、コーンスチープ液、グルテン、尿素、アンモニウム塩 、硝酸塩、NZ−アミン、硫酸アンモニウム等である。培養培地の構成物として用 いることができる無機塩は、ホスフェート（例えばリン酸カルシウム）、スルフ ェート（例えば硫酸ナトリウム）、クロライド（例えば塩化マグネシウム）等を 含み、そして鉄、マグネシウム、カルシウム、マンガン、コバルト等をイオンと して用いることができる。培養条件、例えばインキュベーション温度、培養培地 のpH、エレーション、インキュベーション時間等は、用いる株に従って選択し、 調節しなければならない。しかしながら、一般に、発酵は、20℃〜30℃の温度及 び５〜９のpHで、好気性条件下で４〜14日間、行われる。 要約すると、本発明は、（Ｉ）Ｐ．キリソゲヌムのgdh，hex及びact遺伝子の 、並びにＡ．キリソゲヌムのact遺伝子のプロモーターを含むDNAフラグメント、 （II）上述のプロモーターをそれらの翻訳開始部位と一緒に組み込むプラスミド 、（III）同種もしくは異種構造遺伝子又はアンチセンスDNAフラグメントが前記 プロモーターの制御下に位置しているプラスミド、（IV）前記プラスミドで形質 転換したＰ．キリソゲヌム又はＡ．キリソゲヌム株、(VI)プロモーターの制御下 でプラスミド内に位置した構造遺伝子又はアンチ センスDNAを発現することができる形質転換株及び（VII）Phexの制御下で同種又 は異種細胞外タンパク質を分泌することができる形質転換株を含む。 以下の例は、その範囲を限定することなく本発明を詳細に記述する。 実施例１ １．１．Ｐ．キリソゲヌムのgdh遺伝子のクローニング及びキャラクタリゼー ション Ｐ．キリソゲヌムのgdh遺伝子をクローン化する目的で、確立された手順（Sam brook，J.ら(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring H arbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA）を用いてファージベ クターλGEM12内にDNAライブラリーを作製した。これにより、（Barredoら（199 4）スペイン特許Ｐ9400931により記載される方法により精製した）真菌の全DNA を、Sau3A Ｉで部分的に消化し、約20kbのフラグメントをスクロース勾配（10〜4 0％）で精製した。これらのフラグメントを、先にBamH Ｉで消化し、精製したベ クターの腕と連結し、そして次にその連結混合物を、製造元の説明に従ってGipa ckIIGold（Stratagent）システムを用いて試験管内でパッケージングした。500 μｌのSM中に再度懸濁したパッケージング反応を、組換えファージのパーセンテ ージを決定する目的で、存在するファージ及び大腸菌NM539の数を滴定するため に、大腸菌LE392の感染物を作るのに用いた。大腸菌NM539は、ファージＰ２の溶 原性株であり、それに感染するファージが重要でない中央領域を欠く場合に溶菌 プラークを生産するだけである。そのファージタイターは、大腸菌LE392内で132 pfu／μｌ(全部で66,000pfu)、大腸菌NM539内で113pfu/μｌ(全部で56,500pfu) であることが見い出された。これは、ファージの約85 ％は外来性DNA挿入物を有していたことを意味する。完全なDNAライブラリーを作 り上げるのに必要とされる組換えファージの数を、等式：Ｎ＝ln（１−ｐ）／ln （１−ｆ）（式中、“ｐ”は要求される確率であり、“ｆ”は組換え体内に含ま れる選択された生物のゲノムの割合であり、そして“Ｎ”は必要とされる組換え 体の数である）で計算した。Ｐ．キリソゲヌムのゲノムが約30,000kb内に含まれ (Fierroら(1993)，Mol．Gen．Genet．241：573-578)、そしてパッケージングさ れた挿入物の平均が18kb（約20kbの大きさが選択されているという事実にかかわ らず）であると仮定して、Ｄ．キリソゲヌムDNAライブラリーを、得られた組換 えファージの数で約99.999％の確率で得た。この一連の理論的確認を行った後、 大腸菌NM539に感染させ、そして完全なDNAライブラリーを150mm直径の５のペト リ皿上に広げ（約11,300pfu／ペトリ皿）、50mlのSM＋2.5mlのクロロホルム中に 集め、４℃に維持した。この方法において、いつでもプレートする準備の整った 組換えファージの十分かつ典型的な容量が利用できた。 約60,000pfuを150mm直径の３つのペトリ皿に広げ、次にニトロセルロースフィ ルターに移した（BA85，0.45μｍ，Schleicher & Schuell）。該フィルターを、 Ｎ．クラッサのgdh遺伝子に対応する合成オリゴヌクレオチドでの標準プロトコ ル（Sambrook，J.ら(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold S pring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，USA）を用いてハイ ブリダイズした。全部で10の陽性クローンを第２及び第３のハイブリダイゼーシ ョンサイクルにより精製し、そして次にそれらのDNAを一連の制限エンドヌクレ アーゼで消化して、サザンブロット技術により分析した。この方法において、gd h 遺伝子を各々7.2kbEcoR Ｉフラグメントにおいて並びに2.9及び1.5kbの２つのBa mH Ｉ フラグメントにおいて同定した。プラスミドpBluescriptＩ KS(＋)（Stratagene ）及びpUC13における対応するサブクローニングを行った後、gdh遺伝子を含む2. 9kb Sau3A Ｉ−Xba Ｉフラグメントの両方の方法に適合するプラスミドpALP784及 びpALP785を作製した。前記遺伝子を含むDNA領域の制限地図を図１に示す。 gdh遺伝子のヌクレオチド配列を決定する目的で、“Erase a base”法(Promeg a)により、プラスミドpALP784及びpALP785から一連のクローンを作製し、次に製 造元の説明に従って、両方の場合において“Sequence”テストキット(USB)を用 いるジデオキシヌクレオチド法により配列決定した。得られた2,816ヌクレオチ ド配列を、Geneplotプログラム(DNASTAR)で分析して極めて顕著に優位なコドン 用法パターンのORFの存在を確認した。ATG翻訳開始コドンを位置922において見 い出し、TAA翻訳コドンを位置2,522において見い出した。159bp及び56bpの２つ のイントロンの存在も、各々位置971〜1130及び1262〜1318の間で決定した。前 記ORFは6.18の等電点の49,837Daのタンパク質をコードし、その461アミノ酸配列 （配列番号：５）はＮ．クラッサのNADP依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵 素のアミノ酸配列と72.4％の同一性を有する。 プロモーター領域において、位置766〜796の間に位置したものが最も長いもの であるが、種々のピリミジンが豊富なゾーンが見い出された。これらのゾーンは 高度に発現された遺伝子内で見い出され、そして転写開始の部位からすぐ上流に 位置する。更に、位置752（TATATAATT）及び852(TATAATTT)内に２つの予想され るTATAボックス（真菌内のその共通配列はTATAAAである）がある。これらのTATA ボックスは、翻訳開始の部位から30〜50bp上流に見い出されたので、本物のTATA ボックスは位置752内に位置したもの、即ち翻訳開始の部位から42bp上流に位置 したものである可能性が最も高い。配 列CCAATは、翻訳開始の部位から50〜200bp上流に位置する周知の真核生物遺伝子 の約30％のプロモーター領域内に見い出される。CCAATボックスは、gdh遺伝子の プロモーター領域内の位置691内、即ち翻訳開始の予想される部位から約105bp上 流にある。 １．２．Ｐ．キリソゲヌム及びＡ．キリソゲヌム内のgdhプロモーター下での 調節遺伝子の発現 形質転換の過程並びにＰ．キリソゲヌム及びＡ．キリソゲヌム形質転換体の選 択を、それらの抗生物質フレオマイシンに対する耐性により、以下に記載のよう に行った。この目的のため、5.4kbの大きさを有しそして真菌内のマーカーとし てのPgdhの制御下で発現されるＳ．ヒンドゥスタヌス(S ．hindusanus)のbleR 遺 伝子、大腸菌内のマーカーとしてのクロランフェニコール耐性遺伝子及びプラス ミドpBC KS（＋） （Stratagene）のポリリンカーを有するプラスミドpALfleo７ を作製することが必要であった。 プロトプラストの生産及びＰ．キリソゲヌムの形質転換のために用いられる手 順は、少し改良を加えたCantoralら(1987，Biotechnology ５：494-497)及びDie zら(1987，Curr．Genet．12：277-282)に記載される方法であった。まず第１に 、Ｐ．キリソゲヌムを25℃で18〜21時間、10％イースト抽出液を加えたPM規定培 地（Anne'，J.，(1997)，Agricultura 25)中で培養し、ナイロンフィルターを通 すろ過によりその菌糸体を回収し、そして0.9％ NaClの３〜５容量で洗った。ろ 紙の間でそれを乾燥させた後、それをプロトプラスト緩衝液中に再懸濁(100mg／ ml)した。そのミセル懸濁液を均一であると考えた時に、プロトプラスト緩衝液 中４mg／mlのCaylasa溶液(Cayla)の容量をそれに加え、そしてそれを160r.p.m． で撹拌しながら25℃で３時間、インキュベートした。プロトプラストの外観を顕 微鏡で観察した。それらのほとんどが遊離された時、それら を30μｍ孔ナイロンフィルターを通すろ過により菌糸体から分離した。そのプロ トプラスト懸濁液を0.7Ｍ KClで３回洗い、その洗浄の間、３分間、400×ｇで遠 心した。その沈殿したプロトプラストを10mlのKCM溶液に再度懸濁し、そしてTho maチャンバー内で計数することによりそれらの濃度を評価した後、それらをKCM で１〜５×108プロトプラスト／mlに調節した。次に、この溶液100μｌを注意深 く１〜10μｇのDNA＋10μｌのPCMと混合し、そしてその混合物を20分、冷却した 水中でインキュベートした。次に500mlのPCMを加え、そしてその混合物を20分、 周囲温度に維持し、その後、600μｌのKCMを加えた。30μｇ／mlのフレオマイシ ン中で増殖するように、プラスミドpALfleo７，pALP480及びpALPfleo１中に存在 するフレオマイシン耐性遺伝子によりら与えられる能力に基づいて形質転換体を 選択した。この目的のため、200μｌの形質転換反応物と、ソルビトール（１Ｍ ）及びフレオマイシン（30μｇ／ml）を加えた（Zapeck's培地５mlと混合し、そ して次にそれを同培地５mlと共にペトリ皿上に広げた。そのプレートを形質転換 体が現れるまで25℃でインキュベートした（４〜８日）。 プロトプラストの生産及びＡ．キリソゲヌムの形質転換のために -64)により記載される方法であった。まず第１に、Ａ．キリソゲヌムの株を28℃ で24時間、MMC規定培地中で増殖させ、そしてその菌糸体をナイロンフィルター を通すろ過により回収し、３〜５容量の0.9％NaClで洗った。ろ紙の間でそれを 乾燥させた後、それをプロトプラスト緩衝液中で再度懸濁した（50mg／ml）。そ のミセル懸濁液が均一になったと考えられる時、最終濃度10mMのDTTをそれに加 え、それを28℃で１時間、150r.p.m．でインキュベートした。次にそれを15分、 12,000×ｇで遠心し、その沈殿を20mlのプロトプラ スト緩衝液中に再度懸濁した。次に、プロトプラスト緩衝液中４mg／mlのCaylas a溶液(Cayla)の容量を加え、そしてそれを100r.p.m．で撹拌しながら25℃で３時 間、インキュベートした。プロトプラストの外観を顕微鏡で観察した。それらの ほとんどが遊離した時、それらを25μｍ孔ナイロンフィルターを通してのろ過に より菌糸体から分離した。そのプロトプラスト懸濁液を0.7Ｍ KClで３回洗い、 その洗浄の間に３分間、1,000×ｇで遠心した。沈殿したプロトプラストを10ml のNCM緩衝液中に再度懸濁し、そしてThomaチャンバーを計数することによりそれ らの濃度を評価した後、それらを１〜５×108プロトプラスト／mlに調節した。 次に、この溶液100μｌを注意深く１〜10μｇのDNAと混合し、そしてその混合物 を20分、冷やした水浴中に維持し、その後、１mlのCCMを加え、次に更に20分、 周囲温度でインキュベートした。その混合物を５分間、1,000×ｇで遠心し、そ してその沈殿物を800μｌのNCM緩衝液中に再度懸濁した。10μｇ／mlのフレオマ イシン中で増殖させるために、プラスミドpALfleo７及びpALCfleo１中に存在す るフレオマイシン耐性遺伝子により与えられる能力に基づいて形質転換体を選択 した。この目的のため、200μｌの形質転換反応物を、スクロース(0.3Ｍ)及びフ レオマイシン（10μｇ／ml）を加えたTSA培地５mlと混合し、そして次に５mlの 同培地と共にペトリ皿上に広げた。そのプレートを形質転換体の外観が見えるま で28℃でインキュベートした（５〜８日）。 得られた形質転換体において、（Ｉ）形質転換体に用いるプラスミドに対応す るDNAの存在、（II）制御遺伝子に対応する転写物の存在及び（III）発現された 遺伝子に対応する酵素活性の分析を行った。Barredoら（1994）（スペイン特許 Ｐ9400931)により記載される条件に従って全DNAを得て、次にそれをSambrookら （1989）(Mo lecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Col d Spring Harbor，New York，USA)により記載される手順を用いてサザンブロッ ト技術により分析した。全DNAを、Ausubelら（1987）（Current Protocols in M olecular Biology,John Wiley & Sons，New York，USA）により記載される方法 により精製した。得られたRNAを−20℃でエタノール中で沈殿させた。それを用 いるために、それを４℃で10,000×ｇで20分の遠心により回収した。それらの分 子の大きさに基づくRNA分子の分離をアガロース−ホルムアルデヒド電気泳動に より行った。次にRNAをニトロセルロースフィルターに移し、要求されるプロー ブとハイブリダイズさせた。これら全てはSambrookら（1989）（Moleculer Clon ing：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Har bor，New York，USA)により記載される方法により行った。ハイブリダイゼーシ ョンバンドの外観は、転写物の存在を示し、これにより宿主真菌：Ｐ．キリソゲ ヌム又はＡ．キリソゲヌム中でバクテリア遺伝子を発現する能力を示した。β− ガラクトシダーゼ酵素活性を、Sambrookら（1989）(Moleculer Cloning：A Labo ratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New Yo rk，USA)により記載される方法により形質転換体において評価した。フレオマイ シン耐性遺伝子の発現を、25℃で７日間のインキュベートの後、Czapeck's固体 培地中でＰ．キリソゲヌム又はＡ．キリソゲヌムに与えられる耐性のレベルに基 づいて評価した。 １．２．１．Pgdh下でのＰ．キリソゲヌム及び大腸菌内での大腸菌のlacZ遺伝 子の発現 大腸菌のlacZ遺伝子をＰ．キリソゲヌム内でそれを発現させる目的でPgdhと翻 訳的に融合させた。これにより、lacZ遺伝子をプラスミドpML１(Carramolinoら 、1989，Gene 77：31-38)のEcoR Ｉ及 びSal Ｉ部位の間にサブクローニングし、プラスミドpMLacを作り出した。次にPg dhをpMLacのEcoR Ｉ及びSma Ｉ部位の間に導入し、プラスミドpSKGを作った（図５ ）。最後に、スルホンアミド耐性遺伝子(Carramolinoら、1989，Gene 77：31-38 )をpSKGのEcoR Ｉ部位に導入してプラスミドpSKGSuを作り出した（図５）。それ らのスルホンアミド耐性について選択されたプラスミドpSKGSuを有するＰ．キリ ソゲヌム形質転換体において、サザン・ブロット技術によりプラスミドの存在に ついて、及びノーザンブロット技術によりlacZ遺伝子に対応する転写物の存在に ついて分析を行った。次にβ−ガラクトシダーゼ酵素活性を、２つの先の分析に おいて陽性である形質転換体において測定した。その形質転換体は大腸菌のlacZ 遺伝子を有効に発現し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性レベルが、トリプトフ ァン（遺伝子プロモーター（trpC）の制御下において、lacZ遺伝子を発現する単 一コピーの形質転換体においてよりそれらのゲノム内に組み込まれたプラスミド のコピーを含むものにおいてより高いことが観察された。 Ｐ．キリソゲヌムのPgdhも大腸菌内でlacZ遺伝子の発現を誘発することができ るか否かを見い出す目的で、プラスミドpSKGを大腸菌DH５α（ΔlacZ）内に導入 した。得られた形質転換体は、イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトシド（IPIG）及 び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド(Ｘ−gal) を加えたLB培地中での25℃で10日間のインキュベーションの後、青色のコロニー を作り出す能力を有していた。この結果は、Pgdh−lacZ構成物は、大腸菌の内因 性lacZ遺伝子より有効でないが、大腸菌内でβ−ガラクトシダーゼ酵素を発現す ることを確認した。 １．２．２．Pgdh下でのＰ．キリソゲヌム及びＡ．キリソゲヌム内でのＳ．ヒ ンドゥスタヌスのbleR遺伝子の発現 そのプロモーター領域のないbleR遺伝子を、1,100bpのNco Ｉ−Apa Ｉフラグメ ントとしてプラスミドpUT737（Mullaneyら、（1985），Mol．Gen．Genet．199： 37-45）から得た。次にこのフラグメントを、Nco Ｉ−Apa Ｉで先に消化したプラ スミドpUT713内でサブクローニングしてプラスミドpALfleo５を供した。Pgdhをp ALP25から726bp EcoR Ｉ−BamH Ｉフラグメントとして回収し、次にそれを（先にE coR Ｉ −BamH Ｉで消化した）pALfleo５内でサブクローニングしてpALfleo６を作 り出した。この最後のプラスミドは4.2kbの大きさを有し、bleR遺伝子はPgdh及 び大腸菌内のアンピシリン耐性遺伝子の制御下で発現した。後者のマーカーをク ロランフェニコール耐性遺伝子と置換する目的で、Pgdh，bleR及びtrpC遺伝子の ターミネーター(TtrpC)を含む1,900bp EcoR Ｉ−Not ＩフラグメントをpALfleo６ から精製して、EcoR Ｉ−Not Ｉで消化したプラスミドpBC ＫＳ（＋）（Stratagen e)に連結した。これは、5.4kbの大きさを有し、真菌内での選択マーカーとして のPgdh下でのＳ．ヒンドゥスタヌスのbleR遺伝子、大腸菌内のマーカーとしての クロランフェニコール耐性遺伝子及びプラスミドpBC KS（＋）のポリリンカーを 有するプラスミドpALfleo７（図５）を生じた。Pgdh及びbleR の間の融合領域の 配列決定により、その正確な読み枠内でのその遺伝子の配置を確認した。 Ｐ．キリソゲヌム及びＡ．キリソゲヌムの形質転換をプラスミドpALfleo７で 行い、ここでそれら形質転換体は各々30μｇ／ml及び10μｇ／mlのフレオマイシ ンに対するそれらの耐性に基づいて選択した。次に、それら形質転換体のフレオ マイシン耐性の最大レベルを固体培地内で確立し、100μｇ／ml超のフレオマイ シンの存在下で増殖することができるいくつかのものを得る。それらのフレオマ イシン耐性について選択した形質転換体において、サザンブロット 技術によりプラスミドの存在について、及びノーザンブロット技術によりbleR に 対応する転写物の存在について分析を行った。これらの結果により、Pgdhの制御 下でのＰ．キリソゲヌム及びＡ．キリソゲヌム内で異種遺伝子を発現する可能性 を確認した。 プラスミドpALfleo７を、Ｐ．キリソゲヌムのPgdhも大腸菌内でbleR遺伝子の 発現を誘発することができるか否かを見い出す目的で大腸菌内に導入した。得ら れた形質転換体は、0.2μｇ／mlのフレオマイシンを含むLB内で増殖する能力を 有しており、ここでそのフレオマイシンの最小阻害濃度は大腸菌について0.025 μｇ／ml未満であった。この結果は、Pgdhは、Ｐ．キリソゲヌム内でより有効で ないが、大腸菌内で発現されることを確認した。プラスミドpALfleo７での大腸 菌DH５αの形質転換体は、受託番号CECT4849でSpanish Coliection of Type Cul tures(CECT)に寄託した。他のプラスミド、例えばpALP784及びpALP785は、pALfl eo７内に含まれるgdh遺伝子のプロモーターとのハイブリダイゼーションにより2 .9kbSau3AＩ−XbaＩフラグメントを選択し、そしてそれを各々pBluescriptＩ KS (＋)又はpUC13内でサブクローニングすることにより寄託されたプラスミドから 簡単に得ることができる。 １．３．gdhプロモーター下でのＰ．キリソゲヌム及びＡ．キリソゲヌム内で のアンチセンス発現 工業株における遺伝子発現の不活性化は、不要な酵素活性の除去のために時々 必要である。多くの工業株の倍数性のレベルは遺伝子破壊を行うことにより発現 を遮断することをほとんどの場合、難しくするという事実のため、二倍性のレベ ルと独立した発現の不活性化のためのシステムを用いることが必要である。強力 なプロモーターの制御下で発現されたアンチセンス構成物の開発は、遺伝子発現 の中断を可能にする。 例として、Ｐ．キリソゲヌム内でフェニルアセテート２−ヒドロキシラーゼを コードする遺伝子（pahA）の発現を不活性化するためのPgdhの使用を以下に記載 する。まず第１に、単−BamH Ｉ部位を通して融合したPgdh及びTtrpCを有するプ ラスミドpALP873を作製した。そのプラスミドpALP873をBamHＩで消化し、その両 端をDNAポリメラーゼＩのKlenowフラグメントで満たし、それを、EcoR Ｖ消化に よりプラスミドpALP555から得たpahA遺伝子の内側の1,053bp cDNAフラグメント で消化した。生じたpALP874と呼ぶプラスミドを、それがPgdhに関連するアンチ センスpahA遺伝子フラグメントを有するので、選択した。このプラスミドから、 プラスミドpALP888を生じさせるKlenowで満たされ、プラスミドpALfleo７のEcoR Ｖ 部位においてサブクローニングされた、アンチセンスカセットを有する2.5kb EcoR Ｉ −Xba Ｉフラグメントを精製した。この最後のプラスミドは、7.2kbの大き さを有し、（Ｉ）Pgdhの制御下のpahA遺伝子のアンチセンスカセット、（II）真 菌内の選択マーカーとしてのbleR遺伝子、（III）大腸菌内のマーカーとしての クロランフェニコール耐性遺伝子及び（IV）プラスミドpBC KS（＋）のポリリン カーを有することを特徴とする。 Ｐ．キリソゲヌムの形質転換をプラスミドpALP888で行い、ここでそれら形質 転換体は30μｇ／mlのフレオマイシンに対する耐性に基づいて選択した。選択し た形質転換体のうち約20％がフェニル酢酸を酸化する能力の減少を示し、ここで それらのいくつかは前記活性の検出可能なレベルを欠如していた。これらの形質 転換体において、プローブとしてコーティング鎖に対応するオリゴヌクレオチド を用いて、サザンブロット技術によりプラスミドの存在について、及びノーザン ブロット技術によりpahA遺伝子に対応するアンチセンス転写物の存在について分 析を行った。両方の場合、陽性の結果を 得て、アンチセンス構成物の使用によりＰ．キリソゲヌムにおける不要な酵素活 性を全体的に又は部分的に遮断する可能性を確認した。これらの結果は、本特許 に記載されるプロモーターのいずれか（Pgdh，Phex，PactPc及びPactAc）又はい ずれかの利用できるプロモーターを用いて、関連する糸状菌に、及びいずれかの 酵素活性に広げることができる。 実施例２ ２．１．Ｐ．キリソゲヌムのhex遺伝子のクローニング及びキャラクタリゼーシ ョン 精製及びキャラクタリゼーション後に酵素β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダー ゼであることが見い出された主要酵素の存在を、ペニシリンＧ生産の条件下での 工業発酵から得られたＰ．キリソゲヌム菌糸体内で決定した。精製されたタンパ ク質のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法により決定し、２つの異な る配列：を得た。 これらの配列に基づいて、一連のＰ．キリソゲヌム遺伝子内に存在するコドン 用法の傾向を仮定して、以下の組合せの合成オリゴヌクレオチドをデザインした ： Ｐ．キリソゲヌムのhex遺伝子を実施例１に記載されるDNAライ ブラリー及び手順を用いてクローン化した。全部で11の陽性クローンを精製し、 そして次にそれらのDNAを一連の制御エンドヌクレアーゼで消化してサザンブロ ット技術により分析した。この方法において、hex遺伝子を3.2kb Sac Ｉフラグメ ントにおいて及び2.1kbSal Ｉフラグメントにおいて同定した。両方の方向におけ るプラスミドpBC KS（＋）（Stratagene）におけるSal Ｉフラグメントのサブク ローニングによりプラスミドpALP295及びpALP303を作り出した。hex遺伝子を含 むDNA領域の制限地図を図２に示す。 hex遺伝子のヌクレオチド配列を決定するために、上述のプラスミドpALP295及 びpALP303、並びにpALP319及びpALP461（2.8kb BamH Ｉフラグメントの両方の方 向）、pALP388及びpALP389（2.4kb Sal Ｉフラグメントの両方の方向）並びにpAL P377及びpALP378（1.2kb Pst Ｉフラグメントの両方の方向）を用いた（図２）。 一連のクローンを“Erase a base”法(Promega)により前記プラスミドから作製 し、そして次に“Sequenase”テストキット(USB)を用いてジデオキシヌクレオチ ド法により配列決定した。これらは両方とも製造元の説明に従った。得られた5, 240のヌクレオチド配列（配列番号：２）を、Geneblotプログラム(DNASTAR)で分 析し、極めて著しく優位なコドン用法パターンの２つのORFの存在を確認した。h ex 遺伝子のATG翻訳開始コドンが位置1,324において見い出され、そしてTGA終止 コドンが位置3,112において見い出された。前記ORFはイントロンを欠如し、5.34 の等電点の66,545Daのタンパク質をコードし、その596アミノ酸配列（配列番号 ：６）はカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）のβ−Ｎ−アセチルヘキ ソサミニダーゼのアミノ酸配列と49.0％の同一性を有する。更に、位置19〜40及 び99〜120において、その予想されるアミノ酸配列は、精製された酵素から化学 的に決定されたアミノ酸配列を含む。プロテアー ゼ認識部位(Lys-Arg)は上述のアミノ酸配列（Ａ）の直前の位置に現れる（アミ ノ酸97〜98）。 プロモーター領域において、位置1,106−1,128及び1,182−1,200の間に２つの ピリミジンの豊富なゾーン、位置1,258において予想されるTATAボックス(ATAAAT A)及び位置1,163においてCAATボックスが見い出される。 ２．２．Phex下でのＰ．キリソゲヌム内でのＳ．ヒンドゥスタヌスのbleR遺伝 子の発現 （Ｉ）Ｐ．キリソゲヌム形質転換体の形質転換及び選択（II）DNAの分析、（I II）RNAの分析並びに（IV）酵素測定のプロセスを実施例１のセクション１．２ に記載されるように行った。 Phex下でbleR遺伝子を発現するために、まず最初に、hex遺伝子のイニシエー ターメチオニンをコードするATGコドン上にNco Ｉ部位を作製した。これは、プラ イマーとして次のオリゴヌクレオチド： を用いてPCRにより行った。 PCRにより得られたDNAフラグメントをプラスミドpBC KS（＋）（Stratagene） のSma Ｉ部位内で両方の方向においてサブクローニングして、pALP427及びpALP42 8を作り出した。両方のプラスミドの挿入物を、両方の場合、製造元の説明に従 って、テストキット”Erase a base”（Promega）及び“Seqwenase”（USB）を 用いて配列決定した。この方法において、得られたPhexは変異を欠き、タンパク 質のイニシエーターメチオニンをコードするATG上にNco Ｉ部位を含んでいること が示された。 pALP427は、bleR 遺伝子のサブクローニングを行うことについ て選択されたプラスミドであった。そのプロモーター領域を含まないbleR遺伝子 を、1,100bp Nco Ｉ−Apa ＩフラグメントとしてプラスミドpUT737（Mullaneyら （1985），Mol．Gen．Genet．199：37-45）から得た。次にこのフラグメントを 、Nco Ｉ−Apa Ｉで先に消化したPhexを有する）プラスミドpALP427内でサブクロ ーニングしてプラスミドpALP480(図６)を供した。この最後のプラスミドは5.4bp の大きさ、Phexの制御下で発現されるbleR 遺伝子、bleR 遺伝子下でのtrpC遺伝子 のターミネーター、大腸菌内のマーカーとしてのクロランフェニコール耐性遺伝 子及びプラスミドpBC KS（＋）のポリリンカーを有する。Phex及びbleR の間の融 合領域の配列決定により、その正確な読み枠内でのその遺伝子の配置を確認した 。 Ｐ．キリソゲヌムの形質転換をプラスミドpALP480で行い、ここでそれら形質 転換体は30μｇ／mlのフレオマイシンに対する耐性に基づいて選択した。次に最 大レベルの形質転換体のフレオマイシン耐性を固体培地内で確立し、100μｇ／m l超のフレオマイシンの存在下で増殖することができるいくつかのものが得られ た。それらのフレオマイシン耐性について選択された形質転換体において、サザ ンブロット技術によりプラスミドの存在について、及びノーザンブロット技術に よりbleR遺伝子に対応する転写物の存在について分析を行い、両方の場合におい て陽性の結果が得られた。これらの結果は、Phexの制御下でＰ．キリソゲヌム内 で異種遺伝子を発現する可能性を確認した。プラスミドpALP480での大腸菌DH５ αの形質転換体を受託番号CECT4852でSpanish Collection of Type Cultures(CE CT)に寄託した。プラスミドpALP295，pALP319，pALP377及びpALP388は、pALP480 内に含まれるhex遺伝子のプロモーターとのハイブリダイゼーションにより各々D NAフラグメント2.1kb SalＩ， 2.8kb BamHＩ，1.2kb PstＩ及び2.4kb SalＩを選択し、そして次にそれらをpBlu escriptＩ KS(＋)内にサブクローニングすることにより簡単に、寄託されたプラ スミドから得ることができる。 ２．３．hex遺伝子を用いるＰ．キリソゲヌム内でのタンパク質の細胞外生産 酵素β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、ペニシリンＧ生産の条件下で工 業発酵槽内の培養培地にＰ．キリソゲヌムにより豊富に分泌されるタンパク質で ある。この酵素が分泌される能力は、Ｐ．キリソゲヌム又は関連糸状菌内での同 種又は異種タンパク質の発現及び分泌のためにhex遺伝子を用いることを可能に する。 その酵素は次のアミノ酸：Met-Lys-Phe-Ala-Ser-Val-Leu-Asn-Val-Leu-Gly-Al a-Leu-Thr-Ala-Ala-Ser-Ala(配列番号：６のアミノ酸１〜18)から作られた分泌 シグナル配列を有する。一般に、シグナルペプチドは３つの保存された構造的ド メインを有する（Takizawa，Nら（1994）Recombinant microbes for industrial and agriculturel applications，Murooka，Y.及びImanake，T(eds)，Marcel D ekker，Inc．New York）。それらは、（Ｉ）通常１〜５の残基を有し、そして膜 を横切るタンパク質の有効な転移に必要とされる“ｎ”と呼ばれる正電荷のアミ ノ末端領域(Met-Lys)，（II）７〜15残基で作られた“ｈ”と呼ばれる疎水性領 域(Phe-Ala-Ser-Val-Leu-Asn-Val-Leu)並びに（III）３〜７残基で作られた“ｃ ”と呼ばれるカルボキシ末端の極性領域（Gly-Ala-Leu-Thr-Ala-Ala-Ser-Ala） である。細胞内で合成されたタンパク質は、２つの塩基性残基（Lys-Arg、配列 番号６のアミノ酸97及び98）で作られた開裂部位で処理され、成熟タンパク質を 作り出す。 hex遺伝子を用いてタンパク質を発現させ、分泌させる場合に２つの可能性が ある。即ち、（Ｉ）分泌シグナル配列を含むプロモー ター領域を、読み枠内で、発現されるべき遺伝子のコード化領域に融合すること 、並びに（II）読み枠内で、完全なhex遺伝子を発現されるべき遺伝子のコード 化領域に融合することである。分子生物学の標準的な技術（Sambrook，J.ら(198 9)，Moleculer Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laborator y，Cold Spring Harbor，New York，USA；Ausubelら(1987)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，USA）を用いて、当業 者は、Ｐ．キリソゲヌム又は関連糸状菌内で関心のタンパク質の発現及び分泌の ために、hex遺伝子又は他の完全な遺伝子の分泌配列を含むプロモーターを用い ることができるであろう。 実施例３ ３．１．Ｐ．キリソゲヌムのact遺伝子のクローニング及びキャラクタリゼー ション Ｐ．キリソゲヌムのact遺伝子を、実施例１に記載されるDNAライブラリー及び 手順を用いてクローン化した。この場合、Ａ．ニジュランス（A ．nidwlans）（F idelら(1988)，Gene 70：283-293）のact遺伝子由来の888bp Nco Ｉ−Cla Ｉフラ グメントでハイブリダイゼーションを行った。全部で10の陽性クローンを精製し 、そして次にそれらのDNAを一連の制限エンドヌクレアーゼで消化してサザンブ ロット技術により分析した。この方法において、act遺伝子を、5.2kb BamH Ｉフ ラグメント、4.9kb EcoR Ｉフラグメント及び5.9kb HindIIIフラグメントにおい て同定した。HindIIIフラグメントをプラスミドpBluescriptＩ KS(＋)（Stratag ene）内で両方の方向においてサブクローニングしてプラスミドpALP298及びpALP 299を作り出した。両方の方向におけるプラスミドpBluescriptＩ KS(＋)（Strat agene）内でのEcoR Ｉフラグメントのサブクローニングに よりプラスミドpALP315及びpALP316を作り出した。act遺伝子を含むDNA領域の制 限地図を図３に示す。 act遺伝子のヌクレオチド配列を決定するために、上述のプラスミドpALP315及 びpALP316を用いた。両方とも製造元の説明に従って、“Erase a base”法(Prom ega)により前記プラスミドから一連のクローンを作製し、そして次に“Sequenas e”テストキット（USB）を用いてジデオキシヌクレオチド法）により配列決定し た。得られた2,994ヌクレオチド配列（配列番号：３）を、Geneplotプログラム( DNASTAR)で分析して極めて顕著に優利なコドン用法パターンのORFの存在を確認 した。act遺伝子のATG翻訳開始コドンが位置494において見い出され、そしてTAA 終止コドンが位置2,250において見い出された。前記ORFは位置501〜616，649〜8 45，905〜1046，1078〜1180及び1953〜2021において５つのイントロンを有し、5 .51の等電点の41,760Daのタンパク質をコードし、その375アミノ酸配列（配列番 号：７）はＡ．ニジュランスのγ−アクチンタンパク質のアミノ酸配列と98.1％ の同一性を有する。そのプロモーター領域において、位置356〜404及び418〜469 の間の２つの広いピリミジンの豊富なゾーン、位置259における予想されるTATA ボックス(TATAAAAAT)並びに位置174，217，230及び337における４つのCAATボッ クスが見い出された。 ３．２．PactPc下でのＰ．キリソゲヌム内でのbleR 遺伝子の発現 PactPc下でbleR 遺伝子を発現するために、まず第１に、hex遺伝子のイニシエ ーターメチオニンをコードするATGコドン上にNco Ｉ部位を作製した。これは、プ ライマーとして次のオリゴヌクレオチド： を用いてPCRにより行った。 PCRにより得られたDNAフラグメントをプラスミドpBC KS（＋）（Stratagene） のSma Ｉ部位において両方の方向においてサブクローニングして、pALPact １及びpALPact ２ を作り出した。両方のプラスミドの挿入物を、両方の場合、製造元の 説明に従って、テストキット“Erase a base”（Promega）及び“Seqwenase”(U SB)を用いて配列決定した。この方法において、得られたPactPcは変異を欠き、 そしてタンパク質のイニシエーターメチオニンをコードするATG上のNco Ｉ部位を 含んでいた。 pALPact １は、bleR 遺伝子のサブクローニングを行うために選択されたプラ スミドであった。そのプロモーター領域を含まないｂleR遺伝子を、1,100bp Nc o Ｉ −Apa ＩフラグメントとしてプラスミドpUT737（Mullaneyら（1985），Mol．G en．Genet．199：37-45）から得た。次にこのフラグメントをNco Ｉ−Apa Ｉで先 に消化した（PactPcを有する）プラスミドpALPact １内でサブクローニングして プラスミドpALPfleo１（図６）を作り出した。この最後のプラスミドは、PactPc の制御下で発現されるbleR遺伝子、bleR 遺伝子下のtrpC遺伝子のターミネーター 、大腸菌内のマーカーとしてのクロランフェニコール耐性遺伝子及びプラスミド pBC KS（＋）のポリリンカーを有する。PactPc及びbleR の間の融合領域の配列決 定により、正確な読み枠内でのその遺伝子の配置を確認した。 Ｐ．キリソゲヌムの形質転換をプラスミドpALPfleo１で行い、ここでこれら形 質転換体は30μｇ／mlのフレオマイシンに対する耐性に基づいて選択した。次に これら形質転換体のフレオマイシン耐性の最大レベルを固体培地内に確立し、こ こで100μｇ／ml超のフレオマイシンの存在下で増殖することができるいくつか のものが得ら れた。それらのフレオマイシン耐性について選択された形質転換体において、サ ザンブロット技術によりプラスミドの存在について、及びノーザンブロット技術 によりbleR 遺伝子に対応する転写物の存在について分析を行い、両方の場合で陽 性の結果が得られた。これらの結果は、PactPcの制御下でＰ．キリソゲヌム内で 異種遺伝子を発現する可能性を確認した。act遺伝子を有するプラスミドpALP 31 5での大腸菌DH５αの形質転換体は、受託番号CECT4851でSpanish Collection of Type Cultures(CECT)に寄託した。プラスミドpALP316は、反対方向において、p BluescriptＩ KS(＋)のEcoRＩ部位内にpALP315挿入物をサブクローニングするこ とにより簡単に、寄託したプラスミドpALP315から得ることができる。 実施例４ ４．１．Ａ．キリソゲヌムのact遺伝子のクローニング及びキャラクタリゼー ション Ａ．キリソゲヌムのgdh遺伝子をクロ−ニングする目的で、実施例１のセクシ ョン１．１に記載されるように、ファージベクターγGEN12内にDNAライブラリー を作製した。得られたファージタイターは大腸菌LE392内で50pfu／μｌ(全部で2 5,000pfu)及び大腸菌NM539内で41pfu／μｌ(全部で20,500pfu)であった。これは 、そのファージの約82％が外来DNAフラグメントを有すること、及びＡ．キリソ ゲヌムDNAライブラリーが99.999％の確率で得られたことを意味する。この一連 の理論的確認を行った後、大腸菌NM539を感染させ、完全なDNAライブラリーを15 0mm直径の３つのペトリ皿上に広げ（約7,000pfu／ペトリ皿）、50mlのSM＋2.5ml のクロロホルム中に集め、そして４℃に維持した。この方法において、いつでも プレートする準備ができた十分かつ典型的な量の組換えファージ（2,100pfu／μ ｌ）が利用できた。 約20,00０pfuを150mm直径の２つのペトリ皿上に広げ、そして次にニトロセル ロースフィルター（BA85，0.45μｍ，Schleicher & Schuell）に移した。このフ ィルターを、標準的プロトコル(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Col d Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，USA)を用いて、 Ａ．ニジュランスのact遺伝子に対応する888bp Nco Ｉ−Cla Ｉフラグメントとハ イブリダイズさせた。全部で５つの陽性クローンを精製し、そして次にそれらの DNAを一連の制限エンドヌクレアーゼで消化し、そしてサザンブロット技術によ り分析した。この方法において、act遺伝子を8.7kb HindIIIフラグメント内で同 定した。このフラグメントを、プラスミドpBluescriptＩ KS(＋)（Stratagene） 内で両方の方向でサブクローニングし、プラスミドpALC52及びpALC53を作り出し た。act遺伝子を含むDNA領域の制限地図を図４に示す。 上述のプラスミドpALC52及びpALC53を用いてact遺伝子のヌクレオチド配列を 決定した。両方とも製造元の説明に従って、それらプラスミドから、一連のクロ ーンを、“Erase a base”法(Promega)により作製し、そして次に“Sequenase” テストキット(USB)を用いてジデオキシヌクレオチド法により配列決定した。得 られた3,240ヌクレオチド配列（配列番号：４）をGeneplotプログラム(DNASTAR) で分析して、極めて著しく優位なコドン利用法パターンのORFの存在を確認した 。act遺伝子のATG翻訳開始コドンは位置787において見い出され、そしてTAA終止 コドンは位置2,478において見い出された。前記ORFは位置794〜920，952〜1,123 ，1,180〜1,289，1,321〜1,410及び2,183〜2,249において５つのイントロンを有 し、5.51の等電点の41,612Daのタンパク質をコードし、その375アミノ酸配列（ 配列番号：８）は、各々Ａ．ニジュランス及びＰ．キリソゲヌムのγ−アクチン タンパク質のアミノ酸配列と98.4％及 び98.1％の同一性を有する。プロモーター領域において、位置607〜654の間のピ リミジンの豊富なゾーン、位置747における予想されるTATAボックス（TTATAAAA) 及び位置338におけるCAATボックスが見い出された。 ４．２．PactAc下でのＡ．キリソゲヌム内でのbleR遺伝子の発現 PactAcの制御下で発現されるbleR遺伝子、bleR遺伝子下のtrpC遺伝子のターミ ネーター、大腸菌内のマーカーとしてのクロランフェニコール耐性遺伝子及びプ ラスミドpBC KS（＋）のポリリンカーを含むプラスミドpALCfleo１（図６）を、PactAc の制御下でbleR遺伝子を発現する目的のために作製した。 そのプロモーター領域のないbleR 遺伝子は、1,100bp Nco Ｉ−Apa Ｉフラグメ ントとしてプラスミドpUT737（Mullaneyら（1985），Mol．Gen．Genet．199：37 -45）から得た。次にこのフラグメントを、act遺伝子はタンパク質のイニシエー ターメチオニンをコードするATG上にNco Ｉ部位を有するという事実を利用して、PactAc と読み枠内で融合した。これにより、bleR遺伝子をNco Ｉ−Apa Ｉで先に消 化した（PactAcを有する）プラスミドpALCact １内にサブクローニングしてプラ スミドpALCfleo１（図６）を供した。PactAcとbleR との間の融合領域の配列決定 によりその遺伝子の正確な読み枠内の配置を確認した。 Ａ．キリソゲヌムの形質転換を、プラスミドpALCfleo１で行い、ここでそれら 形質転換体は10μｇ／mlのフレオマイシンに対する耐性に基づいて選択した。次 に最大レベルの形質転換体の耐性を固体培地内に確立し、30μｇ／ml超のフレオ マイシンの存在下で増殖することができるいくつかのものを得た。それらのフレ オマイシン耐性について選択した形質転換体において、サザンブロット技術によ りプラスミドの存在について、及びノーザンブロット技術によりbleR遺伝子に対 応する転写物の存在について分析を行い、両方の場合に陽性の結果を得た。これ らの結果により、PactAcの制御下でのＡ．キリソゲヌムにおいて異種遺伝子を発 現する可能性を確認した。act遺伝子を有するプラスミドpALC52での大腸菌DH５ αの形質転換体は、受託番号CECT4850でSpanish Collection of Type Cultnres( CECT)に寄託した。プラスミドpALC53は、反対の方向で、pBluescriptＩ KS(＋) のHind部位内にpALC52挿入物をサブクローニングすることにより簡単に、寄託さ れたプラスミドpALC52から得ることができる。 宿主として大腸菌を用いる寄託されたプラスミド中に存在する挿入物の、放線 菌類、ペニシリウム(Penicillium)、アスペルギルス（Aspergillus）、アクレモ ニウム（Acremomium）又はサッカロマイセス(Saccharomyces)内の導入は、技術 的ルーチンの、及び前記属又は科の形質転換のための最も適切なベクターを選択 することの唯一の問題である。 図面の詳細な記載 図１−NADP依存性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素活性（EC.１．４．１． ４）をコードするＰ．キリソゲヌムのgdh遺伝子の制限地図。 図２−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ酵素活性（EC．３．２．１．52） をコードするＰ．キリソゲヌムのhex遺伝子の制限地図。 図３−γ−アクチンをコードするＰ．キリソゲヌムのact遺伝子の制限地図。 図４−γ−アクチンをコードするＡ．キリソゲヌムのact遺伝子 の制限地図。 図５−プロモーターPgdh下でのＳ．ヒンドゥスタヌスの大腸菌bleR遺伝子のla cZ 遺伝子、及びＰ．キリソゲヌムのpahA遺伝子のアンチセンスフラグメントの発 現のためのベクター。 図６−プロモーターPhex，PactPc，PactAc下でのＰ．キリソゲヌム及び／又は Ａ．キリソゲヌム内でのＳ．ヒンドゥスタヌスのbleR遺伝子の発現のためのベク ター。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 37/00 Ｃ１２Ｐ 37/00 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:82） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:82） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 コラドス デ ラ ビエハ，アルフォンワ ホータ. スペイン国，エー―24010 レオン，３― ３°セー．カレ バルカルセ (72)発明者 サルト マルドナド，フランシスコ スペイン国，エー―28023 マドリッド, プラド デ ソモサガス，33―２°セー, カレ デル アブレゴ (72)発明者 ディエス ガルシア，ブルーノ スペイン国，エー―24192 レオン，トロ バホ デル セレセド，カレ ゼネラリシ モ フランコ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．微生物内で遺伝子発現を増加させ又は遮断するための方法であって、ペニ シリウム・キリソゲヌム（Penicillium chrysogenum）のgdh遺伝子のプロモータ ーの制御下で、前記微生物中で、遺伝子、部分的遺伝子配列又はDNAフラグメン トを発現させることを特徴とする方法。 ２．微生物内で遺伝子発現を増加させ又は遮断するための方法であって、ペニ シリウム・キリソゲヌムのhex遺伝子のプロモーターの制御下で、前記微生物中 で、遺伝子、部分的遺伝子配列又はDNAフラグメントを発現させることを特徴と する方法。 ３．微生物内でタンパク質を細胞外発現させるための方法であって、該微生物 内で、ペニシリウム・キリソゲヌムのhex遺伝子との遺伝子融合物を発現させる ことを特徴とする方法。 ４．微生物内で遺伝子発現を増加させ又は遮断するための方法であって、ペニ シリウム・キリソゲヌムのact遺伝子の制御下で、前記微生物中で、遺伝子、部 分的遺伝子配列又はDNAフラグメントを発現させることを特徴とする方法。 ５．微生物内で遺伝子発現を増加させ又は遮断するための方法であって、アク レモニウム・キリソゲヌム（Acremonium chrysogenum）のact遺伝子の制御下で 、前記微生物中で、遺伝子、部分的遺伝子配列又はDNAフラグメントを発現させ ることを特徴とする方法。 ６．前記形質転換された微生物が、非ヒト真核生物、好ましくはペニシリウム (Penicillium)、アスペルギルス(Aspergillus)又はアクレモニウム（Acremonium ）であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 ７．用いる微生物が、好ましくはペニシリウム・キリソゲヌム、 アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）又はアクレモニウム・ キリソゲヌム（Acremonium chrysogenum）であることを特徴とする請求項６に記 載の方法。 ８．gdh遺伝子のプロモーターを含む、Sau3AＩ及びXbaＩ制限部位に結合した2 811bpのＰ．キリソゲヌムから単離されたDNA化合物。 ９．hex遺伝子のプロモーターを含む、BamHＩ及びSacＩ制限部位に結合した77 37bpのＰ．キリソゲヌムから単離されたDNA化合物。 10．act遺伝子のプロモーターを含む、BglII及びEcoRＩ制限部位に結合した49 47bpのＰ．キリソゲヌムから単離されたDNA化合物。 11．act遺伝子のプロモーターを含む２つのHindIII制限部位に結合剤した8650 bpのＡ．キリソゲヌムから単離されたDNA化合物。 12．Ｐ．キリソゲヌムのgdh遺伝子を含む配列番号：１に記載のDNA配列。 13．Ｐ．キリソゲヌムのhex遺伝子を含む配列番号：２に記載のDNA配列。 14．Ｐ．キリソゲヌムのact遺伝子を含む配列番号：３に記載のDNA配列。 15．Ａ．キリソゲヌムのact遺伝子を含む配列番号：４に記載のDNA配列。 16．請求項８〜15のいずれかに記載のDNA化合物と、制限条件下でハイブリダ イズすることができるヌクレオチド配列。 17．Ｐ．キリソゲヌムのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ酵素に相当する配列番 号：５に記載のアミノ酸配列。 18．Ｐ．キリソゲヌムのβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ酵 素に相当する配列番号：６に記載のアミノ酸配列。 19．Ｐ．キリソゲヌムのγ−アクチンタンパク質を相当する配列番号：７に記 載のアミノ酸配列。 20．Ａ．キリソゲヌムのγ−アクチンタンパク質に相当する配列番号：８に記 載のアミノ酸配列。 21．請求項８〜16のいずれかに記載のDNA化合物を有するベクター、又はその フラグメント。 22．プラスミドからなることを特徴とする請求項２に記載のベクター。 23．pALP784，pALP785及びpALfleo７からなることを特徴とする請求項22に記 載のプラスミド。 24．pALP295，pALP319，pALP377，pALP388及びpALP480からなることを特徴と する請求項22に記載のプラスミド。 25．pALP315及びpALP316からなることを特徴とする請求項22に記載のプラスミ ド。 26．pALC52及びpALC53からなることを特徴とする請求項22に記載のプラスミド 。 27．同種又は異種遺伝子の発現の増加した形質転換された非ヒト生物を得るた めの方法であって、 ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３もしくは配列番号：４、又は それらの組換えDNA化合物を、全体として又は部分的に有するベクターを作製す るステップと、 ｂ）該ベクターを非ヒト宿主生物内に導入し、同種又は異種遺伝子を発現する 形質転換された生物を得るステップと、 ｃ）形質転換されていない対照生物と比較して、同種又は異種遺伝子の発現の 増加を示す形質転換された生物を選択するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 28．細胞タンパク質を生産することができる形質転換された非ヒト生物を得る ための方法であって、 ａ）配列番号：２又はその組換えDNA化合物を、全体として又は部分的に有す るベクターを作製するステップと、 ｂ）該ベクターを非ヒト宿主生物内に導入し、少くとも１のタンパク質を発現 及び分泌する形質転換された生物を得るステップと、 ｃ）形質転換されていない対照生物より高いレベルにおいて、少くとも１のタ ンパク質を分泌することができる形質転換された生物を選択するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 29．形質転換された非ヒト生物の活性を全体として又は部分的に遮断するアン チセンス遺伝子発現を有する該形質転換された非ヒト生物を得るための方法であ って、 ａ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３もしくは配列番号：４、又は それらの組換えDNA化合物を、全体として又は部分的に有するベクターを作製す るステップと、 ｂ）該ベクターを非ヒト宿主生物内に導入し、アンチセンス遺伝子発現を有す る形質転換された生物を得るステップと、 ｃ）形質転換されていない対照生物と比較して、遺伝子の全体として又は部分 的に遮断された発現を示す形質転換された生物を選択するステップと、 を含むことを特徴とする方法。 30．用いられるベクターが、請求項21〜26のいずれかに記載のベクターである か、又はそれらから得られることを特徴とする請求項27又は29に記載の形質転換 された生物を得るための方法。 31．用いられるベクターが、請求項24に記載のベクターであるか 、又はそれから得られることを特徴とする請求項28に記載の形質転換された生物 を得るための方法。 32．用いられる宿主生物が、非ヒト真核生物、好ましくはペニシリウム、アス ペルギルス又はアクレモニウムであることを特徴とする請求項27〜31のいずれか に記載の形質転換された生物を得るための方法。 33．用いられる微生物が、好ましくはペニシリウム・キリソゲヌム、アスペル ギルス・ニジュランス又はアクレモニウムキリソゲヌムであることを特徴とする 請求項32に記載の方法。 34．用いられる宿主生物が、原核生物、好ましくは大腸菌又は放線菌類である ことを特徴とする請求項27〜31のいずれか一に記載の形質転換された生物を得る ための方法。 35．請求項27〜34のいずれかに記載される方法により得ることができる請求項 21〜26のいずれかに記載のベクター内に全体として又は部分的に含まれる請求項 ８〜16のいずれかに記載のDNA配列が導入されていることを特徴とする形質転換 された非ヒト生物。 36．原核生物、好ましくは大腸菌又は放線菌類からなることを特徴とする請求 項35に記載の形質転換された生物。 37．真核生物、好ましくはペニシリウム、アスペルギルス、アクレモニウム又 はサッカロマイセス属の真核生物からなることを特徴とする請求項35に記載の形 質転換された生物。 38．好ましくは、ペニシリウム・キリソゲヌム、アスペルギルス・ニジュラン ス、アクレモニウム・キリソゲヌム又はサッカロマイセス・セレビシアエからな ることを特徴とする請求項36に記載の形質転換された生物。 39．CECT4849，CECT4852，CECT4851及びCECT4850で示される純粋な株又はそれ らの変異体及び形質転換された誘導体からなることを 特徴とする請求項36に記載の生物。 40．抗生物質の生産における、請求項35〜39のいずれかに記載の形質転換され た生物の使用。 41．ペニシリンの生産における請求項35〜39のいずれかに記載の形質転換され た生物の使用。 42．セファロスポリンの生産における請求項35〜39のいずれかに記載の形質転 換された生物の使用。
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6610839B1 (en) * 1997-08-14 2003-08-26 Geron Corporation Promoter for telomerase reverse transcriptase
US6777203B1 (en) * 1997-11-19 2004-08-17 Geron Corporation Telomerase promoter driving expression of therapeutic gene sequences
ES2127697B1 (es) * 1997-03-05 2000-03-16 Antibioticos Sau Promotores de los genes glutamato deshidrogenasa, beta-n-acetilhexosaminidasa y gamma-actina y su utilizacion en sistemas de expresion, secrecion y antisentido de hongos filamentosos.
US7378244B2 (en) * 1997-10-01 2008-05-27 Geron Corporation Telomerase promoters sequences for screening telomerase modulators
ES2143408B1 (es) * 1998-04-02 2000-12-01 Urquima Sa Promotor y construcciones para expresion de proteinas recombinantes en hongos filamentosos.
WO2000052176A1 (de) * 1999-03-03 2000-09-08 Cilian Ag β-HEXOSAMINIDASE SOWIE DIESE KODIERENDE DNA-SEQUENZ AUS CILIATEN UND DEREN VERWENDUNG
US20090104165A1 (en) * 2004-09-22 2009-04-23 Bioworks, Inc. Transgenic strains of trichoderma and their use in biocontrol
EP1801221A1 (en) * 2005-12-22 2007-06-27 Sandoz AG Promoter sequences
CN102127546B (zh) * 2010-11-24 2012-10-24 山东农业大学 一种骨骼肌特异性actin启动子及其应用
CN116004892B (zh) * 2022-10-31 2025-04-29 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 一种香蕉灰纹病菌的pcr检测引物及检测方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8508800D0 (en) * 1985-04-04 1985-05-09 Glaxo Group Ltd Microbiological process
FI864473L (fi) * 1985-11-20 1987-05-21 Panlabs Inc Sammansatta yttryckskassetter foer fungaltransformering.
ES2127697B1 (es) * 1997-03-05 2000-03-16 Antibioticos Sau Promotores de los genes glutamato deshidrogenasa, beta-n-acetilhexosaminidasa y gamma-actina y su utilizacion en sistemas de expresion, secrecion y antisentido de hongos filamentosos.

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