MX2013010043A - Terapia para transtornos neurologicos a base de baclofeno y acampros ato. - Google Patents

Terapia para transtornos neurologicos a base de baclofeno y acampros ato.

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Abstract

La presente invención se refiere a combinaciones y procedimientos para el tratamiento de trastornos neurológicos relacionados con la excitotoxicidad por glutamato y la toxicidad por 3 amiloides. Más específicamente, la presente invención se refiere a nuevas terapias de combinación de esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, trastorno relacionado con la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, dolor neuropático, neuropatía alcohólica, alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, o lesión de la médula espinal, a base de una combinación de baclofeno y acamprosato.

Description

TERAPIA PARA TRASTORNOS NEUROLÓGICOS A BASE DE BACLOFENO Y ACAMPROS ATO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a combinaciones y procedimientos para el tratamiento de enfermedades y trastornos neurológicos . Más específicamente, la presente invención se refiere a una nueva terapia de combinación para trastornos neurológicos, a base a de una combinación de baclofeno y acamprosato.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Alzheimer (EA) es el prototipo de demencia cortical caracterizado por un déficit de memoria junto con disfasia (trastorno del lenguaje en el gue existe una alteración de la expresión y de la comprensión del lenguaje), dispraxia (incapacidad para coordinar y realizar determinados movimientos y gestos intencionales en ausencia de capacidad motora o deficiencias sensoriales) y agnosia (capacidad para reconocer objetos, personas, sonidos, formas, u olores) atribuibles a la participación de las áreas de asociación corticales. También pueden estar implicados síntomas especiales tales como paraparesia espástica (debilidad que afecta a las extremidades inferiores) (1-4).
La incidencia de la enfermedad de Alzheimer aumenta drásticamente con la edad. EA es en la actualidad la causa más común de demencia. Clínicamente se caracteriza por un deterioro global de la función cognitiva que progresa lentamente y que deja a los pacientes en fase terminal condenados a la cama, incontinentes y dependientes de los cuidados de custodia. La muerte se produce, como promedio, 9 años después del diagnóstico (5) .
La tasa de incidencia de la EA aumenta drásticamente con la edad. Las proyecciones demográficas de las Naciones Unidas estiman que el número de personas mayores de 80 años se acercará a 370 millones hacia el año 2050. En la actualidad, se estima que un 50 % de las personas mayores de 85 años de edad padecen EA. Por lo tanto, más de 100 millones de personas en todo el mundo padecerán demencia en 50 años. El gran número de personas que necesitan cuidados constantes y otros servicios afectarán gravemente a los recursos médicos, económicos y humanos (6) .
El deterioro de la memoria es la característica temprana de la enfermedad e implica a la memoria episódica (memoria para sucesos del día a día) . La memoria semántica (memoria para el significado verbal y visual) está implicada posteriormente en la enfermedad. Por el contrario, la memoria de trabajo (memoria a corto plazo que implica las estructuras y los procedimientos usados para almacenar y manipular temporalmente la información) y la memoria procedimental (memoria inconsciente que es la memoria a largo plazo de las competencias y el procedimiento) se conservan hasta el final. A medida que la enfermedad progresa, las características adicionales de deterioro del lenguaje, déficits de percepción visual y espacial, agnosias y apraxias aparecen.
El cuadro clásico de la enfermedad de Alzheimer es suficientemente característico como para permitir la identificación en aproximadamente un 80 % de los casos (7) . Sin embargo, la heterogeneidad clínica se produce y no sólo esto es importante para la gestión clínica sino que proporciona la implicación adicional de tratamientos farmacológicos específicos para formas funcionalmente diferentes ( 8 ) .
La evidencia patológica de la EA incluye placas amiloides que contienen beta-amiloides (Abeta) , ovillos neurofibrilares (NFT) que contienen disfunción y pérdida de proteina Tau y neuronal y sináptica (9-11) . Durante la última década, se han propuesto dos hipótesis principales sobre la causa de la EA: la "hipótesis de la cascada de amiloides", que establece que el proceso neurodegenerativo es una serie de sucesos desencadenados por el procesamiento anómalo de la proteína precursora de amiloides (APP) (12), y la "hipótesis de la degeneración del citoesqueleto neuronal" (13), que propone que los cambios en el citoesqueleto son los sucesos desencadenantes. La teoría más ampliamente aceptada que explica la progresión de la EA sigue siendo la hipótesis de la cascada de amiloides (14-16) y los investigadores de la EA se han centrado principalmente en la determinación de los mecanismos que subyacen a la toxicidad asociada con las proteínas Abeta. La permeabilidad microvascular y la angiogénesis de remodelación, anómala y el colapso de barrera hematoencefálica se han identificado como sucesos claves que contribuyen a la toxicidad por APP en la cascada de amiloides (17) . Por el contrario, la proteína Tau ha recibido mucha menos atención por parte de la industria farmacéutica que los amiloides, debido a preocupaciones tanto fundamentales como prácticas. Además, el cambio en la densidad sináptica es la lesión patológica que mejor se correlaciona con el deterioro cognitivo que con los otros dos. Los estudios han revelado que la patología amiloide parece progresar de una manera específica de neurotransmisores en la que los terminales colinérgicos parecen los más vulnerables, seguido de los terminales glutamatérgicos y finalmente por los terminales GABAérgicos (11)· El glutamato es el neurotransmisor excitatorio más abundante en el sistema nervioso de los mamíferos. En afecciones patológicas, su acumulación anómala en las derivaciones de la hendidura sináptica lleva a la sobreactivación de los receptores de glutamato (18). La acumulación anómala de glutamato en las derivaciones de la hendidura sináptica lleva a la sobreactivación de los receptores de glutamato que da como resultado procesos patológicos y finalmente la muerte celular neuronal. Este proceso, denominado excitotoxicidad, se observa normalmente en los tejidos neuronales durante los trastornos neurológicos agudos y crónicos.
Cada vez es más evidente que la excitotoxicidad está implicada en la patogénesis de múltiples trastornos de diversas etiologías tales como: lesión de la médula espinal, apoplejía, lesión cerebral traumática, pérdida de audición, alcoholismo y síndrome de abstinencia por alcohol, neuropatía alcohólica, o dolor neuropático así . como enfermedades neurodegenerativas tales como esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, y enfermedad de Huntington (19-21) . El desarrollo de tratamientos eficaces para estas enfermedades sigue siendo uno de los asuntos principales de salud pública debido a su incidencia así como a la falta de tratamientos curativos.
Se usan dos tipos de medicamentos para mejorar o retrasar los síntomas de la EA que se aplican en algunos moduladores de la acetilcolinesterasa y bloqueadores de los receptores NMDA de glutamato (26-27).
Los antagonistas de NMDAR que se dirigen a diversos sitios de este receptor se han sometido a ensayo para contrarrestar la excitotoxicidad. Los antagonistas no competitivos de NMDAR se dirigen al poro del canal iónico reduciendo de este modo la entrada de calcio en las neuronas postsinápticas . Algunos de ellos alcanzaron el estado de aprobación. Como un ejemplo, la memantina está aprobada actualmente para la enfermedad de Alzheimer de moderada a grave. Se ha sometido a ensayo clínicamente para otras indicaciones que incluyen un componente de excitotoxicidad tal como dependencia al alcohol (fase II), esclerosis lateral amiotrófica (fase III), demencia asociada con Parkinson (Fase II), epilepsia, enfermedad de Huntington (fase IV), esclerosis múltiple (fase IV) , enfermedad de Parkinson (fase IV) y lesión cerebral traumática (fase IV) . Esta molécula, sin embargo, es de beneficio limitado para la mayoría de los pacientes con enfermedad de Alzheimer, ya que solo tiene efectos sintomáticos modestos. Otro enfoque en la limitación de la excitotoxicidad consiste en la inhibición de la liberación presináptica de glutamato. El riluzol, aprobado actualmente para la esclerosis lateral amiotrófica, mostró resultados alentadores en los modelos de isquemia y lesión cerebral traumática (22-25) . En la actualidad se está sometiendo a ensayo en pruebas de esclerosis múltiple temprana en fase II, enfermedad de Parkinson (no muestra ningún resultado mejor que el placebo) así como en la lesión de la médula espinal. En 1995, el fármaco alcanzó el estatus de fármaco huérfano para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica y en 1996 para el tratamiento de la enfermedad de Huntington.
También se ha sugerido el uso de antagonistas del receptor de NMDA tales como memantina, felbamato, acamprosato y MRZ 2/579 para el tratamiento de la depresión en el documento US2010076075.
El documento O2009133128 , el documento WO2009133141, el documento WO2009133142 y el documento WO2011054759 desvelan combinaciones de fármacos para su uso en el tratamiento de la EA.
A pesar de la investigación activa en esta área, todavía existe la necesidad de terapias alternativas o mejoradas para trastornos neurológicos, y, en particular, trastornos neurológicos que están relacionados con la toxicidad por glutamato y/o beta amiloides. La presente invención proporciona nuevos tratamientos para dichas enfermedades neurologicas del sistema nervioso central (SNC) y del sistema nervioso periférico (SNP) .
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Es un objetivo de la presente invención proporcionar nuevos procedimientos y composiciones terapéuticos para tratar trastornos neurológicos. Más particularmente, la invención se refiere a composiciones y procedimientos para tratar trastornos neurológicos relacionados con la toxicidad por glutamato y/o beta amiloides, basado en una combinación de baclofeno y acamprosato.
La invención se origina, entre otros, a partir del descubrimiento inesperado, por los inventores, de que la combinación de baclofeno y acamprosato proporciona un beneficio importante e inesperado a los pacientes con enfermedad de Alzheimer. Además, los inventores han descubierto sorprendentemente que esta combinación proporciona protección importante e inesperada de las células neuronales frente a diversas lesiones encontradas en los trastornos neurológicos que incluyen la toxicidad por glutamato. De este modo, esta combinación de baclofeno y acamprosato constituye un tratamiento eficaz para pacientes que padecen, están predispuestos a, o se sospecha que padecen trastornos neurológicos .
Un objeto de la presente invención se refiere por lo tanto a composiciones que comprenden una combinación de baclofeno y acamprosato, para uso en el tratamiento de un trastorno neurológico, particularmente EA y trastornos relacionados, esclerosis múltiple (EM) , esclerosis lateral amiotrófica (ELA) , enfermedad de Parkinson (EP) , neuropatías (por ejemplo dolor neuropático o neuropatía alcohólica) , alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, enfermedad de Huntington (EH) y lesión de la médula espinal.
La composición de la invención puede contener baclofeno y acamprosato como los únicos principios activos. Como alternativa, las composiciones pueden comprender un principio o principios activos adicionales. A este respecto, un objeto adicional de la presente invención se refiere a una composición que comprende una combinación de baclofeno, acamprosato, y al menos un tercer compuesto seleccionado entre sulfisoxazol, metimazol, prilocaína, difilina, quinacrina, carbenoxolona, ácido aminocaproico, cabergolina, dietilcarbamazina, cinacalcet, cinnarizina, eplerenona, fenoldopam, leflunomida, levosimendán, sulodexida, terbinafina, zonisamida, etomidato, fenformina, trimetazidina, mexiletina, ifenprodilo, moxifloxacina, bromocriptina o torasemida, para uso en el tratamiento de trastornos neurológicos en un sujeto con necesidad de los mismos Como se desvelará adicionalmente en la presente solicitud, los compuestos en una terapia de combinación de la invención se pueden administrar simultáneamente, separadamente, secuencialmente y/o repetidamente al sujeto.
La invención también se refiere a cualquier composición farmacéutica que comprende per se una combinación de al menos dos compuestos tal como se ha definido anteriormente.
Las composiciones la invención por lo general comprenden adicionalmente uno o varios excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Además, los compuestos tal como se usan en la presente invención pueden estar en la forma de una sal, hidrato, éster, éter, ácido, amida, racemato, o isómero. También pueden estar en forma de formulaciones de liberación sostenida. Además también se pueden usar profármacos o derivados de los compuestos.
En una realización preferente, el compuesto se usa como tal o en forma de una sal, hidrato, éster, éter o forma de liberación sostenida del mismo. Una sal particularmente preferente para uso en la presente invención es el acamprosato cálcico.
En otra realización preferente, se usa un profármaco o derivado .
Un objetivo adicional de la presente invención es un procedimiento para preparar una composición farmacéutica, procedimiento que comprende mezclar baclofeno y acamprosato, en un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro objetivo de la presente invención se refiere a un procedimiento para tratar un trastorno neurológico en un sujeto mamífero con necesidad del mismo, preferentemente un ser humano que lo necesita, procedimiento que comprende la administración a dicho sujeto una cantidad eficaz de una combinación de la invención.
Un objetivo adicional de la presente invención se refiere a un procedimiento para tratar Alzheimer o un trastorno relacionado en un sujeto mamífero que lo necesita, preferentemente un ser humano que lo necesita, procedimiento que comprende la administración a dicho sujeto de una cantidad eficaz de una combinación de la invención .
Un objetivo preferente de la presente invención se refiere a un procedimiento para tratar un trastorno neurológico en un sujeto mamífero que lo necesita, preferentemente un ser humano que lo necesita, procedimiento que comprende la administración simultáneamente, separadamente o secuencialmente a dicho sujeto de una cantidad eficaz de baclofeno y acamprosato.
Un objetivo más preferente de la presente invención se refiere a un procedimiento para tratar Alzheimer o un trastorno relacionado en un sujeto mamífero que lo necesita, preferentemente un ser humano que lo necesita, procedimiento que comprende la administración simultáneamente, separadamente o secuencialmente a dicho sujeto de una cantidad eficaz de baclofeno y acamprosato.
La invención se puede usar para tratar un trastorno neurológico en cualquier sujeto mamífero, preferentemente en cualquier ser humano, en cualquier etapa de la .enfermedad. Tal como se desvelará en los ejemplos, las composiciones de la invención son capaces de mejorar la afección patológica de dichos sujetos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE IAS FIGURAS DE LA INVENCIÓN Figura 1: Validación del modelo experimental de toxicidad por ß amiloide humano usado para la identificación sistemática de fármacos. Una hora de tratamiento previo con VEGF a 10 nM protegió significativamente la red capilar a partir de esta lesión por amiloides (+ 70 % de la red capilar en comparación con la intoxicación por amiloides).
Figura 2: Efecto de la terapia de combinación de baclofeno (BCL) y acamprosato (ACP) sobre la longitud total de la red capilar en cultivos de HB EC intoxicados con beta amiloides. El péptido amiloide humano (?ß1-42 2,5 µ?) produce una intoxicación significativa, superior a un 40 %, en comparación con las células tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene significativamente con la combinación de acamprosato y baclofeno (A) mientras que, a esas concentraciones, acamprosato (B) y baclofeno (C) solos no tienen ningún efecto significativo sobre la intoxicación. ?: p < 0,05, significativamente diferente a partir de la intoxicación por ?ß1-42; * : p < 0,05, significativamente diferente a partir del vehículo; "ns" sin efecto significativo (ensayo de ANOVA + Post-Hoc de Dunnett) .
Figura 3: Efecto de la terapia de combinación de baclofeno (BCL) y terbinafina (TBN) sobre la longitud total de la red capilar en cultivos de HBMEC intoxicados con beta -amiloides. El péptido amiloide humano (?ß1-42 2,5 µ?) produce una intoxicación significativa, superior a un 40 %, en comparación con las células tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene significativamente con la combinación de terbinafina y baclofeno. *: p < 0,05: significativamente diferente a partir del control (sin intoxicación) .
Figura 4 : Validación del modelo experimental de la toxicidad por ß amiloide humano sobre las células neuronales usado para la identificación sistemática de fármacos. Una hora de tratamiento previo con estradiol (150 nM) o BDNF (50 ng/ml) protegió significativamente las neuronas a partir de esta lesión por amiloides (- 94 %) , lo que se considera como un control positivo para la neuroprotección. * : p < 0,05: significativamente diferente a partir del control (sin intoxicación); ?: p < 0,05, significativamente diferente a partir de la intoxicación por ?ß1-42.
Figura 5: Efecto de la terapia de combinación de acamprosato (ACP) y baclofeno (BCL) sobre la liberación de LDH en la toxicidad por ?ß1-42 humano en células corticales primarias de rata. El péptido amiloide humano (?ß1-42 10 µ?) produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene significativamente con la combinación de acamprosato y baclofeno (A) mientras que, a esas concentraciones, acamprosato (B) y baclofeno (C) solos no tienen ningún efecto significativo sobre la intoxicación. ?: p < 0,05, significativamente diferente a partir de la intoxicación por ?ß1-42; *: p < 0,05, significativamente diferente a partir de vehículo; "ns" sin efecto significativo (ensayo de ANOVA + Post-Hoc de Dunnett) .
Figura 6: Efecto de la terapia de combinación de cinacalcet (CNC) y Sulfisoxazol (SFX) sobre la liberación de LHD en' la toxicidad por ?ß1-42 humano en células corticales primarias de rata. El péptido amiloide humano (?ß1-42 10 µ?) produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene significativamente con la combinación de cinacalcet y sulfisoxazol . : p < 0,05, significativamente diferente a partir de vehículo.
Figura 7 : Efecto de la terapia de combinación de acamprosato (ACP) y baclofeno (BCL) sobre la longitud total de la red de neuritas en neuronas corticales intoxicadas con beta amiloides. El péptido amiloide humano (?ß1-42 2,5 µ?) produce una intoxicación significativa, superior a un 15 %, en comparación con las células tratadas con vehículo. Esta intoxicación se previene significativamente con la combinación de acamprosato y baclofeno mientras que, a esas concentraciones, acamprosato y baclofeno por sí solos no tienen efecto significativo sobre la intoxicación. ?: p < 0,05, significativamente diferente a partir de la intoxicación por ?ß1-42; <$> : p < 0,05, significativamente diferente a partir de vehículo (ensayo de ANOVA + Post-Hoc de Dunnett) .
Figura 8 : Efecto de la terapia de combinación de acamprosato y baclofeno sobre el comportamiento tal como se define mediante el ensayo del laberinto en Y. El péptido amiloide produce una disminución significativa en la cognición tal como se mide mediante el porcentaje de alternancia (un 53,8 % frente a un 73,5 %) . Este efecto perjudicial se evita significativamente (un 48,2 % de protección) mediante la combinación de acamprosato (0,2 mg/kg/día) y baclofeno (3 mg/kg/día) . F: p < 0,05, significativamente diferente a partir de intoxicación por ?ß25-35; : p < 0,05, significativamente diferente a partir de vehículo (ensayo de ANOVA + Post-Hoc de Dunnett) .
Figura 9: Efecto de la terapia de combinación de acamprosato y baclofeno sobre la memoria tal como se define mediante la evitación pasiva (tiempo de espera de escape) . El péptido amiloide produce una disminución significativa en los rendimientos de memoria tal como se mide mediante el tiempo de espera de escape en comparación con el control. Este efecto perjudicial se evita significativamente (protección completa) mediante la combinación de acamprosato (0,2 mg/kg) y baclofeno (3 mg/kg) . : p < 0,05, significativamente diferente a partir de intoxicación por ?ß25-35; : p < 0,05, significativamente diferente a partir de vehículo (ensayo de ANOVA + Dunn) .
Figura 10: Efecto de la terapia de combinación de acamprosato y baclofeno sobre la evitación pasiva (tiempo de espera de cruce) . El péptido amiloide produce una disminución significativa en los rendimientos de memoria tal como se mide mediante el tiempo de espera de cruce, superior a un 44 %, en comparación con el control. Este efecto perjudicial se evita significativamente (efecto de protección de un 78,8 %) mediante la combinación de acamprosato (0,2 mg/kg) y baclofeno (3 mg/kg) mientras que, a esas concentraciones, acamprosato y baclofeno por sí solos tienen un efecto inferior sobre la intoxicación. F: p < 0,05, significativamente diferente a partir de intoxicación por ?ß25-35; : p < 0,05, significativamente diferente a partir de vehículo (ensayo de ANOVA + Dunn) .
Figura 11: Efecto de la terapia de combinación de acamprosato y baclofeno sobre la densidad de neuronas en el hipocampo. El péptido amiloide produce una disminución significativa en la densidad neuronal tal como se mide mediante el número de neuronas por milímetro en el hipocampo, superior a un 21 %, en comparación con el control. Esta lesión neuronal se previene significativamente (un 63,2 % de las neuronas dañadas están protegidas) mediante la combinación' de acamprosato (0,2 mg/kg) y baclofeno (3 mg/kg) . : p < 0,05, significativamente diferente a partir de intoxicación por ?ß25-35; F: p < 0,05, significativamente diferente a partir, de vehículo (ensayo de ANOVA + Post-Hoc de Dunnett) .
Figura 12 : Efecto de la terapia de combinación de acamprosato y baclofeno sobre la integridad de la barrera hematoencefálica . El péptido amiloide afecta a la barrera hematoencefálica (BBB) induciendo un efecto significativo sobre su permeabilidad, superior a un 51 %, en comparación con el control. Esos daños en la barrera hematoencefálica se evitan significativamente (un 66,6 % de la integridad restaurada) mediante la combinación de acamprosato (0,2 mg/kg) y baclofeno (3 mg/kg) . F: p < 0,05, significativamente diferente a partir de intoxicación por ?ß25-35; : p < 0,05, significativamente diferente a partir de vehículo (ensayo de ANOVA + Post-Hoc de Dunnett) .
Figura 13: Efecto de la. terapia de combinación de acamprosato y baclofeno sobre la densidad sináptica tal como se refleja mediante la concentración de sinaptofisina . El péptido amiloide afecta a la función de la sinapsis induciendo una disminución significativa de la concentración de sinaptofisina en el cerebro, superior a un 34 %, en comparación con el control. Esos daños en la densidad sináptica se evitan significativamente (76 %) mediante la combinación de acamprosato (0,2 mg/kg/dia) y baclofeno (3 mg/kg/día) . F: p < 0,05, significativamente diferente a partir de intoxicación por ?ß25-35; : p < 0,05, significativamente diferente a partir de vehículo (ensayo de ANOVA + Post-Hoc de Dunnett) .
Figura 14: Efecto protector de la terapia de combinación de acamprosato y baclofeno sobre el estrés oxidativo en el hipocampo. El péptido amiloide induce un aumento significativo del estrés oxidativo en el hipocampo tal como se mide mediante la peroxidación lipídica, superior a un 59 %, en comparación con el control. Este estrés oxidativo se previene significativamente (65,9 %) mediante la combinación de acamprosato (0,2 mg/kg/día) y baclofeno (3 mg/kg/día) . : p < 0,05, significativamente diferente a partir de intoxicación por ?ß25-35; : p < 0,05, significativamente diferente a partir de vehículo (ensayo de ANOVA + Post-Hoc de Dunnett) .
Figura 15: Efecto de la terapia de combinación de baclofeno y acamprosato frente a la toxicidad por glutamato sobre las células corticales neuronales. La intoxicación por glutamato se previene significativamente mediante la combinación de baclofeno (400 nM) y acamprosato (1,6 nM) mientras que, a esas concentraciones, baclofeno y acamprosato por sí solos no tienen ningún efecto significativo en la intoxicación. : p < 0,001, significativamente diferente a partir de la intoxicación por glutamato; (ensayo ANOVA + Post-Hoc de Dunnett) .
Figura 16: Efecto de la terapia de combinación de donepezilo, acamprosato y baclofeno sobre las actuaciones de comportamiento y cognitivo tal como se define mediante el ensayo de laberinto en Y. El péptido amiloide produce una disminución significativa en la cognición tal como se mide mediante el porcentaje de alternancia (un 51,5 % frente a un 71,8 %). Este efecto perjudicial se evita significativamente (un 98 % de protección) mediante la combinación de donepezilo (0,25 mg/kg/dia) , acamprosato (32 µg/kg/día) y baclofeno (480 µg/kg/dia) , mientras que a esas concentraciones, los fármacos por si solos no tienen efecto significativo. : p < 0,01, significativamente diferente a partir de la intoxicación por ?ß25-35; : p < 0,01, significativamente diferente a partir de vehículo (ensayo de ANOVA + Post-Hoc de Dunnett) .
Figura 17: Comparación del efecto protector del tratamiento previo con acamprosato y su derivado homotaurina en los ensayos de toxicidad por ?ß1-42 humano en células corticales primarias de rata. ?ß1-42 produce una intoxicación significativa en comparación con las neuronas tratadas con vehículo. La intoxicación se previene igualmente de forma significativa con homotaurina y acamprosato (99 %, 8 nM) . F: p < 0,0001: significativamente diferente a partir de la intoxicación por ?ß1-42.
Figura 18: Efecto de la terapia de combinación de acamprosato y baclofeno sobre el desarrollo de encefalomielitis autoinmune experimental progresiva crónica (EAE) tal como se define por la puntuación clínica. La inmunización induce una disminución significativa en las características físicas tal - - como se mide mediante la puntuación clínica. Este efecto perjudicial se previene significativamente (valor de p < 0,01) mediante la combinación de acamprosato (2 mg/kg/día) y baclofeno (30 mg/kg/día).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona nuevos procedimientos y composiciones para tratar trastornos neurológicos . La invención desvela el nuevo uso de combinaciones de fármacos que permiten una corrección eficaz de dichas enfermedades y se pueden usar en cualquier sujeto mamífero.
La invención es adecuada para tratar cualquier trastorno neurológico, ya sea central o periférico, particularmente trastornos en los que están implicados lesiones de nervios o neuronales, ß amiloides, colapso de BBB o la excitotoxicidad por glutamato. Los ejemplos específicos de dichos trastornos incluyen enfermedades neurodegenerativas, neuropatías, lesión de- la médula espinal, y abuso de sustancias tales como alcoholismo .
Trastornos neurodegenerativos se refiere a enfermedades, tales como enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) , esclerosis múltiple (EM) , enfermedad de Parkinson (EP) , enfermedad de Huntington (EH) , que incluyen una pérdida progresiva de la función y la muerte de las neuronas.
Las neuropatías se refieren a afecciones en las que los nervios del sistema nervioso periférico están dañados; éstas incluyen daños en el sistema nervioso periférico provocados por factores genéticos, enfermedad inflamatoria, o por sustancias químicas que incluyen fármacos ( vincristina, oxaliplatino, alcohol etílico) . El tratamiento de neuropatías también incluye el tratamiento del dolor neuropático.
La invención es particularmente adecuada para tratar EA y trastornos relacionados. En el contexto de la presente invención, la expresión "trastorno relacionado" incluye demencia senil de tipo EA ( SDA ) , demencia con cuerpos de Lewis, demencia vascular, deterioro cognitivo leve (MCI) y alteración de memoria asociada con la edad (AAMI) .
Tal como se usa en el presente documento, "tratamiento" incluye la terapia, prevención, profilaxis, retraso o reducción de los síntomas provocados por o de las causas de las enfermedades o trastornos mencionados anteriormente. El término tratamiento incluye en particular el control de la progresión de la enfermedad y de los síntomas asociados. El término tratamiento incluye particularmente i) una protección frente a la toxicidad causada por Beta amiloides, o una reducción o retraso de dicha toxicidad, y/o ii) una protección frente a la excitotoxicidad por glutamato, o una reducción retraso de dicha toxicidad, en los sujetos tratados. El término tratamiento también designa una mejora de los síntomas cognitivos o una protección de las células neuronales .
Dentro del contexto de la presente invención, la denominación de un fármaco o compuesto específico se refiere a que incluye no solamente la molécula nombrada específicamente sino también cualquier sal, hidrato, derivado, isómero, racemato, conjugado, profármaco o derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos de cualquier pureza química.
La expresión "tratamiento/terapia de combinación o combinatoria" designa un tratamiento en el que al menos se coadministran baclofeno y acamprosato a un sujeto para provocar un efecto biológico. En una terapia combinada de acuerdo con la presente invención, los al menos dos fármacos se pueden administrar juntos o por separado al mismo tiempo o secuencialmente . Además, el al menos baclofeno y acamprosato se pueden administrar a través de diferentes rutas y protocolos. Como resultado, aunque se pueden formular conjuntamente, los fármacos de la combinación también se pueden formular por separado.
El término "profármaco", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier derivado funcional (o precursores) de un compuesto de la presente invención, que, cuando se administra a un sistema biológico, genera dicho compuesto como resultado de, por ejemplo, reacción o reacciones químicas espontáneas, reacción o reacciones químicas catalizadas por enzimas, y/o reacción o reacciones químicas metabólicas. Los profármacos normalmente son inactivos o menos activos que el fármaco resultante y se pueden usar, por ejemplo, para mejorar las propiedades fisicoquímicas del fármaco, para dirigir el fármaco a un tejido específico, para mejorar las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del fármaco y/o para reducir los efectos secundarios no deseados. Algunos de los grupos funcionales comunes que son susceptibles de diseño de profármaco incluyen, pero no se limitan a, grupos carboxílico, hidroxilo, amina, fosfato/fosfonato y carbonilo. Los profármacos producidos por lo general a través de la modificación de estos grupos incluyen, pero no se limitan a, ésteres, carbonatos, carbamatos, amidas y fosfatos. La orientación técnica específica para la selección de profármacos adecuados es de conocimiento común general (29- - - 33) . Además, la preparación de profármacos se puede realizar mediante procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Los procedimientos que se pueden usar para sintetizar otros profármacos se describen en numerosos análisis sobre el tema (30; 34-40) . Por ejemplo, el arbaclofeno placarbilo aparece en la base de datos de ChemID plus Advance (página web : //chem. sis . nlm. nih . gov/chemidplus/ ) y el arbaclofeno placarbilo es un profármaco bien conocido del Baclofeno (41-42) .
El término "derivado" de un compuesto incluye cualquier molécula que está funcionalmente y/o estructuralmente relacionada con dicho compuesto, tal como un ácido, amida, éster, éter, variante acetilada, variante hidroxilada, o una variante alquilada (C1-C6) de dicho compuesto. El término "derivado" también incluye compuestos relacionados estructuralmente que han perdido uno o más sustituyentes tal como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, la homotaurina es un derivado desacetilado del acamprosato. Los derivados preferentes de un compuesto son moléculas que tienen un grado sustancial de similitud con dicho compuesto, tal como se determina mediante procedimientos conocidos. Compuestos similares, junto con sus índices de similitud con una molécula precursora se pueden encontrar en numerosas bases de datos tales como PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/) o DrugBank (http://www.drugbank.ca/) . En una realización más preferente, los derivados deberían tener un índice de similitud de Tanimoto mayor de 0,4, preferentemente mayor de 0,5, más preferentemente mayor de 0,6, incluso más preferentemente mayor de 0,7 con un fármaco precursor. El índice de similitud de Tanimoto se usa ampliamente para medir el grado de similitud estructural entre dos moléculas. El índice de similitud de Tanimoto se puede calcular mediante software tal como el Detector Subgrafo de Moléculas Pequeñas (43-44), disponible en línea (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/SMSD/ ) . Los derivados preferentes deberían estar relacionados tanto estructural como funcionalmente con un compuesto precursor, es decir, que también deberían retener al menos parte de la actividad del fármaco precursor, más preferentemente deberían tener una actividad protectora frente a la toxicidad por ?ß?? por glutamato.
El término derivados también incluye metabolitos de un fármaco, por ejemplo, una molécula que tiene su origen en la modificación o modificaciones (bioquímicas) o procesamiento de dicho fármaco después de la administración a un organismo, normalmente a través de sistemas enzimáticos especializados, y que muestra o retiene una actividad biológica del fármaco. Se han desvelado metabolitos que son responsables de gran parte de la acción terapéutica del fármaco precursor. En una realización específica, un "metabolito" tal como se usa en el presente documento designa un fármaco modificado o procesado que retiene al menos parte de la actividad del fármaco precursor, preferentemente que tiene una actividad protectora frente a la toxicidad por ?ß o a la toxicidad por glutamato. El término "sal" se refiere a una sal de adición ácida inorgánica u orgánica, farmacéuticamente aceptable y relativamente no tóxica, de un compuesto de la presente invención. La formación de la sal farmacéutica consiste en el emparejamiento de una molécula de fármaco ácido, básico o - - zwitteriónico con un contraión para crear una versión salina del fármaco. En la reacción de neutralización se pueden usar una amplia variedad de especies químicas. Las sales farmacéuticamente aceptables de la invención incluyen por lo tanto las obtenidas haciendo reaccionar el compuesto principal, que actúa como una base, con un ácido inorgánico u orgánico para formar una sal, por ejemplo, sales del ácido acético, ácido nítrico, ácido tartárico, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metano sulfónico, ácido alcanfor sulfónico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido succínico o ácido cítrico. Las sales farmacéuticamente aceptables de la invención también incluyen aquéllas en las que las principales funciones del compuesto son como un ácido y se hace reaccionar con una base apropiada para formar, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio, o colina. Aunque la mayor parte de las sales de un principio activo dado son bioequivalentes , algunas pueden tener, entre otras, propiedades de aumento de solubilidad o de biodisponibilidad . La selección de sales es ahora una operación convencional común en el procedimiento de desarrollo de fármacos tal como enseñaron H. Stahl y C.G Wermuth en su manual (45) .
En una realización preferente, la denominación de un compuesto tiene la intención de denominar al compuesto per se, así como a cualquier sal, hidrato, isómero, racemato, éster o éter farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una realización más preferente, la denominación de un compuesto tiene la intención de denominar al compuesto tal como se denomina específicamente per se, así como cualquier sal farmacéuticamente aceptable del mismo. -2 - En una realización en particular, se usa una formulación de liberación sostenida del compuesto.
Tal como se ha analizado anteriormente, la invención se refiere a combinaciones de fármacos en particular que tienen un fuerte efecto inesperado sobre varios procesos biológicos implicados en los trastornos neurologicos. Estas combinaciones de fármacos representan nuevos enfoques para tratar trastornos neurologicos, tales como enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, neuropatías (por ejemplo dolor neuropático o neuropatía alcohólica) , alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, y lesión de la médula espinal. Más específicamente, la invención desvela composiciones, que comprenden baclofeno en combinación con acamprosato, que proporcionan un efecto significativo in vivo sobre los trastornos neurologicos.
De hecho, la invención muestra, en la parte experimental, que las terapias de combinación que comprenden baclofeno y acamprosato pueden mejorar de manera importante la afección de los pacientes que sufren con trastornos neurologicos. En particular, los inventores han descubierto sorprendentemente que las combinaciones de baclofeno y acamprosato tienen un fuerte efecto, inesperado sobre la longitud de la red capilar o sobre la liberación de LDH en las células nerviosas intoxicadas con beta amiloides, y representan nuevos enfoques terapéuticos de la EA. Además, los ejemplos muestran que, en una terapia de combinación de la invención, el baclofeno puede ser eficaz a una dosis de 80 nM o inferior, y que el acamprosato puede ser eficaz en una dosis de 1 nM o inferior.
Estos resultados son notables y particularmente ventajosos ya que, en dosis tan bajas, se evita cualquier posible efecto secundario .
Además, estas combinaciones protegen eficazmente a las células neuronales de diversas afecciones tales como la toxicidad por glutamato, estrés oxidativo y previene la permeabilización de la BBB o la apoptosis inducida por las células neuronales que están implicadas en varios trastornos neurológicos .
Por lo tanto, la presente invención propone una nueva terapia para trastornos neurológicos, a base de composiciones de baclofeno y acamprosato. Más particularmente, la presente invención propone por lo tanto, una nueva terapia para la enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, neuropatías (por ejemplo dolor neuropático o neuropatía alcohólica), alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, y lesión de la médula espinal, a base de composiciones de baclofeno y acamprosato. En este sentido, en una realización en particular, la invención se refiere a una composición que comprende baclofeno y acamprosato.
En una realización adicional, la invención se refiere a una composición que comprende baclofeno y acamprosato para uso en el tratamiento de la EA, trastornos relacionados con la EA, EM, EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo, dolor neuropático o neuropatía alcohólica) , alcoholismo o abstinencia del alcohol, o lesión de la médula espinal.
En una realización adicional, la invención se refiere al uso de baclofeno y acamprosato para la preparación de un - - medicamento para el tratamiento de la EA, trastornos relacionados con la EA, EM, EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo, dolor neuropático o neuropatía alcohólica), alcoholismo o abstinencia del alcohol, o lesión de la médula espinal.
Los números CAS ilustrativos para baclofeno y acamprosato se proporcionan en la Tabla 1 que sigue a continuación. La Tabla 1 también indica, de una manera no limitativa, sales comunes, racematos, profármacos, metabolitos o derivados de estos compuestos usados en las composiciones de la invención.
Tabla 1 Fármaco Números CAS Clase o índice de similitud de Tanimoto Acamprosato y compuestos relacionados Acamprosato 77337-76-9 ; 77337-73-6 ND Homotaurina 3687-18-1 0,73 Sulfonato de etil dimetil amonio propano / 0,77 Taurina 107-35-7 0,5 Baclofeno y compuestos relacionados Baclofeno 1134-47-0; 66514-99-6; 69308-37-8; 70206-22-3; 63701-56-4; 63701-55-3 ND Acido 3- (p-clorofenil ) -4-hidroxibutírico / Metabolito Arbaclofeno placarbilo 847353-30-4 Profármaco En Hanafi y col, 2011 (41) se proporcionan ejemplos específicos de profármacos de baclofeno, particularmente ésteres de baclofeno y carbamatos de ésteres de baclofeno, que son de interés particular para la dirección del SNC. Por lo tanto, dichos profármacos son particularmente adecuados para las composiciones de la presente invención. Baclofeno - - placarbilo, tal como se ha mencionado anteriormente, también es un profármaco bien conocido y por lo tanto se puede usar en lugar de baclofeno en las composiciones de la invención. Otros profármacos de baclofeno se pueden encontrar en las siguientes solicitudes de patente: documento W02010102071, documento US2009197958 , documento WO2009096985, documento WO2009061934, documento O2008086492, documento US2009216037, documento WO2005066122, documento US2011021571, documento WO2003077902, documento O2010120370.
Los profármacos útiles para acamprosato tales como éster del ácido pantoico, ésteres de neopentil sulfonilo, profármacos de ésteres de neopentil sulfonilo o profármacos del éster de neopentil sulfonilo con carboxilato enmascarado de acamprosato se indican especialmente en el documento WO2009033069, el documento WO2009033061, el documento WO2009033054, el documento WO2009052191, el documento WO2009033079, el documento US 2009/0099253, el documento US 2009/0069419, el documento US 2009/0082464, el documento US 2009/0082440, y el documento US 2009/0076147. baclofeno y acamprosato se pueden usar solos o se pueden combinar adicionalmente con compuestos adicionales. En este sentido, en una realización en particular, las composiciones de la invención pueden comprender adicionalmente al menos un compuesto seleccionado entre sulfisoxazol, metimazol, prilocaina, difilina, quinacrina, carbenoxolona, ácido aminocaproico, cabergolina, dietilcarbamazina, cinacalcet, cinnarizina, eplerenona, fenoldopam, leflunomida, levosimendán, sulodexida, terbinafina, zonisamida, etomidato, fenformina, trimetazidina, mexiletina, ifenprodilo, moxifloxacina, bromocriptina o torasemida. Los números CAS ilustrativos para cada uno de estos compuestos se proporcionan en la Tabla 2 que sigue a continuación: Tabla 2 NOMBRE DEL FÁRMACO NÚMERO CAS Ácido aminocaproico 60-32-2 Bromocriptina 25614-03-3 Cabergolina 81409-90-7 Carbenoxolona 5697-56-3 Cinacalcet 226256-56-0 Cinnarizina 298-57-7 Dietilcarbamazina 90-89-1 Difilina 479-18-5 Eplerenona 107724-20-9 Etomidato 33125-97-2 Fenoldopam 67227-57-0 Ifenprodilo 23210-56-2 o 23210-58-4 Leflunomida 75706-12-6 Levosimendán 141505-33-1 Metimazol 60-56-0 Mexiletina 5370-01-4 o 31828-71-4 Moxifloxacina 354812-41-2 Fenformina 114-86-3 Prilocaína 721-50-6 o 14289-31-7 o 14289-32-8 Quinacrina 83-89-6 Sulfisoxazol 127-69-5 Sulodexida 57821-29-1 Terbinafina 91161-71-6 Torasemida 56211-40-6 o 72810-59-4 Trimetazidina 5011-34-7 o 13171-25-0 -2 - Zonisamida 68291-97-4 En una realización en particular, la invención se refiere al uso de esta combinación para tratar EA o un trastorno relacionado en un sujeto que lo necesita.
En una realización en particular, la invención se refiere al uso de esta combinación para tratar EM, EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo dolor neuropático o neuropatía alcohólica) , alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, o lesión de la médula espinal, en un sujeto que lo necesita .
Tal como se desvela en los ejemplos, las terapias de composición que usan al menos baclofeno y acamprosato tienen un fuerte efecto inesperado sobre los procesos biológicos que conducen a lesiones neuronales. Además, estas combinaciones también mostraron in vivo una capacidad muy eficaz para corregir los síntomas de las enfermedades neurológicas . Estas combinaciones representan por lo tanto nuevos enfoques para tratar trastornos neurológicos como tales como enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, neuropatías (por ejemplo dolor neuropático o neuropatía alcohólica) , alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, y lesión de la médula espinal. Estas composiciones previenen de forma eficaz la toxicidad del péptido Damiloide (?ß) o la excitotoxicidad por glutamato sobre las células neuronales. Además, in vivo, estas composiciones conducen a una mejora de varios síntomas cognitivos así como a una protección de las células neuronales. Por lo tanto, representan procedimientos nuevos y potentes para tratar dichos trastornos.
- - La sección experimental muestra, además, que las composiciones que se han mencionado anteriormente también son eficaces i) en la protección, de forma sinérgica, de las células neuronales in vitro a partir de la excitotoxicidad por glutamato, y ii) en conferir beneficio clínico en modelos in vivo para enfermedades relacionadas con la excitotoxicidad por glutamato.
Las composiciones de la invención pueden comprender 1, 2, 3, 4 o 5 fármacos distintos, más preferentemente 2, 3 o 4 fármacos distintos para el tratamiento de combinación de la enfermedad de Alzheimer (EA) , trastornos relacionados con la EA, E , EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo dolor neuropático o neuropatía alcohólica) , alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, o lesión de la médula espinal en un sujeto que lo necesita. En una realización preferente, los fármacos de la invención se usan en combinación o combinaciones para la administración combinada, separada o secuencial, con el fin de proporcionar el efecto más eficaz. Las composiciones preferentes de la invención, para uso en el tratamiento de un trastorno neurológico tal como enfermedad de Alzheimer (EA) , trastornos relacionados con la EA, EM, EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo dolor neuropático o neuropatía alcohólica) , alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, o lesión de la médula espinal, comprenden una de las siguientes combinaciones de fármacos, para la administración combinada, separada o secuencial: baclofeno y acamprosato, baclofeno y acamprosato y dietilcarbamazina, baclofeno y acamprosato y cinacalcet, - baclofeno y acamprosato y sulfisoxazol , - - - baclofeno y acamprosato y torasemida, - baclofeno y acamprosato e ifenprodilo, - baclofeno y acamprosato y mexiletina , - baclofeno y acamprosato y eplerenona, - baclofeno y acamprosato y levosimendán, - baclofeno y acamprosato y terbinafina, o - baclofeno y acamprosato y leflunomida .
Tal como se desvela en la sección experimental, las terapias de combinación de la invención proporcionan un efecto terapéutico y biológico sustancial para mejorar la enfermedad de Alzheimer o trastornos relacionados en seres humanos. Ellos inducen un fuerte efecto neuroprotector frente a la toxicidad por ?ß y dan resultados positivos en actuaciones de comportamiento y en ensayos bioquímicos in vivo. Los resultados muestran que las composiciones de la invención i) corrigen de manera eficaz las vias moleculares desencadenadas, in vivo, mediante agregados de ?ß y ii) conducen a una mejora de las deficiencias neurofisiológicas observadas en animales enfermos tal como la supervivencia de neuronas o la integridad de la sinapsis.
Además, los resultados presentados también muestran que las terapias de combinación anteriores tienen un importante efecto neuroprotector sinérgico frente a la excitotoxicidad por glutamato (figura 15), una vía que está implicada en diversas enfermedades neurológicas tales como EA, EM, EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo dolor neuropático o neuropatía alcohólica) , alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, o lesión de la médula espinal. Estas terapias dan resultados positivos en modelos in vivo o in vitro para estas enfermedades.
Además, los resultados in vivo también muestran que las composiciones de la invención restauran de forma eficaz la integridad de la barrera hematoencefálica y previenen, retrasan, o disminuyen el mecanismo que desencadena la apoptosis, que se sabe que está alterada en varias enfermedades neurológicas .
Además, la interacción sinérgica particularmente elevada observada para estos dos fármacos permite el uso de las concentraciones de fármacos que no muestran ningún efecto cuando se usan en un tratamiento con un solo fármaco. Además, tal como se muestra en la sección experimental, la combinación de baclofeno y acamprosato provoca un beneficio terapéutico mejorado sobre la enfermedad de Alzheimer en comparación con otras combinaciones terapéuticas. Estas composiciones previenen eficazmente los efectos tóxicos de la proteina o del péptido ß amiloide sobre células humanas y en un modelo in vivo y representan nuevos y potentes procedimientos para el tratamiento de dicho trastorno.
Un objeto de la presente invención también reside de este modo en una composición tal como se ha definido anteriormente para tratar un trastorno neurológico, tal como la enfermedad de Alzheimer (EA) , trastornos relacionados con la EA, EM, EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo neuropatía alcohólica o dolor neuropático) , alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, o lesión de la médula espinal.
Tal como se ha indicado anteriormente, en una terapia de combinación de la presente invención, los compuestos o fármacos se pueden formular juntos o separadamente, y se administran juntos, separadamente o secuencialmente .
Un objetivo adicional de la presente invención reside en el uso de una composición tal como se ha definido anteriormente para la preparación de un medicamento para tratar un trastorno neurológico tal como la enfermedad de Alzheimer (EA) , trastornos relacionados con la EA, E , EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo dolor neuropático o neuropatía alcohólica) , alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, o lesión de la médula espinal.
La invención también proporciona un procedimiento para tratar un trastorno neurológico tal como la enfermedad de Alzheimer (EA) , trastornos relacionados con la EA, EM, EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo dolor neuropático o neuropatía alcohólica) , alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, o lesión de la médula espinal, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una composición tal como se ha desvelado anteriormente. Un objetivo adicional de la invención es un procedimiento para tratar un trastorno neurológico tal como la enfermedad de Alzheimer (EA) , trastornos relacionado con la EA, EM, EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo dolor neuropático o neuropatía alcohólica) , alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, o lesión de la médula espinal, procedimiento que comprende administrar simultáneamente, separadamente o secuencialmente, a un sujeto que lo necesita, una cantidad eficaz de una composición tal como se ha desvelado anteriormente En una realización preferente, la invención se refiere a un procedimiento para tratar un trastorno neurológico tal como la enfermedad de Alzheimer (EA) , trastornos relacionados con la EA, EM, EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo dolor neuropático o neuropatía alcohólica) , alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, o lesión de la médula espinal en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar simultáneamente, separadamente o secuencialmente al sujeto una cantidad eficaz de baclofeno y acamprosato Las composiciones de la invención comprenden por lo general uno o varios vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. Además, para su uso en la presente invención, los fármacos o los compuestos normalmente se mezclan con excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
En este sentido, un objetivo adicional de la presente invención es un procedimiento para preparar una composición farmacéutica, procedimiento que comprende la mezcla de los compuestos anteriores en un excipiente o vehículo apropiado. En una realización en particular, el procedimiento comprende mezclar baclofeno y acamprosato en un excipiente o vehículo apropiado .
De acuerdo con realizaciones preferentes de la invención, tal como se ha indicado anteriormente, los compuestos se usan como tal o en forma de una sal, profármaco, derivado, o formulación de liberación sostenida farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Aunque muy eficaz in vitro e in vivo, dependiendo del sujeto o de la afección específica, la terapia de combinación de la invención se puede usar adicionalmente en conjunto o en asociación o en combinación con fármacos o tratamientos adicionales beneficiosos para la afección neurológica tratada en los sujetos.
Otras terapias usadas en conjunto con el fármaco o fármacos o con la combinación o combinaciones de fármaco o fármacos de - - acuerdo con la presente invención, pueden comprender uno o más fármacos que mejoran los síntomas de la enfermedad de Alzheimer, un trastorno relacionado con la EA, EM, EP, ELA, EH, neuropatías (por ejemplo dolor neuropático o neuropatía alcohólica) , alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, o lesión de la médula espinal, o el fármaco o fármacos que se podrían usar para el tratamiento paliativo de estos trastornos. Por ejemplo, los resultados muestran también que las terapias de combinación que se han mencionado anteriormente tienen un importante efecto sinérgico de neuroprotección cuando se combinan con donepezilo (figura 16) . De este modo, las terapias ilustrativas que se pueden usar con las combinaciones de la invención son donepezilo (CAS: 120014-06-4), gabapentina (CAS: 478296-72-9; 60142-96-3), rivastigmina (123441-03-2) o memantina (CAS: 19982-08-2) . En este sentido, en una realización en particular, el fármaco o fármacos o las composiciones de acuerdo con la presente invención se pueden combinar adicionalmente con extractos de Ginkgo biloba. Los extractos adecuados incluyen, sin limitación, extractos de Ginkgo biloba, extractos de Ginkgo biloba mejorados (por ejemplo enriquecidos con principios activos o con reducción de contaminantes) o cualquier fármaco que contenga extractos de Ginkgo biloba.
La terapia de acuerdo con la invención se puede proporcionar en el hogar, en la consulta del médico, una clínica, un departamento ambulatorio de un hospital, o en un hospital, de modo que el médico pueda observar los efectos de la terapia de cerca y hacer los ajustes que sean necesarios.
La duración de la terapia depende de la etapa de la enfermedad que se está tratando, la combinación usada, la - - edad y la afección del paciente, y de como responde el paciente al tratamiento. La dosificación, frecuencia y modo de administración de cada componente de la combinación se pueden controlar independientemente. Por ejemplo, un fármaco se puede administrar por vía oral, mientras que el segundo fármaco se puede administrar por vía intramuscular. La terapia de combinación se puede administrar en ciclos de administración y descanso que incluyen periodos de descanso para que el organismo del paciente tenga la oportunidad de recuperación de cualquier efecto secundario imprevisto hasta la fecha. Los fármacos también se pueden formular juntos de tal manera que una administración distribuye todos los fármacos .
La administración de cada fármaco de la combinación puede ser mediante cualquier medio adecuado que de como resultado una concentración del fármaco que, combinado con el otro componente, sea capaz de mejorar la afección del paciente o tratar de manera eficaz la enfermedad o el trastorno.
Si bien es posible que los fármacos de la combinación se administren como el producto químico puro, es preferente presentarlos en forma de una composición farmacéutica, a la que también se hace referencia en el presente contexto como formulación farmacéutica. Las composiciones posibles incluyen las adecuadas para administración oral, rectal, tópica (que incluyen transdérmica , bucal y sublingual) , o parenteral (que incluyen subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica) .
Más comúnmente estas formulaciones farmacéuticas se prescriben al paciente en "envases para el paciente" que contienen un número de unidades de dosificación u otros medios para la administración de las dosis individuales medidas para su uso durante un periodo de tratamiento distinto en un solo envase, normalmente en un envase de tipo blister. Los envases para el paciente tienen una ventaja sobre las prescripciones tradicionales, en las que un farmacéutico divide el suministro de un paciente de un producto farmacéutico a partir de un suministro a granel, en los que el paciente siempre tiene acceso al prospecto contenido en el envase para el paciente, que normalmente falta en las prescripciones tradicionales. La inclusión de un prospecto ha demostrado mejorar el cumplimiento del paciente con las instrucciones del médico. Por lo tanto, la invención incluye adicionalmente una formulación farmacéutica, tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento, en combinación con el material de envasado adecuado para dichas formulaciones. En dicho envase para el paciente, el uso previsto de una formulación para el tratamiento de combinación se puede inferir a partir de las instrucciones, instalaciones, provisiones, adaptaciones y/u otros medios para ayudar al uso de la formulación más adecuadamente para el tratamiento. Dichas medidas hacen que un envase para el paciente sea específicamente adecuado para y adaptado para su uso para el tratamiento con la ' combinación de la presente invención.
El fármaco puede estar contenido, en cualquier cantidad apropiada, en cualquier sustancia vehículo adecuada. El fármaco puede estar presente en una cantidad de hasta un 99 % en peso del peso total de la composición. La composición se puede proporcionar en una forma de dosificación que es adecuada para la administración oral, parenteral (por - - ejemplo, por via intravenosa, por via intramuscular) , rectal, cutánea, nasal, vaginal, inhaladores, piel (parche) , o la ruta de administración ocular. Por lo tanto, la composición puede estar en forma de, por ejemplo, comprimidos, cápsulas, pildoras, polvos, granulados, suspensiones, emulsiones, soluciones, geles incluyendo hidrogeles, pastas, pomadas, cremas, parches, pociones, dispositivos para administración osmótica, supositorios, enemas, inyectables, implantes, pulverizaciones, o aerosoles.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20a ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams y Wilkins, 2000 y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds . J. Swarbrick y J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nueva York) .
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se pueden formular para liberar básicamente el fármaco activo inmediatamente después de la administración o en cualquier periodo de tiempo predeterminado o periodo de tiempo después de la administración.
Las formulaciones de liberación controlada incluyen (i) formulaciones que crean una concentración básicamente constante del fármaco en el organismo durante un periodo de tiempo prolongado, (ii) formulaciones que después de un lapso de tiempo predeterminado crean una concentración básicamente constante del fármaco dentro del organismo durante un periodo de tiempo prolongado, (iii) formulaciones que mantienen la acción del fármaco durante un periodo de tiempo predeterminado al mantener un nivel de fármaco relativamente - - eficaz, constante en el organismo con una minimización simultánea de los efectos secundarios indeseables asociados con fluctuaciones en el nivel plasmático de la sustancia de fármaco activo; (iv) formulaciones que localizan la acción del fármaco, por ejemplo, mediante la colocación espacial de una composición de liberación controlada adyacente al o en el tejido u órgano enfermo, y (v) formulaciones que dirigen la acción del fármaco mediante el uso de vehículos o derivados químicos para administrar el fármaco a un tipo de célula diana en particular.
La administración de fármacos en la forma de una formulación de liberación controlada es especialmente preferente en los casos en los que el fármaco tiene (i) un índice terapéutico estrecho (es decir, la diferencia entre la concentración en plasma que conduce a efectos secundarios dañinos o reacciones tóxicas y la concentración en plasma que conduce a un efecto terapéutico es pequeña; en general, el índice terapéutico, IT, se define como la relación de la dosis letal media (DL50) a la dosis eficaz media (DE50) ) , (ii) una ventana de absorción estrecha en el tracto gastrointestinal, o (iii) una vida media biológica muy corta de manera que se requiere una dosificación frecuente durante un día con el fin de mantener el nivel de plasma a un nivel terapéutico.
Se puede seguir cualquiera de una serie de estrategias con el fin de obtener la liberación controlada en la que la velocidad de liberación es mayor que la tasa de metabolismo del fármaco en cuestión. La liberación controlada se puede obtener mediante la selección apropiada de diversos parámetros de formulación e ingredientes, que incluyen, por ejemplo, diversos tipos de composiciones y revestimientos de - - liberación controlada. Por lo tanto, el fármaco se formula con excipientes apropiados en una composición farmacéutica que, después de la administración, libera el fármaco de una manera controlada (composiciones de comprimidos o cápsulas unitarias individuales o múltiples, soluciones oleosas, suspensiones, emulsiones, microcápsulas, microesferas, nanoparticulas , parches, y liposomas) .
Formas Sólidas de Dosificación para Uso Oral Las formulaciones para uso oral incluyen comprimidos que contienen la composición de la invención en una mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes o cargas inertes (por ejemplo, sacarosa, celulosa microcristalina, almidones que incluyen almidón de patata, carbonato de calcio, cloruro sódico, fosfato cálcico, sulfato cálcico, o fosfato sódico) ; agentes de granulación y disgregantes (por ejemplo, derivados de celulosa que incluyen celulosa microcristalina, almidones que incluyen almidón de patata, croscarmelosa sódica, alginatos, o ácido alginico) ; agentes aglutinantes (por ejemplo, goma arábiga, ácido alginico, alginato sódico, gelatina, almidón, almidón pregelatinizado, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropil metilcelulosa, etilcelulosa, polivinilpirrolidona, o polietilenglicol ) ; y agentes lubricantes, deslizantes, y antiadhesivos (por ejemplo, ácido esteárico, sílices, o talco) . Otros excipientes f rmacéuticamente aceptables pueden ser colorantes, agentes saborizantes , plastificantes, humectantes, agentes de taponamiento, y similares.
Los comprimidos pueden estar sin revestir o se pueden - - revestir mediante técnicas conocidas, opcionalmente para retrasar la desintegración y la absorción en el tracto gastrointestinal y proporcionando de este modo una acción sostenida durante un periodo más largo. El revestimiento se puede adaptar para liberar la sustancia de fármaco activo con un patrón predeterminado (por ejemplo, con el fin de lograr una formulación de liberación controlada) o se puede adaptar para que no libere la sustancia de fármaco activo hasta después del paso del estómago (revestimiento entérico) . El revestimiento puede ser un revestimiento de azúcar, un revestimiento de película (por ejemplo, a base de hidroxipropil metilcelulosa, metilcelulosa, metil hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa, copolímeros de acrilato, polietilenglicoles y/o polivinilpirrolidona ) , o un revestimiento entérico (por ejemplo, a base de copolímero de ácido metacrílico, ftalato acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropil metilcelulosa, succinato acetato de hidroxipropil metilcelulosa, acetato ftalato de polivinilo, goma laca, y/o etilcelulosa) . Se puede usar un material de retardo temporal tal como, por ejemplo, monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.
Las composiciones de comprimidos sólidos pueden incluir un revestimiento adaptado para proteger la composición de los cambios químicos no deseados, (por ejemplo, degradación química antes de la liberación de la sustancia farmacológica activa) . El revestimiento se puede aplicar sobre la forma de dosificación sólida de una manera similar a la que se describe en la Encyclopedia of Pharmaceutical Technology.
Los fármacos se pueden mezclar juntos en el comprimido o se - - pueden dividir. Por ejemplo, un primer fármaco está contenido en el interior del comprimido, y un segundo fármaco está en el exterior, de tal manera que una porción sustancial del segundo fármaco se libera antes de la liberación del primer fármaco.
Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar en forma de comprimidos ' masticables, o como cápsulas de gelatina dura en las que el principio activo se mezcla con un diluyente sólido inerte (por ejemplo, almidón de patata, celulosa microcristalina, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín) , o en forma de cápsulas de gelatina blanda en las que el principio activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo, parafina líquida, o aceite de oliva. Los polvos y los granulados se pueden preparar usando los ingredientes que se han mencionado anteriormente en comprimidos y cápsulas de una manera convencional.
Las composiciones de liberación controlada para uso oral, por ejemplo, se puede preparar para liberar el fármaco activo mediante el control de la disolución y/o la difusión de la sustancia de fármaco activo.
La liberación controlada por disolución o por difusión se puede conseguir mediante el revestimiento apropiado de un comprimido, cápsula, microgránulo, o formulación granulada de fármacos, o mediante la incorporación del fármaco en una matriz apropiada. Un revestimiento de liberación controlada puede incluir una o más de las sustancias de revestimiento que se han mencionado anteriormente y/o, por ejemplo, goma laca, cera de abejas, glicocera, cera de ricino, cera de carnaúba, alcohol estearílico, monoestearato de glicerilo, diestearato de glicerilo, palmitoestearato de glicerol, etilcelulosa, resinas acrílicas, ácido dl-poliláctico, acetato butirato de celulosa, cloruro de polivinilo, acetato de polivinilo, vinil pirrolidona, polietileno, polimetacrilato, metacrilato de metilo, 2-hidroximetacrilato, hidrogeles de metacrilato, 1,3 butilen glicol, metacrilato de etilenglicol , y/o polietilenglicoles . En una formulación de matriz de liberación controlada, el material de la matriz también puede incluir, por ejemplo, metilcelulosa hidratada, cera de carnaúba y alcohol estearílico, carbopol 934, silicona, triestearato de glicerilo, acrilato de metilo-metacrilato de metilo, cloruro de polivinilo, polietileno y/o fluorocarbono halogenado.
Una composición de liberación controlada que contiene uno o más de los fármacos de las combinaciones que se reivindican también puede estar en la forma de un comprimido o cápsula flotante (es decir, un comprimido o cápsula que, después de la administración oral, flota en la parte superior del contenido gástrico durante un determinado período de tiempo) . Una formulación de comprimido flotante del fármaco o fármacos se puede preparar por granulación de una mezcla del fármaco o fármacos con excipientes y un 20-75 % p/p de hidrocoloides, tales como hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, o hidroxipropilmetilcelulosa . Los gránulos obtenidos se pueden comprimir a continuación en comprimidos. Al contactar con el jugo gástrico, el comprimido forma una barrera de gel básicamente impermeable al agua alrededor de su superficie. Esta barrera de gel forma parte del mantenimiento de una densidad inferior a uno, permitiendo de ese modo que el comprimido permanezca flotando en el jugo gástrico.
Líquidos para Administración Oral - - Polvos, polvos dispersables, o gránulos adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua son formas de dosificación convenientes para la administración oral. La formulación en forma de una suspensión proporciona el principio activo en una mezcla con un agente dispersante o humectante, agente de suspensión, y uno o más conservantes. Agentes de suspensión adecuados son, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, alginato sódico, y similares.
Composiciones Parenterales La composición farmacéutica también se puede administrar por vía parenteral mediante inyección, infusión o implantación (intravenosa, intramuscular, subcutánea, o similares) en formas de dosificación, formulaciones, o mediante dispositivos de administración adecuados o implantes que contienen vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables convencionales, no tóxicos. La formulación y la preparación de dichas composiciones son bien conocidas por los expertos en la técnica de la formulación farmacéutica.
Las composiciones para uso parenteral se pueden proporcionar en formas de dosificación individual (por ejemplo, en ampollas de dosis individuales), o en viales que contienen varias dosis y en las que se puede añadir un conservante adecuado (véase a continuación) . La composición puede estar en forma de una solución, una suspensión, una emulsión, un dispositivo de infusión, o un dispositivo de administración para la implantación o se puede presentar en forma de un polvo seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Aparte del fármaco o fármacos activos, la composición puede incluir vehículos y/o - - excipientes adecuados parenteralmente aceptables. El fármaco o fármacos activos se pueden incorporar en microesferas, microcápsulas , nanoparticulas , liposomas, o similares para la liberación controlada. La composición puede incluir agentes de suspensión, solubilizantes , estabilizantes, agentes de ajuste del pH, y/o agentes dispersantes.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden estar en la forma adecuada para inyección estéril. Para preparar dicha composición, el fármaco o fármacos activos adecuados se disuelven o se suspenden en un vehículo líquido parenteralmente aceptable. Entre los vehículos y los disolventes aceptables que se pueden usar están el agua, agua ajustada a un pH adecuado mediante la adición de una cantidad apropiada de ácido clorhídrico, hidróxido sódico o un tampón adecuado, 1 , 3-butanodiol, solución de Ringer, y solución isotónica de cloruro sódico. La formulación acuosa también puede contener uno o más conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoato de metilo, etilo o n-propilo) . En los casos en los que solo uno de los fármacos es moderadamente o poco soluble en agua, se puede añadir un agente para potenciar o solubilizar la disolución, o el disolvente puede incluir un 10-60 % p/p de propilenglicol o similar.
Las composiciones parenterales de liberación controlada pueden estar en forma de suspensiones acuosas, microesferas, microcápsulas, microesferas magnéticas, soluciones oleosas, suspensiones oleosas, o emulsiones. Como alternativa, el fármaco o fármacos activos se puede incorporar en vehículos biocompatibles, liposomas, nanoparticulas, implantes, o dispositivos de infusión. Materiales para uso en la preparación de microesferas y/o microcápsulas son, por - - ejemplo, polímeros biodegradables/bioerosionables tales como poligalactina, poli- (cianoacrilato de isobutilo) , poli (2-hidroxietil-L-glutamina) . Vehículos biocompatibles que se pueden usar cuando se formula una formulación parenteral de liberación controlada son hidratos de carbono (por ejemplo, dextranos) , proteínas (por ejemplo, albúmina), lipoproteínas, o anticuerpos. Los materiales para uso en implantes pueden ser no biodegradables (por ejemplo, polidimetil siloxano) o biodegradables (por ejemplo, poli (caprolactona) , poli (ácido glicólico) o poli (orto ásteres) ) .
Rutas alternativas Aunque es menos preferente y menos conveniente, se pueden contemplar otras rutas de administración, y por lo tanto otras formulaciones. En este sentido, para la aplicación rectal, las formas de dosificación adecuadas para una composición incluyen supositorios (de tipo emulsión o suspensión) , y cápsulas de gelatina rectales (soluciones o suspensiones) . En una formulación típica de supositorio, el fármaco o fármacos activos se combinan con una base de supositorio apropiada farmacéuticamente aceptable tal como manteca de cacao, ácidos grasos esterificados, gelatina glicerinada, y diversas bases solubles en agua o dispersables como polietilenglicoles . Se pueden incorporar diversos aditivos, potenciadores, o tensioactivos .
Las composiciones farmacéuticas también se pueden administrar por vía tópica sobre la piel para su absorción percutánea en formas de dosificación o formulaciones que contienen vehículos y excipientes convencionalmente farmacéuticos aceptables no tóxicos, que incluyen microesferas y liposomas. Las formulaciones incluyen cremas, ungüentos, lociones, - - linimentos, geles, hidrogeles, soluciones, suspensiones, barras, pulverizadores, pastas, parches, y otros tipos de sistemas de administración transdérmica de fármacos. Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables pueden incluir agentes emulgentes, antioxidantes, agentes de tamponamiento, conservantes, humectantes, potenciadores de penetración, agentes quelantes, agentes formadores de gel, bases de pomadas, perfumes, y agentes protectores de la piel. Los conservantes, humectantes, potenciadores de la penetración pueden ser parabenos, tales como p-hidroxibenzoato de metilo o de propilo, y cloruro de benzalconio, glicerina, propilenglicol, urea, etc.
Las composiciones farmacéuticas que se han descrito anteriormente para la administración tópica en la piel también se pueden usar en conexión con la administración tópica sobre o cerca de la parte del organismo que se va a tratar. Las composiciones se pueden adaptar para su aplicación directa o para la aplicación por medio de dispositivos de administración de fármacos especiales tales como apositos, o como alternativa parches, compresas, esponjas, tiras, u otras formas de material flexible adecuado .
Dosificaciones y duración del tratamiento Se observará que los fármacos de la combinación se pueden administrar de forma simultánea, ya sea en la misma o en diferentes formulaciones farmacéuticas o secuencialmente . Si hay administración secuencial, el retraso en la administración del segundo (o adicional) principio activo no debería ser tal como para perder el beneficio del efecto eficaz de la combinación de los principios activos. Un - - requisito mínimo para una combinación de acuerdo con esta descripción es que la combinación debería tener como objetivo el uso combinado con el beneficio del efecto eficaz de la combinación de los principios activos. El uso previsto de una combinación se puede inferir a partir de instalaciones, suministros, adaptaciones y/u otros medios para ayudar con el uso de la combinación de acuerdo con la invención.
Las cantidades terapéuticamente eficaces de los fármacos en una combinación de la presente invención incluyen, por ejemplo, cantidades que son eficaces para reducir los síntomas de la enfermedad de Alzheimer, detener o ralentizar la progresión de la enfermedad una vez que se ha manifestado clínicamente, o prevenir o reducir el riesgo de desarrollar la enfermedad.
Aunque los fármacos activos de la presente invención se pueden administrar en dosis divididas, por ejemplo dos o tres veces al día, es preferente una dosis diaria única de cada fármaco en la combinación, siendo lo más preferente con una sola dosis diaria de todos los fármacos en una sola composición farmacéutica (forma de dosificación individual) .
La administración puede ser de una a varias veces al día durante varios días a varios años, y puede incluso ser durante toda la vida del paciente. La administración crónica o al menos repetida periódicamente a largo plazo está indicada en la mayoría de los casos.
La expresión "forma de dosificación individual" se refiere a unidades físicamente separadas (tales como cápsulas, comprimidos, o cilindros de jeringas cargadas) adecuadas como dosificaciones individuales para seres humanos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material o - - materiales calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el vehículo farmacéutico requerido .
La cantidad de cada fármaco en una composición de dosificación individual preferente depende de varios factores que incluyen el procedimiento de administración, el peso corporal y la edad del paciente, el estado de la enfermedad, el riesgo de efectos secundarios potenciales en consideración con el estado de salud general de la persona a tratar. Además, la información farmacogenómica (el efecto del genotipo sobre el perfil farmacocinético, farmacodinámico o de eficacia de un agente terapéutico) acerca de un paciente en particular puede afectar a la dosis usada.
Excepto cuando se responde a los casos especialmente muy deteriorados, en los que se pueden requerir dosis más altas, la dosificación preferente de cada fármaco en la combinación normalmente se encontrará dentro del intervalo de dosis no superior a la dosificación que normalmente se prescribe para el tratamiento de mantenimiento a largo plazo o se demuestra que son seguras en los estudios clínicos en fase 3 Una ventaja notable de la invención es que cada compuesto se puede usar a bajas dosis en una terapia de combinación, mientras que produce, en combinación, un beneficio clínico considerable para el paciente. La terapia de combinación de hecho puede ser eficaz a dosis en las que los compuestos individualmente tienen un bajo efecto o ninguno. En consecuencia, una ventaja particular de la invención reside en la capacidad de usar dosis subóptimas de cada compuesto, es decir, dosis que son más bajas que las dosis terapéuticas que se prescriben normalmente, preferentemente 1/2 de las - - dosis terapéuticas, más preferentemente 1/3, 1/4, 1/5, o incluso más preferentemente 1/10 de las dosis terapéuticas. En los ejemplos particulares, se usan dosis tan bajas como 1/20, 1/30, 1/50, 1/100, o incluso inferiores, de las dosis terapéuticas.
A dichas dosificaciones subterapéuticas , los compuestos no deberían presentar ningún efecto secundario, mientras que la combinación o combinaciones de acuerdo con la invención son totalmente eficaces en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.
Una dosificación preferente corresponde a cantidades de un 1 % hasta un 50 % de las que se prescriben normalmente para el tratamiento de mantenimiento a largo plazo.
La dosificación más preferente puede corresponder a cantidades de un 1 % hasta un 10 % de las que se prescriben normalmente para el tratamiento de mantenimiento a largo' plazo .
Los ejemplos específicos de dosificaciones de fármacos para uso en la invención se proporcionan a continuación: - Acamprosato entre 1 y 1000 mg/día, preferentemente inferior a 400 mg al día, más preferentemente inferior a 200 mg/día, incluso más preferentemente inferior a 50 mg/día, siendo dichas dosificaciones particularmente adecuadas para la administración oral.
Baclofeno entre 0,01 a 150 mg al día, preferentemente inferior a 100 mg al día, más preferentemente inferior a 50 mg/día, incluso más preferentemente inferior a 25 mg/día, siendo dichas dosificaciones particularmente adecuadas para la administración oral. -5 - - Ácido aminocaproico por vía oral de aproximadamente 0,1 g a 2,4 g al día, - Bromocriptina por vía oral de aproximadamente 0,01 a 10 mg al día, - Dietilcarbamazina por vía oral de aproximadamente 0,6 a 600 mg al día . , - Cabergolina por vía oral de aproximadamente 1 a 10 µg al día, - Cinacalcet por vía oral de aproximadamente 0,3 a 36 mg al día.
- Cinnarizina por vía oral de aproximadamente 0,6 a 23 mg al día, - Difilina por vía oral de aproximadamente 9 a 320 mg al día, - Eplerenona por vía oral de aproximadamente 0,25 a 10 mg al día, - Ifenprodilo por vía oral de aproximadamente 0,4 a 6 mg al día, - Leflunomida por vía oral de aproximadamente 0,1 a 10 mg al día .
- Levosimendán por vía oral de aproximadamente 0,04 a 0,8 mg al día, - Mexiletina por vía oral de aproximadamente 6 a 120 mg al día, - Moxifloxacina por vía oral de aproximadamente 4 a 40 mg al día, - Fenformina por vía oral de aproximadamente 0,25 a 15 mg al día, - Quinacrina por vía oral de aproximadamente 1 a 30 mg al día, - Sulfisoxazol por vía oral de aproximadamente 20 a 800 mg al - - día .
- Sulodexida por vía oral de aproximadamente 0,05 a 40 mg al día .
- Terbinafina por vía oral de aproximadamente 2,5 a 25 mg al día, - Torasemida por vía oral de aproximadamente 0,05 a 4 mg al día, - Trimetazidina por vía oral de aproximadamente 0,4 a 6 mg al día, - Zonisamida por vía oral de aproximadamente 0,5 a 50 mg al día .
Cuando la composición comprende, como principio activo, solamente baclofeno y acamprosato, estos dos compuestos se pueden usar en diferentes relaciones, por ejemplo, en una relación en peso de acamprosato/baclofeno comprendida entre 0,05 y 1000 (p:p), preferentemente entre 0,05 y 100 (p:p), más preferentemente entre 0,05 y 50 (p:p) - Se entenderá que la cantidad del fármaco administrado en realidad será determinada por un médico, a la luz de las circunstancias relevantes, que incluyen la afección o afecciones a tratar, la composición exacta a administrar, la edad, el peso, y la respuesta del paciente individual, la gravedad de los síntomas del paciente, y la vía de administración elegida. Por lo tanto, los intervalos de dosificación anteriores están destinados a proporcionar una orientación general y apoyo para las enseñanzas en el presente documento, pero no se pretende que limiten el alcance de la invención.
Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines de ilustración y no a modo de limitación.
- - Ej emplos El cuidado y la cria de animales, asi como las experimentaciones se realizan de acuerdo con las directrices del Comité de Investigación y Cuestiones Éticas de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor (I.A.S.P.) (1983) .
A) TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES RELACIONADAS CON LA TOXICIDAD POR ?ß En esta serie de experimentos, las combinaciones candidatas se han sometido a ensayo para su capacidad para prevenir o reducir los efectos tóxicos del ?ß1-42 humano. ?ß1-42 es el péptido de longitud completa que constituye los agregados encontrados en biopsias de pacientes humanos que padecen EA. Los fármacos primero se someten a ensayo individualmente, seguido por ensayos de su acción combinatoria. El efecto se determina en diversos tipos de células, para documentar adicionalmente la actividad de las combinaciones en modelos in vitro que ilustran diferentes características fisiológicas de la EA. Los estudios in vivo también se realizan en un modelo de ratón para la EA que confirma este efecto protector mediante la evaluación del efecto de las combinaciones sobre i) el rendimiento cognitivo de los animales y ii) en las huellas moleculares (inducción de la apoptosis, inducción de estrés oxidativo, inducción de la vía de inflamación) de EA I. LAS TERAPIAS DE COMBINACIÓN DE BACLOFENO-ACAMPROSATO PREVIENEN LA TOXICIDAD DE ?ß1-42 HUMANO IN VITRO 1.1. Efecto sobre la toxicidad del péptido ?ß1-42 humano sobre células HBME humanas Se usaron cultivos de células endoteliales microvasculares de cerebro humano para estudiar la protección proporcionada por el compuesto o los compuestos candidatos sobre la toxicidad por ?ß1-42.
Células cerebrales endoteliales microvasculares de cerebro humano (HB EC, ScienCell Ref : 1000, congeladas en el paso 10) se descongelaron rápidamente en un baño de agua a + 37 °C. El sobrenadante se puso inmediatamente en 9 mi de medio de Eagle modificado con Dulbecco (D E ; Pan Biotech ref: P04-03600) que contenia un 10 % de suero bovino fetal (FCS; ref GIBCO 10270-106) . La suspensión celular se centrifugó a 180 x g durante 10 min a + 4 °C y los sedimentos se suspendieron en medio CSC sin suero (CSC sin suero, Cell System, Ref. : SF-4Z0-500-R, Lote 51407-4) con un 1,6 % de RocketFuel sin suero (Cell System, Ref.: SF-4Z0-500-R, Lote 54102), un 2 % de Penicilina a 10.000 U/ml y 10 mg/ml de Estreptomicina (PS ; Pan Biotech ref: P06-07100 lote 133080808) y se sembraron a una densidad de 20 000 células por pocilio en placas de 96 pocilios (sistema de angiogénesis biocoat con capa de matrigel, BD, Ref 354150, Lote A8662) en un volumen final de 100 µ? . En soporte de matrigel, las células cerebrales endoteliales comenzaron espontáneamente el proceso de morfogénesis de la red capilar (33) .
Se realizaron tres cultivos separados por afección, 6 pocilios por afección.
Compuestos de ensayo y tratamiento de ß1-42 amiloide humano Brevemente, se reconstituyó péptido ?ß1-42 (Bachem, ref: H1368 lote 1010533) en medio de cultivo definido a 20 µ? (solución madre) y se agitó lentamente a + 37 °C durante 3 días en la oscuridad. El medio de control se preparó en las mismas condiciones.
Después de 3 días, este péptido amiloide humano se usó sobre HBMEC a 2,5 µ? diluido en medio de control (tiempo óptimo de incubación) . El péptido ?ß1-42 se añadió 2 horas después de la siembra de HBMEC sobre matrigel durante 18 horas de incubación .
Una hora después de la siembra de HBMEC sobre matrigel, los compuestos de ensayo y VEGF-165 se disolvieron en medio de cultivo (+ DMSO al 0,1 %) y continuación se incubó previamente con HBMEC durante 1 hora antes de la aplicación de ?ß1-42 (en un volumen final por pocilio de cultivo de 100 µ?) . Una hora después de la incubación de los compuestos de ensayo o VEGF (dos horas después de la siembra de células sobre matrigel), se añadieron 100 µ? de péptido ?ß1-42 a una concentración final de 2,5 µ? diluido en medio de control en presencia de los compuestos de ensayo o VEGF (en un volumen/pocilio total de 200 µ?) , para evitar diluciones adicionales del fármaco.
Organización de las placas de cultivos VEGF-165, conocida por ser una isoforma proangiogénica de VEGF-A, se usó para todos los experimentos en este estudio como compuesto de referencia. VEGF-165 es una de las isoformas de VEGF más abundante implicadas en la angiogénesis . VEGF se usó como compuesto de ensayo de referencia a 10 nM (Figura 1) .
Se evaluaron las siguientes condiciones: • Control Negativo: solo medio + DMSO al 0,1 % • Intoxicación: ß1-42 amiloide (2,5 µ?) durante 18 h.
• Control positivo: VEGF-165 (10 nM) (1 compuesto de referencia/cultivo) 1 hora antes de la adición de ?ß1-42 (2,5 µ?) durante un tiempo de incubación de 18 h.
• Compuestos de ensayo: Compuesto o compuestos de ensayo 1 hora antes de la adición de ?ß1-42 (2,5 µ?) durante un tiempo de incubación de 18 h.
Cuantificación de la red capilar Se tomaron 2 fotografías con lentes de 4x por pocilio, usando el analizador InCell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare) en transmisión de la luz. Todas las imágenes se tomaron en las mismas condiciones. El análisis de las redes de la angiogénesis se realizó usando el software Developer (GE Healthcare) . Se evaluó la longitud total de la red capilar. Procesamiento de datos Los datos se expresaron en porcentaje de las condiciones de control (sin intoxicación, sin amiloides = 100 %) para expresar la lesión por amiloides. Todos los valores se expresaron como media +/- SEM (media s.e.) de los 3 cultivos (n = 6 pocilios por afección) . Los análisis estadísticos se realizaron en las diferentes condiciones (ANOVA DE UNA VÍA seguido por el ensayo de Dunnett cuando estaba permitido, versión 5.0 del software Statview) .
Resultados La combinación de Baclofeno-Acamprosato proporciona un efecto protector significativo frente a la toxicidad del péptido ?ß1-42 humano en el modelo de HBMEC (se observa una reducción de un 24 % de la lesión por el péptido ?ß1-42), tal como se muestra en la Figura 2. Los resultados muestran claramente gue la intoxicación por el péptido amiloide humano (?ß1-42 2,5 µ?) se previene significativamente mediante la combinación del fármaco mientras que, a esas concentraciones, los fármacos por si solos no tienen efecto significativo sobre la intoxicación en las condiciones experimentales que se han descrito anteriormente.
Por el contrario, la combinación de baclofeno y terbinafina (que se presenta aquí sólo para fines de comparación) proporciona una protección más débil (se observa una reducción de un 15 % de la lesión por el péptido ?ß?-42) frente a ?ß1-42 (figura 3) .
De este modo, aunque estas dos combinaciones permiten una protección frente a ?ß1-42, la combinación de baclofeno -acamprosato destaca claramente. En efecto, estos fármacos a concentraciones que no tienen ningún efecto sólo permiten la protección significativa de las células HBME humanas frente a ?ß1-42 cuando se usan combinación. Además, la combinación de baclofeno-acamprosato es más eficaz que la combinación de baclofeno-terbinafina . Dicho efecto de baclofeno y acamprosato representa una mejora notable en un 60 % en comparación con, por ejemplo, el efecto de la combinación de baclofeno-terbinafina .
Además, la concentración de baclofeno usada en la combinación de baclofeno-acamprosato es mucho menor que la concentración de baclofeno usada en la combinación de baclofeno-terbinafina (reducción de 25 veces) . 1.2 Efecto sobre la toxicidad del péptido ?ß1-42 humano sobre células de neuronas corticales primarias.
Cultivo de neuronas corticales primarias Se cultivaron neuronas corticales de rata tal como se ha descrito en Singer y col. (47) . Ratas hembras recién preñadas de 15 días de gestación se sacrificaron por dislocación cervical (ratas Wistar) y los fetos se retiraron del útero. La corteza se retiró y se colocó en un medio de Leibovitz enfriado con hielo (L15) que contenía un 2 % de Penicilina con 10.000 U/ml y 10 mg/ml de estreptomicina y un 1 % de albúmina de suero bovino (BSA) . Las cortezas se disociaron por tripsina durante 20 min a 37 °C (0,05 %) . La reacción se detuvo mediante la adición de medio de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) que contenía DNasal de calidad II y un 10 % de suero de ternera fetal (FCS) . Las células se disociaron mecánicamente a continuación mediante 3 pases en serie a través de una pipeta de 10 mi y se centrifugaron a 515 x g durante 10 min a + 4 °C. El sobrenadante se descartó y el sedimento de células se resuspendió en un medio de cultivo definido que consistía en Neurobasal complementado con B27 (2 %), L-glutamina (0,2 mM) , un 2 % de solución de PS y 10 ng/ml de BDNF. Las células viables se contaron en un citómetro de Neubauer usando el ensayo de exclusión con azul de tripano. Las células se sembraron a una densidad de 30 000 células/pocilio en placas de 96 pocilios (los pocilios se revistieron previamente con poli-L-lisina (10 µ?/ml) ) y se cultivaron a + 37 °C en un aire humidificado (95 %) /atmósfera de C02 (5 %) .
Se realizarán tres cultivos independientes por afección, 6 pocilios por afección.
Compuestos de ensayo y tratamiento de ß1-42 amiloide Humano Brevemente, el péptido ?ß1-42 se reconstituyó en medio de cultivo definido a 40 µ? (solución madre) y se agitó lentamente a + 37 °C durante 3 días en la oscuridad. El medio de control se preparó en las mismas condiciones.
Después de 3 días, se usó la solución sobre neuronas corticales primarias como sigue a continuación: Después de 10 días de cultivo de neuronas, los compuestos de ensayo se disolvieron en medio de cultivo ( + DMSO al 0,1 %) y a continuación se incubó previamente con neuronas durante 1 hora antes de la aplicación de ?ß1-42 (en un volumen final por pocilio de cultivo de' 100 µ?) . Una hora después de la incubación del compuesto o compuestos de ensayo, se añadieron 100 µ? de péptido ?ß1-42 a una concentración final de 10 µ diluido en presencia del compuesto o compuestos de ensayo de fármaco o fármacos, para evitar diluciones adicionales de fármaco o fármacos. Las neuronas corticales se intoxicaron durante 24 horas. Se realizaron tres cultivos separados por afección, 6 pocilios por afección.
BDNF (50 ng/ml) y Estradiol-ß (150 nM) se usaron como control positivo y compuesto de referencia, respectivamente. Se realizarán tres cultivos separados por afección, 12 pocilios por afección.
Organización de las placas de cultivos Estradiol-ß a 150 nM se usó como un control positivo (Figura 4) .
Estradiol-ß se disolvió en medio de cultivo y se incubó previamente durante 1 h antes de la aplicación de ß1-42 amiloide.
Se evaluaron las siguientes condiciones: - PLACA DE CONTROL: 12 pocilios /afección Control negativo: medio solo + DMSO al 0,1 % Intoxicación: ß1-42 amiloide (10 µ?) durante 24 h.
• Compuesto de referencia: Estradiol (150 nM) lh.
- PLACA DE FÁRMACO: 6 pocilios/afección • Control negativo: medio solo + DMSO al 0,1 % • Intoxicación: ß1-42 amiloide (10 µ?) durante 24 h.
• Compuesto o compuestos de ensayo: compuesto o compuestos de ensayo - 1 hora seguido de ß1-42 amiloide (10 µ?) durante 24 h.
Ensayo de actividad de lactato deshidrogenase (LDH) 24 horas después de la intoxicación, el sobrenadante se retiró y se analizó con el Kit de Detección de Citotoxicidad (LDH, Roche Applied Science, ref: 11644793001, lote: 11800300). Este ensayo colorimétrico para la cuantificación de la toxicidad celular se basa en la medida de la actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) liberada desde el citosol de las células teñidas en el sobrenadante.
Procesamiento de datos Los datos se expresaron en porcentaje de las condiciones de control (sin intoxicación, sin amiloides = 100 %) para expresar la lesión por amiloides. Todos los valores se expresaron como media +/- SEM (media s.e.) de los 3 cultivos (n = 6 pocilios por afección) . Los análisis estadísticos se realizaron en las diferentes condiciones (ANOVA DE UNA VÍA seguido por el ensayo de Dunnett cuando era permitido, versión 5.0 del software Statview) .
Resultados La combinación de baclofeno y acamprosato induce un efecto de protección significativa frente a la toxicidad del péptido ?ß1-42 humano (mejora de un 34 % de supervivencia celular) en las células neuronales corticales primarias tal como se muestra en la figura 5. Los resultados muestran claramente que la intoxicación por péptido amiloide humano (?ß1-42 10 µ?) se previene significativamente mediante la combinación mientras que, a esas concentraciones, baclofeno o acamprosato, por si solos, no tienen ningún efecto significativo sobre la intoxicación.
Pero el contrario, aunque activa en este modelo, la combinación de sulfisoxazol y cinacalcet proporciona una protección más débil frente a ?ß1-42 (19 %, figura 6) .
De este modo, mientras que esas dos combinaciones permiten una protección frente a ?ß1-42, la combinación de baclofeno -acamprosato destaca claramente. En efecto, a concentraciones que no tienen efecto por si solas, los fármacos producen una protección significativa de las células neuronales corticales primarias frente a ?ß1-42 cuando se usan en combinación . Además, la combinación de baclofeno-acamprosato es mucho más eficaz que la combinación de sulfisoxazol-cinacalcet . Dicho efecto de Baclofeno y acamprosato representa una mejora notable de un 60 % en comparación con, por ejemplo, el efecto de la combinación de sulfisoxazol y cinacalcet.
Tomados en conjunto, estos resultados muestran un efecto positivo notable e inesperado de las combinaciones de baclofeno-acamprosato en varios modelos in vitro de la enfermedad de Alzheimer. El efecto observado es muy superior al provocado por otras terapias de combinación a base de baclofeno (por ejemplo, baclofeno-terbinafina) , u otras terapias de combinación activa (sulfisoxazol-cinacalcet ) .
Se ha realizado una comparación de la actividad de protección de acamprosato y homotaurina sobre las células corticales - - (Figura 17) . Esos resultados muestran que el derivado de acamprosato, denominado homotaurina, permite una protección eficaz frente a ?ß1-42. En el contexto de la presente invención, baclofeno o acamprosato se pueden sustituir de este modo con sus derivados, siempre que esos derivados sean eficaces en el ensayo que se describe en el presente documento . 1.3. Protección frente a la toxicidad de ?ß1-42 en un modelo de crecimiento de neuritas y de funcionalidad de las sinapsis.
Se cultivaron neuronas corticales de rata 'tal como se describe en Singer y col. (35) . Ratas hembras recién preñadas de 15 días de gestación se sacrificaron por dislocación cervical (ratas Wistar) y los fetos se retiraron del útero. La corteza se retiró y se colocó en un medio de Leibovitz enfriado con hielo (L15) que contenia un 2 % de penicilina con 10.000 U/ml y 10 mg/ml de estreptomicina y un 1 % de albúmina de suero bovino (BSA) . Las cortezas se disociaron por tripsina durante 20 min a 37 °C (0,05 %) . La reacción se detuvo mediante la adición de medio de Eagle modificado con Dulbecco (DME ) que contenia DNasal de calidad II y un 10 % de suero de ternera fetal (FCS) . Las células se disociaron mecánicamente a continuación mediante 3 pases en serie a través de una pipeta de 10 mi y se centrifugaron a 515 x g durante 10 min a + 4 °C. El sobrenadante se descartó y el sedimento de células se resuspendió en un medio de cultivo definido que consistía en neurobasal complementado con B27 (2 %) , L-glutamina (0,2 mM) , un 2 % de solución de PS y 10 ng/ml de BDNF. Las células viables se contaron en un citómetro de Neubauer usando el ensayo de exclusión con azul de tripano. Las células se sembraron a una densidad de 30 000 células/pocilio en placas de 96 pocilios (los pocilios se revistieron previamente con poli-L-lisina (10 µ?/ml) ) y se cultivaron a + 37 °C en un aire humidificado (95 %) /atmósfera de C02 (5 %) .
Después de 10 días de cultivo, las células se incuban con los fármacos. Después de 1 hora, las células se intoxican mediante 2,5 µ? de beta-amiloide (1-42; Bachem) en medio definido sin BDNF, pero junto con fármacos. Las neuronas corticales se intoxican durante 24 horas. BDNF (10 ng/ml) se usa como un control positivo (neuroprotector ) . Se realizaron tres cultivos independientes por cada afección, 6 pocilios por afección.
Longitud de las neuritas y cuantificación de Sinapsis Después de 24 horas de intoxicación, el sobrenadante se retira y las neuronas corticales se fijan mediante una solución fría de etanol (95 %) y ácido acético (5 %) durante 5 min. Después de la permeabilización con un 0,1 % de saponina, las células se bloquean durante 2 h con PBS que contenía suero fetal de ternera al 1 % . A continuación, las células se incuban con anticuerpo monoclonal anti proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP-2; Sigma) o con anti sinaptofisina (SYN, S5798, Sigma) junto con anticuerpos anti PSD95 (P246, Sigma) con el fin de cuantificar las sinapsis. Estos anticuerpos tiñen específicamente los cuerpos celulares y las neuritas de neuronas de neuronas (MAP2) o elementos pre y post sinápticos (SYN y PSD95, respectivamente) .
Estos anticuerpos se revelan con IgG de cabra anti-ratón conjugadas con Alexa Fluor 488 (Molecular Probé) . Los núcleos de las neuronas se marcaron con un marcador fluorescente (solución de Hoechst, SIGMA) .
Se toman 10 fotografías por pocilio usando el analizador InCell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare) con lentes de 20 x. Todas las imágenes se toman en las mismas condiciones. El análisis de la red de neuritas se realiza usando el software Developer (GE Healthcare) para evaluar la longitud total de la red de neuritas.
Resultados La combinación de baclofeno y acamprosato induce un efecto protector significativo frente a la toxicidad del péptido ?ß1-42 humano (mejora de un 80 % de la red de neuritas) en células de neuronas corticales primarias, tal como se muestra en la figura 7. Los resultados muestran claramente que la intoxicación por el péptido amiloide humano (?ß1-42 2,5 µ?) se evita de manera significativa mediante la combinación, mientras que a esas concentraciones, baclofeno o acamprosato, por sí solos, no tienen efecto significativo sobre la intoxicación.
Además, la longitud total de la red de neuritas tratadas con esta combinación no es más significativamente diferente que la de las células de control. Por lo tanto, esta combinación permite una protección eficaz de las células de neuronas corticales frente a la toxicidad del péptido ?ß1-42 humano pero también un crecimiento de neuritas comparable con una célula neuronal cortical sana.
II. LAS TERAPIAS DE COMBINACIÓN DE BACLOFENO-ACAMPROSATO PREVIENEN LA TOXICIDAD DE ?ß25-35 HUMANO IN VIVO Animales En todo el estudio se usan ratones Swiss macho. Los animales se alojan en jaulas de plástico, con libre acceso a comida y agua en el laboratorio, excepto durante los experimentos de comportamiento, y se mantienen en un entorno regulado, bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h (luz encendida a las 8:00 a.m.) . Los experimentos se realizan en una habitación experimental insonorizada y con regulación de aire, a la que los ratones se han habituado al menos 30 minutos antes de cada experimento.
Tratamiento de combinación El fármaco o fármacos se administran diariamente mediante sonda (por via oral) . El péptido ß25-35 y el péptido ß?25-35 codificado (control) se han disuelto en agua bidestilada estéril, y se almacenan a - 20 °C hasta su uso. Los péptidos ß-amiloides se administran a continuación por via intracerebroventricular (i.c.v.) . En resumen, cada ratón se anestesia ligeramente con éter, y una aguja de acero inoxidable de presión se inserta unilateralmente 1 rain a la derecha del punto de la linea media equidistante de cada ojo, a una distancia igual entre los ojos y los oídos y perpendicular al plano del cráneo. Los péptidos o el vehículo se administran gradualmente dentro de aproximadamente 3 s. Los ratones muestran un comportamiento normal dentro de 1 min después de la inyección. El sitio de administración se comprueba mediante la inyección de tinta china en experimentos preliminares. Ni la inserción de la aguja, ni la inyección del vehículo tienen una influencia significativa en la supervivencia, las respuestas de comportamiento o las funciones cognitivas.
Tratamiento con fármacos o fármacos En el día -1, es decir, 24 h antes de la inyección del péptido ?ß25-35, se administran combinaciones de fármaco o la solución de vehículo, por vía oral mediante sonda dos veces al día (a las 8:00 am y a las 6:00 pm) .
En el día 0 (a las 10:00 am) , los ratones se inyectan i.c.v. con péptido ?ß25-35 o con péptido ?ß25-35 codificado (control) en un volumen final de 3 µ? (3 mM) .
Entre el día 0 y el día 7, se administran fármacos, combinación de fármacos o la solución de vehículo por vía oral mediante sonda una o dos veces al día (a las 8:00 am y a las 6:00 pm) . Un grupo de animales recibe donepezilo (compuesto de referencia - 1 mg/kg/día) por vía oral mediante sonda en una inyección única (a las 8:00 am) . Los fármacos se solubilizan en agua y se preparan en el momento justo antes de cada administración mediante sonda.
En el día 7, todos los animales se someten ensayo para determinar el rendimiento de alternancia espontánea en el ensayo de laberinto en Y, un índice de la memoria de trabajo espacial .
En el día 7 y 8, la memoria contextual a largo plazo de los animales se evalúa usando mediante el procedimiento de evitación pasiva de tipo retirada.
En el día 8, los animales de sacrifican. Su cerebro se disecciona y se mantiene a - 80 °C para análisis adicionales. Las combinaciones potencian las actuaciones de comportamiento y cognitiva de animales intoxicados Ensayo de rendimientos de alternancia espontánea en laberinto en Y En el día 7, todos los animales se sometieron a ensayo para el rendimiento de alternancia espontánea en el laberinto en Y, un índice de la memoria de trabajo espacial. El laberinto en Y está hecho con cloruro de polivinilo de color gris. Cada brazo tiene 40 cm de largo, 13 cm de alto, 3 cm de ancho en la parte inferior, 10 cm de ancho en la parte superior, y convergen en un ángulo igual. Cada ratón se coloca en el extremo de un brazo y se le permite el movimiento libremente a través del laberinto durante una sesión de 8 min. Las series de entradas en los brazos, que incluyen los posibles retornos en el mismo brazo, se comprueban visualmente. Una alternancia se define como las entradas en los tres brazos en ocasiones consecutivas. El número de alternancias máximas es por lo tanto el número total de entradas en los brazos menos dos y el porcentaje de alternancia se calcula como (alternancias reales / alternancias máximas) x ' 100. Los parámetros incluyen el porcentaje de alternancia (índice de memoria) y el número total de entradas en los brazos (índice de exploración) . Los animales que muestran un comportamiento extremo (Porcentaje de alternancia < 25 % o > 85 % o el número de entradas en los brazos < 10) se descartan. Normalmente, esto representa un 0-5 % de los animales. Este ensayo sirve por otro lado para analizar, al nivel del comportamiento, el impacto y el efecto amnésico inducido en ratones mediante la inyección de ?ß25-35.
Ensayo de evitación pasiva El aparato es una caja de dos compartimentos (15 x 20 x 15 cm de altura) con uno iluminado con paredes de cloruro de polivinilo de color blanco y el otro oscurecido con paredes de polivinilo de color negro y un suelo de rejilla. Una puerta de guillotina separa cada compartimiento. Una lámpara de 60 W colocada a 40 cm por encima del aparato ilumina el compartimento blanco durante el experimento. Descargas eléctricas combinadas en las patas (0,3 mA durante 3 s) se podrían distribuir al suelo de rejilla usando un codificador generador de descargas (Instrumentos Lafayette, Lafayette, EE.UU.) . La puerta de guillotina está cerrada inicialmente durante la sesión de entrenamiento. Cada ratón se coloca en el compartimento blanco. Después de 5 s, la puerta se levanta. Cuando el ratón entra en el compartimiento oscuro y coloca todas sus patas en el suelo de rejilla, la puerta se cierra y la descarga en las patas se libera durante 3 s. Se registra el paso a través de la latencia, es decir, la latencia necesaria para entrar en el compartimiento oscurecido, y el número de vocalizaciones. El ensayo de retención se realiza 24 h después del entrenamiento. Cada ratón se coloca de nuevo en el compartimento blanco. Después de 5 s, la puerta se eleva, el tiempo de espera de cruce y el tiempo de espera de escape, es decir, el tiempo necesario para regresar al compartimento blanco, se registran hasta los 300 s.
Se observan resultados positivos en las actuaciones de comportamiento y en los ensayos bioquímicos realizados 7 días después de la inyección icv del péptido ß25-35GS3 La combinación de baclofeno y acamprosato induce un efecto protector significativo sobre las actuaciones de comportamiento y cognitiva de los animales intoxicados tal como se muestra en las figuras 8, 9 ylO.
En la figura 8, con sólo un 53,8 % de la alternancia, los ratones intoxicados exhiben una memoria de trabajo espacial fuertemente afectada en comparación con el control. Con una mejora de más de un 48 % de su porcentaje de alternancia en comparación con el control, el deterioro se evita significativamente en los ratones tratados con baclofeno y acamprosato.
Del mismo modo, las figuras 9 y 10 muestran que los animales intoxicados exhiben deterioro en las actuaciones conductuales y cognitivas de acuerdo con su puntuación en el tiempo de espera de escape y el tiempo de espera de cruce, respectivamente. En ambos ensayos, la combinación de baclofeno y acamprosato permite una corrección significativa del deterioro. El tiempo de espera de escape de los ratones tratados con esta combinación no es significativamente más diferente que el de los ratones de control (Figura 9) y el tiempo de espera de escape de cruce (Figura 10) se incrementa significativamente mediante las combinaciones de la invención con un mayor efecto de la combinación en comparación con los fármacos por si solos.
El deterioro de la memoria es la característica temprana de la enfermedad de Alzheimer y estos resultados muestran claramente que el efecto tóxico del péptido amiloide en las actuaciones conductuales y cognitivas (incluyendo la memoria) se previenen significativamente mediante las combinaciones de la invención.
Además, la figura 16 muestra que la dosis extremadamente baja de baclofeno (480 µg/kg/dia) , acamprosato (32 µg/kg/día) y donepezilo (0,25 mg/kg/día) se puede combinar para permitir una protección completa de las actuaciones de comportamiento y cognitivo de los ratones tal como se mide mediante el ensayo de laberinto en Y. Mientras que el donepezilo, a esta concentración, no tiene ningún efecto significativo (32 % de protección) en la memoria de trabajo espacial, su uso en conjunto con la combinación de baclofeno y acamprosato permite una protección completa (98 %) de las actuaciones cognitivas de los ratones intoxicados. Las combinaciones de la invención por lo tanto se pueden combinar además con otras terapias con el fin de potenciar su acción.
Las combinaciones mejoran la afectación neurofisiológica de las enfermedades neurológicas Se someten a ensayo terapias de combinaciones en el modelo in vivo de intoxicación por ?ß. Se evalúan sus efectos sobre varios parámetros que se ven afectados en las enfermedades neurológicas: - Nivel de expresión de las caspasas 3 y 9, considerado como un indicador de la apoptosis, - Peroxidación lipidica, considerada como un marcador para el nivel de estrés oxidativo, - Ensayo de expresión de GFAP, considerado como un marcador del nivel de la inflamación del cerebro, - Integridad de la barrera hematoencefálica, - Integridad de la sinapsis general (ELISA de sinaptofisina) .
- Cuantificación de neuronas viables en la CAI Integridad de la barrera hematoencefálica El diseño experimental sobre la intoxicación animal por ?ß es el mismo que en la parte III.
El efecto protector potencial de las terapias de combinación sobre la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB) se analiza en los ratones inyectados por vía intracerebroventricular (i.c.v.) con péptido amiloide ß25-35 oligomérico (?ß25-35) o péptido de control ?ß25-35 codificado (Sc-?ß), 7 dias después de la inyección.
En el día 7 después de la inyección de ?ß25-35, los animales se someten a ensayo para determinar la integridad de la BBB mediante el uso del procedimiento de EB (azul de Evans) . Se conoce que el tinte EB se une a la albúmina sérica después de la inyección periférica y se ha usado como un trazador para la albúmina de suero.
El tinte EB (2 % en solución salina, 4 ml/kg) se inyecta por vía intraperitoneal (i.p.) 3 h antes de la perfusión transcardiaca. Los ratones se anestesian a continuación i.p. con 200 µ? de mezcla de 80 mg/kg de ketamina, 10 mg/kg de xilazina, se abre el tórax. Los ratones se someten a perfusión transcardiaca con 250 mi de solución salina durante aproximadamente 15 min hasta que el fluido de la aurícula derecha se vuelve incoloro. Después de la decapitación, el cerebro se retira y se disvecciona en tres regiones: corteza cerebral (izquierda + derecha), hipocampo (izquierda + derecha), diencéfalo. A continuación, cada región cerebral se pesa para la medida cuantitativa de la extravasación de EB-albúmina .
Las muestras se homogeneizan en solución salina tamponada con fosfato y se mezclan por agitación vorticial después de la adición de ácido tricloroacético al 60 % para precipitar la proteína. Las muestras se enfrían a 4 °C, y después se centrifugan 30 min a 10.000 g, 4 °C. El sobrenadante se mide a 610 nm para la absorbancia de EB usando un espectrofotómetro .
EB se cuantifica tanto como - - * µg/mg de tejido cerebral mediante el uso de una curva convencional, obtenida mediante la concentración conocida de EB-albúmina . * µ?/mg de proteína.
Integridad de la sinapsis global (ELISA de sinaptofisina) Se ha elegido la sinaptofisina como un marcador de la integridad de la sinapsis y se somete a ensayo usando un kit de ELISA comercial (USCN, Ref . E90425Mu) . Las muestras se preparan a partir de tejidos del hipocampo y se homogeneizan en un tampón de extracción específica tal como lo describe el fabricante y la literatura de referencia.
Los tejidos se aclaran con PBS enfriado con hielo (0,02 moles/1, pH 7,0-7,2) para retirar el exceso de sangre minuciosamente y se pesan antes de la congelación con nitrógeno y almacenamiento a - 80 °C. Los tejidos se cortan en trozos pequeños y se homogeneizan en 1 mi solución salina tamponada con fosfato (PBS) en hielo frío con un homogeneizador de vidrio. La suspensión resultante se sónica con un disruptor celular ultrasónico o se somete a dos ciclos de congelación-descongelación para romper adicionalmente las membranas celulares. A continuación, los homogeneizados se centrifugan durante 5 min a 5.000 g y el sobrenadante se somete a ensayo inmediatamente.
Todas las muestras se someten a ensayo por triplicado.
La cuantificación de las proteínas se realiza con el kit de ensayo de proteínas de BCA (ácido bicinconínico ) de Pierce (Pierce, N° de Ref. 23227) para evaluar el rendimiento de extracción y permitir la normalización.
Las . concentraciones de proteína total se calculan a continuación a partir de las diluciones de la curva convencional y sirven para normalizar los resultados de ELISA.
Cuantificación de las neuronas viables en los CAI El día 8, cada ratón se anestesia con 200 µ? por vía intraperitoneal de una mezcla previa de 80 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina y se perfunde por vía transcardial con 100 mi de solución salina seguido por 100 mi de paraformaldehido al 4 %.. Los cerebros se retiran y se mantienen durante 24 h después de la fijación en solución de paraformaldehido al 4 % a 4 °C.
Después de la fijación posterior, los cerebros se lavan en una solución salina de tampón de fosfato (PBS) , a continuación el cerebelo se retira y los prosencéfalos se colocan en una plataforma Vibratom (Leica VT100OS, Leica, Wetzlar, Alemania) para el corte.
Los cerebros se cortan en secciones coronales (20 µp? de espesor) usando un vibratom (Leica VT100OS, Leica, Wetzlar, Alemania) . Las secciones en serie se colocan en placas de 24 pocilios con PBS. A continuación, se seleccionan para incluir la formación del hipocampo y se colocan 9 secciones en la tira de vidrio recubierta con gelatina (un portaobjetos por animal para el violeta de cresilo) . Todos los portaobjetos se secan a temperatura ambiente durante 48 h para evitar el despegado. Los portaobjetos se almacenan a temperatura ambiente hasta que se produce la tinción de violeta de cresilo .
Las secciones se tiñen con reactivo de violeta de Cresilo al 0,2 % (Sigma-Aldrich) , a continuación, se deshidratan con -7 - etanol absoluto, se tratan con tolueno, y se montan con medio de Mountex (BDH Laboratory Supplies, Poole, Dorset, Reino Unido) .
Después del montaje, los portaobjetos se mantienen a temperatura ambiente para secado de 24 h. El examen de la zona de CA 1 se realizó usando un microscopio de luz (Dialux 22, Leitz), con cortes digitalizados a través de una cámara CCD (Sony XC-77CE, Sony, París, Francia) con el software de NIHImage ® vl .63 La medida de CAI y los recuentos de células piramidales se procesan usando ImageJ ® (NIH) . Los datos se expresan como la media de nueve cortes de células piramidales de CA 1 por milímetro para cada grupo (recuento de CAI del hipocampo izquierdo y derecho) (49) .
Ensayo de estrés oxidativo Los ratones se sacrificaron por decapitación y ambos hipocampos se retiran rápidamente, se pesan y se mantienen en nitrógeno líquido hasta que se someten a ensayo. Después de la descongelación, los hipocampos se homogeneizan en metanol frío (1/10 p/v) , se centrifuga a 1.000 g durante 5 min y el sobrenadante se coloca en un tubo Eppendorf. El volumen de reacción de cada homogeneizado se añade a FeS04 1 mM, H2S04 0,25 M, naranja de xilenol 1 mM y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente. Después de leer la absorbancia a 580 nm (A580 1), se añaden a la muestra 10 µ? de hidroperóxido de eumeno 1 mM (CHP) y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente, para determinar el nivel de oxidación máxima. La absorbancia se mide a 580 nm (A580 2) . El nivel de peroxidación de lípidos se determina como equivalentes CHP (CHPE) de acuerdo con: CHPE = A580 1/A580 2 x [CHP] y se expresa como equivalentes de CHP por peso de tejido y como porcentaje de los datos del grupo de control.
Ensayo de inducción de la via de caspasa y ensayo de expresión de GFAP Los ratones se sacrifican por decapitación y ambos hipocampos se retiran rápidamente, se aclaran en PBS enfriado en hielo (0,02 moles/1, pH 7,0-7,2) para retirar el exceso de sangre pesada cuidadosamente y se mantiene en nitrógeno líquido hasta que se someten a ensayo. Los tejidos se cortan en trozos pequeños y se homogeneizan en 1 mi de PBS enfriado en hielo con un homogeneizador de vidrio. La suspensión resultante se. sónica con un disruptor celular ultrasónico o se somete a dos ciclos de congelación-descongelación para romper aún más las membranas celulares. A continuación, los homogeneizados se centrifugan a 5.000 g durante 5 min y el sobrenadante se somete a ensayo inmediatamente.
Los experimentos se realizan con ensayo comercial: Caspasa-3 (USCN - E90626 u), Caspasa-9 (USCN - E90627Mu) , GFAP (USCN -E90068) .
La cuantificación de las proteínas se realiza con el kit de ensayo de proteínas de BCA (ácido bicinconínico) de Pierce (Pierce, N° de Ref. 23227) para evaluar el rendimiento de extracción y permitir la normalización.
La combinación de baclofeno y acamprosato induce un efecto protector significativo sobre las funciones neurofisiológicas de los animales intoxicados tal como se muestra en las figuras 11, 12, 13 y 14.
Con una protección de más de un 60 % en comparación con los animales intoxicados sin tratar, la combinación es eficaz para la protección de las neuronas (Figura 11) y la densidad sináptica (Figura 13) .
Del mismo modo, la figura 12 muestra que la combinación de baclofeno y acamprosato protege la integridad de la BBB (76 %) en comparación con los animales intoxicados sin tratar. Por último, esta terapia de combinación es eficaz en la reducción del estrés oxidativo global inducido por ?ß en el cerebro de los animales tratados en comparación con los animales intoxicados no tratados (figura 14) .
Tal como se muestra en la Parte A de los ejemplos, se han protegido varias funciones neurológicas con deficiencias en numerosos trastornos neurológicos , que incluyen trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados y los síntomas se han retardado o reducido mediante la combinación de baclofeno - acamprosato. B) PREVENCIÓN DE LA TOXICIDAD DEL GLUTAMATO SOBRE LAS CÉLULAS NEURONALES En este conjunto de experimentos adicionales, los compuestos candidatos se han sometido a ensayo por su capacidad para prevenir o reducir los efectos tóxicos de la toxicidad del glutamato sobre las células neuronales. La toxicidad del glutamato está implicada en la patogénesis de enfermedades neurológicas o trastornos tales como esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, neuropatías, alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, o lesión de la médula espinal. Los fármacos primero se someten a ensayo individualmente, seguido de ensayos de su acción combinatoria.
Procedimientos La eficacia de las combinaciones de fármacos de la invención se evalúa sobre células de neuronas corticales primarias. El protocolo que se usa en estos ensayos es el mismo que el que se ha descrito en la sección A.1.2 mencionada anteriormente. Ensayos de toxicidad de glutamato El efecto neuroprotector de los compuestos se evalúa mediante la cuant ificación de la red de neuritas ( Inmunotinción de neurofilamentos (NF) ) , que revela específicamente las neuronas glutamatérgicas .
Después de 12 días de cultivo de neuronas, los fármacos de las combinaciones candidatas se disuelven en medio de cultivo (+ DMSO al 0,1 %) . Las combinaciones candidatas se preincuban a continuación con neuronas durante 1 hora antes de la lesión por glutamato. Una hora después de la incubación con, se añade glutamato durante 20 min, a una concentración final de 40 µ?, en presencia de combinaciones de candidatos, con el fin de evitar diluciones de fármaco adicionales. Al final de la incubación, se cambia el medio por medio con la combinación de candidatos pero sin glutamato. El cultivo se fija 24 horas después de la lesión por glutamato. MK801 (maleato de Dizocilpinahidrógeno, 77086-22-7 - 20 µ?) se usa como un control positivo.
Después de la permeabilización con -saponina (Sigma) , las células se bloquean durante 2 h con PBS que contenía de suero de cabra al 10 %, a continuación, las células se incuban con anticuerpo primario monoclonal de ratón frente a anticuerpo de neurofilamentos (NF, Sigma) . Este anticuerpo se revela con IgG de cabra anti-ratón conjugadas con Alexa Fluor 488.
Los núcleos de las células se marcan con un marcador fluorescente (solución de Hoechst, SIGMA), y la red de neuritas se cuantifica. Se usan seis pocilios por afección para evaluar la supervivencia neuronal en 3 cultivos diferentes .
Resultados La combinación de baclofeno - acamprosato proporciona un efecto protector frente a la toxicidad del glutamato para las células de neuronas corticales Como se observa a modo de ejemplo en la figura 15, las combinaciones de la invención protegen fuertemente a las neuronas de la toxicidad del glutamato en las condiciones experimentales que se han descrito anteriormente. Es de destacar que se observa una protección eficaz al usar concentraciones de fármaco en las que los fármacos usados por si solos tienen un efecto protector inferior. La combinación de baclofeno y acamprosato induce una mejora de más de un 200 % en comparación con el acamprosato por si solo y superior a un 47 % en comparación con el baclofeno usado por si solo.
C) MEJORA DE OTROS TRASTORNOS RELACIONADOS CON LA EXCI OXICIDAD DEL GLUTAMATO USANDO COMBINACIONES DE LA INVENCIÓN El efecto protector in vitro que se ha mencionado anteriormente frente a la toxicidad del glutamato de fármacos y combinaciones de fármacos de la invención combinados con los efectos protectores a modo de ejemplo en el presente documento en varios modelos de EA, fue el motivo por el que los inventores sometieron a ensayo estos fármacos y combinaciones en algunos modelos de otras enfermedades en la patogénesis de las cuales también está implicada la toxicidad del glutamato, como EM, ELA y dolor neuropático.
I) EFECTO PROTECTOR DE LAS COMBINACIONES EN UN MODELO IN VIVO DE ESCLEROSIS MULTIPLE.
Un modelo en el que los ratones inmunizados con glicoproteina (inmunizados con MOG) de mielina de oligodendrocitos desarrollan la EAE progresiva crónica se usa para demostrar el efecto beneficioso de las composiciones de la invención en el tratamiento de la esclerosis múltiple.
Animales y productos químicos Ratones hembra C57L/6J (8 semanas de edad) se adquieren en Janvier (Francia) ; después de dos semanas de habituación, los ratones hembra (10 semanas de edad) desarrollan parálisis crónica después de la inmunización con el péptido MOG (glicoproteina de mielina de oligodendrocitos) . La encefalomielitis experimental se induce con el MOG35-55 del it de Hooke/PTX de Emulsión de CFA (toxina Pertussis) para la Inducción de EAE (EK-0110, EK-0115, laboratorios Hooke) . El kit de control es CK-0115 (laboratorios Hooke) .
Procedimiento experimental La encefalomielitis experimental se induce mediante el procedimiento siguiente: El día 0, se realizan dos inyecciones subcutáneas de 0,1 mi cada una, una en la parte posterior superior del ratón y una en la parte baja de la espalda. Cada inyección contiene 100 µg de péptido MOG35-55 (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK) , 200 µg de H37Ra de Mycobacterium tuberculoses inactivado y se emulsiona en adyuvante completo de Freund (CFA) (laboratorios Hooke) . La emulsión proporciona el antígeno necesario para expandir y diferenciar los linfocitos T autoinmunes específicos de MOG. Dos inyecciones intraperitoneales de 500 ng de toxina de Pertussis en PBS (kit de Hooke) se realizan 2 horas (Día 0) y 24 horas (Dial) después de la inyección de MOG. La toxina pertussis potencia el desarrollo de la EAE, al proporcionar el adyuvante adicional.
Los ratones desarrollan EAE 8 días después de la inmunización y permanecen crónicamente paralizados durante la duración del experimento. Después de la inmunización, los ratones se observan diariamente para los síntomas clínicos en un procedimiento ciego. Los animales se mantienen en una instalación libre de patógenos convencionales y todos los experimentos se realizan de acuerdo con las directrices establecidas por, y son aprobados por el comité local permanente de bioética.
Grupos experimentales y tratamiento con fármacos: Grupos de ratones hembra, tal 'como se desvelan, se omogeneizan en peso antes de la inmunización: Grupo de control: inyección de vehículo en las mismas condiciones de los ratones EAE (desde el Día -1 al Día 28, el placebo se administra a diario) - Grupo de EAE: inyección de MOG (día 0) + inyecciones de toxina Pertussis (Día 0 y 1) - a partir del Día -1 al Día 28, el placebo se administra diariamente por vía oral EAE + control positivo: inyección de MOG (Día 0) + inyecciones de toxina Pertussis (Día 0 y 1) - a partir del Día -1 al Día 28, se administra dexametasona diariamente por vía oral.
- EAE + grupo de tratamiento: inyección de MOG (Día 0) + inyecciones de toxina Pertussis (Día 0 y 1) . Los tratamientos comienzan un Día antes de la inmunización y se prolongan hasta el Día 28.
Las puntuaciones clínicas se miden en los Días 0-5-8-9-12-14-16-19-21-23-26-28.
El software Statistica (Statsoft Inc. ) se usa para todo el análisis estadístico. Se usan análisis de ANOVA y ensayo de t de Student para analizar la puntuación de la enfermedad clínica. P < 0,05 se considera significativo.
Los retrasos en la aparición de la enfermedad, puntuación clínica y retraso de la muerte, se han comparado entre cada grupo para el grupo 'inmu" de referencia con las curvas de Kaplan-Meier y un modelo de Cox ("supervivencia" de la caja R) . Los valores de p resultantes son unilaterales y analizan la hipótesis de que sea mejor que el grupo de referencia ' inmu ' .
La puntuación clínica total se compone de la puntuación de la cola, la puntuación de las extremidades posteriores, la puntuación de las extremidades anteriores y la puntuación de la vejiga que se describe tal como sigue a continuación: Puntuación de la cola: Puntuación = 0 Un ratón normal mantiene su cola erguida cuando se mueve.
Puntuación = 1 Si la extremidad de la cola está flácida con una tendencia a caer.
Puntuación = 2 Si la cola está totalmente flácida y se arrastra sobre la mesa.
Puntuación de las extremidades posteriores: Puntuación = 0 Un ratón normal tiene un paso enérgico y no arrastra sus patas Puntuación = 1 Cualquiera de los siguientes ensayos es positivo : A - Ensayo de lanzamiento: mientras se mantiene la cola entre el dedo pulgar y el índice, lanzar al animal sobre su espalda y observar el tiempo que necesita para enderezarse. Un ratón sano se girará inmediatamente. Un retraso sugiere debilidad de las extremidades posteriores.
B - Colocar el ratón en la parte superior de la jaula de alambre y observar mientras cruza de un lado al otro. Si una o ambas extremidades se deslizan con frecuencia entre las barras se considera que hay una parálisis parcial.
Puntuación = 2 Ambos ensayos previos son positivos.
Puntuación = 3 Una o ambas extremidades posteriores muestran signos de parálisis pero algunos movimientos se conservan; por ejemplo: el animal puede agarrarse y aferrarse a la parte inferior de la parte superior jaula de alambre durante un breve instante antes de soltarse.
Puntuación = 4 Cuando ambas extremidades traseras están paralizadas y el ratón las arrastra cuando se mueve.
Puntuación de las extremidades anteriores: Puntuación = 0 Un ratón normal usa sus patas delanteras activamente para agarrar y caminar y mantiene su cabeza erguida .
Puntuación = 1 Caminar es posible, pero difícil debido a una debilidad en una o ambas de las patas, por ejemplo, las patas delanteras se consideran débiles cuando el ratón tiene dificultad para agarrar la parte inferior de la jaula de alambre de la parte superior. Otro signo de debilidad es la cabeza colgando hacia abajo.
Puntuación = 2 Cuando una extremidad anterior está paralizada (imposibilidad de agarrar y el ratón se da la vuelta alrededor de la extremidad paralizada) . En este momento la cabeza también ha perdido gran parte de su tono muscular.
Puntuación = 3 El ratón no se puede mover, y la comida y el agua son inalcanzables.
Puntuación de la vejiga: Puntuación = 0 Un ratón normal tiene el control total de su vej iga .
Puntuación = 1 Un ratón se considera incontinente cuando la parte inferior de su cuerpo se empapa con la orina.
La puntuación global para cada animal se determina mediante la adición de todas las categorías qué se han mencionado anteriormente. La puntuación máxima para los animales vivos es de 10.
Resultados-Terapias de combinación son eficaces en un modelo de E Una mejora significativa de la puntuación clínica global se observa en los ratones "EAE + grupo de tratamiento" para la combinación de baclofeno y acamprosato.
La combinación de baclofeno (30 mg/kg/día) y acamprosato (2 mg/kg/día) indujo un efecto protector significativo frente al desarrollo de la EAE crónica progresiva y, por tanto, confirmó el efecto beneficioso de la composición en el tratamiento de la esclerosis múltiple (Figura 18) . Con la reducción de más de un 30 % de los síntomas, los resultados muestran claramente que la combinación induce una reducción significativa del desarrollo de la enfermedad a partir del día 13. Este resultado confirma el efecto notable positivo de la combinación de baclofeno-acamprosato en la protección neuronal incluida en la desmielinización y sus implicaciones. Tomados en conjunto, estos resultados muestran que esta combinación permite una protección eficaz de las neuronas frente a muchas tensiones que intervienen en el desarrollo de enfermedades neurológicas tales como excitotoxicidad o desmielinizaciónDpor EpDamiloides , colapso por BBB, o por glutamato.
II. EFECTO PROTECTOR DE LAS COMBINACIONES EN MODELOS DE ELA. El efecto de las terapias de combinación de acuerdo con la presente invención sobre ELA se han demostrado in vitro, en un modelo de cocultivo, e in vivo, en un modelo de ratón de la ELA. Los protocolos y los resultados se presentan en esta sección .
II.1 Efecto protector frente a la toxicidad del glutamato en cultivos primarios de cocultivo de nervio-músculo Cocultivos primarios de células nerviosas y musculares El músculo humano se prepara de acuerdo con un procedimiento que se ha descrito anteriormente a partir de porciones de biopsia de paciente sano (48) . Las células musculares se establecen a partir de células disociadas (10000 células por pocilios), sembradas en placas revestidas con gelatina al 0, 1 % en placas de 48 pocilios y se cultivan en un medio de proliferación que consiste en la mezcla de medio MEM y medio M199.
Inmediatamente después de la fusión de las células satélite, cortes transversales enteros de médula espinal de embriones de 13 dias de edad de ratas Wistar con los ganglios de la raíz dorsal (DRG) unidos se colocan en la monocapa muscular a 1 explante por pocilio (en el área central) . Los DRG son necesarios para conseguir una buena relación de inervaciones. Los cultivos inervados se mantienen en medio de mezcla. Después de 24 horas en las cocultivos habituales, se observan neuritis que se dejan crecer en los explantes de la médula espinal. Entran en contacto con miotubos e inducen las primeras contracciones después de 8 días. Rápidamente a partir de ese momento, las fibras musculares inervadas situadas en la proximidad de los explantes de la médula espinal, se contraen continuamente de forma virtual contrayéndose. Las fibras inervadas son morfológicamente y espacialmente diferentes a las de las no inervadas y se podrían distinguirse fácilmente de ellas.
Se realiza un cocultivo (6 pocilios por afecciones) .
Lesión de glutamato En el día 27, se incuban cocultivos con compuestos candidatos o Riluzol una hora antes de la intoxicación con glutamato (60 µ ) durante 20 min. A continuación, los cocultivos se lavan y los compuestos candidatos o Riluzol se añaden durante para un periodo adicional de 48 horas. Después de este tiempo de incubación, los cocultivos no fijados se incuban con ?-bungarotoxina acoplada con Alexa 488 a una concentración de 500 nmol/l durante 15 min a temperatura ambiente. Entonces, los cocultivos se fijan mediante PFA durante 20 min a temperatura ambiente. Después de la perrneabilización con un 0,1 % de saponina, los cocultivos se incuban con anticuerpo anti-neurofilamentos (NF) .
Estos anticuerpos se detectan con IgG de cabra anti-ratón conjugadas con Alexa Fluor 568 (Molecular Probé) . Los núcleos de las neuronas están marcados con un marcador fluorescente (solución de Hoechst) .
Los puntos finales son (1) Longitud total de las neuritas, (2) Número de unidades motoras, (3) Área de la unidad motora total, que son indicativos de la supervivencia y de la funcionalidad de neuronas motoras.
Para cada afección, se realizan 2 x 10 fotografías por pocilio usando Incell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare) , con un aumento de 20 x. Todas las imágenes se toman en las mismas condiciones.
Resultados La combinación de baclofeno y acamprosato protege eficazmente a las neuronas motoras y a las unidades motoras en el modelo de cocultivo.
II.2 - Las terapias de combinación son eficaces en el modelo de ratón con ELA Los experimentos se realizan en ratones macho. Ratones macho transgénicos B6SJL-Tg (S0D1) 2Gur/ratones J y su control (respectivamente SN2726 y SN2297 de los Laboratorios Jackson, Ben Harbor, Estados Unidos y distribuidos por Charles River en Francia) se eligen en este conjunto de experimentos para imitar la ELA.
Los ratones enfermos expresan el transgén SOD1-G93A, diseñado con un gen SOD1 humano mutante (una única sustitución de aminoácidos de glicina a alanina en el codón 93) , dirigidos por su promotor SOD1 humano endógeno. Los ratones de control expresan el gen S0D1 humano de control.
Asignación al azar de los animales: La asignación de grupo y la asignación al azar de los animales se basan en el peso corporal; para cada grupo, la asignación al azar se realiza un día antes del primer tratamiento .
Administración del fármaco Los ratones se dosifican con el tratamiento del fármaco candidato diluido en vehículo a partir del 60° día después del nacimiento hasta la muerte. Las soluciones diluidas de fármacos candidatos se preparan con agua a temperatura ambiente justo antes del inicio de la administración.
• En agua potable: El riluzol se añade en agua potable a una concentración final de 6 mg/ml (ajustado para cada grupo de peso corporal medio) en ciclodextrina al 5 % . Como un ratón bebe aproximadamente 5 mi /día, la dosis estimada administrada es de 30 mg/kg/día que es una dosis que demostró que aumentaba la supervivencia de los ratones.
- La ciclodextrina se usa como vehículo a la concentración final de un 5 %, diluida en agua a temperatura ambiente a partir de la solución de reserva (ciclodextrina al 20 %) .
• Administración oral (per os) : - Las combinaciones de fármacos se administran por vía oral, todos los días.
- La ciclodextrina se usa como vehículo a la concentración final de un 5 , diluida en agua a temperatura ambiente a partir de la solución de reserva (ciclodextrina al 20 %) .
Observación clínica La observación clínica de cada ratón se realiza todos los días, desde el primer día de tratamiento (60 días de edad) hasta la muerte (o el sacrificio) . La observación clínica consiste en el estudio de las pruebas de comportamiento: inicio de la parálisis, "pérdida de extensión", "pérdida del reflejo de enderezamiento", y observación de la marcha general : Inicio de la parálisis: La observación consiste en la observación de la parálisis de cada miembro. El inicio de la parálisis corresponde con el día de los primeros signos de parálisis .
- La prueba de pérdida de extensión consiste en temblores o aviso de sacudidas y la posición de las extremidades posteriores (colgante o extendida hacia fuera) cuando el ratón se suspende por la cola.
- El ensayo de pérdida del reflejo de enderezamiento evalúa la capacidad del ratón para enderezarse a sí mismo en 30 segundos después de ser girado hacia cada lado. El reflejo de enderazamiento se pierde cuando el ratón es incapaz de enderezarse por sí mismo. La pérdida del reflejo de enderezamiento determina el estadio final de la enfermedad: el ratón que no puede enderezarse por sí mismo se sacrifica. Resultados-Terapias de combinación son eficaces en el modelo in vivo de ELA Se observa una mejora de la enfermedad en los animales enfermos tratados con la combinación de Baclofeno y Acamprosato .
III) EFECTO PROTECTOR DE LAS COMBINACIONES DE LA INVENCIÓN EN NEUROPATÍA INDUCIDA POR OXALIPLATINO COMO UN MODELO IN VIVO PARA EL DOLOR NEUROPÁTICO.
Las terapias de combinación de la presente invención se someten a ensayo in vivo, en modelos adecuados de neuropatía periférica, es decir, el modelo agudo de neuropatía inducida por oxaliplatino y el modelo crónico de neuropatía inducida por oxaliplatino. Los animales, los protocolos y los resultados se presentan en esta sección.
Cría de Animales Se usan ratas Sprague-Dawley (CERJ, Francia) , con un peso de 150 - 175 g en el comienzo de la parte experimental del tratamiento con Oxaliplatino (DO) . Los animales se alojan en un animalario con acceso limitado en una habitación de temperatura (19,5 °C - 24,5 °C) y humedad relativa (45 % - 65 %) controladas con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h, con acceso a voluntad a alimentos de laboratorio microgranulado convencional y agua durante todo el estudio. Se alojan 4 o 5 animales por jaula y se observa un periodo de aclimatación de una semana antes de cualquier ensayo.
Diseño experimental Se usan los siguientes cuatro grupos de ratas en todos los experimentos: Grupos de Control: Grupo 1: Vehículo de oxaliplatino (agua destilada), i.p. / vehículo de combinación o combinaciones candidatas (agua destilada), p.o. todos los días.
Grupo 2: oxaliplatino (agua destilada), i.p. / vehículo de combinación o combinaciones candidatas (agua destilada), p.o. todos los días.
Grupo 3: 3 mg/kg de oxaliplatino i.p. / solo fármaco en agua destilada, p.o. todos los días x 9.
Grupos ensayados de la composición: Grupo 4: 3 mg/kg de oxaliplatino i.p. / combinación o combinaciones candidatas en agua destilada, p.o. todos los días x 9.
Grupo 5: 3 mg/kg de oxaliplatino i.p. / gabapentina (100 mg/kg) en agua destilada, p.o. en los días de ensayo (es decir DI y D8) ; Los elementos del vehículo y el ensayo se administran todos los días de D-l a D7 (el día antes del último día de ensayos), mientras que la gabapentina se administra en los días de ensayo (120 minutos antes del ensayo) .
Todos los tratamientos se administran en un orden codificado y aleatorio cuando es posible. Las dosis se expresan en términos de sustancia activa libre.
Inducción de Neuropatía La neuropatía aguda es inducida por una sola inyección intraperitoneal de oxaliplatino (3 mg/kg) .
La neuropatía periférica crónica es inducida por inyecciones intraperitoneales repetidas de oxaliplatino (3 mg/kg, i.p.) en los días 0, 2, 4 y 7 (CD = 12 mg/kg, i.p.) . La neuropatía crónica en los seres humanos es acumulativa también y se observa más frecuentemente en pacientes que han recibido dosis totales de oxaliplatino > o = 540 mg/m2 lo que corresponde a ~ 15 mg/kg como dosis acumulada en las ratas (Cersosimo R.J. 2005) .
La neuropatía dolorosa inducida por oxaliplatino en ratas reproduce los síntomas de dolor en pacientes tratados con oxaliplatino : - La hiperalgesia térmica es el primer síntoma. Se puede medir mediante el ensayo con acetona o con el ensayo de de inmersión de la cola; La hiperalgesia mecánica aparece más tarde. Se puede cuantificar con el ensayo de Von Frey o con el ensayo de presión en la pata.
Dosificación y ensayo con animales Todas las combinaciones de fármacos se administran desde el día anterior a la primera inyección intraperitoneal de 3 mg/kg de oxaliplatino (D-l) y se continuó diariamente por vía oral hasta el D7. Durante los días de los ensayos (es decir, DI y D7), las combinaciones de fármacos se administran después del ensayo. Los animales del grupo tratado con la referencia (gabapentina) se dosifican solo durante los dias de los ensayos.
Ensayo con acetona Se evalúa alodinia fria usando el ensayo con acetona mediante la medida de las respuestas a la estimulación térmica no nociceptiva en DI (alrededor de 24 horas después de la primera inyección de 3 mg/kg de oxaliplatino (efecto agudo de oxaliplatino) , y D8 (efecto crónico de oxaliplatino) .
En el ensayo con acetona, la latencia de la retirada de la pata trasera se mide después de la aplicación de una gota de acetona a la superficie plantar de ambas patas traseras (tiempo de reacción) y se puntúa la intensidad de la respuesta (puntuación total) . El tiempo de reacción para el efecto de enfriamiento de la acetona se mide dentro de 20 segundos (limite) después de la aplicación de acetona. Las respuestas a la acetona también se clasifican en la siguiente escala de 4 puntos: 0 (no hay respuesta), 1 (retirada rápida, movimiento rápido de la pata) , 2 (retirada prolongada o movimiento rápido marcado de la pata-) , 3 (movimiento rápido repetido de la pata con lamido o mordida) .
Para cada grupo experimental, los resultados se expresan como : - El tiempo de reacción definido como el tiempo, expresado en segundos, necesario para producir la reacción de la pata (media de 6 medidas para cada rata en conjunto ± SEM) .
- La puntuación total acumulada definida como la suma de las 6 puntuaciones para cada rata en conjunto ± SEM. La puntuación mínima es 0 (sin respuesta en cualquiera de las 6 pruebas) y la puntuación máxima posible es 18 (movimiento rápido repetido y lamer o morder las patas en cada una de las seis pruebas) .
Análisis estadísticos Se realiza ensayo de Student, unilateral, de tipo 3. El nivel de significación se establece como p < 0,05; todos los grupos se comparan con el grupo de enfermos + vehículo (grupo tratado con oxaliplatino) . Las medias y la media de error estándar se muestran en las figuras.
Resultados El oxaliplatino indujo una disminución significativa en el tiempo de reacción de retirada de la pata después de la aplicación de acetona (grupo de enfermos + vehículo) durante el transcurso del tiempo. Esta disminución es progresiva y significativa a partir del día 1 (modelo agudo de neuropatía inducida por oxaliplatino) hasta el día 8 (modelo crónico) en comparación con el grupo de vehículo.
• Efecto antialodínico en el modelo agudo y en el modelo crónico de neuropatía inducida por oxaliplatino La combinación de baclofeno y acamprosato se somete a ensayo en los dos modelos de neuropatía inducida por oxaliplatino. Induce una disminución significativa en la puntuación total acumulativa y un aumento significativo del tiempo de reacción en comparación con el grupo tratado con vehículo-oxaliplatino . una disminución significativa en la puntuación total acumulativa y un aumento significativo del tiempo de reacción en comparación con el grupo tratado con vehículo-oxaliplat ino . En conclusión, esta combinación de fármacos protege de la neuropatía aguda y crónica REFERENCIAS 1. Crook R. y col. (1998) . A variant of Alzheimer's disease with spastic paraparesis and unusual plaques due to deletion of exon 9 of presenilin 1. Nat Med. 4 (4) : 452-5. 2. Houlden H., Baker M . , y col. (2000) . Variant Alzheimer ' s disease with spastic paraparesis and cotton wool plaques is caused by PS-1 mutations that lead to exceptionally high amyloid-beta concentrations . Ann Neurol. 48 (5) : 806-8. 3. Kwok J.B., Taddei K. , y col. (1997) . Two novel presenilin-1 mutations in early-onset Alzheimer' s disease pedigrees and preliminary evidence for association of presenilin-1 mutations with a novel phenotype. Neuroreport . 8 (6) : 1537-42. 4. Verkkoniemi A., Kalimo H., y col. (2001) . Variant Alzheimer disease with spastic paraparesis: neuropathological phenotype. J Neuropathol Exp Neurol. 60 (5) : 483-92. 5. Citrón M. (2004) . Strategies for disease modification in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci. 5 (9) : 677-85. 6. Suh Y.H. y Checler F. (2002) . Amyloid precursor protein, presenilins, and alpha-synuclein : molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease. Pharmacol Rev. 54 (3) : 469-525. 7. Blacker D . , Albert M.S., y col 1. (1994) . Reliability and validity of NINCDS-ADRDA criteria for Alzheimer's disease. The National Institute of Mental Health Genetics Initiative. Arch Neurol. 51 (12) : 1198-204. 8. Rossor M.N., Fox N.C.,y col . (1996) . Clinical features of sporadic and familial Alzheimer's disease. Neurodegeneration . 5 (4) : 393-7. 9. Glenner G.G., Wong C. ., y col. (1984) . The amyloid deposits in Alzheimer's disease: their nature and pathogenesis. Appl Pathol. 2 (6) : 357-69. - - 10. Ballatore C, Lee V.M., y col. (2007) . Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer 's disease and related disorders. Nat Rev Neurosci. 8 (9) : 663-72. 11. Bell K.F. y Claudio Cuello A. (2006) . Altered synaptic function in Alzheimer's disease. Eur J Pharmacol . 545 (1) : 11-21. 12. Hardy J.A. y Higgins G.A. (1992) . Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science. 256 (5054) : 184-5. 13. Braak H. y Braak E. (1991) . Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4) : 239-59. 14. Golde T.E. (2005) . The Abeta hypothesis: leading us to rationally-designed therapeutic strategies for the treatment or prevention of Alzheimer disease. Brain Pathol. 15 (1) : 84- . 15. Hardy J. y Selkoe D.J. (2002) . The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics . Science. 297 (5580) : 353-6. 16. Selkoe D.J. (2000) . The genetics and molecular pathology of Alzheimer's disease: roles of amyloid and the presenilins. Neurol Clin. 18 (4) : 903-22. 17. Zlokovic B. V., The Blood Brain Barrier In Health And Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron review. 2008, 57, 178-201. 18. Budd Haeberlein, S.L. y S.A. Lipton, Excitotoxicity in neurodegenerative disease, en Encyclopedia of neuroscience, L.R. Squire, Editor. 2009, Elsevier, p. 77-86. 19. Hughes, J.R., Alcohol withdrawal seizures. Epilepsy Behav, 2009. 15 (2) : p. 92-7. 20. Kim, A.H., G.A. Kerchner, y C. DW, Blocking Excitotoxicity, en CNS Neuroprotection, F.W. Marcoux y D.W.
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Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende baclofeno y acamprosato para uso en el tratamiento de un trastorno neurológico en un sujeto que lo necesita.
2. Una composición para uso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente al menos un compuesto seleccionado entre sulfisoxazol, metimazol, prilocaina, difilina, quinacrina, carbenoxolona, ácido aminocaproico, cabergolina, dietilcarbamazina, cinacalcet, cinnarizina, eplerenona, fenoldopam, leflunomida, levosimendán, sulodexida, terbinafina, zonisamida, etomidato, fenformina, trimetazidina, mexiletina, ifenprodilo, moxifloxacina, bromocriptina o torasemida.
3. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en la que dicha composición comprende al menos una de las siguientes combinaciones de compuestos: baclofeno y acamprosato, baclofeno y acamprosato y dietilcarbamazina, baclofeno y acamprosato y cinacalce , baclofeno y acamprosato y sulfisoxazol, baclofeno y acamprosato y torasemida , baclofeno y acamprosato e ifenprodilo, baclofeno y acamprosato y mexiletina , baclofeno y acamprosato y eplerenona, baclofeno y acamprosato y levosimendán, baclofeno y acamprosato y terbinafina, o baclofeno y acamprosato y leflunomida .
4. Una composición para uso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende baclofeno y acamprosato como los únicos principios activos.
5. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptables.
6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el trastorno neurológico está seleccionado entre enfermedades neurodegenerativas, neuropatías, abuso de sustancias o lesión de la médula espinal .
7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el trastorno neuroregenerativo está seleccionado entre enfermedad de Alzheimer, enfermedades relacionadas con la enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington.
8. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los compuestos de dicha composición se formulan o se administran en conjunto, separadamente o secuencialmente .
9. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición se administra repetidamente al sujeto.
10. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la relación de acamprosato/baclofeno (p:p) está comprendida entre 0,05 y 1000.
11. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la dosis de baclofeno es inferior a 100 mg/dia.
12. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la dosis de acamprosato es inferior a 1000 mg/dia.
13. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que se usa una sal cálcica de acamprosato.
14. Una composición que comprende baclofeno y acamprosato. RESUME DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a combinaciones y procedimientos para el tratamiento de trastornos neurologicos relacionados con la excitotoxicidad por glutamato y la toxicidad por ß amiloides. Más específicamente, la presente invención se refiere a nuevas terapias de combinación de esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, trastorno relacionado con la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, dolor neuropático, neuropatía alcohólica, alcoholismo o síndrome de abstinencia por alcohol, o lesión de la médula espinal, a base de una combinación de baclofeno y acamprosato.
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