RS57426B1 - Terapija neuroloških poremećaja kombinacijom baklofena i akamprosata - Google Patents

Terapija neuroloških poremećaja kombinacijom baklofena i akamprosata

Info

Publication number
RS57426B1
RS57426B1 RS20180734A RSP20180734A RS57426B1 RS 57426 B1 RS57426 B1 RS 57426B1 RS 20180734 A RS20180734 A RS 20180734A RS P20180734 A RSP20180734 A RS P20180734A RS 57426 B1 RS57426 B1 RS 57426B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
baclofen
acamprosate
combination
composition according
day
Prior art date
Application number
RS20180734A
Other languages
English (en)
Inventor
Daniel Cohen
Ilya Chumakov
Serguei Nabirochkin
Emmanuel Vial
Mickaël Guedj
Original Assignee
Pharnext
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pharnext filed Critical Pharnext
Publication of RS57426B1 publication Critical patent/RS57426B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/137—Arylalkylamines, e.g. amphetamine, epinephrine, salbutamol, ephedrine or methadone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/145—Amines having sulfur, e.g. thiurams (>N—C(S)—S—C(S)—N< and >N—C(S)—S—S—C(S)—N<), Sulfinylamines (—N=SO), Sulfonylamines (—N=SO2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/164—Amides, e.g. hydroxamic acids of a carboxylic acid with an aminoalcohol, e.g. ceramides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/196—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino group being directly attached to a ring, e.g. anthranilic acid, mefenamic acid, diclofenac, chlorambucil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/27—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carbamic or thiocarbamic acids, meprobamate, carbachol, neostigmine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/325—Carbamic acids; Thiocarbamic acids; Anhydrides or salts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A61K31/4045—Indole-alkylamines; Amides thereof, e.g. serotonin, melatonin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/428—Thiazoles condensed with carbocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/64—Sulfonylureas, e.g. glibenclamide, tolbutamide, chlorpropamide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na kombinacije pogodne za tretiranje neuroloških bolesti i poremećaja. Preciznije, ovaj pronalazak odnosi se na inovativnu kombinatornu terapiju neuroloških poremećaja, na bazi kombinacije baklofena i akamprosata.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Alchajmerova bolest (AD) je prototipska kortikalna demencija okarakterisana deficitom memorije zajedno sa disfazijom (poremećaj govora u kojem postoji oštećenje govora i razumevanja govora), dispraksijom (nemogućnost koordinisanja i izvođenja određenih svrsishodnih pokreta i gestova u odsustvu motoričnih ili senzornih oštećenja) i agnozijom (sposobnost prepoznavanja objekata, lica, zvukova, oblika, ili mirisa) koji se mogu pripisati uključivanju udruženih kortikalnih oblasti. Specijalni simptomi kao što su spastična parapareza (slabost koja utiče na donje ekstremitete) mogu takođe biti uključeni (1-4).
[0003] Učestalost Alchajmerove bolesti dramatično se povećava sa godinama. AD je trenutno najčešći uzrok demencije. Klinički je okarakterizovana globalnim padom kognitivne funkcije koja napreduje polako i ostavlja pacijente u krajnjem stadijumu vezane za krevet, ikontinentne i zavisne od negovateljskog čuvanja. Smrt se javlja, u proseku, 9 godina nakon dijagnoze (5).
[0004] Stopa incidencije AD povećava se dramatično sa godinama. Projekcije stanovništva Ujedinjenih Nacija procenjuju da će se broj ljudi starijih od 80 godina približiti do 370 miliona do 2050.godine. Trenutno, procenjuje se da je 50 % ljudi starijih od 85 godina starosti obolelo od AD. Dakle, više od 100 miliona ljudi širom sveta oboleće od demencije kroz 50 godina. Veliki broj ljudi kojima je potrebna stalna pomoć i druge usluge ozbiljno će uticati na medicinske, novčane i ljudske resurse (6).
[0005] Oštećenje memorije predstavlja ranu karakteristiku bolesti i uključuje epizodnu memoriju (memorija za događaje koji se odvijaju dan za danom). Semantička memorija (memorija za verbalno i vizuelno značenje) uključena je kasnije u bolest. Nasuprot tome, radna memorija (kratkotrajno pamćenje koje uključuje strukture i procese koji se koriste za privremeno skladištenje i manipulaciju informacijama) i proceduralno pamćenje (nesvesna memorija koja je dugoročno pamćenje veština i procedure) sačuvani su i kasnije. Kako bolest napreduje, pojavljuju se dodatna oštećenja funkcije jezika, deficiti vizuelne i prostorne percepcije, agnozija i apraksija.
[0006] Klasična slika Alchajmerove bolesti dovoljno je karakteristična da omogući identifikaciju u oko 80% slučajeva (7). I pored toga, javlja se klinička heterogenost što ne samo da je važno za kliničko upravljanje, već pruža dodatnu implikaciju specifičnih tretmana medikamentima za funkcionalno različite oblike (8).
[0007] Patološko obeležje AD-a uključuje amiloidne plakove koji sadrže beta - amiloid (Abeta), neurofibrilarne čvorove (NFT) koji sadrže Tau i neuronsku i sinaptičku disfunkciju i gubitak (9-11). Za poslednjih deset godina, predložene su dve glavne hipoteze o uzroku AD-a: ”amiloid kaskadna hipoteza”, u kojoj se navodi da je neurodegenerativni proces niz događaja izazvan abnormalnom obradom amiloid prekursor proteina (APP) (12), i ”hipoteza citoskeletne degeneracije neurona” (13), koja predlaže da citoskeletne promene izazivaju ove događaje. Najšire prihvaćena teorija koja objašnjava AD napredovanje ostaje amiloid kaskadna hipoteza (14-16) i AD istraživači su uglavnom fokusirani na utvrđivanje mehanizama u osnovi toksičnosti povezanih sa Abeta proteinima.
Mikrovaskularna propustljivost i prepravljanje, nenormalna angiogeneza i slom krvne moždane barijere identifikovani su kao ključni događaji koji doprinose APP toksičnosti u amiloidnoj kaskadi (17). Nasuprot tome, Tau protein je dobio mnogo manje pažnje od strane farmaceutske industrije nego amiloid, kako zbog osnovnih, tako i zbog praktičnih razloga. Štaviše, sinaptička promena gustine je patološka lezija koja najbolje korelira sa kognitivnim oštećenjem u odnosu na druge dve. Istraživanja su pokazala da amiloidna patologija pokazuje napredak na specifičan neurotransmiterski način gde se kolinergični terminali pojavljuju kao najugroženiji, a nakon njih glutamatergički terminali i na kraju GABAergični terminali (11). Glutamat je najrasprostranjeniji ekscitatorni neurotransmiter u nervnom sistemu sisara. Pod patološkim uslovima, njegova abnormalna akumulacija u sinaptičkim pukotinama dovodi do preterane aktivacije glutamatnih receptora (18). Abnormalna akumulacija glutamata u sinaptičkim pukotinama dovodi do preterane aktivacije glutamatnih receptora, što za rezultat ima patološke procese i na kraju odumiranje ćelija neurona. Ovaj proces, nazvan ekscitotoksičnost, obično je primećen u neuronskim tkivima u toku akutnih i hroničnih neuroloških poremećaja.
[0008] Postaje jasno da je ekscitotoksičnost uključena u patogenezi višestrukih poremećaja različite etiologije, kao što su: povreda kičmene moždine, moždani udar, traumatske povrede mozga, gubitak sluha, alkoholizam i prestanak uzimanja alkohola, alkoholna neuropatija, ili neuropatski bol, kao i neurodegenerativne bolesti što kao multiple skleroza, Alchajmerova bolest, amiotrofična lateralna skleroza, Parkinsonova bolest i Hantingtonova bolest (19-21). Razvoj efikasnog lečenja ovih bolesti i dalje ostaje veliki javni zdravstveni problem zbog njihove učestalosti, kao i nedostatka lekovitog tretmana.
[0009] Dve vrste lekova koriste se za poboljšanje ili usporavanje simptoma AD koji se oslanjaju na neke modulatore acetilholinesteraze i blokatore NMDA glutamatnih receptora (26-27).
[0010] NMDAR antagonisti koji ciljaju različita mesta ovog receptora testirani su kako bi se suprotstavili ekscitotoksičnosti. Nekonkurentni NMDAR antagonisti ciljaju jonsku kanalnu poru čime se smanjuje unos kalcijuma u postsinaptičke neurone. Neki od njih su dostigli odobren status. Kao primer, memantin je trenutno odobren kod umerene do jake Alchajmerove bolesti. Klinički je testiran u drugim indikacijama koje uključuju komponentu ekscitotoksičnosti kao što je zavisnost od alkohola (faza II ), amiotrofična lateralna skleroza (faza III), demencija povezana sa Parkinsonom (faza II), epilepsija, Hantingtonova bolest (faza IV), multiple skleroza (faza IV), Parkinsonova bolest (faza IV) i traumatske povrede mozga (faza IV). Ovaj molekul, međutim, ima ograničenu korist kod većine pacijenata obolelih od Alchajmerove bolesti jer ima samo skromne simptomatske efekte. Još jedan pristup u ograničavanju ekscitotoksičnosti sastoji se u inhibiciji presinaptičkog oslobađanja glutamata. Riluzol, trenutno odobren kod amiotrofične lateralne skleroze, pokazao je ohrabrujuće rezultate kod modela ishemije i traumatske povrede mozga (22-25). Trenutno je testiran u fazi II ispitivanja kod rane multiple skleroze, Parkinsonove bolesti (ne pokazuje nikakve bolje rezultate od placeba), kao i kod povrede kičmene moždine.1995., lek je dostigao status leka za retke bolesti za lečenje amiotrofične lateralne skleroze, a 1996. za lečenje Hantingtonove bolesti. Upotreba antagonista NMDA receptora, kao što su memantin, felbamat, akamprosat i MRZ 2/579 za tretiranje depresije takođe je predloženo u US2010076075.
[0011] Hama et al. (50), odnosi se na upotrebu baklofena (agonist GABA receptora) kombinovanog sa ketaminom (antagonist NMDA receptora) za adresiranje neuropatskog bola usled povrede kičmene moždine. Lyden et al. (51), izučava neuro-zaštitni efekat kombinovanje muskimola (GABA-A agonist) sa MK801 (NMDA antagonist) na učenje i zapreminu odeljka mozga nakon cerebralne ishemije. Costa et al. (52) ukazuju da kombinovanje baklofena i muskimola in vitro omogućava delimičnu obnovu gubitka potencijala polja indukovanog ishemijom. Zhou et al. (53) izučava neuroprotektivni efekat kombinovanja baklofena i muskimola nakon moždane ishemija.
[0012] WO2009133128, WO2009133141, WO2009133142 i WO2011054759 opisuju kombinacije lekova za upotrebu u tretiranju AD.
[0013] Uprkos aktivnom istraživanju u ovoj oblasti, još uvek postoji potreba za alternativnom ili terapijom sa poboljšanom efikasnošću za neurološke poremećaje i, naročito, neurološke poremećaje koji se odnose na glutamatnu i/ili amiloidnu beta toksičnost. Ovaj pronalazak obezbeđuje nove tretmane za takve neurološke bolesti centralnog nervnog sistema (CNS) i perifernog nervnog sistema (PNS ).
SAŽETAK PRONALASKA
[0014] Predmet ovog pronalaska je da obezbedi nove terapeutske kompozicije pogodne za tretiranje neuroloških poremećaja. Preciznije, pronalazak se odnosi na kompozicije pogodne za tretiranje neuroloških poremećaja povezanih sa glutamatnom i/ili amiloidnom beta toksičnosti, bazirane na kombinaciji baklofena i akamprosata.
[0015] Pronalazak proizilazi, između ostalog, od neočekivanog otkrića, od strane pronalazača, da kombinacija baklofena i akamprosata obezbeđuje značajnu i neočekivanu korist kod pacijenata sa Alchajmerovom bolešću. Štaviše, pronalazači su iznenađujuće otkrili da ova kombinacija daje značajnu i neočekivanu zaštitu neuronskih ćelija protiv različitih povreda koje su ubrojane u neurološkim poremećajima uključujući glutamatnu toksičnost. Stoga, ovakva kombinacija baklofena i akamprosata predstavlja efikasan tretman za pacijente koji pate od, imaju predispoziciju ka, ili se sumnja da pate od neuroloških poremećaja.
[0016] Predmet ovog pronalaska odnosi se na kompoziciju kao što je definisano u patentnim zahtevima. Preciznije, ovaj pronalazak odnosi se na kompozicije koje sadrže baklofen ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i akamprosat ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Ovde su opisane kompozicije koje obuhvataju kombinaciju baklofena i akamprosata, za upotrebu u tretiranju neurološkog poremećaja, naročito AD i srodnih poremećaja, multiple skleroze (MS), amiotrofične lateralne skleroze (ALS), Parkinsonove bolesti (PD), neuropatija (na primer, neuropatski bol ili alkoholna neuropatija), alkoholizma ili ostavljanja alkohola, Hantingtonove bolesti (HD) i povrede kičmene moždine.
[0017] Kompozicija prema ovom pronalasku može da sadrži baklofen i akamprosat kao jedine aktivne sastojke. Alternativno, kompozicije mogu da sadrže dodatni(e) aktivni(e) sastojak(e). U tom smislu, dalji cilj ovog pronalaska odnosi se na kompoziciju koja sadrži kombinaciju baklofena, akamprosata, i najmanje jednog trećeg jedinjenja odabranog od sulfisoksazola, metimazola, prilokaina, difilina, kvinakrina, karbenoksolona, aminokapronske kiseline, kabergolina, dietilkarbamazina, cinakalceta, cinarizina, eplerenona, fenoldopama, leflunomida, levozimendana, sulodeksida, terbinafina, zonisamida, etomidata, fenformina, trimetazidina, meksiletina, ifenprodila, moksifloksacina, bromokriptina ili torasemida, za upotrebu u tretiranju neuroloških poremećaja kod subjekta kome je to potrebno.
[0018] Kao što će dalje biti opisano u ovoj prijavi, jedinjenja u kombinatornoj terapiji ovog pronalaska mogu se davati subjektu istovremeno, odvojeno, sekvencijalno i/ili u više navrata.
[0019] Ovaj pronalataka takođe se odnosi na bilo koju farmaceutsku kompoziciju per se koja sadrži kombinaciju najmanje dva jedinjenja kao što je gore definisano.
[0020] Kompozicije prema ovom pronalasku obično dalje obuhvataju jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata ili nosača. Takođe, jedinjenja u ovom pronalasku takođe su opisana u obliku soli. Ona takođe mogu biti opisana u obliku formulacija sa produženim oslobađanjem.
[0021] U poželjnom ostvarenju, jedinjenje se koristi kao takvo ili u obliku svoje soli. Posebno poželjna so za upotrebu u predmetnom pronalasku je akamprosat kalcijum. Ovde je takođe opisan postupak za pripremanje farmaceutske kompozicije, pri čemu taj postupak obuhvata mešanje baklofena i akamprosata, u farmaceutski prihvatljivom ekscipijentu ili nosaču. Ovde je takođe opisan postupak za tretiranje neurološkog poremećaja kod sisara kada je to potrebno, poželjno humanog subjekta kome je to potrebno, pri čemu se taj postupak sastoji od davanja pomenutom subjektu efikasne količine kombinacije ovog pronalaska. Ovde je takođe opisan postupak za tretiranje Alchajmera ili povezanog poremećaja kod sisara kome je to potrebno, poželjno humanog subjekta kome je to potrebno, pri čemu se taj postupak sastoji od davanja pomenutom subjektu efikasne količine kombinacije prema ovom pronalasku. Ovde je takođe opisan postupak za tretiranje neurološkog poremećaja kod sisara kome je to potrebno, poželjno humanog subjekta kome je to potrebno, pri čemu taj postupak obuhvata istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno davanje pomenutom subjektu efikasne količine baklofena i akamprosata. Ovde je takođe opisan postupak za lečenje Alchajmera ili srodnog poremećaja kod sisara kome je potrebno, poželjno humanog subjekta kome je to potrebno, pri čemu taj postupak obuhvata davanje pomenutom subjektu efikasne količine baklofena i akamprosata istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno. Ovde je opisano tretiranje neurološkog poremećaja kod bilo kog sisara, poželjno kod bilo kog humanog subjekta, u bilo kojoj fazi bolesti. Kao što će biti otkriveno u primerima, kompozicije ovog pronalaska su u stanju da ublaže patološko stanje pomenutih subjekata.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0022]
FIG.1: Validacija eksperimentalnog modela toksičnosti humanog βamiloida na endotelijalne ćelije, upotrebljena je za skrining supstance. Jedan sat VEGF predtretmana na 10 nM značajno je zaštitilo kapilarnu mrežu od ovakve amiloidne povrede (+70 % kapilarne mreže u odnosu na amiloidnu intoksikaciju).
FIG.2: Uticaj baklofen (BCL) i akamprosat (ACP) kombinovane terapije na ukupnu dužinu kapilarne mreže na beta-amiloid intoksikovanim HBMEC kulturama. Humani amiloid peptid (Aβ1-
422,5µM) proizvodi značajnu intoksikaciju, iznad 40 %, u poređenju sa ćelijama tretiranih nosačem. Ova intoksikacija značajno je sprečena kombinacijom akamprosata i
baklofena (A) dok, na tim koncentracijama, akamprosat (B) i baklofen (C) sami nemaju značajan uticaj na intoksikaciju. : p<0,05, značajno različit od Aβ1-42intoksikacije; *: p<0,05, značajno različit od nosača; "ns" bez značajnog efekta (ANOVA Dunnett Post-Hoc test).
FIG.3: Uticaj baklofen (BCL) i terbinafin (TBN) kombinovane terapije na ukupnu dužinu kapilarne mreže na beta-amiloid intoksikovanim HBMEC kulturama. Humani amiloid peptid (Aβ1-422,5µM) proizvodi značajnu intoksikaciju, iznad 40 %, u poređenju sa ćelijama tretiranih nosačem. Ova intoksikacija značajno je sprečena kombinacijom terbinafina i baklofena. *: p<0,05: značajno se razlikuje od kontrole (bez intoksikacije).
FIG.4: Validacija eksperimentalnog modela toksičnosti humanog βamiloida na neuronske ćelije, upotrebljena je za skrining supstance. Jedan sat estradiol (150 nM) ili BDNF (50ng/mL) predtretmana značajno je zaštitilo neurone od ovakve amiloidne povrede (-94 %), koja se smatra kao pozitivna kontrola za neurozaštitu.*: p<0,05: značajno se razlikuje od kontrole (bez intoksikacije); : p<0,05, značajno različit od Aβ1-42intoksikacije.
FIG.5: Uticaj akamprosat (ACP) i baklofen (BCL) kombinovane terapije na LDH oslobađanje kod toksičnosti humanog Aβ1-42na primarnim kortikalnim ćelijama pacova. Humani amiloid peptid (Aβ1-4210µM) proizvodi značajnu intoksikaciju u poređenju sa neuronima tretitanih nosačem. Ova intoksikacija značajno je sprečena kombinacijom akamprosata i baklofena (A) dok, na tim koncentracijama, akamprosat (B) i baklofen (C) sami nemaju značajan uticaj na intoksikaciju. : p<0,05, značajno različit od Aβ1-42intoksikacije; *: p<0,05, značajno različit od nosača; "ns" bez značajnog efekta. (ANOVA Dunnett Post-Hoc test).
FIG.6: Uticaj cinakalcet (CNC) i sulfisokazol (SFX) kombinovane terapije na LDH oslobađanje kod toksičnosti humanog Aβ1-42na primarnim kortikalnim ćelijama pacova. Humani amiloid peptid (Aβ1-4210µM) proizvodi značajnu intoksikaciju u poređenju sa neuronima tretiranih nosačem. Ova intoksikacija se sprečava kombinacijom cinakalceta i sulfisoksazola. *: p<0,05, značajno različit od nosača.
FIG.7: Uticaj akamprosat (ACP) i baklofen (BCL) kombinovane terapije na ukupnu dužinu mreže neurona u beta-amiloid intoksikovanim kortikalnim neuronima. Humani amiloid peptid (Aβ1-
422,5µM) proizvodi značajnu intoksikaciju, iznad 15 %, u poređenju sa ćelijama tretiranih nosačem. Ova intoksikacija značajno je sprečena kombinacijom akamprosata i baklofena dok, na tim koncentracijama, akamprosat baklofen sami nemaju značajan uticaj na intoksikaciju. : p<0,05, značajno različit od Aβ1-42intoksikacije; *: p<0,05, značajno različit od nosača (ANOVA Dunnett Post-Hoc test).
FIG.8: Uticaj akamprosat i baklofen kombinovane terapije na ponašanje kao što je definisano Y-lavirint testom. Amiloid peptid proizvodi značajno smanjenje u spoznaji kako je izmereno procentualnom alternacijom (53,8 % naspram 73,5 % ). Ovaj štetni efekat značajno je sprečen (48,2 % zaštite) kombinacijom akamprosata (0,2mg/kg/dan) i baklofena (3mg/kg/dan). ◊: p<0,05, značajno različit od Aβ25-35intoksikacije; *: p<0,05, značajno različit od nosača (ANOVA Dunnett Post-Hoc test).
FIG.9: Uticaj akamprosat i baklofen kombinovane terapije na memoriju kao što je definisano pasivnim izbegavanjem (latencije ispuštanja). Amiloid peptid proizvodi značajan pad memorijskih performansi izmereno latencijom ispuštanja u odnosu na kontrolu. Ovaj štetni efekat značajno je sprečen (potpuna zaštita) kombinacijom akamprosata (0,2mg/kg) i baklofena (3mg/kg). ◊: p<0,05, značajno različit od Aβ25-35intoksikacije; *: p<0,05, značajno različit od nosača (ANOVA Dunn-ov test).
FIG.10: Efekat akamprosat i baklofen kombinovane terapije na memoriju kao što je definisano pasivnim izbegavanjem (faza kroz latenciju). Amiloid peptid proizvodi značajno smanjenje u performansama pamćenja kao što je izmereno fazom kroz latenciju, iznad 44 %, u odnosu na kontrolu. Ovaj štetni efekat je značajno sprečen (78,8 % efekta zaštite) kombinacijom akamprosata (0,2mg/kg) i baklofena (3mg/kg) dok, na tim koncentracijama, akamprosat i baklofen sami imaju manji efekat na intoksikaciju. ◊: p<0,05, značajno različit od Aβ25-
35intoksikacije; *: p<0,05, značajno različit od nosača (ANOVA Dunn-ov test).
FIG.11: Uticaj akamprosat i baklofen kombinovane terapije na gustinu neurona u hipokampusu. Amiloidni peptid proizvodi značajan pad neuronske gustine izmerene brojem neurona po milimetru u hipokampusu, iznad 21 %, u odnosu na kontrolu. Ova povreda neurona značajno je sprečena (63,2 % povređenih neurona je zaštićeno) kombinacijom akamprosata (0,2mg/kg) i baklofena (3mg/kg). ◊: p<0,05, značajno različit od Aβ25-35intoksikacije; *: p<0,05, značajno različit od nosača (ANOVA Dunnett Post-Hoc test).
FIG.12: Efekat akamprosat i baklofen kombinovane terapije na integritet krvno-moždane barijere. Amiloidni peptid utiče na krvno-moždanu barijeru (BBB) indukujući značajno povećanje njene propustljivosti, iznad 51 %, u odnosu na kontrolu. Ta oštećenja na krvno-moždanoj barijeri značajno su sprečena (66,6 % integriteta je obnovljeno) kombinacijom akamprosata (0,2mg/kg) i baklofena (3mg/kg). ◊: p<0,05, značajno različit od Aβ25-35intoksikacije; *: p<0,05, značajno različit od nosača (ANOVA Dunnett Post-Hoc test).
FIG.13: Uticaj akamprosat i baklofen kombinovane terapije na sinaptičku gustinu prikazano kao koncentracija sinaptofizina. Amiloidni peptid utiče na sinapsičku funkciju indukujući značajno smanjenje koncentracije sinaptofizina u mozgu, iznad 34 %, u odnosu na kontrolu. Ta oštećenja na sinaptičkoj gustini značajno su sprečena (76 %) kombinacijom akamprosata (0,2mg/kg/dan) i baklofena (3mg/kg/dan). ◊: p<0,05, značajno različit od Aβ25-35intoksikacije; *: p<0,05, značajno različit od nosača (ANOVA Dunnett Post-Hoc test).
FIG.14: Zaštitni efekat akamprosat i baklofen kombinovane terapije na oksidativni stres u hipokampusu. Amiloidni peptid indukuje značajno povećanje oksidativnog stresa u hipokampusu izmeren lipidnom peroksidacijom, iznad 59 %, u odnosu na kontrolu. Ovaj oksidativni stres značajno je sprečen (65,9 %) kombinacijom akamprosata (0,2mg/kg/dan) i baklofena (3mg/kg/dan). ◊: p<0,05, značajno različit od Aβ25-35intoksikacije; *: p<0,05, značajno različit od nosača (ANOVA Dunnett Post-Hoc test).
FIG.15: Efekat baklofen i akamprosat kombinovane terapije protiv glutamatne toksičnosti na kortikalnim ćelijama neurona. Glutamatna intoksikacija značajno je sprečena kombinacijom baklofena (400 nM) i akamprosata (1,6 nM ), dok, na tim koncentracijama, baklofen i
akamprosat sami nemaju značajan uticaj na intoksikaciju. ◊: p<0,001, značajno različit od glutamatne intoksikacije; (ANOVA Dunnett Post-Hoc test).
FIG.16: Efekat donepezil, akamprosat i baklofen kombinovane terapije na ponašanje i kognitivne performanse kao što je definisano Y - lavirint testom. Amiloidni peptid proizvodi značajno smanjenje u spoznaji kako je izmereno procentualnom alternacijom (51,5 % naspram 71,8 % ). Ovaj štetni efekat je značajno sprečen (98 % zaštite) kombinacijom donepezila (0,25 mg/kg/dan), akamprosata (32µg/kg/dan) i baklofena (480µg/kg/dan), dok na tim koncentracijama lekovi sami nemaju značajan efekat. ◊: p<0,01, značajno različit od Aβ25-
35intoksikacije; *: p<0,01, značajno različit od nosača (ANOVA Dunnett Post-Hoc test).
FIG.17: Poređenje zaštitnog efekta predtretmana akamprosata i njegovog derivata homotaurina humanim Aβ1-42testovima toksičnosti na primarnim kortikalnim ćelijama pacova. Aβ1-42proizvodi značajnu intoksikaciju u odnosu na neurone tretirane nosačem. Intoksikacija je podjednako značajno sprečena homotaurinom i akamprosatom (99 %, 8nM). ◊: p<0,0001: značajno se razlikuje od Aβ1-42intoksikacije.
FIG.18: Efekat akamprosat i baklofen kombinovane terapije na razvoj hroničnog progresivnog eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa (EAE), kao što je definisano kliničkom ocenom. Imunizacija izaziva značajno smanjenje fizičkih karakteristika izmerenih kliničkom ocenom. Ovaj štetni efekat je značajno sprečen (p-vrednost < 0,01) kombinacijom akamprosata (2 mg/kg/dan) i baklofena (30 mg/kg/dan).
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0023] Ovaj pronalazak obezbeđuje nove kompozicije pogodne za tretiranje neuroloških poremećaja. Ovaj pronalazak otkriva nove kombinacije lekova koji omogućavaju efeikasnu korekciju takvih bolesti i mogu se upotrebiti na bilo kom sisaru.
[0024] Ovaj pronalazak je pogodan za tretiranje neuroloških poremećaja, bilo centralno ili periferno, a naročito poremećaja kod kojih su uključene povrede nerava ili neurona, βamiloid, BBB slom ili glutamatna ekscitotoksičnost. Specifični primeri takvih poremećaja uključuju neurodegenerativne bolesti, neuropatije, povredu kičmene moždine, i zloupotrebu supstanci kao što je alkoholizam.
[0025] Neurodegenerativni poremećaji se odnose na bolesti, kao što je Alchajmerova bolest i srodni
1
poremećaji, amiotrofična lateralna skleroza (ALS), multiple skleroza (MS), Parkinsonova bolest (PD), Hantingtonova bolest (HD), koje obuhvataju progresivni gubitak funkcije i smrt neurona.
[0026] Neuropatije se odnose na stanja gde su oštećeni nervi perifernog nervnog sistema, što uključuje oštećenja perifernog nervnog sistema izazvana genetskim faktorima, inflamatornom bolešću, ili hemijskom supstancom, uključujući lekove (vinkristin, oksaliplatin, etil alkohol). Tretman neuropatija takođe uključuje tretiranje neuropatskog bola.
[0027] Ovaj pronalazak je posebno pogodan za tretiranje AD i srodnih poremećaja. U kontekstu ovog pronalaska, termin ”srodni poremećaj” obuhvata senilne demencije AD tipa (SDAT), demeciju sa Levijem telima, vaskularnu demenciju, blago kognitivno oštećenje (MCI) i oštećenje memorije povezano sa starenjem (AAMI).
[0028] Kako se ovde koristi, "tretman” obuhvata terapiju, prevenciju, profilaksu, usporavanje ili smanjenje simptoma izazvanih ili uzrokovanih od strane navedenih bolesti ili poremećaja. Termin tretman uključuje posebno kontrolu progresije bolesti i povezanih simptoma. Termin tretman posebno uključuje zaštitu protiv toksičnosti izazvane Amiloidom Beta, ili smanjenje ili usporavanje pomenute toksičnosti, i/ili ii) zaštitu od glutamatne ekscitotoksičnosti, ili smanjenje ili usporavanje navedene toksičnosti, kod tretiranih subjekata. Termin tretman takođe označava poboljšanje kognitivnog simptoma ili zaštitu neuronskih ćelija.
[0029] U kontekstu ovog pronalaska, oznaka određenog leka ili jedinjenja treba da obuhvata ne samo konkretno imenovan molekul, već i svaku njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
[0030] Termin ”kombinacija ili kombinatorno tretiranje/terapija” označava tretman u kojem se najmanje baklofen i akamprosat koadministriraju nekom subjektu kako bi se prouzrokovao biološki efekat. U kombinovanoj terapiji prema ovom pronalasku, najmanje dva leka mogu se ordinirati zajedno ili odvojeno, istovremeno ili sekvencijalno. Takođe, najmanje baklofen i akamprosat mogu se davati kroz različite puteve i protokole. Kao rezultat toga, iako se mogu formulisati zajedno, lekovi kombinacije mogu takođe biti formulisani zasebno.
[0031] Termin "prolek ", kako se ovde koristi odnosi se na bilo koje funkcionalne derivate (ili prekursore) jedinjenja prema ovom pronalasku, koji, kada se primeni u biološkom sistemu, generiše navedeno jedinjenje kao rezultat npr., spontane hemijske reakcije (reakcija), enzim katalizovane hemijske reakcije (reakcija), i/ili metaboličke hemijske reakcije (reakcija). Prolekovi su obično neaktivni ili manje aktivni od dobijenog leka i mogu se koristiti, na primer, za poboljšanje fizičko-hemijskih svojstava leka, kako bi usmerio lek ka određenom tkivu, kako bi se poboljšala farmakokinetička i farmakodinamička svojstva leka i/ili za smanjenje neželjenih sporednih efekata. Neke od uobičajenih funkcionalnih grupa koje su pogodne za dizajn proleka uključuju, ali nisu ograničene na, karboksilne, hidroksilne, amino, fosfatne/fosfonatne i karbonilne grupe. Prolekovi obično proizvodeni modifikacijom ovih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, estre, karbonate, karbamate, amide i fosfate. Specifične tehničke smernice za izbor pogodnih prolekova opšte su poznate (29-33). Pored toga, priprema prolekova može se obavljati konvencionalnim metodama poznatim stručnjacima iz ove oblasti. Metode koje se mogu koristiti za sintezu drugih prolekova opisani su u brojnim časopisima na ovu temu (30; 34-40). Na primer, Arbaklofen Plakarbil je naveden u ChemID plus Advance bazi podataka (sajt: chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/), a Arbaklofen Plakarbil je dobro poznati prolek baklofena (41-42).
[0032] Termin ”derivat” jedinjenja obuhvata bilo koji molekul koji je funkcionalno i/ili strukturalno srodan navedenom jedinjenju, kao što je kiselina, amid, estar, etar, acetilovana varijanta, hidroksilirana varijanta, ili alkilisana (C1-C6) varijanta takvog jedinjenja. Termin derivat takođe obuhvata strukturalno srodno jedinjenje koje je izgubilo jedan ili više supstituenata kako je gore navedeno. Na primer, homotaurin je deacetilizovan derivat akamprosata. Poželjni derivati jedinjenja su molekuli koji imaju značajan stepen sličnosti sa navedenim jedinjenjem, kao što je određeno poznatim metodama. Slična jedinjenja zajedno sa svojim indeksom sličnosti sa matičnim molekulom mogu se naći u brojnim bazama podataka kao što PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/) ili DrugBank (http://www.drugbank.ca/). U poželjnijem ostvarenju, derivati treba da imaju Tanimoto indeks sličnost veći od 0,4, poželjno veći od 0,5, poželjnije veći od 0,6, još poželjnije veći od 0,7 sa matičnim lekom. Tanimoto Indeks sličnost se široko koristi za merenje stepena strukturne sličnosti između dva molekula. Tanimoto indeks sličnost može da se izračuna pomoću softvera kao što je Small Molecule Subgraph Detector (43-44) dostupan na internetu (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/SMSD/). Poželjni derivati treba da budu i strukturalno i funkcionalno srodni matičnom jedinjenju, odnosno, oni takođe treba da zadrže bar deo aktivnosti matičnog leka, poželjnije trebalo bi da imaju zaštitnu aktivnost protiv Aβ ili glutamatne toksičnosti.
[0033] Termin derivati takođe uključuje metabolite leka, na primer, molekul koji rezultira iz (biohemijske) modifikacije(a) ili prerade navedenog leka nakon administracije u organizmu, obično preko specijalizovanih enzimskih sistema, i koji prikazuje ili zadržava biološku aktivnost leka. Metaboliti su otkriveni kao veoma odgovorni za velika terapijska delovanja matičnog leka. U specifičnom ostvarenju, "metabolit" kako se ovde koristi označava modifikovani ili obrađeni lek koji zadržava bar deo aktivnosti matičnog leka, poželjno koji ima zaštitnu aktivnost protiv Aβ toksičnosti ili glutamatne toksičnosti.
[0034] Termin "so" se odnosi na farmaceutski prihvatljive i relativno netoksične, neorganske ili organske adicione soli sa kiselinom jedinjenja iz ovog pronalaska. Formiranje farmaceutske soli sastoji se u uparivanju kiselog, baznog ili cviterjonskog molekula leka sa katjonom kako bi se stvorila slana verzija leka. Širok spektar hemijskih vrsta može da se koristi u reakciji neutralizacije. Farmaceutski prihvatljive soli ovog pronalaska tako uključuju one dobijene reakcijom glavnog jedinjenja, koje funkcioniše kao baza, sa neorganskom ili organskom kiselinom kako bi se formirala so, na primer, soli sirćetne kiseline, azotne kiseline, tartarne kiseline, hlorovodonične kiseline, sumporne kiseline, fosforne kiseline, metan sulfonske kiseline, kamfor sulfonske kiseline, oksalne kiseline, maleinske kiseline, ćilibarne kiseline ili limunske kiseline. Farmaceutski prihvatljive soli iz ovog pronalaska takođe uključuju one u kojima glavno jedinjenje funkcioniše kao kiselina i reaguje sa odgovarajućom bazom kako bi se formirale, npr., natrijumove, kalijumove, kalcijumove, magnezijumove, amonijumove ili holinske soli. Iako većina soli datog aktivnog principa predstavlja bioekvivalente, neka mogu imati, između ostalog, povećana svojstva rastvorljivosti ili bioraspoloživosti. Odabir soli je sada zajednički standard operacija u procesu razvoja lekova prema priručniku H. Stahl i C.G Wermuth (45).
[0035] U poželjnom ostvarenju, oznaka jedinjenja treba da označi jedinjenje kao što je posebno označeno per se, kao i bilo koju njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
[0036] U posebnom ostvarenju, koristi se formulacija sa produženim oslobađanjem jedinjenja.
[0037] Kao što je prethodno pomenuto, ovaj pronalazak se odnosi na određene kombinacije lekova koje imaju snažan neočekivan efekat na nekoliko bioloških procesa uključenih u neurološkim poremećajima. Ove kombinacije lekova stoga predstavljaju nove pristupe za tretiranje neuroloških poremećaja, kao što su Alchajmerova bolest i srodni poremećaji, multiple skleroza, amiotrofična lateralna skleroza, Parkinsonova bolest, Hantingtonova bolest, neuropatije (na primer, neuropatski bol ili alkoholna neuropatija), alkoholizam ili ostavljanje alkohola, i povreda kičmene moždine. Preciznije, ovaj pronalazak otkriva kompozicije, koje sadrže baklofen u kombinaciji sa akamprosatom, koji daju značajan efekat in vivo kod neuroloških poremećaja.
[0038] Zaista, pronalazak pokazuje, u eksperimentalnom delu, da kombinovane terapije koje sadrže baklofen i akamprosat mogu značajno poboljšati stanje pacijenata koji pate od neuroloških poremećaja. Konkretno, pronalazači su iznenađujuće otkrili da kombinacije baklofena i akamprosata imaju jak,
1
neočekivani efekat na dužinu kapilarne mreže ili LDH oslobađanje u beta-amiloidnim intoksikovanim nervnim ćelijama, i predstavljaju nove terapijske pristupe AD. Takodje, primeri pokazuju da, u kombinovanoj terapiji pronalaska, baklofen može biti efikasan u dozi od 80 nM ili manje, a da akamprosat može biti efikasan u dozi od 1 nM ili manje. Ovi rezultati su izuzetni i sa posebno povoljni budući da su, na ovako niskim dozama, bilo koji mogući neželjeni efekti izbegnuti.
Dalje, ove kombinacije efektivno štite neuronske ćelije iz raznih nepogoda, kao što je glutamatna toksičnost, oksidativni stres i sprečavaju BBB permeabilizaciju ili apoptoziju indukovanu nervnim ćelijama koje su uključene u nekoliko neuroloških poremećaja.
[0039] Ovaj pronalazak stoga predlaže novu terapiju neuroloških poremećaja, na bazi kompozicija baklofena i akamprosata. Još preciznije, ovaj pronalazak prema tome opisuje novu terapiju Alchajmerove bolesti i srodnih poremećaja, multiple skleroze, amiotrofične lateralne skleroze, Parkinsonove bolesti, Hantingtonove bolesti, neuropatija (na primer, neuropatski bol ili alkoholna neuropatija), alkoholizma ili ostavljanja alkohola, i povrede kičmene moždine, na bazi kombinacija baklofena i akamprosata.
[0040] U tom smislu, u posebnom ostvarenju, ovaj pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži baklofen i akamprosat. Ovde je takođe opisana kompozicija koja sadrži baklofen i akamprosat za upotrebu u tretiranju AD, AD srodnih poremećaja, MS, PD, ALS, HD, neuropatija (na primer, neuropatski bol ili alkoholna neuropatija), alkoholizma ili ostavljanja alkohola, ili povrede kičmene moždine. Ovde je takođe opisana upotreba baklofena i akamprosata za proizvodnju leka za tretiranje AD, AD srodnih poremećaja, MS, PD, ALS, HD, neuropatija (na primer, neuropatski bol ili alkoholna neuropatija), alkoholizma ili ostavljanja alkohola, ili povrede kičmene moždine.
[0041] Ilustrativni CAS brojevi za baklofen i akamprosat dati su u Tabeli 1 ispod. Tabela 1 takođe navodi, na neograničavajući način, uobičajene soli, racemate, prolekove, metabolite ili derivate ovih jedinjenja.
Tabela 1
[0042] Specifični primeri prolekova baklofena dati su u Hanafi et al, 2011 (41), naročito baklofen estri i baklofen estarski karbamati koji su od posebnog interesa za CNS ciljanje. Baklofen plakarbil kao što je pomenuto ranije takođe je dobro poznati prolek i može se, stoga, upotrebiti umesto baklofena. Drugi prolekovi baklofena mogu se naći u sledećim patentnim prijavama: WO2010102071, US2009197958, WO2009096985, WO2009061934, WO2008086492, US2009216037, WO2005066122, US2011021571, WO2003077902, WO2010120370.
[0043] Korisni prolekovi za akamprosat kao što su estar pantonske kiseline, neopentil sulfonil estri, neopentil sulfonil estarski prolekovi ili maskirani karboksilat neopentil sulfonil estarskih prolekovi akamprosata posebno su navedeni u WO2009033069, WO2009033061, WO2009033054, WO2009052191, WO2009033079, US 2009/0099253, US 2009/0069419, US 2009/0082464, US 2009/0082440, i US 2009/0076147.
[0044] Baklofen i akamprosat mogu da se koriste sami ili mogu da se dalje kombinuju sa dodatnim jedinjenjima. U tom smislu, u određenom ostvarenju, kompozicije iz pronalaska mogu dalje sadržati najmanje jedno jedinjenje izabrano od sulfisoksazola, metimazola, prilokaina, difilina, kvinakrina, karbenoksolona, aminokapronske kiseline, kabergolina, dietilkarbamazina, cinakalceta, cinarizina, eplerenona, fenoldopama, leflunomida, levozimendana, sulodeksida, terbinafina, zonisamida, etomidata, fenformina, trimetazidina, meksiletina, ifenprodila, moksifloksacina, bromokriptina ili torasemida. Ilustrativni CAS brojevi za svako od ovih jedinjenja dati su u Tabeli 2 koja sledi:
Tabela 2
1
1
Ovde je takođe opisana upotreba ove kombinacije za tretiranje AD ili povezanog poremećaja kod subjekta kome je to potrebno. Ovde je takođe opisana upotreba ove kombinacije za tretiranje MS, PD, ALS, HD, neuropatija (na primer, neuropatski bol ili alkoholna neuropatija), alkoholizma ili ostavljanja alkohola, ili povrede kičmene moždine, kod subjekta kome je to potrebno.
[0045] Kao što je obelodanjeno u primerima, kompozicione terapije pomoću najmanje baklofena i akamprosata imaju jak neočekivani efekat na biološke procese koji vode ka povredama neurona. Dalje, ove kombinacije takođe su pokazale in vivo veoma efikasnu sposobnost ispravljanja simptoma neuroloških bolesti. Ove kombinacije stoga predstavljaju nove pristupe za tretiranje neuroloških poremećaja, kao što su Alchajmerova bolest, multiple skleroza, amiotrofična lateralna skleroza, Parkinsonova bolest, Hantingtonova bolest, neuropatije (na primer, neuropatski bol ili alkoholna neuropatija), alkoholizam ili ostavljanje alkohola, i povreda kičmene moždine. Ove kompozicije efikasno sprečavaju toksičnost amiloidnih β (Aβ) peptida ili glutamatne ekscitotoksičnosti na neuronske ćelije. Štaviše, in vivo, ove kompozicije vode do poboljšanja nekoliko kognitivnih simptoma kao i do zaštite neuronskih ćelija. Stoga, oni predstavljaju nove i potentne metode za tretiranje takvih poremećaja. Eksperimentalna sekcija dalje pokazuje da su gore pomenute kompozicije takođe efikasne i) u sinergijskoj zaštiti in vitro neuronskih ćelija iz glutamatne ekscitotoksičnosti, i ii) u stvaranju kliničke koristi u in vivo modelima za bolesti povezane sa glutamatnom ekscitotoksičnosti.
[0046] Kompozicije opisane u ovom pronalasku mogu da sadrže 2, 3, 4 ili 5 različitih supstanci, poželjnije 2, 3 ili 4 različite supstance za kombinatorno tretiranje Alchajmerove bolesti (AD), AD povezanih poremećaja, MS, PD, ALS, HD, neuropatija (na primer, neuropatski bol ili alkoholna neuropatija), alkoholizma ili ostavljanja alkohola, ili povrede kičmene moždine kod subjekta kome je to potrebno. U jednom poželjnom ostvarenju, supstance iz ovog pronalaska koriste se u kombinaciji(ama) za kombinovano, odvojeno ili sekvencijalno davanje, kako bi se obezbedio najefikasniji efekat. Ovde takođe opisane kompozicije za upotrebu u tretiranju neurološkog poremećaja kao što je Alchajmerova bolest (AD), AD povezani poremećaji, MS, PD, ALS, HD, neuropatije (na primer, neuropatski bol ili alkoholna neuropatija), alkoholizam ili ostavljanje alkohola, ili povreda kičmene moždine, koje obuhvataju jednu od sledećih kombinacija lekova, za kombinovano, odvojeno ili sekvencijalno davanje:
-baklofen i akamprosat,
-baklofen i akamprosat i dietilkarbamazin,
-baklofen i akamprosat i cinakalcet,
1
-baklofen i akamprosat i sulfisoksazol,
-baklofen i akamprosat i torasemid,
-baklofen i akamprosat i ifenprodil,
-baklofen i akamprosat i meksiletin,
-baklofen i akamprosat i eplerenon,
-baklofen i akamprosat i levozimendan,
-baklofen i akamprosat i terbinafin, ili
-baklofen i akamprosat i leflunomid.
[0047] Kao što je obelodanjeno u eksperimentalnom delu, kombinatorne terapije ovog pronalaska obezbeđuju znatan terapeutski i biološki efekat kako bi se poboljšala Alchajmerova bolest ili srodni poremećaji kod humanih subjekata. Oni izazivaju snažan neuroprotektivan efekat protiv Aβ toksičnosti i daju pozitivne rezultate u bihejvioralnim performansama i biohemijskim testovima in vivo. Rezultati pokazuju da kompozicije pronalaska i) efikasno ispravljaju molekularne puteve izazvane, in vivo, od strane Aβ agregata i ii) dovode do poboljšanja neurofizioloških oštećenja primećenih kod obolelih životinja kao što su preživljavanje neurona ili integritet sinapse.
[0048] Šta više, predstavljeni rezultati takođe pokazuju da navedene kombinacije terapija imaju važan sinergističan neurozaštitni efekat protiv glutamatne ekscitotoksičnosti (FIG.15) putanje koja je implicirana u različitim neurološkim bolestima kao AD, MS, PD, ALS, HD, neuropatije (na primer neuropatski bol ili alkoholna neuropatija), alkoholizam ili ostavljanje alkohola, ili povreda kičmene moždine. Ove terapije daju pozitivne rezultate u in vivo ili in vitro modelima ovih bolesti.
[0049] Pored toga, in vivo rezultati pokazuju da kompozicije pronalaska efikasno obnavljaju integritet moždane krvne barijere i sprečavaju, usporavaju, ili umanjuju aktivaciju apoptoze, za koje se zna da slabe u nekoliko neuroloških bolesti.
[0050] Pored toga, posebno visoka sinergetska interakcija primećena za ova dva leka omogućava upotrebu koncentracija supstanci koje ne pokazuju efekat kada su upotrebljene u tretmanu pojedinačnom supstancom. Štaviše, kao što je prikazano u eksperimentalnom delu, kombinacija baklofena i akamprosata izaziva poboljšanu terapeutsku korist na Alchajmerovu bolesti u odnosu na druge terapeutske kombinacije. Ove kompozicije efikasno sprečavaju toksične efekte amiloidnog β proteina ili peptida na humanim ćelijama i u in vivo modelu i predstavljaju nove i potentne metode za tretiranje takvih poremećaja. Ovde je takođe opisana kompozicija kao što je gore definisana za tretiranje neurološkog poremećaja kao što je Alchajmerova bolest (AD), AD povezani poremećaji, MS,
1
PD, ALS, HD, neuropatije (na primer, alkoholna neuropatija ili neuropatski bol), alkoholizam ili ostavljanje alkohola, ili povreda kičmene moždine.
[0051] Kao što je navedeno ranije, u kombinovanoj terapiji ovog pronalaska, jedinjenja ili lekovi mogu biti formulisana zajedno ili odvojeno, i mogu se davati zajedno, odvojeno ili sekvencijalno. Ovaj pronalazak takođe opisuje upotrebu kompozicije kao što je prethodno definisano za proizvodnju leka za tretiranje neurološkog poremećaja kao što je Alchajmerova bolest (AD), AD povezani poremećaji, MS, PD, ALS, HD, neuropatije (na primer, neuropatski bol ili alkoholna neuropatija), alkoholizam ili ostavljanje alkohola, ili povreda kičmene moždine. Ovde je takođe opisan postupak za tretiranje neurološkog poremećaja kao što je Alchajmerova bolest (AD), AD povezani poremećaji, MS, PD, ALS, HD, neuropatije (na primer, neuropatski bol ili alkoholna neuropatija), alkoholizam ili ostavljanje alkohola, ili povreda kičmene moždine, koji obuhvata davanje subjektu kome je to potrebno efikasne količine kompozicije kako je prethodno opisana. Ovde je takođe opisano tretiranje neurološkog poremećaja kao što je Alchajmerova bolest (AD), AD povezani poremećaji, MS, PD, ALS, HD, neuropatije (na primer, neuropatski bol ili alkoholna neuropatija), alkoholizam ili ostavljanje alkohola, ili povreda kičmene moždine, pri čemu postupak obuhvata istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno davanje subjektu kome je to potrebno efikasne količine kompozicije kako je prethodno opisana.
[0052] Ovaj pronalazak takođe opisuje postupak tretiranja neurološkog poremećaja kao što je Alchajmerova bolest (AD), AD povezani poremećaji, MS, PD, ALS, HD, neuropatije (na primer, neuropatski bol ili alkoholna neuropatija), alkoholizam ili ostavljanje alkohola, ili povreda kičmene moždine kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno davanje subjektu efikasne količine baklofena i akamprosata.
[0053] Kompozicije prema ovom pronalasku obično sadrže jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenata. Takođe, za upotrebu u predmetnom pronalasku, supstance ili jedinjenja obično se mešaju sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentima ili nosačima.
[0054] U tom smislu, ovde je opisan postupak za pripremanje farmaceutske kompozicije, pri čemu postupak obuhvata mešanje navedenih jedinjenja u odgovarajućem ekscipijentu ili nosaču.
[0055] Na primer, opisan je postupak koji obuhvata mešanje baklofena i akamprosata u odgovarajućem ekscipijentu ili nosaču.
1
[0056] Prema poželjnim ostvarenjima ovog pronalaska, kao što je prethodno navedeno, jedinjenja se koriste kao takva ili u obliku njihove farmaceutski prihvatljive soli.
[0057] Iako veoma efikasan in vitro i in vivo, u zavisnosti od subjekta ili specifičnog stanja, kombinacija prema ovom pronalasku može dalje da se koristi u vezi ili udruženo ili u kombinaciji sa dodatnim lekovima ili tretmanima korisnim u tretiranju neurološkog stanja kod subjekata.
[0058] Druge terapije opisane u konjukciji sa supstancom(ama) ili kombinacijom(ama) supstance(ci) u skladu sa ovim pronalaskom, mogu da sadrže jednu ili više supstanci koja(e) poboljšava(ju) simptome Alchajmerove bolesti, AD povezanog poremećaja, MS, PD, ALS, HD, neuropatija (na primer, neuropatski bol ili alkoholna neuropatija), alkoholizma ili ostavljanja alkohola, ili povrede kičmene moždine, ili supstance(a) koja(e) se može(mogu) koristiti za palijativno tretiranje ovih poremećaja. Na primer, rezultati takođe pokazuju da navedene kombinacione terapije imaju važno sinergetsko neurozaštitno dejstvo kada se kombinuju sa donepezilom (FIG.16). Pri tome, ilustrativne terapije koje mogu da se koriste sa kombinacijama ovog pronalaska su donepezil (CAS: 120014-06-4), gabapentin (CAS: 478296-72-9; 60142-96-3), rivastigmin (123441-03-2) ili memantin (CAS: 19982-08-2).
[0059] U tom smislu, u posebnom ostvarenju, supstanca(e) ili kompozicije prema ovom pronalasku mogu se dalje kombinovati sa Ginkgo Biloba ekstraktima. Pogodni ekstrakti uključuju, bez ograničenja, Ginkgo biloba ekstrakte, poboljšane Ginkgo biloba ekstrakte (na primer obogaćene aktivnim sastojcima ili sa umanjenim zagađivačima) ili bilo koja supstanca koja sadrži Ginkgo biloba ekstrakte.
[0060] Terapija se može obezbediti u kući, lekarskoj ordinaciji, klinici, bolničkoj ambulanti, ili bolnici, tako da lekar može pomno da posmatra efekte terapije i obavi bilo koja podešavanja koja su potrebna.
[0061] Trajanje terapije zavisi od faze bolesti koja se tretira, starosti i stanja pacijenta, i kako pacijent reaguje na tretman. Doziranje, učestalost i način davanja svake komponente kombinacije može da se kontroliše nezavisno. Na primer, jedan lek može da se primenjuje oralno, dok drugi lek može da primenjuje intramuskularno. Kombinovana terapija može da se daje u on-i-off ciklusima koji uključuju pauze za odmor, tako da telo pacijenta ima šansu oporavka od bilo kog od sada nepredviđenih sporednih efekata. Lekovi mogu takođe biti formulisani zajedno tako da jedno davanje pruža sve lekove.
2
[0062] Administracija svakog leka kombinacije može biti bilo koji pogodan način koji rezultira u koncentraciji leka koji je, u kombinaciji sa drugom komponentom, u stanju da ublaži stanje pacijenta ili efikasno tretira bolest ili poremećaj.
[0063] Iako je moguće da se lekovi kombinacije ordiniraju kao čista hemikalija poželjno je da se uvedu kao farmaceutska kompozicija, takođe u ovom kontekstu kao farmaceutska formulacija. Moguće kompozicije obuhvataju one koje su pogodne za oralnu, rektalnu, topikalnu (uključujući transdermalnu, bukalnu i sublingvalnu), ili parenteralnu (uključujući subkutanu, intramuskularnu, intravenoznu i intradermalnu) primenu.
[0064] Najčešće se ove farmaceutske formulacije pripisuju pacijentu u "pacijent pakovanjima” koja sadrže određeni broj jedinica za doziranje ili druga sredstva za administraciju odmerenih jediničnih doza za upotrebu tokom posebnog perioda tretiranja u jednom pakovanju, obično blister pakovanju. Pacijent pakovanja imaju prednost u odnosu na tradicionalne recepte, gde apotekar deli sledovanje pacijenta farmaceutika od većeg dela sledovanja, gde pacijent uvek ima pristup pakovanju sadržanom u pacijent pakovanju, što obično nedostaje u tradicionalnim receptima. Uključivanje pakovanja pokazalo je da se poboljšava usaglašenost pacijenta sa uputstvima lekara. Prema tome, ovaj pronalazak dalje obuhvata farmaceutsku formulaciju, kao što je ovde ranije opisano, u kombinaciji sa materijalom za pakovanje pogodnim za pomenute formulacije. Na taj način, pacijent pakovanje namenjeno za upotrebu formulacije za kombinovano tretiranje može se zaključiti instrukcijama, objektima, odredbama, adaptacijama i/ili drugim sredstvima za pomoć upotrebom formulacije koja je najpogodnija za tretiranje. Takve mere čine pacijent pakovanje posebno pogodnim i prilagođenim za upotrebu za tretiranje sa kombinacijom ovog pronalaska.
[0065] Lek može biti sadržan, u bilo kojoj odgovarajućoj količini, u bilo kojem odgovarajućem nosaču supstance. Lek može biti prisutan u količini do 99mas.% od ukupne mase kompozicije. Kompozicija može biti obezbeđena u doznom obliku koji je pogodan za oralnu, parenteralnu (npr., intravensku, intramuskularnu), rektalnu, nazalnu, vaginalnu, inhalantu, kožnu(flaster), ili okularnu putanju davanja. Stoga, kompozicija može biti u obliku, na primer, tableta, kapsula, pilula, praškova, granulata, suspenzija, emulzija, rastvora, gelova uključujući hidrogelove, pasti, masti, krema, flastera, drenaža, uređaja za osmotsku isporuku, supozitorija, klistira, injekcija, implanata, sprejeva, ili aerosoli.
[0066] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane u skladu sa konvencionalnom farmaceutskom praksom (videti, npr., Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York).
[0067] Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku mogu biti formulisane tako da oslobođaju aktivnu supstancu suštinski odmah posle primene ili u bilo koje prethodno određeno vreme ili vremenski period posle administracije.
[0068] Formulacije sa kontrolisanim otpuštanjem obuhvataju (i) formulacije koje stvaraju suštinski konstantnu koncentraciju supstance u telu tokom dužeg vremenskog perioda; (ii) formulacije koje posle unapred određenog vremena usporavanja stvaraju suštinski konstantnu koncentraciju supstance u telu tokom dužeg vremenskog perioda; (iii) formulacije koje produžavaju delovanja supstance tokom unapred određenog vremenskog perioda održavajući relativno, konstantan, efektivan nivo supstance u telu sa pratećim minimiziranjem neželjenih sporednih efekata povezanih sa fluktuacijom u plazmatičnom nivou aktivne supstance; (iv) formulacije koje lokalizuju delovanja supstance, npr, prostornim postavljanjem kontrolisanog oslobađanja kompozicije susedno ili u obolelom tkivu ili organu; i (v) formulacije koje ciljaju delovanje supstance pomoću nosača ili hemijskih derivata pomoću kojih se supstanca isporučuje na ciljani određeni tip ćelija.
[0069] Administracija lekova u obliku formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem naročito je poželjna u slučajevima u kojima lek ima (i) uski terapeutski indeks (tj., razlika između koncentracije u plazmi koja dovodi do štetnih sporednih efekata ili toksičnih reakcija i koncentracije u plazmi koja vodi do terapeutskog efekta je mala; generalno, terapeutski indeks, TI, definiše se kao odnos srednje letalne doze (LD50) prema srednjoj efektivnoj dozi (ED50)); (ii) uzak apsorpcioni prozor u gastro-intestinalnom traktu; ili (iii) veoma kratak biološki poluživot tako da je potrebno često doziranje u toku dana u cilju održavanja nivoa u plazmi na terapeutskom nivou.
[0070] Bilo koji od brojnih strategija može se nastaviti u cilju dobijanja kontrolisanog oslobađanja gde stopa oslobađanja nadmašuje stopu metabolizma leka o kojem se radi. Kontrolisano oslobađanje može se dobiti odgovarajućom selekcijom različitih parametara formulacije i sastojaka, uključujući, npr., razne vrste kompozicija i omotača sa kontrolisanim oslobađanjem. Dakle, lek je formulisan sa odgovarajućim ekscipijentima u farmaceutskoj kompoziciji koja, nakon davanja, oslobađa lek na kontrolisan način (jedno ili višejedinične tabletne ili kapsulaste kompozicije, uljani rastvori, suspenzije, emulzije, mikrokapsule, mikrosfere, nanočestice, flasteri, i lipozomi).
Čvrsti dozni oblici za oralnu primenu
[0071] Formulacije za oralnu upotrebu uključuju tablete koje sadrže kompoziciju prema ovom pronalasku u smeši sa netoksičnim farmaceutski prihvatljivim ekscipijentima. Ovi ekscipijenti mogu biti, na primer, inertni razblaživači ili punioci (npr., saharoza, mikrokristalna celuloza, skrobovi uključujući krompirov skrob, kalcijum karbonat, natrijum hlorid, kalcijum fosfat, kalcijum sulfat, ili natrijum fosfat); granulacioni i dezintegracioni agensi (npr., celulozni derivati koji uključuju mikrokristalnu celulozu, skrobovi uključujući krompirov skrob, kroskarmeloza natrijum, alginate, ili alginsku kiselinu); sredstva za vezivanje(npr., akacija, alginska kiselina, natrijum alginat, želatin, skrob, preželatinizovani skrob, mikrokristalna celuloza, natrijum karboksimetilceluloza, metilceluloza, hidroksipropil metilceluloza, etilceluloza, polivinilpirolidon, ili polietilen glikol); i lubrikanti, sredstva za kliženje, i antiadhezivi (npr., stearinska kiselina, silicijumi, ili talk). Drugi farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti mogu biti boje, sredstva za poboljšanje ukusa, plastifikatori, ovlaživači, sredstva za puferovanje, i slično.
[0072] Tablete mogu biti neobložene ili mogu biti obložene poznatim tehnikama, opciono kako bi se odložila dezintegracija i apsorpcija u gastrointestinalnom traktu i na taj način obezbedilo produženo dejstvo tokom dužeg perioda. Omotač se može prilagoditi tako da oslobodi aktivnu lekovitu supstancu u prethodno određenom obrascu (npr., u cilju da se postigne kontrolisano oslobađanje formulacije), ili se može prilagoditi da ne oslobodi aktivnu lekovitu supstancu do posle prolaska želuca (enterično oblaganje). Omotač može biti šećerni omotač, oblaganje filmom (npr., na bazi hidroksipropil metilceluloze, metilceluloza, metil hidroksietilceluloza, hidroksipropilceluloza, karboksimetilceluloza, akrilatni kopolimeri, polietilen glikoli i/ili polivinilpirolidon), ili enterični omotač (npr., na bazi kopolimera metakrilne kiseline, ftalat celuloznog acetata, ftalat hidroksipropil metilceluloze , sukcinat hidroksipropil metilceluloznog acetata, ftalat polivinil acetata, šelak, i/ili etilceluloza). Može da se koristi materijal za odlaganje vremena kao što je, na primer, gliceril monostearat ili gliceril distearat.
[0073] Čvste tabletaste kompozicije mogu da sadrže omotač prilagođen da zaštiti kompoziciju od neželjenih hemijskih promena (na primer, hemijska degradacija pre oslobađanja aktivne supstance leka). Omotač može da se primeni na čvrstom doznom obliku na sličan način kao što je opisano u Encyclopedia of Pharmaceutical Technology.
[0074] Lekovi mogu da se umešaju zajedno u tabletu, ili mogu biti podeljeni. Na primer, prvi lek se nalazi na unutrašnjoj strani tablete, a drugi lek je na spoljnoj, tako da se znatan deo drugog leka oslobađa pre oslobađanja prvog leka.
[0075] Formulacije za oralnu upotrebu takođe mogu biti predstavljene kao tablete za žvakanje, ili kao tvrde želatinske kapsule u kojima je aktivni sastojak pomešan sa inertnim čvrstim razblaživačem (npr.,
2
krompirov skrob, mikrokristalna celuloza, kalcijum karbonat, kalcijum fosfat ili kaolin), ili kao meke želatinaste kapsule u kojima je aktivni sastojak pomešan sa vodom ili uljanim medijumom, na primer, tečni parafin, ili maslinovo ulje. Praškovi i granule mogu biti pripremljeni korišćenjem sastojaka pomenutih gore pod tabletama i kapsulama na uobičajeni način.
[0076] Kompozicije sa kontrolisanim otpuštanjem za oralnu upotrebu mogu, na primer, biti konstruisane tako da oslobađaju aktivni lek kontrolisanjem rastvaranja i/ili difuzije aktivne supstance leka.
[0077] Kontrolisano oslobađanje rastvaranja ili difuzije može se postići odgovarajućim oblaganjem tableta, kapsula, peleta, ili granulacionih formulacija lekova, ili a uključivanjem leka u odgovarajuću matricu. Prevlaka sa kontrolisanim oslobađanjem može da sadrži jednu ili više od gore navedenih supstanci za oblaganje i/ili, na primer, šelak, pčelinji vosak, glikovosak, ricinusov vosak, karnauba vosak, stearil alkohol, gliceril monostearat, gliceril distearat, glicerol palmitostearat, etilcelulozu, akrilne smole, dl-polimlečnu kiselinu, acetat butirat celulozu, polivinil hlorid, polivinil acetat, vinil pirolidon, polietilen, polimetakrilat, metilmetakrilat, 2-hidrokimethacrilat, metakrilat hidrogelove, 1,3 butilen glikol, etilen glikol metakrilat, i/ili polietilen glikole. U matričnim formulacijama sa kontrolisanim oslobađanjem, materijal matrice može da sadrži, na primer, hidratisovanu metilcellulozu, karnauba vosak i stearil alkohol, karbopol 934, silikon, gliceril tristearat, metil akrilatni-metil metakrilat, polivinil hlorid, polietilen, i/ili halogenovani fluorougljenik.
[0078] Kompozicija sa kontrolisanim oslobađanjem koja sadrži jedan ili više lekova predmetnih kombinacija takođe može biti u obliku plutajuće tablete ili kapsule (tj., tableta ili kapsula koja, nakon oralne administracije, pluta na vrhu želudačnog sadržaja tokom određenog perioda). Plutajuća tabletasta formulacija leka(ova) može da se pripremi granulacijom smeše leka(ova) sa ekscipijentima i 20-75mas. % hidrokoloida, kao što su hidroksietilceluloza, hidroksipropilceluloza, ili hidroksipropilmetilceluloza. Dobijene granule se zatim kompresuju u tablete. U kontaktu sa želudačnim sokom, tableta formira suštinski vodo-nepropustnu gel barijeru oko svojoj površine. Ova gel barijera učestvuje u održavanju gustine manje od postojeće, čime se omogućava da tableta pluta u želudačnom soku.
Tečnosti za oralnu primenu
[0079] Praškovi, disperzibilni praškovi ili granule pogodne za pripremanje vodene suspenzije dodavanjem vode su pogodnu dozni oblici za oralnu primenu. Formulacija kao suspenzija obezbeđuje aktivni sastojak u smeši sa sredstvom za dispergovanje ili kvašenje, agensom za suspendovanje i jednim ili više konzervansa. Pogodna suspenzijska sredstva su, na primer, natrijum-karboksimetilceluloza, metilceluloza, natrijum alginat, i slično.
Parenteralne kompozicije
[0080] Farmaceutska kompozicija se može takođe ordinirati parenteralno injekcijom, infuzijom ili implantacijom (intravenski, intramuskularno, subkutano, ili slično) u doznim oblicima, formulacijama, ili preko odgovarajućih uređaja isporuke ili implantata koji sadrže konvencionalne netoksične, farmaceutski prihvatljive nosače i adjuvanse. Formulacija i dobijanje takvih kompozicija dobro su poznati stručnjacima iz oblasti farmaceutske formulacije.
[0081] Kompozicije za parenteralnu primenu mogu biti obezbeđene u jediničnim doznim oblicima (npr. u jedno doznim ampulama), ili u bočicama koje sadrže nekoliko doza i u kojima može biti dodat pogodan konzervans (vidi dole). Kompozicija može da bude u obliku rastvora, suspenzije, emulzije, infuzionog uređaja, ili uređaj za isporuku za implantaciju ili može biti predstavljen kao suvi prašak koji se rekonstituiše sa vodom ili drugim pogodnim nosačem pre upotrebe. Pored aktivnog(ih) leka(ova), kompozicija može da sadrži pogodne parenteralno prihvatljive nosače i/ili ekscipijente. Aktivni lek(ovi) može biti ugrađen u mikrosfere, mikrokapsule, nanočestice, lipozome, ili slično za kontrolisano oslobađanje. Kompozicija može sadržati agense za suspendovanje, solubilizaciju, stabilizaciju, pH-podešavanje, i/ili dispergovanje.
[0082] Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku mogu biti u formi pogodnoj za sterilnu injekciju. Kako bi se pripremila takva kompozicija, pogodni aktivni lek(ovi) rastvara se ili suspenduje u parenteralno prihvatljivom tečnom nosaču. Među prihvatljivim nosačima i rastvaračima koji se mogu koristiti nalaze se voda, voda prilagođena na pogodnu pH dodavanjem odgovarajuće količine hlorovodonične kiseline, natrijum hidroksid ili pogodan pufer, 1,3-butandiol, Ringerov rastvor, i izotonični rastvor natrijum hlorida. Vodena formulacija može takođe da sadrži jedan ili više konzervanasa (npr., metil, etil ili n-propil p -hidroksibenzoat). U slučajevima gde je jedan od lekova samo slabo ili malo rastvorljiv u vodi, mogu se dodati pojačivač rastvaranja ili sredstvo za rastvaranje, ili rastvarač može da sadrži 10-60mas.% propilen glikola ili slično.
[0083] Parenteralne kompozicije sa kontrolisanim otpuštanjem mogu biti u obliku vodenih suspenzija, mikrosfera, mikrokapsula, magnetnih mikrosfera, uljanih rastvora, uljanih suspenzija ili emulzija.
Alternativno, aktivni lek(ovi) može se ugraditi u biokompatibilne nosače, lipozome, nanočestice,
2
implante, ili infuzione uređaje. Materijali za upotrebu u pripremi mikrosfera i/ili mikrokapsula su, npr., biorazgradivi/bioerodibilni polimeri kao što su poligalaktin, poli-(izobutil cijanoakrilat), poli(2-hidroksietil-L-glutamnin). Biokompatibilni nosači koji se mogu koristiti prilikom formulisanja parenteralne formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem su ugljeni hidrati (npr., dekstrani), proteini (npr., albumin), lipoproteini, ili antitela. Materijali za upotrebu u implantima mogu biti nebiorazgradivi (npr., polidimetil siloksan) ili biorazgradivi (npr., poli(kaprolakton), poli(glikolna kiselina) ili poli(orto estri)).
Alternativni putevi
[0084] Iako su manje poželjni i manje pogodni, drugi putevi administracije, i stoga druge formulacije, mogu biti uzeti u razmatranje. U tom smislu, za rektalnu primenu, pogodni dozni oblici za kompoziciju obuhvataju supozitorije (emulzionog ili suspenzionog tipa) i rektalne želatinske kapsule (rastvori ili suspenzije). U tipičnoj formulaciji supozitorije, aktivni lek(ovi) kombinuje se sa odgovarajućom farmaceutski prihvatljivom supozitornom bazom, kao što je kakao puter, esterifikovane masne kiseline, glicerinovani želatin, i razne u vodi rastvorljive ili disperzibilne baze kao polietilen glikoli. Mogu biti uklkučeni razni aditivi, pojačivači, ili surfaktanti.
[0085] Farmaceutske kompozicije mogu se takođe ordinirati topikalno na kožu radi perkutane apsorpcije u doznim oblicima ili formulacijama koje sadrže konvencionalne netoksične farmaceutski prihvatljive nosače i ekscipijente, uključujući mikrosfere i lipozome. Formulacije uključuju kreme, masti, losione, tečne masti, gelove, hidrogelove, rastvore, suspenzije, štapiće, sprejeve, paste, flastere, i druge vrste transdermalnih sistema isporuke leka. Farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijenti mogu da obuhvataju emulgatore, antioksidanse, sredstva za puferovanje, konzervanse, ovlaživače, pojačivače penetracije, sredstva za helatiranje, gel-formirajuće agense, masne baze, parfeme, i agense za zaštitu kože.
[0086] Konzervansi, humektanti, pojačivači penetracije mogu biti parabeni, kao što su metil ili propil phidroksibenzoat, i benzalkonijum hlorid, glicerin, propilen glikol, urea, itd.
[0087] Farmaceutske kompozicije prethodno opisane za topikalnu primenu na koži takođe se mogu koristiti u vezi sa topikalnom primenu na ili blizu dela tela koji treba da se tretira. Kompozicije mogu biti prilagođene za direktnu primenu ili za primenu putem posebnih uređaja za isporuku leka kao što su zavoji ili alternativno plasteri, jastučići, sunđeri, trake, ili drugi oblici pogodnog fleksibilnog materijala.
2
Doze i trajanje tretmana
[0088] Podrazumeva se da se lekovi kombinacije mogu primenjivati istovremeno, bilo u istoj ili različitoj farmaceutskoj formulaciji ili sekvencijalno. Ako postoji sekvencijalna primena, kašnjenje u primeni drugog (ili dodatnog) aktivnog sastojka ne treba da bude takvo da se izgubi korist delotvornog efekta kombinacije aktivnih sastojaka. Minimalni zahtev za kombinaciju prema ovom opisu je da kombinacija treba da bude namenjena za kombinovanu upotrebu sa delotvornim efikasnim efektom kombinacije aktivnih sastojaka. Namena kombinacije može da se zaključi od strane objekta, odredbe, adaptacije i/ili drugim sredstvima za pomoć za korišćenje kombinacije prema ovom pronalasku.
[0089] Terapeutski efektivne količine lekova u kombinaciji ovog pronalaska uključuju, na primer, količine koje su efikasne za smanjenje simptoma Alchajmerove bolesti, zaustavljanje ili usporavanje napredovanja bolesti kada je počela da se klinički manifestuje, ili prevenciju ili smanjenje rizika od razvoja bolest.
[0090] Iako se aktivni lekovi iz ovog pronalaska mogu ordinirati u podeljenim dozama, na primer, dva ili tri puta dnevno, jedna dnevna doza svakog leka u kombinaciji je poželjna, sa jednom dnevnom dozom svih lekova u jednoj farmaceutskoj kompoziciji (jedinični dozni oblik) koja je najpoželjnija.
[0091] Davanje može biti jedno do nekoliko puta dnevno za nekoliko dana do nekoliko godina, i može čak biti za život pacijenta. Hronična ili bar periodično ponavljana dugoročna primena indikovana je u većini slučajeva.
[0092] Termin ”jedinični dozni oblik” odnosi se na fizički odvojene jedinice (kao što su kapsule, tablete, ili napunjeni cilindri šprica) pogodne kao pojedinačne doze za humane subjekte, gde svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog materijala ili materijala izračunatog da proizvede željeni terapeutski efekat, u asocijaciji sa potrebnim farmaceutskim nosačem.
[0093] Količina svakog leka u poželjnoj jediničnoj doznoj kompoziciji zavisi od nekoliko faktora uključujući metod administracije, telesnu težinu i starost pacijenta, fazu bolesti, rizik potencijalnih neželjenih efekata uzimajući u obzir opšte zdravstveno stanje osobe koja treba da se tretira. Pored toga, farmakogenomična (efekat genotipa na farmakokinetiku, farmakodinamiku ili profil efikasnosti terapeutika), informacije o određenom pacijentu može da utiče na upotrebljenu dozu.
[0094] Osim kada reaguje na posebno ugrožene slučajeve, gde mogu biti potrebne veće doze, poželjna
2
doza svakog leka u kombinaciji obično se nalazi u opsegu doza ne iznad obično propisanih doza za dugoročno održavanje tretmana ili dokazano da budu bezbedni u faza 3 kliničkim ispitivanjima.
[0095] Jedna izuzetna prednost ovog pronalaska je da svako jedinjenje može da se koristi na niskim dozama u kombinovanoj terapiji, dok je za proizvodnju, u kombinaciji, značajno klinički korisno za pacijenta. Kombinovana terapija može zaista biti efikasna u dozama gde jedinjenja pojedinačno imaju nizak ili nikakav efekat. Shodno tome, posebna prednost ovog pronalaska leži u sposobnosti upotrebe pod-optimalnih doza svakog jedinjenja, odnosno, doza koje su niže od obično propisanih terapijskih doza, poželjno 1/2 terapijskih doza, poželjnije 1/3, 1/4, 1/5, ili čak poželjnije 1/10 terapeutskih doza. U određenim primerima, upotrebljene su niske doze poput 1/20, 1/ 30, 1/50, 1/100, ili čak i niže, terapeutskih doza.
[0096] Sa takvim pod-terapeutskim dozama, jedinjenja ne bi pokazivala nikakav sporedni efekat, dok je kombinacija(e) prema ovom pronalasku u potpunosti efikasna u tretiranju Alchajmerove bolesti.
[0097] Poželjna doza odgovara količini od 1 % do 50% onih koje su obično propisane za dugoročno održavanje tretmana.
[0098] Najpoželjnija doza može da odgovara količinama od 1 % do 10 % onih koje su obično propisane za dugoročno održavanje tretmana.
[0099] Specifični primeri doza lekova za upotrebu u pronalasku dati su u daljem tekstu:
- Akamprosat između 1 i 1000 mg/dan, poželjno manje od 400 mg dnevno, još poželjnije manje od 200 mg/dan, još poželjnije manje od 50 mg/dan, gde su ovakve doze naročito pogodne za oralnu primenu.
- Baklofen između 0,01 do 150 mg dnevno, poželjno manje od 100 mg dnevno, poželjnije manje od 50 mg/dan, još poželjnije manje od 25 mg/dan, gde su ovakve doze naročito pogodne za oralnu primenu.
- Aminokapronska kiselina oralno od oko 0,1 g do 2,4 g dnevno,
- Bromokriptin oralno od oko 0,01 do 10 mg dnevno,
- Dietilkarbamazin oralno od oko 0,6 do 600 mg dnevno,
- Kabergolin oralno od oko 1 do 10 µg dnevno,
2
- Cinakalcet oralno od oko 0,3 do 36 mg dnevno,
- Cinarizin oralno od oko 0,6 do 23 mg dnevno,
- Difilin oralno od oko 9 do 320 mg dnevno,
- Eplerenon oralno od oko 0,25 do 10 mg dnevno,
- Ifenprodil oralno od oko 0,4 do 6 mg dnevno,
- Leflunomid oralno od oko 0,1 do 10 mg dnevno,
- Levozimendan oralno od oko 0,04 do 0,8 mg dnevno,
- Meksiletin oralno od oko 6 do 120 mg dnevno,
- Moksifloksacin oralno od oko 4 do 40 mg dnevno,
- Fenformin oralno od oko 0,25 do 15 mg dnevno,
- Kvinakrin oralno od oko 1 do 30 mg dnevno,
- Sulfisoksazol oralno od oko 20 do 800 mg dnevno,
- Sulodeksid oralno od oko 0,05 do 40 mg dnevno,
- Terbinafin oralno od oko 2,5 do 25 mg dnevno,
- Torasemid oralno od oko 0,05 do 4 mg dnevno,
- Trimetazidin oralno od oko 0,4 do 6 mg dnevno,
- Zonisamid oralno od oko 0,5 do 50 mg dnevno.
[0100] Kada kompozicija sadrži, kao aktivni sastojak, samo baklofen i akamprosat, ova dva jedinjenja se mogu koristiti u različitim odnosima, npr, u masenom odnosu akamprosat/baklofen koji obuhvata od 0,05 do 1000 (W:W), poželjno između 0,05 do 100 (W:W), poželjnije od 0,05 do 50 (W: W).
[0101] Biće jasno da količinu leka koja se zapravo daje određuje lekar, u svetlu relevantnih okolnosti, uključujući stanje ili stanja koja se tretiraju, tačan sastav koji se primenjuje, starost, težinu, i odgovor
2
pojedinačnog pacijenta, ozbiljnost simptoma kod pacijenta, i odabranog načina primene. Dakle, gore navedeni opsezi doza treba da obezbede opšte smernice i podršku za učenja, ali bez namere da ograniče obim ovog pronalaska.
[0102] Sledeći primeri dati su u cilju ilustracije, a ne kao ograničenje.
PRIMERI
[0103] Nega i uzgajanje životinja, kao i izvođenje eksperimenata obavlja se u skladu sa smernicama Komiteta za istraživanje i etička pitanja I.A.S.P. (1983).
A) TRETMAN BOLESTI POVEZANIH SA Aβ TOKSIČNOSTI
[0104] U ovoj seriji eksperimenata, kombinacije kandidata testirane su na njihovu sposobnost sprečavanja ili smanjivanja toksičnih efekata humanog Aβ1-42. Aβ1-42je puna dužina peptida koji predstavlja agregate pronađene u biopsijama uzetih od humanih pacijenata koji pate od AD. Efekat je određen na različitim tipovima ćelija, kako bi se dodatno dokumentovala aktivnost kombinacija u in vitro modelima koji ilustruju različite fiziološke funkcije AD-a. In vivo studije izvedene su takođe u mišjem modelu za AD potvrđujući ovaj zaštitni efekat procenom efekta kombinacija na i) kognitivne performanse životinja i ii) na molekularna obeležja (indukcija apoptoze, indukcije oksidativnog stresa, indukcija zapaljenjskog puta) AD-a.
I. BAKLOFEN - AKAMPROSAT KOMBINOVANE TERAPIJE SPREČAVAJU TOKSIČNOST HUMANOG Aβ1-42IN VITRO
I.1 Efekat na toksičnost humanog Aβ1-42peptida na ljudske HBME ćelije.
[0105] Ljudske moždane mikrovaskularne endotelne ćelijske kulture korišćene su za proučavanje zaštite koju omogućava(ju) kandidat jedinjenje(a) na Aβ1-42toksičnost.
Ljudske moždane mikrovaskularne endotelne celebralne ćelije (HBMEC, ScienCell Ref: 1000, zamrznute u prolazu 10) brzo su otopljene u vodenom kupatilu na 37 °C. Supernatant je odmah stavljen u 9 ml Dulbecco-ovog modifikovanog Eagle-ov medijuma (DMEM; Pan Biotech ref: P04-03600) koji sadrži 10 % fetalnog telećeg seruma (FCS; GIBCO ref 10270-106). Ćelijska suspenzija je centrifugovana na 180 x g tokom 10 min na 4 °C, a peleti su suspendovani u CSC medijumu bez seruma (CSC bez seruma, Ćelijski sistem, Ref: SF-4Z0-500-R, Serija 51407-4) sa 1,6% RocketFuel-a bez seruma (Ćelijski sistem, Ref: SF-4Z0-500-R, Serija 54102), 2% penicilina 10.000 U/ml i streptomicina 10mg/ml (PS ; Pan Biotech ref: P06-07100 serija 133080808) i zasejani na gustini od 20000 ćelija po komori u pločama sa po 96 komore (angiogeneza sistema sa matrigelnim slojem bioprevlake, BD, Ref 354150, Serija A8662) u finalnoj zapremini od 100µl. Na matrigelnoj podlozi, endotelne celebralne ćelije spontano su započele proces morfogeneze kapilarne mreže (33).
Tri odvojene kulture izvedene su po stanju, 6 komora po stanju.
Test jedinjenja i tretiranje humanog amiloidnog -β1-42
[0106] Ukratko, Aβ1-42peptid (Bachem, ref: H1368 serija 1010533) rekonstituisan je u definisanom medijumu kulture u 20μM (matični rastvor) i lagano mućkan na 37 °C tokom 3 dana u mraku. Kontrolni medijum je pripremljen u istim uslovima.
Posle 3 dana, humani amiloid peptid je korišćen na HBMEC na 2,5μM rastvoren u kontrolnom medijumu (optimalno vreme inkubacije). Aβ1-42peptid je dodat 2 sata posle zasejavanja HBMEC na matrigelu tokom 18 časova inkubacije.
Jedan sat nakon HBMEC zasejavanja na matrigelu, test jedinjenja i VEGF-165 rastvoreni su u medijumu kulture (+ 0,1 % DMSO), a zatim pre-inkubisani sa HBMEC tokom 1 sata pre Aβ1-42aplikacije (u konačnoj zapremini po komorici kulture 100μl). Jedan sat nakon inkubacije test jedinjenja ili VEGF (dva sata posle zasejavanja ćelija na matrigelu), 100µl Aβ1-42peptida je dodato do finalne koncentracije od 2,5μM razblažene u kontrolnoj podlozi u prisustvu test jedinjenja ili VEGF (u 200 μl ukupne zapremine/komora), kako bi se izbegla dalja razblaženja lekova.
Organizacija ploča sa kulturama
[0107] VEGF-165 koji je poznat kao pro-angiogeni izooblik VEGF-A, korišćen je za sve eksperimente u ovom ispitivanju kao referentno jedinjenje. VEGF-165 je jedan od najbogatijih VEGF izooblika uključenog u angiogenezu. VEGF je korišćen kao referentno test jedinjenje na 10nM (FIG.1).
Ocenjeni su sledeći uslovi:
• Negativna kontrola: srednja sama 0,1 % DMSO
Intoksikacija: amiloidni-β1-42(2,5µM) tokom 18h
• Pozitivna kontrola: VEGF-165 (10nM) (1 referentno jedinjenje/kultura) 1h pre Aβ1-42(2,5 µM) dodavanja tokom 18h inkubacionog vremena.
• Test jedinjenja: Test jedinjenje(a) 1h pre Aβ1-42(2,5 µM) dodavanja tokom 18h inkubacionog vremena.
Kvantifikacija kapilarne mreže
1
[0108] Po komori, uzete su 2 slike sa 4x sočivom, upotrebom InCell AnalyzerTM 1000 uređaja (GE Healthcare) u svetlosnom prenosu. Sve slike su izrađene u istim uslovima. Analiza mreža angiogeneze urađena je korišćenjem Developer softvera (GE Healthcare). Procenjena je ukupna dužina kapilarne mreže.
Obrada podataka
[0109] Podaci su izraženi u procentima kontrolnih stanja (bez intoksikacije, bez amiloida = 100%), kako bi se izrazila amiloidna povreda. Sve vrednosti su izražene kao srednja /- SEM (s.e. srednja vrednost) od 3 kulture (n = 6 komora po stanju). Statističke analize su urađene na različitim uslovima (jednosmerna ANOVA praćena Dunnettovim testom kada je to dozvoljeno, Statview softver verzija 5.0).
Rezultati
[0110] Kombinacija baklofen-akamprosata daje značajan zaštitni efekat protiv toksičnosti humanog Aβ1-
42peptida u HBMEC modelu (primećeno je smanjenje od 24 % Aβ1-42peptidne povrede), kao što je prikazano na FIG.2. Rezultati jasno pokazuju da je intoksikacija humanog amiloidnog peptida (Aβ1-
422,5µM) značajno sprečena kombinacijom lekova dok, na tim koncentracijama, sami lekovi nemaju značajan uticaj na intoksikaciju u eksperimentalnim prethodno opisanim uslovima.
Nasuprot tome, kombinacija baklofena i terbinafina (koja je predstavljena ovde samo radi poređenja) pruža slabiju zaštitu (primećeno je smanjenje od 15 % Aβ1-42peptidne povrede) protiv Aβ1-42(FIG.3). Zbog toga, iako obe kombinacije omogućavaju zaštitu od Aβ1-42, kombinacija baklofen-akamprosat se jasno izdvaja. Zaista, ovi lekovi pri koncentracijama na kojima sami nemaju efekat omogućavaju značajnu zaštitu ljudskih HBME ćelija protiv Aβ1-42kada se koriste u kombinaciji. Osim toga, baklofen -akamprosat kombinacija efikasnija je nego kombinacija baklofen-terbinafin. Takav efekat baklofena i akamprosata predstavlja značajno poboljšanje od 60% u odnosu na, na primer, efekat kombinacije baklofen-terbinafin.
Štaviše, koncentracija baklofena upotrebljena u kombinaciji baklofen-akamprosat mnogo je niža od koncentracije baklofena koja je upotrebljena u kombinaciji baklofen-terbinafin (25-puta umanjenje).
I.2 Efekat na toksičnost humanog Aβ1-42peptida na ćelije primarnih kortikalnih neurona.
Kultura primarnih kortikalnih neurona
[0111] Kortikalni neuroni pacova su kultivisani kao što je opisano od strane Singer et al. (47). Tek zatrudnele ženke pacova od 15 dana gestacije usmrćene su dislokacijom (pacovi Vistar) i fetusi su uklonjeni iz materice. Korteks je uklonjen i stavljen u ledeno-hladan Leibovitz medijum (L15) koji sadrži 2
2
% penicilina 10.000 U/ml i streptomicina 10mg/ml i 1 % goveđeg serum albumina (BSA). Korteksi su razdvajani tripsinom tokom 20 min na 37 °C (0,05 %). Reakcija je zaustavljena dodavanjem Dulbeccoovog modifikovanog Eagle-ovog medijuma (DMEM) koji sadrži DNase1 razred II i 10% fetalnog telećeg seruma (FCS). Ćelije su zatim mehanički razdvojene pomoću 3 serijska pasaža kroz 10 ml pipetu i centrifugirani na 515 x g tokom 10 min na 4 °C. Supernatant je odbačen, a talog ćelija ponovo suspendovan u definisanom medijumu kulture koji se sastoji od Neurobazala dopunjenog sa B27 (2 %), L-glutamina (0,2mM), 2% PS rastvora i 10ng/ml BDNF. Vijabilne ćelije izbrojane su u Neubauer citometru pomoću tripan plavog eksluzionog testa. Ćelije su zasejane u gustini od 30000 ćelija/komora u 96-komorastim pločama (komore su prethodno obložene sa poli-L-lizinom (10μg/ml)) i kultivisane na 37 °C u vlažnom vazduhu (95 %)/CO2 (5 %) atmosfere.
Tri nezavisne kulture će se izvršiti po stanju, 6 komora po stanju.
Test jedinjenja i tretman humanog amiloida-β1-42
[0112] Ukratko, Aβ1-42peptid rekonstituisan je u definisanom medijumu kulture na 40μM (matični rastvor) i lagano protresan na 37 °C tokom 3 dana u mraku. Kontrolni medijum je pripremljen u istim uslovima.
Posle 3 dana, rastvor je upotrebljen na primarnim kortikalnim neuronima na sledeći način:
Nakon 10 dana kulture neurona, test jedinjenja su rastvorena u medijumu kulture (+0,1% DMSO), a zatim predinkubirana sa neuronima tokom 1 sata pre Aβ1-42aplikacije (u konačnoj zapremini kulture po komori od 100 μl). Jedan sat nakon inkubacije test jedinjenja(a), 100µl Aβ1-
42peptida dodato je do konačne koncentracije od 10 μM razblažene u prisustvu leka(ova), kako bi se izbegla dalja razblaživanja test jedinjenja(a). Kortikalni neuroni su intoksikovani alkoholom tokom 24 sata. Tri odvojene kulture izvedene su po stanju, 6 komora po stanju.
[0113] BDNF (50ng/ml) i estradiol-β (150nM) upotrebljeni su kao pozitivna kontrola i referentna jedinjenja respektivno. Tri odvojene kulture će se izvesti po stanju, 12 komora po stanju.
[0114] Organizacija ploča sa kulturama Estradiol-β na 150nM upotrebljen je kao pozitivna kontrola (FIG.4).
Estradiol-β rastvoren je u medijumu kulture i pre-inkubisan tokom 1 h pre aplikacije amiloidnog-β1-
42application.
Ocenjeni su sledeći uslovi:
- KONTROLA PLAKA: 12 komora/stanje
• Negativna kontrola: samo medijum 0,1% DMSO
• Intoksikacija: amiloidni-β1-42(10 µM) tokom 24h
• Referentno jedinjenje: Estradiol (150nM) 1h.
- PLOČE SA LEKOVIMA: 6 komora/stanje
• Negativna kontrola: samo medijum 0,1% DMSO
• Intoksikacija: amiloidni-β1-42(10 µM) tokom 24h
• Test jedinjenje(a): test jedinjenje(a) - 1h nakon čega je usledio amiloidni-β1-42(10 µM) tokom 24h
Test aktivnosti laktat dehidrogenaze (LDH)
[0115] 24 sata posle intoksikacije, supernatant je odstranjen i analiziran sa kitom za detekciju citotoksičnosti (LDH, Roche Applied Science, ref: 11644793001, serija: 11800300). Ovaj kolorimetrijski ogled za kvantifikaciju ćelijske toksičnosti zasniva se na merenju aktivnosti laktat dehidrogenaze (LDH) oslobeđene iz citosola odumirućih ćelija u supernatantu.
Obrada podataka
[0116] Podaci su izraženi u procentima kontrolnih stanja (bez intoksikacije, bez amiloida = 100%), kako bi se izrazila amiloidna povreda. Sve vrednosti su izražene kao srednja /- SEM (s.e. srednja vrednost) 3 kulture (n = 6 komora po stanju). Statističke analize izvedene su pod različitim uslovima (jednosmerna ANOVA praćena Dunnettovim testom kada je to bilo dozvoljeno, Statview softver verzija 5.0).
Rezultati
[0117] Kombinacija baklofena i akamprosata indukuje značajan zaštitni efekat protiv toksičnosti humanog Aβ1-42peptida (poboljšanje od 34% ćelijskog preživljavanja) u ćelijama primarnih kortikalnih neurona kao što je prikazano na FIG.5. Rezultati jasno pokazuju da je intoksikacija humanim amiloidnim peptidom (Aβ1-4210µM) značajno sprečena ovom kombinacijom, dok na tim koncentracijama, baklofen ili akamprosat, sami, nemaju značajan uticaj na intoksikaciju.
Nasuprot tome, iako aktivna u ovom modelu, kombinacija sulfisoksazola i cinakalceta pruža slabiju zaštitu od Aβ1-42(19%, FIG.6).
[0118] Na taj način, iako obe kombinacije omogućavaju zaštitu od Aβ1-42, kombinacija baklofenakamprosat jasno se izdvaja. Zaista, u koncentracijama na kojima sami nemaju nikakav uticaj, lekovi
4
uzrokuju značajnu zaštitu ćelija primarnih kortikalnih neurona protiv Aβ1-42kada se koriste u kombinaciji. Osim toga, baklofen-akamprosat kombinacija mnogo je efikasnija nego sulfisoksazol-cinakalcet kombinacija. Takav efekat baklofena i akamprosata predstavlja značajno poboljšanje od 60% u odnosu na, na primer, efekat kombinacije sulfisoksazola i cinakalceta.
Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju neočekivan i izuzetno pozitivan efekat baklofen-akamprosat kombinacija u nekoliko in vitro modela Alchajmerove bolesti. Primećeni efekat je veoma superioran u odnosu na onaj izazvan drugim kombinovanim terapijama na bazi baklofena (npr., baklofen - terbinafin), ili ostalim aktivnim kombinacionim terapijama (sulfisoksazol - cinakalcet).
Izvedeno je poređenje akamprosat i homotaurin zaštitne aktivnosti na kortikalnim ćelijama (FIG.17). Ovi rezultati pokazuju da derivat akamprosata, pod nazivom homotaurin, dozvoljava efikasnu zaštitu od Aβ1-
42. Baklofen ili akamprosat mogu biti tako supstituisani sa njihovim derivatima, pod uslovom da su ti derivati efikasni u ovde opisanom ogledu.
I.3. Zaštita protiv Aβ1-42toksičnosti u rastu neurita i sinapsičkom modelu funkcionalnosti.
[0119] Kortikalni neuroni pacova su kultivisani kao što je opisano od strane Singer et al.(35). Tek zatrudnele ženke pacova od 15 dana gestacije usmrćene su cervikalnom dislokacijom (pacovi Vistar) i fetusi su uklonjeni iz materice. Korteks je uklonjen i stavljen u ledeno-hladan Leibovitz medijum (L15) koji sadrži 2 % penicilina 10.000 U/ml i streptomicina 10mg/ml i 1 % goveđeg serum albumina (BSA). Korteksi su razdvajani tripsinom tokom 20 min na 37°C (0,05%). Reakcija je zaustavljena dodavanjem Dulbecco-ovog modifikovanog Eagle-ovog medijuma (DMEM) koji sadrži DNase1 razred II i 10% fetalnog telećeg seruma (FCS). Ćelije su zatim mehanički razdvojene pomoću 3 serijska pasaža kroz 10 ml pipetu i centrifugirani na 515 x g tokom 10 min na 4 °C. Supernatant je odbačen, a talog ćelija ponovo suspendovan u definisanom medijumu kulture koja se sastoji od Neurobazala dopunjenog sa B27 (2 %), L-glutamina (0,2mM), 2% PS rastvora i 10ng/ml BDNF. Vijabilne ćelije izbrojane su u Neubauer citometru pomoću tripan plavog eksluzionog testa. Ćelije su zasejane u gustini od 30000 ćelija/komora u 96-komorastim pločama (komore su prethodno obložene sa poli-L-lizinom (10μg/ml)) i kultivisane na 37 °C u vlažnom vazduhu (95 %)/CO2 (5 %) atmosfere.
Nakon 10 dana uzgajanja, ćelije su inkubisane sa lekovima. Posle 1 h, ćelije su intoksikovane sa 2,5 μM beta-amiloida (1-42; Bachem) u utvrđenom medijumu bez BDNF ali zajedno sa lekovima. Kortikalni neuroni su intoksikovani tokom 24 sata. BDNF (10ng/ml) je upotrebljen kao pozitivna (neuroprotektivna) kontrola. Tri nezavisne kulture izvedene su po stanju, 6 komora po stanju.
Dužina neurita i kvantifikacija sinapse
[0120] Posle 24 sata intoksikacije, supernatant je odstranjen, a kortikalni neuroni su fiksirani hladnim rastvorom etanola (95 %) i sirćetne kiseline (5 %) tokom 5 min. Nakon permeabilizacije sa 0,1 % saponina, ćelije su blokirane tokom 2 h sa PBS koji sadrži 1 % seruma telećeg fetusa. Zatim, ćelije su inkubirane sa monoklonalnim antitelom anti mikrotubula-udruženim-proteinom 2 (MAP-2; Sigma) ili sa anti sinaptofizinom (SYN, S5798, Sigma) zajedno sa anti PSD95 (P246, Sigma) antitelima, kako bi se kvantifikovale sinapse. Ova antitela obeležavaju posebno ćelije tela i neurite neurona neurona (MAP2) ili pre i post sinaptičke elemente (SYN i PSD95, respektivno).
[0121] Ova antitela su otkrivena sa Alexa Fluor 488 kozjim anti-mišjim IgG (molekularna sonda). Jezgra neurona obeležena su fluorescentnim markerom (Hoechst rastvor, SIGMA).
[0122] Po komori, uzeto je 10 slika primenom InCell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare) uređaja sa uvećanjem od 20x. Sve slike su uzete u istim uslovima. Analiza mreže neurita urađena je pomoću Developer softvera (GE Healthcare) u cilju procene ukupne dužine mreže neurita.
Rezultati
[0123] Kombinacija baklofena i akamprosata indukuje značajan zaštitni efekat protiv toksičnosti humanog Aβ1-42peptida (poboljšanje od 80 % mreže neurita) u ćelijama primarnih kortikalnih neurona kao što je prikazano na FIG.7. Rezultati jasno pokazuju da je intoksikacija humanim amiloidnim peptidom (Aβ1-422,5 µM) značajno sprečena ovom kombinacijom, dok na tim koncentracijama, baklofen ili akamprosat, sami, nemaju značajan uticaj na intoksikaciju.
Pored toga, ukupna dužina mreže neurita tretirana ovom kombinacijom nije značajno drugačija od kontrolnih ćelija. Stoga, ova kombinacija omogućava efikasnu zaštitu ćelija kortikalnih neurona protiv toksičnosti humanog Aβ1-42peptida ali i rast neurita u poređenju sa zdravim ćelijama kortikalnih neurona.
II. BAKLOFEN-AKAMPROSAT KOMBINACIONE TERAPIJE SPREČAVAJU TOKSIČNOST HUMANOG Aβ25-
35IN VIVO
Životinje
[0124] Muški švajcarski miševi, upotrebljeni su tokom studije. Životinje su smeštene u plastične kaveze, sa slobodnim pristupom laboratorisjkoj hrani i vodi, osim tokom bihejvioralnih eksperimenata, i držani u podešenom okruženju, pod 12-časovnim ciklusom svetlo/mrak (paljenje svetlosti u 8:00). Eksperimenti su izvođeni u zvučno izolovanoj i vazduh-regulisanoj eksperimentalnoj sobi, u kojoj su miševi boravili najmanje 30 minuta pre svakog eksperimenta.
Kombinatorni tretman
[0125] Lek(ovi) je/su svakodnevno ordinirani putem sonde (per os). β25-35 peptid i kodirani β25-35 peptid (kontrola) rastvoreni su u sterilnoj bidestilovanoj vodi, i čuvani na -20 °C do upotrebe. β-amiloidni peptidi se zatim ordiniraju intracerebroventrikularno (i.c.v.) Ukratko, svaki miš je lagano anesteziran sa etrom, a merač u obliku igle od nerđajućeg čelika ubačen je jednostrano 1 mm desno od srednjelinijske tačke na polovini puta od svakog oka, na jednakoj udaljenosti između očiju i ušiju i upravno u odnosu na ravan lobanje. Peptidi ili nosač isporučivani su postepeno u roku od oko 3 s. Miševi pokazuju normalno ponašanje u roku od 1 minuta posle injekcije. Mesto davanja se proverava ubrizgavanjem indijanskog mastila u preliminarnim eksperimentima. Ni ubacivanje igle, ni injektovanje nosača nema značajan uticaj na preživljavanje, bihejvioralne odgovore ili kognitivne funkcije.
Tretman lekom(lekovima)
[0126] Dana -1., tj.24 h pre injektovanja Aβ25-35peptida, kombinacija lekova ili rastvora nosača primenjuje se per os putem sonde dva puta dnevno (u 8:00 i 18:00 časova).
Dana 0 (u 10:00 časova ), miševima su ubrizgavani i.c.v. Aβ25-35 peptid ili kodirani Aβ 25-35 peptid (kontrola) u konačnoj zapremini od 3 µl (3 mM).
Između dana 0 i dana 7., lekovi, kombinacija lekova ili rastvor nosača ordinirani su per os putem sonde jednom ili dva puta dnevno (u 8:00 i 18:00 časova). Jedna grupa životinja dobija donepezil (referentno jedinjenje - 1 mg/kg/dan) per os putem sonde jednim injektovanjem (u 8:00 časova). Lekovi su rastvoreni u vodi i sveže pripremljeni neposredno pre svake gavažne administracije.
Dana 7., sve životinje su testirane na spontane alternacione performanse u Y - lavirint testu, indeks prostorne radne memorije.
Dana 7. i 8., kontekstualno dugoročno pamćenje životinja ocenjeno je pomoću procedure pasivnog izbegavanja tipa korak - dole.
Dana 8., životinje su žrtvovane. Njihov mozak je iseciran i uskladišten na -80 °C zbog daljeg analiziranja.
Kombinacije poboljšavaju bihejvioralne i kognitivne performanse intoksikovanih životinja
Spontane alternacione performanse – Y- lavirint test
[0127] Dana 7., sve životinje su testirane na spontane alternacione performanse u Y - lavirintu, indeks prostorne radne memorije. Y - lavirint je napravljen od sivog polivinilhlorida. Svaki rukavac je dugačak 40 cm, 13 cm visok, širok 3 cm na dnu, širine 10 cm na vrhu, i konvergiraju u jednakom uglu. Svaki miš je postavljen na kraju jednog rukavca i dozvoljeno mu je da se slobodno kreće kroz lavirint tokom 8-minutne sesije. Serije ulaska u rukavac, uključujući moguće povratke u isti rukavac, proveravane su vizuelno. Alternacija se definiše kao ulasci u sva tri rukavca kao sledstveno dešavanje. Broj maksimalnih alternacija je stoga ukupan broj ulaska u rukavac minus dva, a procenat alternacije se izračunava kao (stvarne alternacije/maksimalne alternacije) x 100. Parametri obuhvataju procenat alternacije (indeks memorije) i ukupan broj ulaska u rukavac (indeks istraživanja). Životinje koje pokazuju izuzetno ponašanje (alternacioni procenat < 25 % ili > 85 % ili broj ulazaka u rukavac < 10) se odbacuju. Obično, to čini 0-5% od životinja. Ovaj test uzgred služi kako bi se na bihejvioralnom nivou analizirao uticaj i amnezioni efekat indukovan kod miševa od strane Aβ5-35 injekcije.
Test pasivnog izbegavanja
[0128] Aparat je (15 x 20x 15 cm visine) kutija, koja se satoji od dve komore, sa jednim osvetljenim belim polivinilhlorid zidovima, i drugim zatamnjinim crnim polivinilhlorid zidovima i rešetkastim podom. Vrata u obliku giljotine odvajaju svaki odeljak.60 W lampa pozicionirana 40 cm iznad aparata osvetljava beli odeljak tokom eksperimenta. Kodirani nožni šokovi (0,3 mA tokom 3 s) mogli su biti isporučeni na rešetku poda upotrebom šok generator uređaja za šifrovanje (Lafayette Instruments, Lafayette, SAD). Vrata u obliku giljotine inicijalno su zatvorena tokom sesije treninga. Svaki miš je smešten u beli odeljak. Nakon 5 s, vrata se podižu. Kada miš ulazi u zamračeni odeljak i staje na rešetke poda, vrata se zatvaraju i nožni šokovi se isporučuju tokom 3 sekunde. Zabeleženi su koraci kroz latenciju, to jest, kašnjenje provedeno da uđe u zamračeni odeljak, i broj vokalizacija. Test retencije je izveden 24 h posle treninga. Svaki miš je ponovo stavljen u beli odeljak. Nakon 5 s, vrata se podižu i beleže se koraci kroz latenciju i latencija bežanja, tj., vreme provedeno za povratak u beli odeljak, do 300 s.
Pozitivni rezultati se vide u bihejvioralnim osobinama i biohemijskim testovima izvedeni 7 dana posle β25-35 peptid i.c.v. injekcije.
[0129] Kombinacija baklofena i akamprosata indukuje značajan zaštitni efekat na bihejvioralne i kognitivne performanse intoksikovanih životinja kao što je prikazano na FIG.8, 9 i 10.
Na FIG.8, sa samo 53,8 % alternacije, intoksikovani miševi pokazuju snažno oštećenu prostornu radnu memoriju u odnosu na kontrolu. Sa poboljšanjem od više od 48% njihove procentualne alternacije u odnosu na kontrolu, oštećenje je značajno sprečeno na miševima tretiranih sa baklofenom i akamprosatom.
Slično tome, FIG.9 i 10 pokazuju da intoksikovane životinje pokazuju oštećene bihejvioralne i kognitivne performanse u skladu sa rezultatom u latenciji bekstva i korak kroz latenciju, respektivno. U oba testa, kombinacija baklofena i akamprosata omogućava značajnu korekciju pogoršanja. Latencija bekstva miševa tretiranih sa ovom kombinacijom ne ralikuje se značajno od kontrolnih miševa (FIG.9) i korak kroz latenciju (FIG.10) je značajno povećan kombinacijama ovog pronalaska sa pojačanim efektom kombinacije u odnosu na pojedinačno upotrebljene lekove.
Oštećenje memorije je rana karakteristika Alchajmerove bolesti i ovi rezultati jasno pokazuju da je toksični efekat amiloidnog peptida na bihejvioralne i kognitivne performanse (uključujući memoriju) značajno sprečen kombinacijama ovog pronalaska.
[0130] Osim toga, FIG.16 pokazuje da ekstremno niska doza baklofena (480μg/kg/dan), akamprosata (32μg/kg/dan) i donepezila (0,25 mg/kg/dan) može da se kombinuje kako bi se omogućila kompletna zaštita bihejvioralnih i kognitivnih performansi miševa kao što je izmereno pomoću Y - lavirint testa. Dok donepezil, pri ovoj koncentraciji, nema značajan efekat (32 % zaštite ) na prostornu radnu memoriju, njegova upotreba u konjukciji sa kombinacijom baklofena i akamprosata omogućava potpunu zaštitu (98%) kognitivnih performansi intoksikovanih miševa. Kombinacije prema ovom pronalasku mogu tako biti dalje kombinovane sa drugim terapijama u cilju potentiranja njihovih akctivnosti.
Kombinacije poboljšavaju neurofiziološki problem neuroloških oboljenja
[0131] Kombinacione terapije testirane su u in vivo modelu Aβ intoksikacije. Njihovi efekti na nekoliko parametara koji su uticali na neurološke bolesti ocenjeni su:
- Kaspaze 3 i 9 eksperesioni nivo, koji se smatraju pokazateljem apoptoze,
- Lipidna peroksidacija, koja se smatra markerom nivoa oksidativnog stresa,
- GFAP ekspresioni ogled, koji se smatra markerom nivoa inflamacije mozga,
- Integritet krvne moždane barijere,
- Ukupan integritet sinapse (sinaptofizin ELISA).
- Kvantifikacija vijabilnih neurona u CAl.
Integritet krvno moždane barijere.
[0132] Eksperimentalni dizajn o životinjskoj intoksikaciji sa Aβ isti je kao u delu III.
Potencijalni zaštitni efekat kombinovanih terapija na integritet krvno-moždane barijere (BBB) analiziran je na miševima kojima je intracerebroventrikularno (i.c.v.) ubrizgavan oligomerni amiloidni- β25-35 peptid (Aβ25-35) ili kodiran Aβ25-35 kontrolni peptid ( tj., Aβ), 7 dana posle injekcije.
Dana 7. posle Aβ25-35injekcije, životinje su testirane kako bi se odredio integritet BBB pomoću EB (Evans Blue) metoda. Poznato je da se EB boja vezuje za serum albumina nakon periferne injekcije i upotrebljena je kao tragač za serum albumina.
EB boja (2 % u fiziološkom rastvoru, 4 ml/kg) injektovana je intraperitonealno (i.p.) 3 h pre transkardialne perfuzije. Miševi su zatim anestezirani i.p. sa 200 μl prethodno umešanog ketamina 80 mg/kg, ksilazina 10 mg/kg ,i otvoren im je grudni koš. Miševi su transkardijalno perfuzionisani sa 250 ml fiziološkog rastvora tokom približno 15 min sve dok tečnost iz desne pretkomore nije postala bezbojna. Nakon odsecanja glave, mozak je uklonjen i izseciran u tri regiona: cerebralni korteks (levi desni), hipokampus (levi desni), diencefalon. Zatim, svaki deo mozga je izmeren radi kvantitativnog merenja EB-albumin ekstravazacije.
Uzorci su homogenizovani u fosfat - puferovanom slanom rastvoru i umiksovani mešanjem nakon dodavanja 60 % trihlorsirćetne kiseline kako bi se istaložio protein. Uzorci su ohlađeni na 4 °C, a zatim centrifugirani 30 min na 10.000 g, 4 °C. Supernatant je izmeren na 610 nm zbog EB apsorpcije upotrebom spektrofotometra.
[0133] EB je kvantifikovana i kao
▪ µg/mg moždanog tkiva upotrebom standardne krive, dobijene poznatim koncentrovanjem EB-albumina.
▪ µg/mg proteina.
Ukupan integritet sinapse (sinaptofizin ELISA)
[0134] Sinaptofizin je odabran kao marker sinapse integriteta i analiziran je korišćenjem komercijalnog ELISA kita (USCN , Ref. E90425Mu). Uzorci su pripremljeni od tkiva hipokampusa i homogenizovani u ekstrakcionom puferu po specifikacijama koje su opisane od proizvođača i u referentnoj literaturi. Tkiva su ispirana u ledeno hladnom PBS-u (0,02 mol/l, pH 7.0-7.2) kako bi se temeljno uklonio višak krvi, a zatim su izemerena pre zamrzavanja azotom i skladištenja na -80 °C. Tkiva su isečena na male komade i homogenizovana u 1 ml slanog rastvora ledeno hladnog fosfatnog pufera (PBS) sa staklenim homogenizatorom. Dobijena suspenzija sonifikovana je ultrazvučnim ćelijskim disruptorom ili podvrgnuta dvostrukim ciklusima zamrzavanja - odmrzavanja kako bi se dodatno razbile ćelijske membrane. Homogenati su zatim centrifugovani tokom 5 min na 5000 g, nakon čega je odmah analiziran supernatant.
Svi uzorci su testirani u triplikatima.
Kvantifikacija proteina izvedena je Pierce BCA (bicinhoninska kiselina) proteinskim oglednim kitom (Pierce, Ref. #23227) kako bi se procenile performanse ekstrakcije i omogućila normalizacija.
Ukupne koncentracije proteina zatim su izračunate iz standardne krive razblaženja i upotrebljena kako bi se normalizovali ELISA rezultati.
4
Kvantifikacija vijabilnih neurona u CAl-u
[0135] Dana 8., svaki miš je anesteziran i.p. sa 200 μl prethodno umiksovanog ofketamina 80 mg/kg i ksilazina 10 mg /kg i transkardijalno perfuzionisan sa 100 ml fiziološkog rastvora nakon čega sa 100 ml 4% paraformaldehida. Mozgovi su uklonjeni i uskladišteni radi 24-časovne post-fiksacije u 4 % rastvoru paraformaldehida na 4 °C.
Nakon post-fiksacije, mozgovi su isprani u slanom rastvoru fosfatnog pufera (PBS), a zatim je uklonjen mali mozak, a prednji mozgovi postavljeni na vibratom ploču (Leica VT100OS, Leica, Wetzlar, Nemačka) za sečenje.
Mozgovi su isečeni na koronarne sekcije (20 μm debljine) pomoću vibratoma (Leica VT100OS, Leica, Wetzlar, Nemačka). Serijske sekcije postavljene su u ploču sa 24 -komore sa PBS. Zatim su odabrane kako bi se uključila hipokampalna formacija i 9 sekcija je smešteno u želatinom obložene staklene trake (jedan slajd po životinji za krezil violet). Svi slajdovi su sušeni na sobnoj temperaturi tokom 48 h kako bi se izbeglo odlepljivanje. Pločice su uskladištene na sobnoj temperaturi sve do krezil violet bojenja.
[0136] Sekcije su obojene sa 0,2 % Krezil violet reagensom (Sigma-Aldrich), a zatim dehidrirane sa gradijentnim etanolom, tretirane toluenom, i povezane sa Mountex medijumom (BDH Laboratory Supplies, Poole, Dorset, UK).
Nakon povezivanja, slajdovi su ostavljeni na ST radi 24-časovnog sušenja. Ispitivanje CA 1 područja obavlja se korišćenjem svetlosnog mikroskopa (Dialux 22, Leitz), sa odsecima digitalizovanim kroz CCD kameru (Sony XC-77CE, Sony, Paris, Francuska) sa NIHImage® v1.63 softverom (NIH). CAl merenje i piramidalne ćelijske tačke obrađene su pomoću ImageJ® (NIH). Podaci su izraženi kao srednja vrednost devet CA 1 odsečaka piramidalnih ćelija po milimetru za svaku grupu (uključujući i levi i desni hipokampus CAI) (49).
Test oksidativnog stresa
[0137] Miševi su žrtvovani odsecanjem glave i oba hipokampusa brzo su izvađena, izmerena i čuvana u tečnom azotu do testiranja. Nakon odmrzavanja, hipokampusi su homogenizovani u hladnom metanolu (1/10 w/v), centrifugovani na 1000 g tokom 5 min, a supernatant je smešten u eppendorf epruvetu. Zapremine reakcije svakog homogenata dodate su u FeSO41 mM, H2SO40,25 M, ksilenol oranž 1 mM i inkubisane tokom 30 min na sobnoj temperaturi. Posle čitanja apsorbance na 580 nm (A5801), 10 µl kumen hidroperoksida 1 mM (CHP) dodato je uzorku i inkubisano tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, kako bi se utvrdio maksimalni nivo oksidacije. Apsorbanca je izmerena na 580 nm (A5802).
Nivo lipidne peroksidacije određen je kao CHP ekvivalenti (CHPE) u skladu sa: CHPE = A5801/A5802 x [CHP] i izražen kao CHP ekvivalenati po masi tkiva i kao procenat podataka kontrolne grupe.
Indukcioni test kaspazne putanje i GFAP ekspresioni test
[0138] Miševi su žrtvovani odsecanjem glave i oba hipokampusa su brzo izvađena, isprana u ledeno hladnom PBS-u (0,02 mol/l, pH 7.0-7.2) kako bi se temeljno uklonio višak krvi, izmerena i ostavljena u tečnom azotu do testiranja. Tkiva su isečena na male komade i homogenizovana u 1 ml ledeno hladnom PBS-u sa staklenim homogenizatorom. Dobijena suspenzija sonifikovana je ultrazvučnim ćelijskim disruptorom ili podvrgnuta dvostrukim ciklusima zamrzavanja - odmrzavanja kako bi se dodatno razbile ćelijske membrane. Homogenati su zatim centrifugovani tokom 5 min na 5000 g, nakon čega je odmah analiziran supernatant.
Eksperimenti su obavljeni komercijalnim testom: Kaspaza-3 (USCN - E90626Mu), Kaspaza-9 (USCN -E90627Mu), GFAP (USCN - E90068).
[0139] Kvantifikacija proteina izvedena je Pierce BCA (bicinhoninska kiselina) proteinskim oglednim kitom (Pierce, Ref. #23227) kako bi se procenile performanse ekstrakcije i omogućila normalizacija.
[0140] Kombinacija baklofena i akamprosata indukuje značajan zaštitni efekat na neurofiziološkim funkcijama intoksikovanih životinja kao što je prikazano na FIG.11, 12, 13 i 14. Sa zaštitom više od 60 % u odnosu na netretirane intoksikovane životinje, a ta kombinacija je efikasna za zaštitu neurona (FIG.11) i sinaptičke gustine (FIG.13).
Slično tome, FIG.12 pokazuje da kombinacija baklofena i akamprosata štiti BBB integritet (76%) u poređenju sa netretiranim intoksikovanim životinjama.
Konačno, ova kombinaciona terapija je efikasna u smanjenju ukupnog oksidativnog stresa izazvanog od strane Aβ u mozgu tretiranih životinja u poređenju sa netretiranim intoksikovanim životinjama (FIG.14).
[0141] Kao što je prikazano u Delu A primera, nekoliko neuroloških funkcija usporenih kod brojnih neuroloških poremećaja, uključujući neurodegenerativne poremećaje kao što su Alchajmerova bolest i srodni poremećaji zaštićeni su, a simptomi usporeni ili smanjeni kombinacijom baklofen-akamprosata.
B) PREVENCIJA GLUTAMATNE TOKSIČNOSTI NA ĆELIJAMA NEURONA
[0142] U daljem setu eksperimenta, kandidat jedinjenja testirana su na njihovu sposobnost da spreče ili smanje toksične efekate glutamatne toksičnosti na ćelije neurona. Glutamatna toksičnost je uključena u patogenezu neuroloških bolesti ili poremećaja, kao što su multiple skleroza, Alchajmerova bolest, amiotrofična lateralna skleroza, Parkinsonova bolest, Hantingtonova bolest, neuropatija, alkoholizam ili ostavljanje alkohola, ili povreda kičmene moždine. Lekovi su prvo testirani pojedinačno, nakon čega su usledila testiranja njihovog kombinacionog delovanja.
Metode
[0143] Efikasnost kombinacionih lekova ovog pronalaska procenjena je na ćelijama primarnih kortikalnih neurona. Protokol koji se koristi u ovim testovima je isti kao što je opisano u odeljku A.I.2 gore.
Testovi glutamatne toksičnosti
[0144] Neuroprotektivni efekat jedinjenja ocenjen je kvantifikacijom mreže neurita (imunobojenje neurofilamentima (NF)) koja specifično otkriva glutamatergičke neurone.
Posle 12 dana uzgajanja neurona, supstance kandidat kombinacija rastvoreni su u medijumu kulture (+0,1% DMSO). Kandidat kombinacije su tada pre -inkubisane sa neuronima tokom 1 sata pre glutamatne povrede. Jedan sat nakon inkubacije, glutamat je dodavan tokom 20 min, do konačne koncentracije od 40μM, u prisustvu kandidat kombinacija, kako bi se izbegla dalja razblaženja lekova. Na kraju inkubacije, medijum je zamenjen medijumom sa kandidat kombinacijom ali bez glutamata. Kultura je fiksirana 24 časa nakon glutamatne povrede. MK801 (Dizocilpinvodonik maleat, 77086-22-7 - 20µM) upotrebljen je kao pozitivna kontrola.
Nakon permeabilizacije sa saponinom (Sigma), ćelije su blokirane 2h sa PBS-om koji sadrži 10% kozjeg seruma, nakon čega su ćelije inkubirane sa mišjim monoklonalnim primarnim antitelom protiv neurofilament antitela (NF, Sigma). Ovo antitelo je otkriveno pomoću Alexa Fluor 488 kozjim anti -mišjim IgG-om.
[0145] Jezgra ćelija označena su fluorescentnim markerom (Hoechst rastvor, SIGMA), a neuritna mreža je kvantifikovana. Šest komora po stanju upotrebljeno je za procenu preživljavanje neurona u 3 različite kulture.
Rezultati
[0146] Kombinacija baklofen-akamprosat daje zaštitni efekat protiv glutamatne toksičnosti za ćelije kortikalnih neurona. Kako je prikazano na FIG.15, kombinacije ovog pronalaska snažno štite neurone od glutamatne toksičnosti u prethodno opisanim eksperimentalnim uslovima. Važno je napomenuti da je efikasna zaštita primećena primenom koncentracija leka na kojima lekovi upotrebljeni sami imaju niži
4
zaštitni efekat. Kombinacija baklofena i akamprosata indukuje poboljšanje od više od 200 % u odnosu na sam akamprosat i više od 47% u odnosu na baklofen kada se koristi sam.
C) POBOLJŠANJE OSTALIH POREMEĆAJA POVEZANIH ZA GLUTAMATNU EKSCITOKSIČNOST UPOTREBOM KOMBINACIJA OVOG PRONALASKA
[0147] Prethodno pomenut in vitro zaštitni efekat protiv glutamatne toksičnosti lekova i kombinacija lekova ovog pronalaska u kombinaciji sa zaštitnim efektima navedenim ovde kao primeri u nekoliko AD modela, nagnalo je pronalazače da testiraju ove lekove i kombinacije u nekim modelima drugih bolesti u čijoj patogenezi je takođe uključena glutamatna toksičnost, kao što su MS, ALS i neuropatski bol.
I) ZAŠTITNI EFEKAT KOMBINACIJA U IN VIVO MODELU MULTIPLE SKLEROZE.
[0148] Model u kome mijelin-oligodendrocit glikoprotein-imunizovani (MOG-imunizovani) miševi razvijaju hroničnu progresivnu EAE upotrebljen je kako bi se pokazao blagotvorni efekat kompozicija ovog pronalaska u tretiranju multiple skleroze.
Životinje i hemikalije
[0149] C57L/6J ženke miševa (8 nedelja stare) kupljene su od Janvier-a (Francuska); posle dve nedelje uzgajanja, ženke miševa (10 nedelja stare) razvijaju hroničnu paralizu posle imunizacije sa MOG (Mielin oligodendrocitni glikoprotein) peptidom. Eksperimentalni encefalomijelitis je indukovan sa Hooke Kit MOG35-55/CFA emulzioni PTX (pertusis toksin) za EAE indukciju (EK-0110, EK-0115; Hooke laboratorije). Kontrolni kit bio je CK-0115 (Hooke laboratorije).
Eksperimentalni postupak
[0150] Eksperimentalni encefalomijelitis izazvan je sledećim postupkom:
Dan 0, izvedene su dve subkutane injekcije od po 0,1 ml svaka; jedan na gornjem delu leđa miša i jedna u donjem delu leđa. Svaka injekcije sadrži 100µg MOG35-55peptida (MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK), 200µg inaktiviranog Mycobacterium tuberculosis H37Ra i emulgovanog u kompletnom Freund-ovom adjuvansu (CFA) (Hooke laboratorije). Emulzija obezbeđuje antigen potreban da se prošire i diferenciraju MOG-specifične autoimune T ćelije.
[0151] Dve intraperitonealne injekcije od 500 ng pertussis toksina u PBS (Hooke kit) davane su 2 sata (dan 0) i 24 sata (dan 1) posle MOG injekcije. Pertusis toksin poboljšava razvoj EAE pružanjem dodatnog adjuvansa.
[0152] Miševi razvijaju EAE 8 dana posle imunizacije i ostaju hronično paralizovani tokom trajanja eksperimenta. Posle imunizacije, miševi su svakodnevno posmatrani na kliničke simptome u slepom postupku. Životinje su čuvane u konvencionalnom objektu bez patogena i svi eksperimenti su izvedeni u skladu sa smernicama propisanim, i odobrenim, od strane Stalnog komiteta lokalne bioetike.
Eksperimentalne grupe i tretiranje lekovima:
[0153] Grupe ženki miševa kao što je opisano su homogenizovane po težini pre imunizacije:
- Kontrolna grupa: injekcija nosača u istim uslovima EAE miševa (od Dana -1 do Dana 28, placebo je davan na dnevnoj bazi)
- EAE grupa: MOG injekcija (dan 0) pertusis toksin injekcije (Dan 0 i 1) - od Dana -1 do dana 28, placebo davan oralno na dnevnoj bazi
- EAE pozitivna kontrola: MOG injekcija (dan 0) pertusis toksin injekcije (Dan 0 i 1) - od Dana -1 do dana 28, deksametazon je davan oralno na dnevnoj bazi.
- EAE grupa za tretiranje: MOG injkecija (Dan 0) pertusis toksin injekcije (Dan 0 i 1). Tretmani započeti jedan dan pre imunizacije i trajali do 28. dana.
Klinički rezultati mereni su Danima 0-5-8-9-12-14-16-19-21-23-26-28.
[0154] Statistica softver (Statsoft Inc.) sprovođen je u celosti za statističku analizu. ANOVA analiza i Studentov t test uključeni su kako bi se analiziralo klinički rezultat bolesti. P < 0,05 se smatra značajnim. Kašnjenja nastanka bolesti, klinička ocena i odlaganje smrti, upoređivani su između svake grupe u odnosu „immu" grupu sa Kaplan-Meier krivama i Cox modela (R paket „preživljavanja“). Dobijene pvrednosti su jednostrane i testiraju hipotezu da bude bolja od referentne „immu“ grupe.
Ukupna klinička ocena sačinjena je od ocene repa, ocene zadnjih ekstremiteta, ocene prednjih ekstremiteta i ocene bešike opisana kao što sledi:
Ocena repa:
4
4
[0155] Globalna ocena za svaku životinju određuje se dodavanjem svih gore navedenih kategorija. Maksimalna ocena za žive životinje je 10.
Rezultati- Kombinacione terapije efikasne su u MS modelu
[0156] Značajno poboljšanje globalne kliničke ocene primećeno je u "EAE tretman grupi" miševa za baklofen i akamprosat kombinaciju.
Kombinacija baklofena (30 mg/kg/dan) i akamprosata (2 mg/kg/dan) indukovala je značajan zaštitni efekat protiv razvoja hronične progresivne EAE i stoga je potvrdila blagotvorno dejstvo kompozicije u tretiranju multiple skleroze (FIG.18). Sa više od 30 % smanjenje simptoma, rezultati jasno pokazuju da kombinacija indukuje značajno smanjenje razvoja bolesti od dana 13. Ovaj rezultat potvrđuje izuzetan pozitivan efekat kombinacije baklofen-akamprosat u zaštiti neurona uključujući i one na demijelinizaciji i njenim implikacijama. Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da ova kombinacija omogućava efikasnu zaštitu neurona protiv mnogih stresova koji su uključeni u razvoj neurološke bolesti kao što su βamiloid, BBB slom, glutamatna ekscitotoksičnost ili demijelinizacija.
II. ZAŠTITNI EFEKAT KOMBINACIJA U ALS MODELIMA.
[0157] Efekat kombinacionih terapija prema ovom pronalasku na ALS pokazan je in vitro, u kokulturnom modelu, i in vivo, u mišjem ALS modelu. Protokoli i rezultati predstavljeni su u ovom odeljku.
II.1 Zaštitni efekat protiv glutamatne toksičnosti u primarnim kulturama nervno-mišićne ko-kulture
Primarne ko-kulture nervnih- i mišićnih ćelija
[0158] Ljudski mišić je dobijen prema prethodno opisanom postupku iz delova biopsije zdravog pacijenta (48). Mišićne ćelije su uspostavljene iz razdvojenih ćelija (10000 ćelija po komorama), prevučene u želatin-obložene 0,1 % 48-komornu ploču i uzgajane u medijumu proliferacije koji se sastoji od mešavine MEM medijuma i M199 medijuma.
[0159] Odmah nakon fuzije satelitskih ćelija, celokupni poprečni režnji 13 dana starih embriona Vistar pacova čije su kičmene moždine sa leđnim korenskim ganglijama (DRG) prikačene na mišićni monosloj 1 raspoređeni su po komori (u centralnom delu oblasti). DRG je neophodna da postigne dobar odnos inervacija. Inervacione kulture se održavaju u mešavini medijuma. Nakon 24h u uobičajenoj ko-kulturi neurita primećen je rast iz eksplanata kičmene moždine. Oni čine kontakte sa miocevčicama i indukuju
4
prve kontrakcije posle 8 dana. Brzo nakon toga, inervaciona mišićna vlakna locirana u blizini eksplanata kičmene moždine, praktično su kontinuirano zgrčena. Nadražena vlakna morfološki i prostorno se razlikuju od onih nenadraženih i lako se može izdvojiti od njih.
Urađena je jedna ko-kultura (6 komora po uslovima).
Glutamatna povreda
[0160] Dana 27., ko-kulture su inkubisane sa kandidat jedinjenjima ili riluzolom jedan sat pre glutamatne intoksikacije (60 µM) tokom 20 min. Zatim su ko-kulture isprane i kandidat jedinjenja ili riluzol dodavani tokom dodatnih 48h. Nakon ovog vremena inkubacije, nefiksirane ko-kulture su inkubisane sa α-bungarotoksinom udruženim sa Aleksa 488 na koncentraciji od 500 nmol/L tokom 15 min na sobnoj temperaturi. Zatim su ko-kulture fiksirane sa PFA tokom 20 min na sobnoj temperaturi. Nakon permeabilizacije sa 0,1 % saponina, ko-kulture su inkubisane sa anti-neurofilamentnim antitelima (NF).
[0161] Ova antitela su detektovana sa Aleksa Fluor 568 kozjim anti-mišjim IgG (Molekularna sonda). Jezgra neurona su označena fluorescentnim markerom (Hoechst rastvor). Krajnje tačke su (1) Ukupna dužina neurita, (2) Broj motornih jedinica, (3) Ukupna površina motornih jedinica, koje su indikativ motorneuronskog opstanka i funkcionalnosti.
[0162] Za svako stanje, uzeto je 2 x 10 fotografija po komori primenom InCell AnalyzerTM 1000 (GE Healthcare) uređaja sa uvećanjem od 20x. Sve slike su uzete u istim uslovima.
Rezultati
[0163] Kombinacija baklofena i akamprosata efikasno štiti motorneurone i motorne jedinice u modelu ko-kultura.
II.2 - Kombinacione terapije su efikasne u ALS mišjem modelu
[0164] Eksperimenti se izvode na mužijacima miševa. Transgeni muški miševi B6SJL-Tg(SOD1)2Gur/J miševi i njihova kontrola (respektivno SN2726 i SN2297 iz Jackson Laboratories, Ben Harbor, SAD i distribuirani od strane Charles River u Francuskoj) izabrani su u ovom setu eksperimenata kako bi oponašali ALS.
Bolesni miševi izražavaju SOD1-G93A transgen, dizajniran sa mutant humanim SOD1 genom (jedna
4
aminokiselinska supstitucija glicina u alanin na kodonu 93) vođenim svojim endogenim humanim SOD1 promoterom. Kontrolni miševi izražavaju kontrolni ljudski gen SOD1.
Randomizacija životinja:
[0165] Grupa asignacije i randomizacije životinja bazirane su na osnovu telesne težine; za svaku grupu, randomizacija je izvršena jedan dan pre prvog tretmana.
Davanje lekova
[0166] Miševima je doziran tretman lekova kandidata razblažen u nosaču od 60-tog dana nakon rođenja do smrti. Razblaženi rastvori kandidata lekova pripremaju se sa vodom na sobnoj temperaturi neposredno pre početka davanja.
• U vodi za piće :
[0167] Riluzol je dodat u vodu za piće u konačnoj koncentraciji od 6mg/ml (prilagođen svakoj srednjoj grupnoj telesnoj težini) u 5 % ciklodekstrina. Kako miš popije oko 5 ml/dan, procenjena doza koja je davana je 30mg/kg/dan što je doza koja je pokazala da povećava opstanak miševa.
- Ciklodekstrin se koristi kao nosač u konačnoj koncentraciji od 5%, razređen u vodi na sobnoj temperaturi od kupovnog rastvora (ciklodekstrin 20%).
• Oralna primena (per os) :
[0168]
- Kombinacije lekova davane su per os, svakodnevno.
- Ciklodekstrin se koristi kao nosač u konačnoj koncentraciji od 5%, razređen u vodi na sobnoj temperaturi od kupovnog rastvora (ciklodekstrin 20 %).
Klinička opservacija
[0169] Klinička opservacija svakog miša odvijala se svakodnevno, od prvog dana tretiranja (60 dana starosti) do smrti (ili žrtvovanja). Klinička opservacija sastoji se u proučavanju bihejvioralnih testova: početak paralize, " gubitak ukošene strane ", " gubitak refleksa uspravljanja ", i opšta opsrevacija hoda:
4
- Početak paralize: posmatranje se sastoji od opservacije paralize svakog uda. Pojava paralize odgovara danu prvih znakova paralize.
-Test gubitka ukošene strane sastoji se od potresa ili potresnih obaveštenja i položaj zadnjeg ekstremiteta (visi ili je iskošen napolje) kada je miš je suspendovan za rep.
-Test gubitka refleksa uspravljanja procenjuje sposobnost miša da se ispravi u 30 sekundi pošto je okrenut na neku stranu. Refleks uspravljanja je izgubljen kada miš nije u stanju da se ispravi. Gubitak refleksa uspravljanja određuje krajnji stadijum bolesti: miš koji ne može da se ispravi je eutanaziran.
Rezultati - Kombinacione terapije su efikasne u ALS in vivo modelu
[0170] Poboljšanje bolesti primećeno je za obolele životinje tretirane sa baklofen i akamprosat kombinacijom.
III) ZAŠTITNI EFEKAT KOMBINACIJA U OKSALIPLATIN INDUKOVANOJ NEUROPATIJI U IN VIVO MODELU ZA NEUROPATSKI BOL.
[0171] Kombinacione terapije iz ovog pronalaska testirane su in vivo, u odgovarajućim modelima periferne neuropatije, odnosno, akutnom modelu oksaliplatin-indukovane neuropatije i hroničnog modela oksaliplatin-indukovane neuropatije. Životinje, protokoli i rezultati predstavljeni su u ovom odeljku.
Uzgajanje životinja
[0172] Korišćeni su Sprague-Dawley pacovi (CERJ, Francuska), mase 150 - 175 g na početku eksperimentalnog tretmana oksaliplatinom (D0). Životinje su smeštene u životinjski odeljak sa ograničenim pristupom na temperaturi (19,5 °C - 24,5 °C) i relativnom vlažnosti (45 % - 65 %) kontrolisanim sobnim 12-časovnim ciklusom svetlo/tama, sa ad libitum pristupom standardne peletirane laboratorijske hrane i vode tokom studije. Životinje su smeštene 4 ili 5 po kavezu, a jednonedeljni period aklimatizacije posmatran je pre testiranja.
Eksperimentalni dizajn
[0173] Četiri sledeće grupe pacova upotrebljene su u svim eksperimentima:
Kontrolne grupe :
[0174] Grupa 1: Nosač oksaliplatina (destilovana voda), i.p./ nosač kandidata kombinacije(a) (destilovana voda), p.o. dnevno.
Grupa 2: Oksaliplatin (destilovana voda), i.p./ nosač kandidata kombinacije(a) (destilovana voda), p.o. dnevno.
Grupa 3: Okaliplatin 3 mg/kg i.p./pojedinačan lek u destilovanoj vodi, p.o. dnevno x 9.
Grupe testirane kompozicije:
[0175] Grupa 4: Oksaliplatin 3 mg/kg i.p./kandidat kombinacija(e) u destilovanoj vodi, p.o. dnevno x 9. Grupa 5: Oksaliplatin 3 mg/kg i.p./gabapentin (100 mg/kg) u destilovanoj vodi, p.o. tokom dana ispitivanja (tj. D1i D8);
Vozila i test artikli isporučivani su svakodnevno od D-1 do D7 (dan pre poslednjeg dana testiranja), dok se gabapentin davao tokom dana za ispitivanje (120 minuta pre testa). Svi tretmani su ordinirani u kodiranom i slučajnom redosledu kada je to moguće. Doze su izražene u smislu slobodne aktivne supstance.
Indukovanje neuropatije
[0176] Akutna neuropatija indukovana je jednom intraperitonealnom injekcijom oksaliplatina (3 mg/kg). Hronična periferna neuropatija izazvana je stalnim intraperitonealnim injekcijama oksaliplatina (3 mg/kg, i.p.) danima 0, 2, 4 i 7 (CD = 12 mg/kg, i.p.). Hronična neuropatija kod ljudi je kumulativna i najčešće primećena kod pacijenata koji su primili ukupne doze oksaliplatina > ili =540 mg/m<2>što odgovara do ∼15 mg/kg kao kumulativna doza kod pacova (Cersosimo R.J.2005).
Oksaliplatin-indukovana bolna neuropatija kod pacova reprodukuje simptome bola kod oksaliplatintretiranih pacijenata:
-Termalna hiperalgezija je najraniji simptom. Može se meriti acetonskim testom ili sa testom uranjanja repa;
-Mehanička hiperalgezija se pojavljuje kasnije. Može se kvantifikovati sa Von Frey testom ili testom pritiska na šapu.
Doziranje životinja i testiranje
[0177] Sve kombinacije lekova ordinirane su od dana pre prve intraperitonealne injekcije oksaliplatina 3 mg/kg (D-1) i sprovođene dnevno oralno do D7. Tokom dana testiranja (tj. D1 i D7), kombinacije lekova
1
se ordiniraju posle testa. Životinje iz referentne - tretirane grupe (gabapentin) dozirane su samo tokom dana testiranja.
Aceton test
[0178] Hladna alodinija procenjena je korišćenjem aceton testa merenjem odgovora na termalne nenociceptivne stimulacije tokom D1 (oko 24h posle prve injekcije oksaliplatina 3 mg/kg (akutni efekat oksaliplatina), i D8 (hronični efekat oksaliplatina).
U aceton testu, latencija povlačenja zadnje šape meri se nakon primene kapi acetona na planarnu površinu obe zadnje šape (vreme reakcije) i tako se dobija intenzitet odgovora (hladan rezultat). Vreme reakcije na efekat hlađenja acetona meri se u roku od 20 sekundi (cut-off) posle primene acetona. Odgovori na aceton se takođe ocenjuju na osnovu sledeće 4-stepenaste skale: 0 (bez odgovora); 1 (brzo povlačenje, grčenje šape); 2 (produženo povlačenje ili označeno grčenje šape); 3 (ponavljano grčenje šape sa lizanjem ili ujedanjem).
Za svaku eksperimentalnu grupu, rezultati su izraženi kao:
-Vreme reakcije definisano kao vreme izraženo u sekundama koje je potrebno da izazove reakciju šape (srednja vrednost 6 merenja za svakog pacova zajedno ±SEM).
-Kumulativna hladna ocena definisan kao zbir 6 rezultata za svakog pacova zajedno ±SEM. Minimalni rezultat je 0 (nikakav odgovor na bilo koji od 6 pokušaja) i maksimalni mogući rezultat je 18 (ponavljanje grčenja i lizanja ili ujedanje šapa na svakom od šest ispitivanja).
Statističke analize
[0179] Izveden je Studentski test, jednostrano, tip 3. Nivo značajnosti je podešen kao p< 0,05; sve grupe su upoređene sa obolelom grupom grupom nosača (oksaliplatin-tretirana grupa). Sredstva i srednja vrednost standardne greške prikazani su na crtežima.
Rezultati
[0180] Oksaliplatin je indukovao značajan pad u reakcionom vremenu povlačenja šape nakon aplikacije acetona (obolela grupa nosač) tokom određenog vremena. Ovaj pad je progresivan i značajan od dana 1 (akutni model oksaliplatin indukovane neuropatije) do dana 8 (hronični model) u odnosu na grupu nosača.
• Anti-alodinični efekat u akutnom modelu i hroničnom modelu oksaliplatin-indukovane neuropatije
2
[0181] Kombinacija baklofena i akamprosata testirana je u oba modela oksaliplatin-indukovane neuropatije. Ona indukuje značajno smanjenje kumulativnog hladnog rezultata i značajno povećava vremena reakcije u poređenju sa oksaliplatin-nosač tretiranom grupom. Kao zaključak, ova kombinacija lekova štiti od hronične i akutne neuropatije.
REFERENCE
[0182]
1. Crook R.et al. (1998). A variant of Alzheimer's disease with spastic paraparesis and unusual plaques due to deletion of exon 9 of presenilin 1. Nat Med.4(4): 452-5.
2. Houlden H., Baker M., et al. (2000). Variant Alzheimer's disease with spastic paraparesis and cotton wool plaques is caused by PS-1 mutations that lead to exceptionally high amyloid-beta concentrations. Ann Neurol.48(5): 806-8.
3. Kwok J.B., Taddei K., et al. (1997). Two novel presenilin-1 mutations in early-onset Alzheimer's disease pedigrees and preliminary evidence for association of presenilin-1 mutations with a novel phenotype. Neuroreport.8(6): 1537-42.
4. Verkkoniemi A., Kalimo H., et al. (2001). Variant Alzheimer disease with spastic paraparesis: neuropathological phenotype. J Neuropathol Exp Neurol.60(5): 483-92.
5. Citron M. (2004). Strategies for disease modification in Alzheimer's disease. Nat Rev Neurosci.
5(9): 677-85.
6. Suh Y.H. and Checler F. (2002). Amyloid precursor protein, presenilins, and alpha-synuclein: molecular pathogenesis and pharmacological applications in Alzheimer's disease. Pharmacol Rev.54(3): 469-525.
7. Blacker D., Albert M.S., et al. (1994). Reliability and validity of NINCDS-ADRDA criteria for Alzheimer's disease. The National Institute of Mental Health Genetics Initiative. Arch Neuron.
51(12): 1198-204.
8. Rossor M.N., Fox N.C., et al. (1996). Clinical features of sporadic and familial Alzheimer's disease. Neurodegeneration.5(4): 393-7.
9. Glenner G.G., Wong C.W., et al. (1984). The amyloid deposits in Alzheimer's disease: their nature and pathogenesis. Appl Pathol.2(6): 357-69.
10. Ballatore C., Lee V.M., et al. (2007). Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer's disease and related disorders. Nat Rev Neurosci.8(9): 663-72.
11. Bell K.F. and Claudio Cuello A. (2006). Altered synaptic function in Alzheimer's disease. Eur J Pharmacol.545(1): 11-21.
12. Hardy J.A. and Higgins G.A. (1992). Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science.256(5054): 184-5.
13. Braak H. and Braak E. (1991). Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol.82(4): 239-59.
14. Golde T.E. (2005). The Abeta hypothesis: leading us to rationally-designed therapeutic strategies for the treatment or prevention of Alzheimer disease. Brain Pathol.15(1): 84-7. 15. Hardy J. and Selkoe D.J. (2002). The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science.297(5580): 353-6.
16. Selkoe D.J. (2000). The genetics and molecular pathology of Alzheimer's disease: roles of amyloid and the presenilins. Neurol Clin.18(4): 903-22.
17. Zlokovic B. V., The Blood Brain Barrier In Health And Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron review.2008, 57, 178-201.
18. Budd Haeberlein, S.L. and S.A. Lipton, Excitotoxicity in neurodegenerative disease, in Encyclopedia of neuroscience, L.R. Squire, Editor.2009, Elsevier. p.77-86.
19. Hughes, J.R., Alcohol withdrawal seizures. Epilepsy Behav, 2009.15(2): p.92-7.
20. Kim, A.H., G.A. Kerchner, and C. DW, Blocking Excitotoxicity, in CNS Neuroprotection, F.W. Marcoux and D.W. Choi, Editors.2002, Springer: New York. p.3-36.
21. Hama A, Sagen J., Antinociceptive effect of riluzole in rats with neuropathic spinal cord injury pain. J Neurotrauma.2011 Jan;28(1):127-34.
23. Malgouris, C., et al., Riluzole, a novel antiglutamate, prevent memory loss and hippocampal neuronal damage in ischemic gerbils. J Neurosci, 1989.9(11): p.3720-7.
24. Wahl, F., et al., Effect of riluzole on focal cerebral ischemia in rats. Eur J Pharmacol, 1993.
230(2): p.209-14.
25. Wahl, F., et al., Riluzole reducers brain lesions and improves neurological function in rats after a traumatic brain injury. Brain Res, 1997.756(1-2): p.247-55.
26. McGleenon B.M., Dynan K.B. and Passmore A.P. (1999). Acetylcholinesterase inhibitors in Alzheimer's disease. Br J Clin Pharmacol.48(4): 471-480.
27. Parsons C.G., Danysz W, Quack G. (1999). Memantine is a clinically well tolerated N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist--a review of preclinical data. Neuropharmacology. 38(6):735-67.
28. Magnaghi V, et al. GABA receptor-mediated effects in the peripheral nervous system: a cross-interaction with neuroactive steroids. Journal of Molecular Neuroscience.2006, 28:89-102.
29. Ettmayer, P., Amidon, G. L., Clement, B. & Testa, B. Lessons learned from marketed and investigational prodrugs. J. Med. Chem.47, 2393-2404 (2004).
4
30. Beaumont, K., Webster, R., Gardner, I. & Dack, K. Design of ester prodrugs to enhance oral absorption of poorly permeable compounds: challenges to the discovery scientist. Curr. Drug Metab.4, 461-485 (2003).
31. Heimbach, T. et al. Enzyme-mediated precipitation of parent drugs from their phosphate prodrugs. Int. J. Pharm.261, 81-92 (2003).
32. Yang, C. Y., Dantzig, A. H. & Pidgeon, C. Intestinal peptide transport systems and oral drug availability. Pharm. Res.16, 1331-1343 (1999).
33. Steffansen, B. et al. Intestinal solute carriers: an overview of trends and strategies for improving oral drug absorption. Eur. J. Pharm. Sci.21, 3-16 (2004).
34. Stella, V. et al. Prodrugs: Challenges and Rewards (AAPS, New York, 2007).
35. Wermuth, CG. The Practice of Medicinal Chemistry. (Hardbound, 2003). Part VI, Chap 33: Designing prodrugs and bioprecursors.
36. Pezron, I. et al. Prodrug strategies in nasal drug delivery. Export Opin. Ther. Pat., Vol.12, No.
3 , 331-340 (2002).
37. Stella, V. J. Prodrugs as therapeutics. Expect Opin. Ther. Pat.14, 277-280 (2004).
38. Stella, V. J. & Nti-Addae, K. W. Prodrug strategies to overcome poor water solubility. Adv. Drug Deliv. Rev.59, 677-694 (2007).
39. Higuchi, T.; Stella, V. eds. Prodrugs As Novel Drug Delivery Systems. ACS Symposium Series. American Chemical Society: Washington, DC (1975).31.
40. Roche, E. B. Design of Biopharmaceutical Properties through Prodrugs and Analogs.
American Pharmaceutical Association: Washington, DC (1977).
41. Lal, R., et al., Arbaclofen placarbil, a novel R-baclofen prodrug: improved absorption, distribution, metabolism, and elimination properties compared with R-baclofen. J Pharmacol Exp Ther, 2009.330(3): p.911-21.
42. Feng Xu, Ge Peng, Thu Phan, Usha Dilip, Jian Lu Chen, Tania Chernov-Rogan, Xuexiang Zhang, Kent Grindstaff, Thamil Annamalai, Kerry Koller, Mark A. Gallop, David J. Wustrow, Discovery of a novel potent GABAB receptor agonist; Bioorg Med Chem Lett.2011 Nov 1;21(21):6582-5.)
43. Andrew R. Leach,Valerie J. Gillet. An Introduction to Chemoinformatics. Springer 2007. 44. S. Asad Rahman, M. Bashton, G. L. Holliday, R. Schrader and J. M. Thornton: Small Molecule Subgraph Detector (SMSD) Toolkit, Journal of Cheminformatics 2009, 1:12 doi:10.1186/1758-2946-1-12
45. Stahl H., Wermuth C. G. (Eds.) Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use. Wiley-VCH; 2 edition (March 29, 2011).
46. Wishart DS, Knox C, Guo AC, Cheng D, Shrivastava S, Tzur D, Gautam B, Hassanali M.
DrugBank: a knowledgebase for drugs, drug actions and drug targets. Nucleic Acids Res.36, Issuesuppl 1. D901-D906 (2008).
47. Singer C. et al. Mitogen-activated protein kinase pathway mediates estrogen neuroprotection after glutamate toxicity in primary cortical neurons. J. Neuroscience, 1999, 19(7):2455-2463.
48. Braun S, Croizatb B, Lagrangec MC, Wartera JM, Poindron P. Neurotrophins increase motoneurons'ability to innervate skeletal muscle fibers in rat spinal cord-human muscle cocultures. Volume 136, Issues 1-2, March 1996, Pages 17-23.
49. Meunier J, Ieni J, Maurice T. The anti-amnesic and neuroprotective effects of donepezil against amyloid ∼25-35 peptide-induced toxicity in mice involve an interaction with the G, receptor. Br J Phamlacol.149, 998-1012,2006.
50. Hama A T et al. Synergistic interaction between intrathecal gamma-amynobutyrate (GABA) receptor agonists and an N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonist in rats with neuropathic spinal cord injury pain, Society for Neuroscience abstract viewer and itinerary planner, vol.40, 2010.
51. Lyden Patrick D et al. Combination therapy protects ischemic brain in rats: A glutamate antagonist plus a gamma-aminobutyric acid agonist, Stroke, Lippincott Williams & Wilkings, US, vol.25, no.1, 1994, pages 189-195.
52. C. Costa. Coactivation of GABAA and GABAB Receptor Results in Neuroprotection During in Vitro Sichemia, Stroke, vol.35, no.2, February 2004, pages 596-600.
53. Cui Zhou et al. Neuroprotection of [gamma]-aminobutyric acid receptor agonists via enhancing neuronal nitric oxide synthase (Ser847) phosphorylation through increased neuronal nitric oxide synthase and PSD95 interaction and inhibited protein phosphatase activity in cerebral ischemia, Journal of Neuroscience Research, vol.86, no.13, October 2008, pages 2973-2983.

Claims (13)

Patentni zahtevi
1. Kompozicija koja obuhvata baklofen ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i akamprosat ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.
2. Kompozicija prema zahtevu 1, koja dalje obuhvata najmanje jedno jedinjenje odabrano od sulfisoksazola, metimazola, prilokaina, difilina, kvinakrina, karbenoksolona, aminokapronske kiseline, kabergolina, dietilkarbamazina, cinakalceta, cinarizina, eplerenona, fenoldopama, leflunomida, levozimendana, sulodeksida, terbinafina, zonisamida, etomidata, fenformina, trimetazidina, meksiletina, ifenprodila, moksifloksacina, bromokriptina ili torasemida, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.
3. Kompozicija prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu pomenuta kompozicija obuhvata najmanje jednu od sledećih kombinacija jedinjenja:
baklofen i akamprosat,
baklofen i akamprosat i dietilkarbamazin,
baklofen i akamprosat i cinakalcet,
baklofen i akamprosat i sulfisoksazol,
baklofen i akamprosat i torasemid,
baklofen i akamprosat i ifenprodil,
baklofen i akamprosat i meksiletin,
baklofen i akamprosat i eplerenon,
baklofen i akamprosat i levozimendan,
baklofen i akamprosat i terbinafin, ili
baklofen i akamprosat i leflunomid,
ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.
4. Kompozicija prema zahtevu 1, koja obuhvata najmanje jednu od sledećih kombinacija jedinjenja: baklofen, akamprosat i rivastigmin,
baklofen, akamprosat i memantin, ili
baklofen, akamprosat i gabapentin,
ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.
5. Kompozicija prema zahtevu 1, koja obuhvata baklofen i akamprosat ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, kao jedine aktivne agense.
6. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, koja dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent.
7. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, kod koje su jedinjenja fprmulisana za kombinovano ili odvojeno davanje.
8. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu je pomenuta kompozicija prilagođena za oralno davanje.
9. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, kod koje je maseni odnos akamprosat/baklofen obuhvaćen opsegom između 0,05 i 1000.
10. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu je pomenuta kompozicija formulisana u jednom ili višestrukom jediničnom doznom obliku pogodnom za dnevno davanje.
11. Kompozicija prema zahtevu 10, pri čemu je ukupna doza baklofena pogodna za dnevno davanje manja od 100 mg.
12. Kompozicija prema zahtevu 10 ili 11, pri čemu je ukupna doza akamprosata pogodna za dnevno davanje manja od 1000 mg.
13. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, koja obuhvata kalcijumovu so akamprosata.
RS20180734A 2011-03-01 2012-03-01 Terapija neuroloških poremećaja kombinacijom baklofena i akamprosata RS57426B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11305217 2011-03-01
US201161468658P 2011-03-29 2011-03-29
US201161493606P 2011-06-06 2011-06-06
EP11305687 2011-06-06
EP13196468.6A EP2796132B1 (en) 2011-03-01 2012-03-01 Baclofen and acamprosate based therapy of neurological disorders

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57426B1 true RS57426B1 (sr) 2018-09-28

Family

ID=46758335

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20140089A RS53227B (sr) 2011-03-01 2012-03-01 Terapija neuroloških poremećaja kombinacijom baklofena i akamprosata
RS20181431A RS58114B1 (sr) 2011-03-01 2012-03-01 Terapija neuroloških poremećaja kombinacijom baklofena i akamprosata
RS20180734A RS57426B1 (sr) 2011-03-01 2012-03-01 Terapija neuroloških poremećaja kombinacijom baklofena i akamprosata

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20140089A RS53227B (sr) 2011-03-01 2012-03-01 Terapija neuroloških poremećaja kombinacijom baklofena i akamprosata
RS20181431A RS58114B1 (sr) 2011-03-01 2012-03-01 Terapija neuroloških poremećaja kombinacijom baklofena i akamprosata

Country Status (26)

Country Link
US (7) US9820978B2 (sr)
EP (5) EP3332781A1 (sr)
JP (2) JP5987008B2 (sr)
KR (2) KR101937782B1 (sr)
CN (2) CN103596562B (sr)
AU (2) AU2012222351B2 (sr)
BR (1) BR112013022112B1 (sr)
CA (1) CA2828765C (sr)
CY (3) CY1115074T1 (sr)
DK (3) DK2727588T3 (sr)
EA (2) EA023277B1 (sr)
ES (5) ES2698927T3 (sr)
HR (1) HRP20140131T1 (sr)
HU (1) HUE038653T2 (sr)
IL (2) IL228177B (sr)
LT (2) LT2796132T (sr)
MX (2) MX373746B (sr)
PL (3) PL2560631T3 (sr)
PT (1) PT2560631E (sr)
RS (3) RS53227B (sr)
SG (2) SG192968A1 (sr)
SI (3) SI2560631T1 (sr)
SM (3) SMT201800327T1 (sr)
TR (1) TR201809351T4 (sr)
WO (2) WO2012117075A2 (sr)
ZA (1) ZA201306039B (sr)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2065038A1 (en) 2007-11-30 2009-06-03 Pharnext New therapeutic approaches for treating Charcot-Marie-Tooth disease
EP2135607A1 (en) 2008-06-18 2009-12-23 Pharnext Combination of pilocarpin and methimazol for treating Charcot-MarieTooth disease and related disorders
US9393241B2 (en) 2009-06-02 2016-07-19 Pharnext Compositions for treating CMT and related disorders
EP2263665A1 (en) 2009-06-02 2010-12-22 Pharnext New compositions for treating CMT and related disorders
US9387206B2 (en) 2009-11-03 2016-07-12 Pharnext Therapeutic approaches for treating Alzheimer's disease
EP2322163A1 (en) 2009-11-03 2011-05-18 Pharnext New therapeutics approaches for treating alzheimer disease
KR101937782B1 (ko) 2011-03-01 2019-01-11 파넥스트 바클로펜 및 아캄프로세이트에 기초한 신경 장애의 치료
US10010515B2 (en) 2011-03-01 2018-07-03 Pharnext Therapeutic approaches for treating Parkinson's disease
EP2705842A1 (en) * 2012-09-05 2014-03-12 Pharnext Therapeutic approaches for treating parkinson's disease
UA113165C2 (xx) * 2011-03-01 2016-12-26 Застосування комбінації баклофену і акампросату для лікування неврологічних захворювань та композиція, яка містить баклофен і акампросат
US9241933B2 (en) 2011-03-01 2016-01-26 Pharnext Compositions for treating amyotrophic lateral sclerosis
US9867837B2 (en) * 2011-03-01 2018-01-16 Pharnext Compositions for treating neurological disorders
US9248111B2 (en) 2011-03-01 2016-02-02 Pharnext Therapeutic approaches for treating parkinson's disease
US9931326B2 (en) 2011-03-29 2018-04-03 Pharnext Composition comprising torasemide and baclofen for treating neurological disorders
GB2501457A (en) 2012-02-10 2013-10-30 Rational Intellectual Holdings Ltd Assigning player positions in an online table game
AU2013224959B2 (en) * 2012-03-01 2017-12-07 Pharnext New compositions for treating amyotrophic lateral sclerosis
SMT201700373T1 (it) * 2012-03-01 2017-09-07 Pharnext Nuove composizioni per il trattamento della sclerosi laterale amiotrofica
NZ704280A (en) * 2012-07-18 2017-06-30 Pharnext Baclofen and acamprosate based therapy of macular degeneration disorders
EP2705841A1 (en) 2012-09-05 2014-03-12 Pharnext Combinations of nootropic agents for treating cognitive dysfunctions
GB201300684D0 (en) 2013-01-15 2013-02-27 Apitope Int Nv Peptide
DK3003268T3 (en) 2013-06-05 2018-11-05 Pharnext STABLE ORAL SOLUTIONS FOR COMBINED API
PL3010543T3 (pl) * 2013-06-19 2026-01-19 Som Innovation Biotech, S.A. Środki terapeutyczne stosowane w profilaktyce i/lub leczeniu hiperkinetycznych zaburzeń ruchowych
KR102206745B1 (ko) * 2013-07-12 2021-02-03 경상대학교산학협력단 안토시아닌 및 gabab 수용체 작용제를 유효성분으로 포함하는 신경질환 치료제
WO2015023830A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Stc.Unm Treatment and prevention of stroke and other neurological disorders
WO2015063140A1 (en) * 2013-10-30 2015-05-07 Pharnext Compositions, methods and uses for the treatment of diabetes and related conditions by controlling blood glucose level
MX2016010409A (es) 2014-02-11 2016-11-30 Pharnext Combinacion de baclofeno, acamprosato y trigliceridos de cadena media para el tratamiento de trastornos neurologicos.
WO2016081472A1 (en) * 2014-11-21 2016-05-26 Biohaven Pharmaceutical Holding Company Ltd. Sublingual formulation of riluzole
KR102790656B1 (ko) 2015-05-04 2025-04-02 컨플루언스 파마슈티컬스, 엘엘씨 아캄프로세이트의 스프링클 제형
EP3156050A1 (en) * 2015-10-16 2017-04-19 Universitat Autònoma De Barcelona New combination therapies for treating neurological damage
US11026942B2 (en) 2015-12-29 2021-06-08 Kyoto University Agent for preventing and/or treating Alzheimer's disease
CN109069450A (zh) * 2016-02-05 2018-12-21 法奈克斯公司 神经障碍的新的组合疗法
US10383870B2 (en) 2016-06-10 2019-08-20 Pharnext Early treatment of CMT disease
CN111050761A (zh) * 2017-04-24 2020-04-21 法奈克斯公司 阿尔茨海默病的基于idalopirdine的组合治疗
IL270654B2 (en) * 2017-05-17 2024-07-01 Confluence Pharmaceuticals Llc Formulations of homotaurines and salts thereof
CA3067688A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Novartis Ag Use of mavoglurant in the reduction of alcohol use or in preventing relapse into alcohol use
EP3661500B1 (en) 2017-07-31 2026-01-07 Novartis AG Use of mavoglurant in the reduction of cocaine use or in preventing relapse into cocaine use
EP3746062A1 (en) * 2018-01-29 2020-12-09 Pharnext Baclofen and acamprosate based therapy of alzheimer's disease in patients having lost responsiveness to acetylcholinesterase inhibitor therapy
CN116059192B (zh) 2019-11-13 2024-10-29 润佳（苏州）医药科技有限公司 同位素富集的3-氨基-1-丙磺酸及其衍生物的用途
WO2023154794A1 (en) * 2022-02-09 2023-08-17 University Of North Texas Health Science Center Drug repurposing for delayed treatment of ischemic stroke
CN115350172A (zh) * 2022-08-12 2022-11-18 昆明医科大学 Gabapentin对AD情景记忆改善的应用
WO2025095099A1 (ja) * 2023-11-02 2025-05-08 株式会社ケイファーマ 前頭側頭葉変性症治療剤及び治療用組成物

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5721263A (en) 1993-06-07 1998-02-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Pharmaceutical composition for angiotensin II-mediated diseases
US6573251B2 (en) 1994-03-30 2003-06-03 Denis Barritault Drug and pharmaceutical composition for the treatment of lesions of the nervous system and fractions enriched in heparan sulfate
US6391922B1 (en) * 1998-01-13 2002-05-21 Synchroneuron, Llc Treatment of posttraumatic stress disorder, obsessive-compulsive disorder and related neuropsychiatric disorders
AU3173301A (en) 2000-02-11 2001-08-20 European Molecular Biology Laboratory Methods and compositions for treatment of alzheimer's disease by enhancing plasmin or plasmin-like activity
US20030149010A1 (en) 2001-07-19 2003-08-07 Keller Bradley T. Combination of an aldosterone receptor antagonist and an HMG CoA reductase inhibitor
AU2002316231A1 (en) 2002-02-19 2003-09-29 Xenoport, Inc. Methods for synthesis of prodrugs from 1-acyl-alkyl derivatives and compositions thereof
US20040067918A1 (en) 2002-03-18 2004-04-08 Keller Bradley T. Combination of an aldosterone receptor antagonist and nicotinic acid or a nicotinic acid derivative
US20040102525A1 (en) 2002-05-22 2004-05-27 Kozachuk Walter E. Compositions and methods of treating neurological disease and providing neuroprotection
ES2584606T3 (es) 2002-10-10 2016-09-28 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Microesferas que comprenden ONO-1301
BRPI0413756A (pt) 2003-08-20 2006-10-31 Xenoport Inc composto, métodos para tratar ou evitar espasticidade ou um sintoma de espasticidade, doença de refluxo gastro-esofágico, vìcio em droga, vìcio em ou abuso de álcool, ou vìcio em ou abuso de nicotina, e tosse ou êmese em um paciente, e, composição farmacêutica
CN102702065A (zh) 2003-12-30 2012-10-03 什诺波特有限公司 酰氧基烃基氨基甲酸酯前药及其中间体的合成
US20080025962A1 (en) 2004-11-30 2008-01-31 Angesmg,Inc. Remedy for Alzheimer's Disease
US20080188510A1 (en) 2005-05-23 2008-08-07 Eisai R & D Management Co., Ltd. Novel methods using zonisamide
AU2006308889A1 (en) 2005-10-31 2007-05-10 Braincells, Inc. GABA receptor mediated modulation of neurogenesis
KR20090026275A (ko) 2006-07-06 2009-03-12 로스캄프 리서치 엘엘씨 베타-아밀로이드 생성을 억제하기 위한 화합물 및 그의 조합물, 및 그의 사용 방법
TWI369982B (en) 2007-01-11 2012-08-11 Xenoport Inc Sustained release oral dosage forms of a prodrug of r-baclofen and methods of treatment
KR101441725B1 (ko) 2007-05-22 2014-09-18 오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤 알츠하이머병 치료를 위한 카르보스티릴 유도체 및 도네페질을 포함하는 치료제
WO2009033069A1 (en) 2007-09-07 2009-03-12 Xenoport, Inc. Simple pantoic acid ester neopentyl sulfonyl ester cyclization release prodrugs of acamprosate, compositions thereof, and methods of use
US20090082464A1 (en) 2007-09-07 2009-03-26 Bernd Jandeleit Externally masked neopentyl sulfonyl ester cyclization release prodrugs of acamprosate, compositions thereof, and methods of use
TW200932734A (en) 2007-10-15 2009-08-01 Xenoport Inc Internally masked neopentyl sulfonyl ester cyclization release prodrugs of acamprosate, compositions thereof, and methods of use
US20090118365A1 (en) * 2007-11-06 2009-05-07 Xenoport, Inc Use of Prodrugs of GABA B Agonists for Treating Neuropathic and Musculoskeletal Pain
US20100137442A2 (en) 2008-02-01 2010-06-03 Xenoport, Inc. Sustained Release Particulate Oral Dosage Forms of (R)-Baclofen and Methods of Treatment
WO2009096985A1 (en) 2008-02-01 2009-08-06 Xenoport, Inc. Sustained release particulate oral dosage forms of (r)-baclofen prodrugs and methods of treatment
DK2282779T3 (da) 2008-04-29 2013-05-27 Pharnext Nye terapeutiske fremgangsmåder til behandling af alzheimer sygdom og beslægtede lidelser gennem en modulation af cellestress-respons
WO2009133128A1 (en) * 2008-04-29 2009-11-05 Pharnext Combination compositions for treating alzheimer disease and related disorders with zonisamide and acamprosate
PL2282778T3 (pl) * 2008-04-29 2017-08-31 Pharnext Nowe podejścia terapeutyczne do leczenia choroby alzheimera i powiązanych zaburzeń poprzez modulację angiogenezy
EP2135607A1 (en) 2008-06-18 2009-12-23 Pharnext Combination of pilocarpin and methimazol for treating Charcot-MarieTooth disease and related disorders
EP2377865B1 (en) 2008-11-27 2014-12-17 National University Corporation Kagawa University Cyclobutyl purine derivative, angiogenesis promoting agent, lumenization promoting agent, neurocyte growth promoting agent, and drug
CA2745741A1 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 Intec Pharma Ltd. Zaleplon gastroretentive drug delivery system
KR20110117216A (ko) 2009-03-03 2011-10-26 제노포트 인코포레이티드 Ｒ-바클로펜 전구약물의 서방형 경구 투약 형태
EP2419401A2 (en) 2009-04-17 2012-02-22 XenoPort, Inc. GAMMA-AMINO-BUTYRIC ACID DERIVATIVES AS GABAb RECEPTOR LIGANDS
EP2263665A1 (en) 2009-06-02 2010-12-22 Pharnext New compositions for treating CMT and related disorders
US9393241B2 (en) 2009-06-02 2016-07-19 Pharnext Compositions for treating CMT and related disorders
US9387206B2 (en) 2009-11-03 2016-07-12 Pharnext Therapeutic approaches for treating Alzheimer's disease
EP2322163A1 (en) 2009-11-03 2011-05-18 Pharnext New therapeutics approaches for treating alzheimer disease
US9241933B2 (en) 2011-03-01 2016-01-26 Pharnext Compositions for treating amyotrophic lateral sclerosis
UA113165C2 (xx) 2011-03-01 2016-12-26 Застосування комбінації баклофену і акампросату для лікування неврологічних захворювань та композиція, яка містить баклофен і акампросат
KR101937782B1 (ko) 2011-03-01 2019-01-11 파넥스트 바클로펜 및 아캄프로세이트에 기초한 신경 장애의 치료
US10010515B2 (en) 2011-03-01 2018-07-03 Pharnext Therapeutic approaches for treating Parkinson's disease
US9248111B2 (en) 2011-03-01 2016-02-02 Pharnext Therapeutic approaches for treating parkinson's disease
US9867837B2 (en) 2011-03-01 2018-01-16 Pharnext Compositions for treating neurological disorders
US9931326B2 (en) 2011-03-29 2018-04-03 Pharnext Composition comprising torasemide and baclofen for treating neurological disorders

Also Published As

Publication number Publication date
CY1120369T1 (el) 2019-07-10
KR20140038378A (ko) 2014-03-28
WO2012117075A3 (en) 2012-12-13
WO2012117075A2 (en) 2012-09-07
EA201891833A1 (ru) 2019-01-31
BR112013022112B1 (pt) 2021-09-28
LT2727588T (lt) 2019-01-25
US20170231958A1 (en) 2017-08-17
EP3332781A1 (en) 2018-06-13
ES2698927T3 (es) 2019-02-06
US20200085790A1 (en) 2020-03-19
DK2796132T3 (en) 2018-07-23
SI2796132T1 (sl) 2018-09-28
CN105997969A (zh) 2016-10-12
SG192968A1 (en) 2013-09-30
AU2012222351A1 (en) 2013-08-29
DK2560631T3 (da) 2014-02-10
HK1182615A1 (en) 2013-12-06
IL228177B (en) 2018-01-31
ES2845204T3 (es) 2021-07-26
HK1203158A1 (en) 2015-10-23
NZ614184A (en) 2015-08-28
CY1120925T1 (el) 2019-12-11
US8741886B2 (en) 2014-06-03
WO2012117076A3 (en) 2012-10-26
US20140080873A1 (en) 2014-03-20
SI2560631T1 (sl) 2014-06-30
CN103596562A (zh) 2014-02-19
ES2678794T3 (es) 2018-08-17
TR201809351T4 (tr) 2018-07-23
EP2560631A2 (en) 2013-02-27
US8865769B2 (en) 2014-10-21
SMT201400029B (it) 2014-07-07
US9636316B2 (en) 2017-05-02
JP5987008B2 (ja) 2016-09-06
PL2560631T3 (pl) 2014-06-30
ES2665569T3 (es) 2018-04-26
AU2017210501A1 (en) 2017-08-17
EA023277B1 (ru) 2016-05-31
US20140378440A1 (en) 2014-12-25
AU2017210501B2 (en) 2018-11-01
WO2012117076A2 (en) 2012-09-07
EP2727588A1 (en) 2014-05-07
EP2796132A1 (en) 2014-10-29
JP6416328B2 (ja) 2018-10-31
AU2012222351B2 (en) 2017-05-18
EP2727588B1 (en) 2018-08-29
EA201300974A1 (ru) 2014-01-30
PL2727588T3 (pl) 2019-04-30
MX340568B (es) 2016-07-14
ES2450074T3 (es) 2014-03-21
SI2727588T1 (sl) 2019-03-29
KR101937782B1 (ko) 2019-01-11
EP2680835B1 (en) 2018-02-07
US9144558B2 (en) 2015-09-29
ZA201306039B (en) 2014-10-29
PT2560631E (pt) 2014-02-24
KR101918745B1 (ko) 2018-11-15
RS58114B1 (sr) 2019-02-28
EP2560631B1 (en) 2014-01-15
SMT201800327T1 (it) 2018-09-13
KR20180043844A (ko) 2018-04-30
MX2013010043A (es) 2014-02-11
EP2796132B1 (en) 2018-05-02
JP2014510069A (ja) 2014-04-24
US20160000736A1 (en) 2016-01-07
LT2796132T (lt) 2018-10-10
HRP20140131T1 (hr) 2014-05-09
SG10201610587SA (en) 2017-02-27
IL261725A (en) 2018-10-31
CA2828765C (en) 2019-07-30
MX373746B (es) 2020-05-20
CN105997969B (zh) 2022-03-25
CY1115074T1 (el) 2016-12-14
BR112013022112A2 (pt) 2018-06-26
SMT201800618T1 (it) 2019-02-28
EP2680835A2 (en) 2014-01-08
PL2796132T3 (pl) 2018-10-31
RS53227B (sr) 2014-08-29
US20130090307A1 (en) 2013-04-11
DK2727588T3 (en) 2018-12-10
US9820978B2 (en) 2017-11-21
HUE038653T2 (hu) 2018-11-28
US20130085122A1 (en) 2013-04-04
CA2828765A1 (en) 2012-09-07
CN103596562B (zh) 2016-06-01
JP2017193562A (ja) 2017-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2796132B1 (en) Baclofen and acamprosate based therapy of neurological disorders
JP6328428B2 (ja) 神経疾患の治療のための新しい組成物
JP6395838B2 (ja) 神経疾患の処置のためのトラセミド及びバクロフェンを含む組成物
IL256992A (en) Treatment of neurological disorders based on baclofen and acamprosate
HK1203158B (en) Baclofen and acamprosate based therapy of neurological disorders
HK1197729A (en) Baclofen and acamprosate based therapy of neurological disorders
HK1197729B (en) Baclofen and acamprosate based therapy of neurological disorders
HK1182615B (en) Baclofen and acamprosate based therapy of neurogical disorders
NZ614184B2 (en) Baclofen and acamprosate based therapy of neurogical disorders
NZ614267B2 (en) New compositions for treating neurological disorders
HK1190607A (en) New compositions for treating neurological disorders