NO155446B - Fremgangsmaate til fremstilling av isomaltulose. - Google Patents

Abstract

Isomaltulose fremstilles ved en fremgangsmåte hvor i det minste det isomaltulosedannende enzymsystem fra en isomaltulosedannende mikroorganisme immobiliseres, hvoretter det immobiliserte enzymsystem bringes i berøring med en sukroseløsning for omdannelse av i det minste en del av sukrosen til isomaltulose.

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av isomaltulose ved omdanning av sukrose med enzymer av isomaltulosedannende bakteriestammer.

Isomaltulose er et reduserende disakkarid som ellers er kjent som palatinose. Det har strukturen

og er mer systematisk kjent som 6-0-(a-D-glukopyranosyl)-D-fruktofuranose.

Historisk ble isomaltulose først nevnte i en artikkel fra 1952, J. Amer. Chem. Soc, Vol 74, 1952, p. 3202, som et biprodukt av en fermenterende mikroorganisme, Leuconostoc mesenteroides. Senere arbeid publisert i 1956 og i 1960, henholdsvis i J. Amer. Chem. Soc, Vol 78, 1956, p. 2514 og J. Org Chem., Vol 25, 1960, p. 1062, bekreftet dannelse av isomaltulose som et biprodukt ved dekstranfremstilling fra sukrose ved hjelp av L. mesenteroides.

I DE-patentskrift 1.04 9.800 er det beskrevet hvordan isomaltulose kan oppnås fra sukrose ved en mikrobiologisk prosess hvor det anvendes Protaminobacter rubrum. Det er kjent at andre bakterier kan anvendes for å bevirke omdanningen av sukrose til isomaltulose, og i UK-patentskrift 1.429.334 (som tilsvarer DE-patentskrift 2.217.628) er det nevnt at Serratia plymuthica er egnet.

Nevnte UK-patentskrift 1.429.334 vedrører primært frem-stillingen av isomaltitol (a-D-glukopyranosyl-1,6-sorbitol)

fra isomaltulose ved katalytisk hydrogenering. I praksis gir hydrogeneringen en blanding som også inneholder a-D-gluko-pyranosyl-1 , 6 -manni tol . Denne blanding er tilgjengelig som et lavkaloriholdig søtningsmiddel under varemerket "Palatinit".

Som fortsettelse på en omtale av nevnte DE-patentskrift 1.049.800 er det i nevnte UK-patentskrift 1.429.334 beskrevet at omdanndngen av sakkarose (dvs. sukrose) til isomaltulose hensiktsmessig utføres ved fermentering under anvendelse av en sukroseløsning som inneholder 15-40 vekti;, fortrinnsvis 20-25 vekt.! .. sukrose. Kraftig omrøring og kontinuerlig passasje av luft benyttes. Det angis videre i UK-patent-skriftet at omdanningen kan utføres satsvis eller kontinuerlig og inneholder et eksempel for begge metoder. Etter fermen-teringen fraskilles isomaltuloseløsningen og kan krystalliseres etter filtrering og ionebytterkromatografi.

Fra Europeisk patentskrift 0001099 er det beskrevet eh fremgangsmåte til kontinuerlig fermentering av mikroorganismer, f.eks. Protaminobacter rubrum eller Serratia plymuthica, med samtidig omdanning av sukrose til isomaltulose. Det angis at det er iakttatt at dyrkingen av isomaltulosedannende mikroorganismer kan utføres kontinuerlig med samtidig omdannelse av sukrose til isomaltulose, og det hevdes at det er overraskende og uventet at isomaltulosedannende mikroorganismer samtidig kan omdanne sukrose til isomaltulose under vekst i sukrose-inneholdende plantesafter.

Den sukrosehoidige løsning spesifiseres som en

tynn saft/tykk saft og/eller tynn saft/klarnet produktblanding fra en sukkerfabrikk og med et tørrstoffinnhold på 5-30%, fortrinnsvis 20-27%, hvorved tørrstoffet inneholder 90-98% sukrose. Bortsett fra Protaminobacter rubrum og Serratia plymuthica er det i nevnte Europeiske patentskrift 0001099 angitt muligheten for anvendelse av Serratia marscescens, Erwinia carotovora eller Leuconostoc mesenteroides som isomaltulosedannende mikroorganisme .

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen vedrører ikke bakteriell, aerob fermentering slik som ifølge kjent teknikk, men benytter immobilisering for å understøtte enzymet eller enzymene som utgjør enzymsystemet som er involvert i omdanningen av sukrose til isomaltulose.

Fremgangsmåten kjennetegnes ved at i det minste bakteriestammens isomaltulosedannende enzymsystem immobiliseres ved innleiring i en gel og at det immobiliserte enzymsystem deretter bringes i berøring med en sukroseløsning som inneholder minst 3 0% vekt/volum sukrose, for omdannelse av i det minste en del av sukrosen til isomaltulose, som deretter utvinnes av den bakteriecellefrie løsning ved krystallisasjon.

Enzymsystemet kan anvendes etter ekstraksjon fra den isomaltulosedannende mikroorganisme, selv om ekstraksjon ikke er nødvendig. Således er det f.eks. mulig å anvende hele eller ødelagte celler av mikroorganismen, hvorved cellene funksjonerer som et bærestoff eller en bærer for enzymsystemet.

En viss oppdeling av hele celler kan opptre etter immobilisering, men det foretrekkes sterkt at immobiliserings-metoden og andre prosessvariable velges slik at deling er fraværende eller på et minimum. I den foretrukne utførelses-form av fremgangsmtåten tas det ingen forholdsregler for å opprettholde levedyktighet hos cellene. Det er vanligvis situasjonen at ingen celledeling opptrer når det gjøres et forsøk på å dyrke cellene etter lengre bruk i den foretrukne utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Mer generelt er det et trekk ved den måte fremgangsmåten best utføres på at sukroseløsningen er næringsmessig mangel-full, dvs. at den mangler ett eller flere av de næringsstoffer som er nødvendig for vekst av den isomaltulosedannende mikroorganisme. På denne måte er det mulig å oppnå den ønskete minimale celledeling ved anvendesle av immobiliserte hele celler for å danne enzymsystemet. I sin tur kan fraværet av næringsstoffer bety et dårligere produkt og senke risikoen for vekst for eventuelle infiserende mikroorganismer.

Enzymsystemet som er ansvarlig for dannelsen av isomaltulose kan ekstraheres fra celler av mikroorganismen på konvensjonell måte, f.eks. ved en løsningsmiddelekstraksjon. For å utføre ekstraksjonen kan det benyttes hjelpemetoder, f.eks. ødeleggelse av cellene eller osmotisk sjokk. Fra utførte forsøk med Erwinia rhapontici (den foretrukne isomaltulosedannende mikroorganisme for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen) viser det seg at enzymsystemet er lokalisert i cellenes periplasmiske rom, og at enzymsystemet er en sukrose-spesifikk glukotransferase som bare anvender fruktosen avledet fra sukrose og ikke anvender fri fruktose eller fruktose kombinert i andre molekyler. Det ekstraherte enzymsystem kan om ønsket renses før anvendelse, f.eks. ved elektroforese.

Innleiring i en gel benyttes særlig på grunn av at den er egnet for immobilisering av en enzymatisk aktiv ekstrakt av cellene og av de hele eller ødelagte celler. Egnete gelmaterialer omfatter alginat, polyakrylamid, agar-agar, xantangummi/johannesfrøgummi, kollagen eller celluloseacetat.

Av disse gelmaterialer har det vist seg at en alginatgel, særlig en kalsiumalginatgel, gir best resultater. Andre alginatgeler kan anvendes, såsom de som dannes med andre metaller av gruppe II, men kalsiumalginat foretrekkes sterkt. Særlig foretrekkes immobiliseringen av hele celler i en kalsiumalginatgel. På denne måte innleires cellene i et inert, tredimensjonalt polymernettverk med forholdsvis store hulrom i gelen.

I en kalsiumalginatgel er hastigheten for innover diffusjon av surkose høy, og det meste av intragelhulrommet kan nås av sukrosen. Dessuten er hastigheten for utadrettet lekkasje av hele celler og protein meget lav, og når den utsettes for trykk deformeres gelen svakt, men komprimeres ikke i vesentlig grad. En ekstra fordel er den eksepsjonelle og overraskende stabilitet av den isomaltulosedannende aktivitet hos de immobiliserte, hele celler. Halveringstiden for aktiviteten av cellene som er innleiret i kalsiumalginatgelen nærmer seg 10.000 timer med 8.500 timer som et typisk tall, mens den lengste halveringstid under sammenliknbare betingelser for andre immobiliseiringsmetoder som er forsøkt er under 1000 timer. I motsetning til de fleste vanlige immobiliseringsmetoder resulterer immobilisering i alginatgel typisk i intet vesentlig tap av aktivitet.

For immobilisering av enzymsystemet (i seg selv eller som hele eller ødelagte celler) i alginatgel foretrekkes det å først blande enzymsystemet med en vandig løsning av et løselig alginat, f.eks. natriumalginat. I en foretrukket fremgangsmåte vil dette omfatte oppslemming av hele celler i det løselige alginat. Konsentrasjonen av celler i oppslemmingen er ikke på noen måte kritisk for at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen skal bli vellykket, men ved å forsøke forskjellige konsentrasjoner kan et optimum lettvint finnes for et spesielt system. Typisk er konsentrasjonen av celler mellom 1 og 90% våtvekt/volum,

selv om den fortrinnsvis er fra 10 til 40% våtvekt/volum,

helst ca. 20% våtvekt/volum. Likeledes er konsentrasjonen av løselig alginat ikke kritisk. Særlig egnete konsentrasjoner for anvendelse med hele celler eller andre former av enzymsystemet er mellom 1 og 10% vekt/volum, helst ca. 5% vekt/volum.

Den resulterende alginatblanding måles deretter inn i

en løsning av et metallsalt som det løselige alginat danner en gel med. Som nevnt er den foretrukne gel kalsiumalginat,

og egnete salter omfatter da kalsiumklorid. Nærmere bestemt foretrekkes det å anvende en kalsiumkloridløsning hvis molari-tet er fra 0,01 til 1,0M, særlig fra 0,05 til 0,5M, helst ca. 0,1M. Metallsaltløsningen er fortrinnsvis ved 15-40°C, helst ca. 30°C, når blandingen måles inn, og det er også fordelaktig dersom løsningen omrøres. Det immobiliserte enzymsystems stabilitet økes dersom metallsaltløsningen dessuten inneholder noe løst sukrose, f.eks. 5-40% (vekt/volum) sukrose, fortrinnsvis ca. 20% (vekt/volum) sukrose.

Ved å måle oppslemmingen eller en annen alginatblanding som atskilte dråper er det en enkelt sak å fremstille kuleformete pellets av gel hvor enzymsystemet er innleiret. Pellet-størrelsen kan variere, men for enkel håndteringsskyld og for effektive masseoverføringsegenskaper i bruk foretrekkes det å anvende pellets som er 3-5 mm i diameter. Størrelsen og formen er imidlertid av begrenset viktighet, og det er meget mulig å immobilisere enzymsystemet i en blokk av gel (som deretter opp-deles for anvendelse), i et rep av gel (som for anvendelse kan

vikles på en spole eller skjæres i deler), eller i mikrofi-

brøse partikler ved anvendelse av betingelser med høy skjær-spenning ved måling i alginatblandingen.

Tilsvarende metoder kan benyttes for immobilisering av enzymsystemet i andre gelsystemer. Fremgangsmåter for fremstilling av produkter i geler er tilgjengelige i litteraturen,

og det er en enkel sak å tilpasse dem til formålene ifølge oppfinnelsen. Som eksempler kan det nevnes at det med vel-

lykket resultat er anvendt følgende for å immobilisere enxymsystemet som immobiliserte hele celler:

(i) Kappa-karagenan eller kappa-karagenan/johannesfrø-

gummi under anvendelse av samme fremgangsmåte som for algi-

natet med unntakelse av at den mest foretrukne løsning som celleoppslemmingen ble innført i var en blanding av IM CaC^

og 1 M KC1 ved 20°C.

(ii) Agar-agar ved koking av 3% vekt/volum agar-agar i avionisert vann, avkjøling av den resulterende gel til 50°C, tilsetning av oppslemmingen av celler samt dråpevis tilsetning av den opnådde suspensjon til iskaldt vann. (iii) Xantan/johannesfrøgummi under anvendelse av samme fremgangsmåte som for agar-agar med unntakelse av at gummien bare ble oppvarmet til 8°C og at gelen ble avkjølt til 60°C

før tilsetning av cellene.

(iv) Polyakrylamid under anvendelse av fremgangsmåten

ifølge Chibata et al, Methods in Enzymology, vol. 44, 1976, p.

739 .

Ved immobilisering av ødelagte celler eller løsnings-middelekstrakter av enzymsystemet unngås alle muligheter for at celledeling skal opptre ved bruk og hindrer således ned-

bryting av pellets og blokkering av porer som til sine tider påtreffes når immobiliserte hele celler deler seg inne i kalsiumalginat-gelpellets. Dessuten er med immibiliserte ødelagte celler eller løsningsmiddelekstrakter begynnelsesaktiviteten høy, noe som gjenspeiler fravær av en intakt celleveggmembran som ville kunne funksjonere som en barriere mot duffusjon av sukrose og isomaltulose. Sprengning kan ut-

føres i kulemøller eller ved annen behandling av hele celler.

Kilden for enzymsystemet som anvendes ved immobiliser-

ingen er fortrinnsvis en isomaltuloseproduserende mikroorga-

nisme av slekten Erwinia. Bakterier eller andre slekter kan anvendes,

såsom Serratia plymuthica eller Protaminobacter rubrum, men den førstnevnte er muligens sykdomsfremkallende hos mennesker, og den sistnevnte er tilbøyelig til å danne et uønsket rødt pigment med lav molekylvekt. Mutanter, varianter og andre artifakter av de naturlig forekommende bakterier kan om ønskelig anvendes. F.eks. kan mutanter innføres kjemisk eller fysi-kalsk .

Av artene som hører til slekten Erwinia foretrekkes

E. rhapontici. Særlig egnete stammer av E. rhapontici omfatter de som er deponert i Storbritannia hos the National Collection of Plant Pathogenic Bacteria under aksesjonsnumrene NCPPB 1578, NCPPB 139 og NCPPB 1739. Stammen NCPPB 1578 er også deponert hos the American Type Culture Collection under aksesjonsnum-meret ATCC 29283. Alle NCPPB-stammer som er nevnt her i beskriv-elsen er oppført i første utgave av "Catalogue of Cultures in the National Collection of Plant Pathogenic Bacteria", som er publisert i 19 77 av United Kingdom Ministry of Agriculture, Food and Fisheries, og er offentlig tilgjengelig.

Stammene NCPPB 1578, 139 og 1739 er særlig lovende idet de er mer spesifikke og har høyere begynnelsesaktivitet og stabilitet i forhold til andre stammer av Erwinia eller stammer av andre slekter.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres fortrinnsvis som en kontinuerlig prosess, hensiktsmessig ved å anbringe det immobiliserte enzymsystem i en søyle og lede substratsukrosen som en løsning gjennom søylen .len foretrukket utførelsesf orm anvendes det atskillige parallelle søyler, f.eks. på en karu-sell. Søylestørrelsen kan velges etter ønske, men er hensiktsmessig fra 20 ml og oppover. Litt karbondioksyd dannes vanligvis ved omdannelsen av sukrosen til isomaltulose når det anvendes immobiliserte hele celler, og det er enklere å fjerne dette karbondioksyd dersom væsken passerer oppover gjennom søylen. Oppadrettet passering av væsken kan også medvirke til å fluidisere sjiktet av immobilisert enzymsystem og unngå sam-mentrykning som vil kunne opptre ved nedadrettet passering.

Mens kjente fremgangsmåter til fremstilling av isomaltulose ved fermentering fortrinnsvis utfares under anvendelse av en sukroseløsning med ca. 25 vekt% sukrose, gir fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse overraskende bedre resultater dersom den utføres ved høyere sukrosekonsentrasjoner, f.eks. ved å anvende som substrat en sukroseløsning som inneholder minst 30%, fortrinnsvis minst 40% og helst minst 50% (vekt/volum) sukrose.

Stabiliteten (målt som halveringstid) for det isomaltulosedannende enzymsystem i de immobiliserte celler øker med økning av sukrosekonsentrasjonen, og det gjør også konsentrasjonen av isomaltulose i den omdannete væske.

Disse virkninger er meget markerte og er vist grafisk

i fig. 1 og 2, som er basert på eksperimentelle data oppnådd ved anvendelse av kalsiumalginatpellets av immobilisert E. rhapontici NCPPB 1739.

I de medfølgende tegninger viser:

Fig. 1 variasjonen i stabilitet av de immobiliserte celler i forhold til konsentrasjonen i sukroseløsningen. Fig. 2 virkningen av sukrosekonsentrasjonen på de immobiliserte cellers produktivitet.

Særlig når sukrosekonsentrasjonen øker over 30-40% øker stabiliteten og produktiviteten i markert større grad. Denne virkning synes hovedsakelig å skyldes en egenskap hos det immobiliserte, isomaltulosedannende enzymsystem enn immo-biliseringsmetoden. Dette betyr at en immobiliseringsmetode hvor det anvendes kalsiumalginat vanligvis gir best stabilitet.

Dessuten har en høy sukrosekonsentrasjon tendens til å inhibere deling av immobiliserte celler og å hindre mikro-biell forurensning samtidig som den gjør det enklere å utvinne produktet og senker væskevolumet som skal behandles.

Det kan således oppnås betydelige fordeler ved å anvende en så høy sukrosekonsentrasjon som det er hensiktsmessig, og i praksis er den eneste begrensning vanligvis løsningens visko-sitet. Det har vist seg at i de fleste tilfeller ligger den øvre viskositetsgrense på mellom 100 cP og 1000 cP, typisk på 500 cP.

I den foretrukne utførelsesform, hvor det anvendes celler som er innleiret i kalsiumalginat-gelpellets er sukrosekonsen-tras jonen i utgangsmaterialet hensiktsmessig ca. 55% vekt/volum.

Substratet behøver ikke å være en løsning av ren sukrose. F.eks. kan det tilsettes opptil 15 volumprosent melasse istedenfor sukrose, og det kan ved fremgangsmåten anvendes gjenvin-ningsmateriale eller "affineringssirup", som er to typer urent sukker som finnes i konvensjonelle sukkerraffinerier.

Omdannelsen av sukrose til isomaltulose ifølge den* foreliggende oppfinnelse utføres fortrinnsvis ved 15-40°C, helst ved 20-35°C, mens en temperatur på ca. 30°C er særlig egnet.

Sukroseløsningens pH er ikke særlig kritisk og er fortrinnsvis fra 5 til 9, helst ca. 7. Omdannelsen til isomaltulose resulterer vanligvis i dannelsen av litt syre, men i praksis er det vanligvis unødvendig å ta forholdsregler for å holde pH i området fra 5 til 9. I alle tilfeller minskes syre-dannelse vanligvis når substratkonsentrasjonen økes.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan utføres slik at det oppnås en kontrollert grad av omdannelse av sukrose til isomaltulose og eventuelle ledsagende produkter. Når tiden sukrosen er i berøring med det immobiliserte enzymsystem øker, øker graden av omdannelse mot det praktiske maksimum (typisk mellom 85 og 100% omdannelse av sukrose til produkter). Men maksimal produktivitet oppnås ikke nødvendigvis ved den høyeste grad av omdannelse på grunn av at hurtigere gjennomføring og høyere aktivitet som fremkommer ved kortere oppholdstid kan kompensere at det ikke arbeides med maksimal omdannelse.

I praksis har det således vist seg at maksimal produktivitet oppnås ved å arbeide ved mindre enn maksimal omdannelse, vanligvis ved mellom 70 og 95% omdannelse til produkter. Det foretrekkes å utføre fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ved eller nær den grad av omdannelse som er nødvendig for maksimal produktivitet. Den omdannelse som er nødvendig for å oppnå størst produktivitet kan lettvint finnes ved systematisk eksperimentering. For å gi et eksempel har det vist seg at for kalsiumalginatpellets av immobiliserte Erwinia-celler er der vanligvis et maksimum i produktivitet ved mellom 80 og 90% omdannelse.

Eksistensen av dette maksimum i produktivitet er vist grafisk i fig. 3 som er basert på forsøksdata oppnådd under anvendelse av kalsiumalginatpellets av immobilisert E. rhapontici NCPPB 1739.

Fig. 3 viser variasjonen i produktivitet av de immobiliserte celler i forhold til begynnelsesomdannelsen i prosent, dvs. den prosentvise omdannelse ved ekstrapolering tilbake til tidspunktet null.

Der er en markert topp i produktivitet ved 85-90% omdannelse av sukrose til isomaltulose og ledsagende produkter.

Graden av omdannelse av sukrose til produkter har også en bemerkelsesverdig virkning på stabiliteten av det isomaltulosedannende enzymsystem av de immobiliserte celler. Forsøk viser at stabiliteten kan øke eksponentielt med graden av omdannelse av en konsentrert sukroseløsning. Denne virkning er vist grafisk i fig. 4, som er basert på forsøksdata oppnådd under anvendelse av kalsiumalginatpellets av immobilisert E. rhapontici NCPPB 1739.

Fig. 4 viser variasjonen i halveringstid for de immobiliserte celler i forhold til begynnelsesomdannelsen i prosent.

Data for fig. 4 ble oppnådd ved omdannelse av en 55 prosentig sukroseløsning. Stabiliteten øker eksponensielt til en verdi på ca. 8.500 timer ved 90% omdannelse. Dette dramatiske resultat er høyst uventet og viser igjen fordelene som kan oppnås med den foreliggende oppfinnelse.

Vanligvis gir fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen en løs-ning som inneholder isomaltulose og andre sakkarider sammen med ikke omdannet sukrose. Man har hittil ikke vært i stand til å isolere alle de forskjellige forurensninger, men har bestemt nærværet av sukrose, glukose og fruktose, og det mistenkes at det foreligger andre sakkarider.

Etter at isomaltulosen er dannet, kan den krystalliseres eller renses på annen måte, selv om dette ifølge oppfinnelsen ikke er absolutt nødvendig.

For krystallisasjon foretrekkes det å konsentrere løsningen til en konsentrasjon på 60% vekt/volum, helst 65-70%, og deretter pode og avkjøle løsningen under omrøring til 20°C. Konsentreringen utføres fortrinnsvis ved inndampning ved høyst 6 5°C, hvorved fargedannelse blir minst mulig. Poding av den konsentrerte løsning fremmer vekst av små krystaller, selv om store krystaller kan dannes dersom dette er ønskelig. Det er ingen vanskelig-het å oppnå en primær mengde krystaller som inneholder 90% isomaltulose, og suksessive krystallisasjoner vil øke renheten til 100%.

Krystaller av isomaltulose kan også oppnås ved tilsetning av etanol eller andre utfellingsmidler, f.eks. sukrose, til den omdannete løsning. På denne måte dannes det hurtig krystaller med høyt utbytte, selv om renheten ofte er lavere enn den som oppnås ved konsentreringskrystallisasjonen som er beskrevet i foregående avsnitt. Krystallene som dannes ved tilsetning av etanol inneholder typisk ca. 80% isomaltulose med sukrose som største forurensning.

Når en uren sukroseløsning, såsom affineringssirup, omdannes, er krystallene som dannes ved konsentreringskrystallisasjonen vanligvis lysebrune i farge og forholdsvis urene.

Opptil 95% eller mer av all isomaltulosen i produktvæsken kan lettvint utvinnes som krystaller, hvorved det aktuelle tall er avhengig av krystallisasjonsmetoden og antall suksessive krystallisasjoner som benyttes. Findeling av krystallene gir et frittstrømmende pulver som hovedsakelig er isomaltulose.

Som et alternativ til rensing ved krystallisasjon kan produktvæsken renses ved berøring med en basisk ionebytter-harpiks, såsom "Amberlite" IRA-68, for fjerning av syrer, og med immobiliserte gjærceller for fjerning av glukose, fruktose og sukrose. Dessuten kan frysetørking eller andre metoder benyttes for å fremstille et fast produkt.

Det er fastlagt at isomaltulose har noen fysikalske egenskaper som likner egenskapene til sukrose selv om den har mye lavere søthet (37% i forhold til sukroses søthet ved 7% vekt/ volum i vann). Det har overraskende vist seg at isomaltulose har færre lett mengdebestemmbare egenskaper, som gjør den særlig egnet for anvendelse istedenfor sukrose som en bestanddel ved fremstilling av produkter for menneske- eller dyrekonsum.

Anvendelsen av isomaltulose istedenfor sukrose i slike produkter er gjenstand for norsk patentsøknad 803312. Som beskrevet i nevnte patentsøknad er isomaltulose særlig anvendbar ved fremstilling av tillaget mat, hvor den gir fyldighet, struk-tur, konsistens og andre ønskede virkninger. Smaksstoffer frem-heves ofte når isomaltulose anvendes istedenfor sukrose, og bakte produkter antar vanligvis, en mørkere, dypere farge. I nevnte patentsøknad er det gitt eksempler som omfatter toffee, kjeks, puddinger, kaker og syltetøy.

For anvendelse i matvarer og beslektede produkter kan man anvende krystallisert isomaltulose fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse. Isomaltulosen behøver ikke være ren, og ved noen anvendelser kan det ukrystalliserte, urene produkt anvendes.

Oppfinnelsen vil bli belyst ved hjelp av de følgende eksempler. Vekten av celler i g refererer til en våtvekt. En omtrentlig omregning til tørrvekt kan utføres ved å dele med 5.

Aktiviteter for celler er uttrykt pr. g våte celler.

Eksempel 1

Celler fra en kultur av Erwinia rhapontici (NCPPB 1578, ATCC 29283) ble fortynnet med 10 ml fosfatbufret saltløsning. 0,10 ml prøver av den resulterende suspensjon ble anvendt for å pode 200 ml prøver av vekstmedium i 500 ml steriliserte rysteflasker som var utstyrt med ledeplater. Mediet var som vist i tabell 1 nedenfor:

De innpodete flasker ble rystet med 120 oscillasjoner

pr. minutt ved 30°C i 70 timer og deretter høstet. Cellene ble høstet i den stasjonære vekstfase i dette tilfelle, men kan like godt høstes i den logaritmiske vekstfase eller den døde fase. Cellene ble sentrifugert med 15.000 g i 10 minutter ved 30°C, hvorved det ble oppnådd 1 g pakkede, våte celler pr. 100 ml medium. Når det skulle innpodes større volumer av mediet som skal bearbeides, ble det anvendt en kontinuerlig virkende sentrifugerotor hvor mediet ble pumpet gjennom i 100 ml pr. minutt.

De høstede celler ble deretter umiddelbart suspendert i en løsning av natriumalginat, 5% tørr vekt/volum, i avionisert

vann til dannelse av en 20% våt vekt/volum suspensjon av celler. Cellesuspensjonen ble deretter ekstrudert dråpevis fra en høyde på 10 cm inn i en omrørt løsning av 0,1 M kalsiumklorid som ble holdt på 30°C og som også inneholdt 20% Vekt/volum sukrose som tjente til å stabilisere cellenes isomaltulosedannende aktivitet. De resulterende pellets ble omrørt i 1 time og deretter

pakket i en søyle som var omgitt av en kappe og som'var 30 cm høy og 5 cm i diameter.

En løsning av 55 prosentig vekt/volum sukrose i avionisert vann ble fremstilt og regulert til pH 7,0 med 1,0M NaOH. Suk-roseløsningen ble pumpet opp søylen som ble holdt på 30°C.

Med en sukrosestrømningshastighet på ca. 0,01 tomme søyle-volumer pr. time nærmet omdannelse av sukrose til isomaltuloses og andre produkter seg likevektstilstand.

En stabil tilstand var nådd etter 24 timer. På dette tids-punkt var de immobiliserte cellers aktivitet ca. 0,2 g produkt/g våte celler/h. Cellenes stabilitet, uttrykt som halveringstid, var ca. 1 år. Når sukrosestrømningshastigheten ble økt slik at omdannelsen ble senket til 80%, var aktiviteten ca. 0,325

g produkt/g våte celler/h.

Eluatet fra søylen ble oppsamlet, inndampet til ca. 70%

(vekt/volum) ved 60°C, og fikk deretter kjølne, eller ble aktivt kjølt under omrøring til dannelse av små, hvite krystaller. I praksis vil krystaller kunne utvinnes hurtigere ved poding av den avkjølte løsning med en liten mengde tørr isomaltulose. Krystallene ble oppsamlet ved filtrering eller sentrifugering og tørket ved 40°C og 700 mm Hg i en vakuumovn. Produktet ble analysert og deretter undersøkt. Krystallene var 94,5% isomaltulose med ett molekyl krystallvann pr. molekyl isomaltulose, mens resten var andre sukker. Rekrystallisasjon tre ganger ga ren isomaltulose.

Dersom 80% av substratet ble omdannet til isomaltulose

og ledsagende produkter ble typisk 88 g krystallinsk produkt oppnådd pr. 100 g sukrosesubstrat, og søylens produktivitet var ca. 0,3 tonn tørt, krystallinsk produkt/søylevolum/år.

I bruk avtok tallet på levedyktige immobiliserte celler hurtig. Tallet på levedyktige celler nådd 0 etter ca. 500 timers anvendelse. Etter dette tidsrom var der ingen levedyktige celler tilbake, og det ble ikke iakttatt noen involu-sjonsformer av cellene. Til tross for det forholdsvis hurtige tap av levedyktighet, avtok de immobiliserte cellers isomaltulosedannende aktivitet uavhengig og mye langsommere med en halveringstid på 354 døgn.

Denne iakttagelse viser at levedyktige celler ikke er nød-vendige for dannelse av isomaltulose, og at det sannsynligvis er et eneste stabilt enzym som omdanner sukrosen til isomaltulose og ikke krever resirkulering av kofaktorer eller kontinuerlig regenerering av energikilder. Denne hypotese ble bekreftet ved tilsetning av 0,1 g/l kloramfenikol, som inhiberer proteindannelse, en 55 prosentig (vekt/volum) sukrose som ble anvendt som substrat. Den isomaltulosedannende aktivitet var upåvirket, men det foregikk ikke noen celledeling, selv ikke når det ble tilført næringsstoffer.

Ny vekst av Erwinia-celler in situ kunne ikke igangsettes ved tilførsel av næringsstoffer i form av friskt, sterilt medium, selv etter at cellene hadde vært benyttet kontinuerlig i søylen i et langt tidsrom slik at den isomaltulosedannende aktivitet hadde falt til en liten del av dens opprinnelige verdi. I disse forsøk ble medium pumpet opp søylen ved 0,01 tomme søylevolumer pr. time. Betydelige mengder CC>2 ble avgitt av de immobiliserte cellepellets, pH i det brukte medium som ble eluert fra søylen falt til 4,4, og der var økning i antallet levedyktige celler både i pellets og i brukt medium, og nitro-genanalyse av både det brukte medium og cellepelletene viste at cellevekst hadde funnet sted. Det mest viktige var etter at man hadde vendt tilbake til 55% sukrose som substrat økte den isomaltulosedannende aktivitet hos pelletene, i noen tilfeller til høyere nivåer enn den opprinnelige aktivitet. Det foreligger ikke noe bevis for innføring av enzym i den opprinnelige celle, men det viste seg at regenerering fullstendig skyltes cellevekst. Graden av reaktivering av aktiviteten hos pelletene var proporsjonal med antallet levedyktige celler umiddelbart før tilførsel av næringsstoffer, og det ble ikke oppnådd noen reaktivering hos cellene som hadde vært anvendt i meget lange tidsrom, slik at alle de innleirete celler var blitt ikke-levedyktige (500 timer).

Etter anvendelse av de regenererte celler i et ytterligere tidsrom kunne søylens aktivitet reaktiveres på liknende måte i minst tre sykluser. Evnen til å regenerere immobiliserte cellesøyler muliggjør teoretisk ubegrenset stabilitet av søylen og tillater at alderen av de immobiliserte celler blir uavhengig av det som passerer substratet.

Istedenfor å tilføre næringsstoffer intermitterende etter at pelletene har vært anvendt i et tidsrom, kan vekstmediet tilføres til søylen umiddelbart etter immobilisering. I disse forsøk opptrådte en langsom vekst av Erwinia-celler in situ.

Når en 1 prosentig (våtvekt/volum) cellepellet-podestoff ble immobilisert ble det oppnådd en 30-dobbelt økning av antallet levedyktige celler, idet celler vokste med en fordoblingstid på 64 timer, før forsøket måtte avsluttes på grunn av at alginatgelstrukturen ble mye svakere. Når celler ble anvendt på denne måte, med hyppig regenerering av aktivitet ved at cellevekst fikk foregå, var enzymsystemets egentlige stabilitet mindre enn når det ikke foregikk cellevekst. Det synes således at enzymsystemet er mye mer stabilt når cellen er i en pseudo-hviletilstand eller en bevaringstilstand enn når den fikk lov å dele seg.

Eksempel 2

Grunnfremgangsmåten i eksempel 1 ble benyttet med det ytterligere trinn at de høstede celler av Erwinia rhapontici ble ødelagt ved behandling i kulemølle i 90 minutter ved 8°C før immobilisering. Begynnelsesaktiviteten for pelletene til-svarte aktiviteten ved anvendelse av hele celler som i eksempel 1, men halveringstiden var ca. 170 døgn.

Eksempel 3

Fremgangsmåten i eksempel 1 ble fulgt under anvendelse av andre stammer av isomaltulosedannende mikroorganismer, nemlig Erwinia rhapontici (NCPPB 1578, 139 og 1739, og ATCC 29284), Erwinia caratovora var atroseptica NCPPB 139, Erwinia dissolvens (NCPPB 1862 og 2209). Protaminobacter rubrum (CBS 574, 77), Serratia marscesens (NCIB 8285) samt Serratia plymuthica (ATCC 15928). Spesifikkheten, aktiviteten og stabiliteten for de immobiliserte stammer ble målt. Ved også å ta hen-syn til mikroorganismens sykdomsfremkallende virkning og even-tuell tilbøyelighet til å danne polymer eller pigment, ble deretter prøvestammene (inklusive den i eksempel 1) vurdert når det gjaldt egnethet i fremgangsmåten i eksempel 1. Disse vurderinger var slik som vist i den følgende tabell 2.

Eksempel 4

Fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 1 ble fulgt under anvendelse av forskjellige sukrosekonsentrasjoner på fra 12,5 til 60% vekt/volum. Aktivitetene og halveringstidene ble målt for en prosentvis begynnelsesomdannelse til produkter på 4%, og resultatene er angitt i den følgende tabell 3.

Variasjonen i sukrosekonsentrasjon i substratet har et antall viktige virkninger på de immobiliserte søylers oppførsel. For det første påvirker sukrosekonsentrasjonen de immobiliserte cellers aktivitet, idet konsentrasjoner på over ca. 40% viser seg å være inhiberende. På den annen side var det overraskende at stabiliteten, dvs. halveringstiden, for de immobiliserte celler økte meget markert når sukrosekonsentrasjonene økte over de konsentrasjoner som er benyttet ifølge kjent teknikk. Økningen i de immobiliserte cellers stabilitet med økt sukrosekonsentrasjon mer enn kompenserer enhver minskning i aktivitet, og således økte søylens produktivitet med økning i sukrosekonsentrasjon.

Likevekten produkter:sukrose viste seg også å variere sterkt med sukrosekonsentrasjonen som ble anvendt som substrat, idet de høyeste likevektsverdier ble oppnådd når det ble anvendt 55% vekt/volum sukrose. Således var ved 55% sukrose likevektsforholdet produkter:sukrose ca. 13,2:1, noe som svarte til 9 3% omdannelse til produkter.

Eksempel 5

Fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 1 ble fulgt under anvendelse av celler av Erwinia rhapontici NCPPB 1578 immobilisert ved andre immobiliseringsmetoder som er nevnt ovenfor. Aktivitetene og halveringstidene var som vist i den følgende tabell 4.

Eksempel 6

N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (100 ug/ml) ble løst

i 25 ml 0,1OM citratbuffer, pH 6,0, ved inkubasjon i et vannbad ved 37°C i 20 minutter. Denne løsning ble deretter tilsatt til 50 ml filtrert næringsmedium som inneholdt ca. lg ny-høstede E. rhapontici NCPPB 1578 celler. Cellene ble deretter inkubert i 30 minutter ved 37°C i et vannbad, høstet og suspendert i 4 prosentig sukrosemedium (tabell 1) natten over ved 4°C. 0,1 ml prøver ble spredd utover på 1,5 prosentige vekt/ volum agarplater som inneholdt 4% vekt/volum sukrose, 0,4% vekt/volum trypton og 1% vekt/volum pepton regulert til pH 7,0 og inkubert i 48 timer ved 30°C. Individuelle kolonier ble deretter innpodet i rysteflasker og dyrket i 48 timer ved 30°C under rysting ved 120 slag pr. minutt og høstet, hvoretter cellene ble prøvet og analysert. Mutantstammene var typisk mindre spesifikke enn originalcellene selv om isomaltulose ble fremstilt.

Eksempel 7

Fremgangsmåten som er beskrevet i eksemepl 1 ble utført under anvendelse av alginatgel som inneholdt innleirete NCPPB 1578 celler, som enten var gelatinert enten i en blokk og skåret i fragmenter, eller gelatinert i en kontinuerlig streng og anvendt enten viklet på en stang eller skåret i segmenter. Når de ble anvendt i søyler viste disse immobiliserte celler ingen merkbar forskjell i aktivitet eller stabilitet sammen-liknet med celler som var immobilisert i kuleformete pellets.

Eksempel 8

Eksempel 3 indikerer at stammene av E. rhapontici var særlig egnet. En ytterligere sammenlikning ble utført under standardiserte betingelser under anvendelse av hver av tre E. 'rhapontici-stammer immobilisert i kalsiumalginat. Resultatene var som angitt i tabell 5:

Eksempel 9

Enzymsystemet som er ansvarlig for omdannelsen av sukrose til isomaltulose ble løsningsmiddelsekstrahert fra celler av Erwinia rhapontici NCPPB 1578 under anvendelse av fire forskjellige metoder, nemlig Mickle-rysting, osmotisk sjokk, lydbehandling eller behandling med syntetisk vaskemiddel.

Ved Mickle-rysting ble 2 g prøver av nyhøstede celler rystet med 2 g tørr sand og 2 ml destillert vann i 20 minutter ved romtemperatur under anvendelse av et Mickle-rysteappara.t innstilt på maksimal gyroroterende oscillasjon.

Ved metoden med osmotisk sjokk ble 1,5 g prøver av cellene suspendert'i 10 ml avionisert vann i 30 minutter ved 1°C.

Ved lydbehandling ble 2 g prøver av celler suspendert

i 15 ml avionisert vann og lydbehandlet i 30 minutter under anvendelse av et lydbehandlingsapparat med tuppdiameter på 2,5 cm.

Ved behandling med syntetisk løsningsmiddel ble 10 ml vandig løsning av "Triton" X-100, 0,15 volumprosent, benyttet til behandling av 0,5 g celler.

Etter hver av de respektive behandlinger ble den resulterende suspensjon sentrifugert ved 17.000 g i 30 minutter ved 30°C.

Cellene eller cellerestene og den oppå liggende væske ble deretter separat immobilisert i pellets av kalsiumalginat under anvendelse av den generelle fremgangsmåte i eksempel 1.

Pelletene ble deretter prøvet mot 55 prosentig vekt/ volum sukrose vedrørende isomaltulosedannende aktivitet hvorved det ble oppnådd de resultater som er vist i tabell 6, hvor IM betyr isomaltulose og ledsagende produkter.

Av resultatene i tabell 6 fremgår det at Mickle-rysting slapp inn i den oppåliggende væske ca. 5% av aktiviteten hos cellene, mens all den resterende aktivitet var knyttet til cellerestene. Den løselige enzymekstrakt, dvs. den oppåliggende væske, hadde en aktivitet på 0,094 g produkter/ml/h, en spesifikk aktivitet på 0,0029 g produkter/mg protein/h og inneholdt tolv forskjellige proteinbånd når den ble analysert ved poly-akrylamidgel-elektroforese.

Enzymsystemet ble ekstrahert mer effektivt ved å utsette cellene for osmotisk sjokk. Ved denne metode ble ca. 9% av celleaktiviteten ekstrahert, hvorved ekstrakten hadde en aktivitet på 0,253 g produkter/ml/h og en spesifikk aktivitet på 0,0844 g produkt/mg protein/g. Dessuten viste polyakrylamid-gel-elektroforese bare ti proteinbånd. Den forholdsvis høye renhet hos denne enzymekstrakt foreligger sannsynligvis på grunn av at cellene ikke ble ødelagt av det osmotiske sjokk.

Av resultatene fremgår det at enzymsystemet er knyttet til membranen og/eller anbrakt i cellen, hvorved den mest sannsynlige lokalisering er det periplasmiske rom, særlig på grunn av at osmotisk sjokkbehandling er den beste ekstrak-sjonsmetode og på grunn av at det har vist seg at markør-enzymene fra det periplasmiske rom, såsom syrefosfatase,

ble koekstrahert ved behandlingen med osmotisk sjokk.

Ved å betrakte begynnelsesaktivitetene for de osmotisk sjokkbehandlete, de Mickle-rystede og de ubehandlete celler i tabell 6 hadde de ødelagte celler størst aktivitet. Dette skyldes sannsynligvis fjerning av diffusjonshindring på sub-stratoverføring forårsaket av en intakt cellevegg og membran. Men der var ingen vesentlig forskjell i aktivitetene for de osmotisk sjokkbehandlete, ikke levedyktige celler og friske levedyktige celler, noe som viser at det ikke er i aksjon noe aktivt transportsystem for opptakelse av sukrose i cellen, idet et slikt system ville være avhengig av den integrerte metabolisme av hele cellen, og ville således antas å gå tapt når cellene ble osmotisk sjokkbehandlet.

Videre arbeid med den cellefrie enzymekstrakt som ble oppnådd ved osmotisk sjokkbehandling viste at det hadde et pH-optimum på 7,0, et temperaturoptimum på 30°C og var maksi-malt aktivt i en 35 prosentig vekt/volum sukroseløsning. At substratoptimum for det løselige enzymsystem er lavere enn optimum (55%) for de frie celler eller de immobiliserte celler er ikke overraskende og reflekterer sannsynligvis en modifika-sjon av enzymsystemets indre egenskaper som følge av dets periplasmiske lokalisering. Når det Mickle-rystede, ekstraherte enzymsystem ble anvendt på 55 prosentig vekt/volum sukrose, hadde det immobiliserte enzymsystem en begynnelsesaktivitet på 0,0067 g produkt/g pellets/h og en halveringstid på 62 0 timer mens det oppnådde en begynnelsesomdannelse på 81,5% .

Under anvendelse av universelt og spesifikt merket sukrose, fruktose og glukose som substrat for det ekstraherte enzymsystem viste det seg at systemet inneholdt en sukrose-spesifikk glukotransferanse. Enzymet er også spesifikt for akseptordelen idet bare fruktosen avledet fra sukrose, og ikke fruktose, fruktose eller glukose og fruktose tilført utenfra er tilgjengelig for inkorporering i isomaltulose. Sannsynligvis aktiveres glukosen og fruktosen avledet fra sukrosen på en eller annen måte. F.eks. kan det foreligge et sterisk mer kunstig miljø. Enzymsystemet ga ikke et renere produkt enn det som ble oppnådd ved anvendelse av hele celler.

Eksempel 10

Aktivitet og stabilitet hos fire immobiliserte isomaltuloseproduserende organismer ble målt ved utførelse av fremgangsmåten i eksempel 1.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av isomaltulose ved omdanning av sukrose med enzymer av isomaltulosedannende bakteriestammer, karakterisert ved at i det minste bakteriestammens isomaltulosedannende enzymsystem immobilieres ved innleiring i en gel og at det immobiliserte enzymsystem deretter bringes i berøring med en sukroseløsning som inneholder minst 30% vekt/volum sukrose, for omdannelse av i det minste en del av sukrosen til isomaltulose, som deretter utvinnes av den bakteriecellefrie løsning ved krystallisasjon.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at enzymsystemet immobiliseres som hele celler av den isomaltulosedannende mikroorganisme.

3. Fremgangsmåte i samsar med krav 1, karakterisert ved at en løsningsmiddelekstrakt av enzymsystemet av hele eller ødelagte celler av den isomaltulosedannende mikroorganisme immobiliseres.

4. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at det anvendes en alginatgel.

5. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-4, karakterisert ved at den isomaltulosedannende mikroorganisme er av slekten Erwinia, fortrinnsvis av arten Erwinia rhapontici, helst av arten Erwinia rhapontici NCPPB 1578.

6. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at sukroseløsningen som anvendes inneholder minst 40% vekt/volum sukrose.

7. Fremgangsmåte i samsar med krav 6, karakterisert ved at sukroseløsningen som anvendes inneholder ca. 55% vekt/volum sukrose.

8. Fremgangsmåte i samsvar med et av de foregående krav, karakterisert ved at fra 70 til 95% av sukrosen omdannes til isomaltulose og ledsagende produkter.