NO305520B1

NO305520B1 - FremgangsmÕte til rensing av hyaluronsyre og fraksjon av ren hyaluronsyre til oftalmologisk anvendelse

Info

Publication number: NO305520B1
Application number: NO924873A
Authority: NO
Inventors: Aurelio Romeo; Silvana Lorenzi
Original assignee: Fidia Spa
Priority date: 1991-04-19
Filing date: 1992-12-16
Publication date: 1999-06-14
Also published as: DK0535200T3; CA2084875A1; KR930700557A; KR0178544B1; JP2580458B2; SK377192A3; FI104973B; ES2092971T1; UA27229C2; IL101611A; BR9205240A; ITPD910077A1; HUT63186A; DE69230242T2; IL113453A; AU1576692A; CZ377192A3; ES2092971T3; ATE186307T1; SK280191B6

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en ny hyaluronsyrefraksjon og natriumhyaluronsyrefraksjon med gjennomsnittelig molekylvekt innenfor et bestemt område og fremgangsmåte for fremstilling av fraksjonene av hyaluronsyre og natriumhyaluronsyre. Oppfinnelsen omfatter dessuten farmasøytisk preparat som inneholder nevnte fraksjoner og hyaluronsyrefraksjoner tilpasset øyekirurgi.

Hyaluronsyre (HA) er en typisk og viktig representant for en gruppe biologiske makromolekyler kjent som glykosaminoglykaner (mucopolysakkarider). HA er en biologisk polymer som er til stede, med identisk molekylstruktur, i alt bindevev hos virveldyrorganismer, hvor den spiller en strukturell og biologisk rolle, i den forstand at dens lokale nivå er nøyaktig korellert med tonus, trofisme og vevsheling i tilfelle skade. En oversikt over den fysiologiske rolle av disse biologiske substanser ble gitt i Phys. Rev. (Comper W.D., Laurent T.C.: Physiological function of connective tissue polysaccharides. Phys. Rev., 58, (1), 255-315, 1978). Den fysikalsk kjemiske karakter av HA er karakteren til en sakkarid biopolymer (D-glukuronsyre og N-acetyl-glykosamin), alternerende polymerisert, og som danner lange ugrenede molekylkjeder som varierer i molekylvekt til et maksimum på 8 millioner Daltons (Meyer K.; Chemical Structure of Hyaluronic Acid. Fed. Proceed. 17, 1075, 1958; Laurent T.C.; Chemistry and Molecular Biology of Intracellular Matrix, 703-732, Academic Press N.Y., 1970. Oppførselen til denne biopolymer i vandig løsning garanterer en spesiell viskositet som kalles viskoelastisitet, som er typisk for noen biologiske fluider, såsom synovialvæske og øyets glasslegemevæske, hvor HA er til stede i en konsentrasjon på 0,12 til 0,24 % (Balazs E.A. et al.: Hyaluronic acid and replacement of vitreous and aqueous humor. Mod. Probl. Ophtal., 10, 3-21, 1972). Også kammervæske av human opprinnelse, ble funnet å inneholde HA i en gjennomsnittelig konsentrasjon på 1,14 ug/g (Laurent U.B.G.: Hyaluronate in human aqueous humor. Arch. Ophthalmol., 101, 129-130, 1983).

Det er samlet en mengde publisert evidens som viser at den lokale forsyning av eksogen HA har klare terapeutiske og beskyttende fordeler i en lang rekke patologiske tilstander hos bindevev og epitelvev, såsom: -forringet vevsregenerering i ikke-helende hudsår; -artrose degenerering av artikulært bindevev;

-øyekirurgi.

Spesielt setter man pris på muligheten, som tilveiebringes av den viskoelastiske karakter av HA, til å dekke det vev som utsettes for skaderisiko under kirurgisk manipulering. Ifølge alle de kirurger som har anvendt HA, vil tilstedeværelsen av et viskøst sjikt av eksogen HA på det vev som er mest utsatt for traumatiserende tilfeldige kontakter, såsom cornea, ha en effektiv beskyttende virkning som reflekteres i svært positiv grad i det vellykkede resultat av operasjonen.

Den beskyttende virkning og den fremmende påvirkning på vevshelingen, som utøves av eksogen HA på cornea, er blitt vist både i forsøksdyr (Miller D. et al.: Use of Na-hyaluronate during intraocular lens implantation in rabbits. Ophthalmic Surgery, 8, (6), 58-61, 1977; Miller D. et al.: Use of Na-hyaluronat in autocorneal transplantation in rabbits. Ophthalmic Surgery, 11, (1), 19-21, 1980; Graue E.L. et al.: The protective effect of Na-hyaluronate to corneal endothelium. Exp. Eye Res., 31, 119-127, 1980; Ozaki L. et al.: Protective effect of Healon-coated intraocular lens on the corneal endothelium. Folia Oohthalmologica Japonica, 32, 1301-1305, 1981) og hos mennesker (Norm M.: Preoperative protection of cornea and conjuctiva. Acta Ophthalmologica, 59, 587-594, 1981; Polack F.M. et al.: Sodium hyaluronate (Healon) in keratoplasty and IOL implantation. Ophthalmology, 88, 425-431, 1981).

Flere fremgangsmåter er kjent for fremstilling av renset hyaluronsyre og av spesielle fraksjoner med høy grad av renhet, for anvendelse i terapi, f.eks. ved de foran nevnte indikasjoner.

Molekylfraksjonene av integrale hyaluronsyrer, som kan oppnås direkte ved ekstraksjon av organiske materialer, f.eks. fra hønekam, har molekylvekter som kan variere innenfor vide grenser, f.eks. fra ca. 90 % - 80 % til 0,2 % av molekylvekten av den integrale syre, fortrinnsvis mellom 5 % og 0,2 %. Fraksjonene kan oppnås fra de integrale syrer med hydrolyserende eller oksiderende eller enzymatisk kjemiske midler eller fysiske fremgangsmåter, f.eks. mekaniske eller ved bestråling, og ofte dannes derfor primordiale ekstrakter i disse samme rensefremgangsmåter (se f.eks. artikkelen av Balazs et al. i "Cosmetics & Toiletries". Italian edition No. 5/84, pp 8-17). Separasjonen og rensingen av de oppnådde molekylfraksjoner gjennomføres ved kjente teknikker.

F.eks. er det i US-PS nr. 4 141 973 beskrevet en fremgangsmåte for fremstilling av hyaluronsyrer med en molekylvekt på minst 750000 Daltons som kan anvendes, i betraktning av deres spesielle og høye grad av renhet og for fraværet av inflammatoriske virkninger, i øyeoperasjoner. Fremgangsmåten består i ekstraksjon av HA natriumsalt fra utgangsmaterialet, eliminering av blodrester fra de anvendte dyreorganer, avproteinisering av det således oppnådde ekstrakt, eliminering av inflammatoriske forurensninger, behandling av produkter i vandig løsning med et steriliseringsmiddel og utfelling av hyaluronsyresaltet fra den vandige løsning med et organisk løsningsmiddel. Blodrestene elimineres med etanol, HA i form av dens natriumsalt (som er den form hvori den finnes i utgangsmaterialene) blir ekstrahert med vann, avproteiniseringen gjennomføres ved behandling med fortynnede syrer og samtidig ekstraksjon av de hydrolyserte deler med kloroform, eller ved hjelp av proteolyttiske enzymer, skadelige inflammatoriske substanser elimineres ved ekstraksjon med kloroform ved pH 6-7 og steriliseringen gjennomføres ved behandling med cetylpyridinklorid. Ved denne fremgangsmåten vil den eneste hyaluronsyrefraksjon som oppnås, være den som er spesifikt beskrevet i patentet til å ha en molekylvekt på 1586000 Daltons. På basis av dens kjemiske, fysiske og biologiske egenskaper synes denne molekylfraksjon av hyaluronsyre å tilsvare det kommersielle produkt som er kjent ved varemerket "HEALON".

Det er blitt utviklet nye teknikker såsom molekylultrafiltrering. Ved denne rensemetode er det mulig å kaste de HA fraksjoner som har en molekylvekt som kommer innenfor de høyere eller lavere marginer av området av molekylstørrelser. F.eks. er det i EPO patent nr. 01238572, gitt den 25. juli 1990, beskrevet en fremgangsmåte til å oppnå fraksjoner av natriumhyaluronat med midlere molekylvekter på mellom 250000 og 350000 Daltons, ved å utsette produktet direkte oppnådd ved ekstraksjon av organiske materialer og påfølgende enzymatisk deproteinisering med papain, for to molekylære ultrafiltreringer gjennom membraner med en molekyl-grense på 30000, dvs. med membraner som fanger bare de fraksjoner som har molekylvekter på over 30000. Denne fraksjonering synes å være viktig for å oppnå et produkt fritt for sekundære virkninger av inflamatorisk karakter, siden fraksjonene ansvarlig for slike virkninger er de med lave molekylvekter, f.eks. ca. 30000 Daltons. Etter ytterligere molekylfiltrering ved anvendelse av membraner med en utelukkelsesgrense på 200000 (dvs. membraner som fanger de fraksjoner som har molekylvekter på over 200000 Daltons) vil det oppnådde filtrerte produkt være en fraksjon (som i patentet kalles HYALASTINE) med en midlere molekylvekt mellom 50000 og 100000 Daltons, mens den del som etterlates på membranen er en natrium-hyaluronatfraksjon, som har en midlere molekylvekt mellom 500000 og 730000 (den fraksjon som kalles HYALECTIN).

Det er derfor en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en ny fremgangsmåte til å fremstille en ren hyaluronsyre med molekylvekt innenfor et bestemt område for å redusere postoperative traumer i øyekirurgi.

Denne hensikt er oppnådd med foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremgår av kravene.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en annen fremgangsmåte for fremstilling av en fraksjon av hyaluronsyre som er svært ren og har et bestemt molekylvektområde. Denne fraksjon har en interessant anvendelse i øyekirurgien: produktet blir virkelig ekstremt godt tolerert, det er ikke inflammatorisk og det forårsaker ikke postoperative komplikasjoner. Dessuten gir produktet den betydelige fordel at det er i stand til å etterlates in situ etter kirurgi uten å forårsake postoperative komplikasjoner, såsom spesielt alt for høyt øyetrykk, og reduserer således den risiko som er involvert ved håndtering under dets fjerning, slik som praksis har vært inntil nå. Denne nye fraksjon av ren hyarulonsyre, i form av dens natriumsalt, vil bli kalt ved navnet "HA-1" i den følgende beskrivelse.

Ifølge oppdagelsen av den foreliggende oppfinnelse er det mulig å gripe inn med fordel i fremgangsmåtene for rensing av integrale hyarulonsyrer eller deres salter, spesielt alkalisalter, såsom først og fremst natriumsaltet, med omdanning av slike syrer eller salter til kvaternære ammoniumsalter av en gitt type. Slik saltdannelse kan gjennomføres på et hvilket som helst trinn av rensefremgangsmåten. Siden disse kvaternære ammoniumsalter er lett løselige i visse organiske løsningsmidler, såsom aprotiske løsningsmidler, såsom spesielt N-metylpyrrolidon, kan de ekstraheres med slike løsnings-midler fra den vandige fase, og således gi en spesiell og ytterligere rensing sammenlignet med de teknikker som er beskrevet i tidligere teknologi, en operasjon som åpenbart er ansvarlig for den renhetsgrad av produktene som oppnås ved slutten av fremgangsmåten. Omdanningen av hyaluronsyre- komponenten til kvaternære ammoniumsalter kan utføres f.eks. ved behandling av den vandige løsning av natriumsaltet, inneholdende andre salter såsom spesielt NaCl, ved anvendelse av en reaktor eller en kolonne inneholdende en makromolekylær sulfonsyreionebytter i saltform med kvaternære ammoniumbaser, f.eks. en DOWEX M-l5 harpiks, fremstilt i form av tetrabutylammoniumsalt, som kan oppnås ved behandling av sulfonsyreharpikser med kvaternære ammoniumhydroksider, f.eks. tetrabutylammoniumhydroksid. Ammoniumsaltet går over i eluatet, og elueres fullstendig fra ionebytteren med vann. Dette vandige ekstrakt inndampes til tørrhet, og resten som utgjøres av ammoniumsaltet av polysakkaridet blir løst i et av de foran nevnte løsningsmidler, og deretter frafiltreres de uløselige faste deler.

Fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse karakteriseres derfor i sitt mere generelle aspekt ved rensing av en hyarulonsyre eller en av dens molekylfraksjoner eller et av deres salter ved deres omdanning til et tilsvarende kvaternært ammoniumsalt med lavere ( C\- C^) alifatiske hydrokarbylsubstituenter.

For det andre karakteriseres fremgangsmåten ved oppsamling av det kvaternære ammoniumsalt av hyarulonsyre eller en av dens molekylfraksjoner i et organisk løsningsmiddel som er i stand til å løse slike salter og ved gjenvinning fra den filtrerte løsning av hyaluronsyren eller dens molekylfraksjon i form av et metallsalt, og om ønsket ved å underkaste saltene oppnådd på denne måte ytterligere rensing f.eks. på en måte som per se allerede er kjent.

Oppfinnelsen vedrører derfor anvendelse av de kvaternære ammoniumsalter av hyaluronsyrer både i fremgangsmåtene for ekstraksjon av polysakkaridet fra dyreorganene og fra de samlede ekstrakter, hvor rensingen ifølge oppfinnelsen kan utføres på et hvilket som helst egnet trinn av fremgangsmåten, innbefattet de operasjoner hvori fragmentering og separasjon av molekylfraksjoner blir gjennomført, og i en hvilken som helst videre bearbeiding av slike fraksjoner, og ved den videre rensing av allerede isolerte fraksjoner, rene eller ikke rene, nye eller kjente.

Som tidligere nevnt kan omdanning av hyaluronsyre polysakkaridet gjennom-føres på et hvilket som helst egnet trinn av rensefremgangsmåten, og en fagmann på dette området vil være i stand til å velge når dette bør være i hvert enkelt tilfelle, ifølge de kriterier som dikteres av den spesielle kombinasjon av de forskjellige kjente trinn som er blitt valgt. Disse konvensjonelle og kjente trinn omfatter i alt vesentlig og generelt: 1) Ekstraksjon av polysakkaridet (generelt og fortrinnsvis i form av natriumsaltet) fra dyreorganene, på forhånd finhakket og homogenisert. Dette gjøres vanligvis ved hjelp av et organisk løsningsmiddel som kan blandes med vann, såsom en alifatisk alkohol eller et lavere (Ci-Cg) alifatisk keton, såsom etanol eller aceton. 2) Eliminering av proteinsubstanser ved ekstraksjon med egnede løsningsmidler eller ved spalting av en vandig løsning av ekstraktet oppnådd under 1) med et proteolyttisk enzym, såsom papain, pepsin, trypsin eller pronase, i nærvær av en buffer, f.eks. cystein hydroklorid-fosfat.

3) Dialyse av et ekstrakt oppnådd ifølge 1) eller 2).

4) Sterilisering av en løsning oppnådd i hvilket som helst av de tidligere trinn med et kjent bakterisid, f.eks. cetylpyridinklorid i en natrium-kloridløsning. Denne operasjon repeteres vanligvis flere ganger. 5) Separasjon av hyaluronsyre polysakkaridfraksjoner eller deres respektive salter med forskjellige molekylvekter, eller henholdsvis eliminering av uønskede fraksjoner, f.eks. med marginale molekylvekter, dvs. for langt borte fra det oppgitte molekylstørrelsesområde. Denne operasjon utføres fortrinnsvis ved molekylultrafiltrering, f.eks. på den kjente måte. 6) Isolering av den rensede fraksjon eller av det respektive salt (f.eks. natriumsaltet) fra den vandige løsning ved utfelling med et egnet organisk løsningsmiddel, f.eks. med en alkohol.

Rekkefølgen av disse trinn, og muligvis også av andre allerede anvendt i tidligere teknologi eller utviklet av eksperter på dette området, kan varieres betydelig. Det spesielle trinn ifølge den foreliggende oppfinnelse, dvs. saltdannelsen med kvaternære ammoniumioner, kan innføres vilkårlig og fordelaktig vis hvor man burde vente den største tekniske effekt. Ammoniumsaltet av polysakkaridkomponenten kan fjernes direkte fra harpiksen i ionebytteren med de foran nevnte løsningsmidler som er i stand til å løse slike salter, såsom dem som er spesifisert i det følgende, men fortrinnsvis ekstraheres ammoniumsalter først med vann og inndampes til tørrhet. Det således isolerte ammoniumsalt blir oppsamlet i de foran nevnte løsningsmidler og løsningen deretter filtrert.

En spesiell måte til å gjennomføre fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse skriver seg fra følgende innføring, i kombinasjon med den foran nevnte operasjon, i den foran nevnte rekkefølge, mellom trinnene 2) og 3). I tillegg til de kjente renseteknikker og det spesifikke trinn ifølge den foreliggende oppfinnelse, dvs. omdanning av metallsaltene av hyaluronsyre til kvaternære ammoniumsalter, er det mulig, ifølge et annet spesielt trekk ifølge den foreliggende oppfinnelse, å gjøre bruk av gelateringsmidler for jernioner, fortrinnsvis i det foran nevnte ekstraksjonstrinn 1). I virkeligheten er det kjent at jernioner som alltid er til stede i opprinnelige hyaluronsyre-ekstrakter som skriver seg fra blodrester fra de anvendte dyreorganer, er ansvarlige for depolymeriseringsprosesser av polysakkaridkjeden. Elimineringen av metallioner har vist seg svært nyttig til å oppnå hyaluronsyre fraksjoner med relativt høye molekylvekter, og dette kan oppnås ved gelatering. Ved å ta denne forholdsregel er det mulig, ikke bare å oppnå hyaluronsyrer eller deres salter med eventuelt høye molekylvekter, men også spesielt rene produkter som er stabile i vandige løsninger takket være det totale fravær av de foran nevnte jernioner.

Et foretrukket formål ifølge denne oppfinnelse er derfor en fremgangsmåtekarakterisert vedå ekstrahere dyreorganer inneholdende hyaluronsyre og/eller ett av dens salter med et organisk løsningsmiddel som kan blandes med vann i nærvær av gelateringsmidler for jernioner, å repetere operasjonen inntil det ikke er flere jernioner, ved oppsamling av den tidligere tørkede rest fra disse vaskinger i et vandig løsningsmiddel i nærvær av et proteolyttisk middel og en egnet buffer, og påsetting av løsningen, på forhånd befridd for eventuelle faste rester, på en ionebytter som utgjøres av en makromolekylær sulfonsyreharpiks i form av et av dens kvaternære amoniumsalter med lavere (Ci-g) alifatiske radikaler. Eluatet som ekstraheres fra ionebytteren blir

deretter tørket og løst i et organisk løsningsmiddel som er i stand til å løse de kvaternære amoniumsalter av hyaluronsyrer og fraksjoner derav. Amonium-

saltet omdannes deretter til et natriumsalt ved tilsetning av en vandig løsning av et natriumhalogenid, såsom natriumklorid eller natriumbromid, til den organiske løsning. Den således oppnådde vandige løsning av natriumsaltet ekstraheres deretter med organiske løsningsmidler som ikke kan blandes med vann, og underkastes eventuelt gjentatt dialyse. Den oppnådde løsning behandles deretter med et steriliseringsmiddel, og om ønsket kan løsningen oppnådd etter sterilisering underkastes ultramolekylfiltrering. Eventuelle uønskede hyaluronsyrepolysakkaridfraksjoner blir så kastet, og de ønskede fraksjoner av natriumhyaluronatet blir isolert på i og for seg kjent måte.

De løsningsmidler som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse til å løse de kvaternære ammoniumsalter er aprotiske løsningsmidler, såsom N-alkylpyrrolidoner, spesielt N-metylpyrrolidon, dialkylsulfoksider, dialkylkarboksylamider, såsom spesielt lavere (Ci-5) dialkylsulfoksider, spesielt dimetylsulfoksid og lavere (Ci-5) dialkylamider av lavere (Ci_6) alifatiske syrer, såsom dimetyl- eller dietylformamid eller dimetyl- eller diacetylacetamid.

Tetraalkylammoniumbasene som anvendes til fremstilling av ionebytter-harpiksen og følgelig karakteristiske hyaluronsyreammoniumsalter ifølge denne oppfinnelse, er baser med lavere alifatiske radikaler, fortrinnsvis alkyler med mellom 1 og 6 karbonatomer. Mest fortrinnsvis anvendes den harpiks som danner salter med tetrabutylammoniumionet. I de foran nevnte kombinasjoner som anvendes til fremgangsmåtene for ekstraksjon, rensing og isolering av hyaluronsyrene, av deres molekylfraksjoner og deres salter, og spesielt i den foran nevnte kombinasjon, som utgjør en foretrukket fremgangsmåte ifølge denne oppfinnelse, blir det foretrukket å anvende følgende agenser. (a) for ekstraksjon av utgangsmaterialet som utgjøres av dyreorganer:

etanol eller aceton.

(b) som gelateringsmiddel for jernioner: 1,10-fenantrolin eller

dimetylderivatet.

(c) som proteolyttiske midler: de som allerede er nevnt.

(d) som løsningsmidler for de kvaternære ammoniumsalter:

N-metylpyrrolidon eller dimetylsulfoksid.

(e) som løsningsmiddel for rensingen av det vandige ekstrakt av natriumsalt oppnådd fra den organiske løsning av ammoniumsaltene:

metylenklorid, etylacetat.

(f) som steriliseringsmiddel: cetylpyridinklorid i nærvær av fosfatbuffer. (g) som organisk løsningsmiddel til utfelling av natriumsaltet fra den

rensede vandige løsning, eventuelt etter ultrafiltrering: etanol.

I de foran nevnte fremgangsmåter er det mulig også å innføre variasjoner som kan være til videre nytte til med hell å oppnå enda renere sluttprodukter. F.eks. kan anvendelse av steriliseringsmidler av den foran nevnte type, dvs. kvaternære ammoniumsalter med heterosykliske kjerner og som inneholder langkjedede alkyler (f.eks. cetyl) såsom det nevnte cetylpyridinklorid, på samme tid tjener som et rensetrinn, siden tilsetningen av disse til en løsning av natriumhyaluronat vil gi det tilsvarende ammoniumsalt med ionet av hyaluronsyre. Disse salter utfelles i vandig løsning, og denne behandling gjør det derfor mulig å oppnå, ved påfølgende gjentatte utfellinger og vaskinger av utfellingene, og deretter ved å løse i NaCl-løsning, en løsning av natriumhyaluronat hvorifra ultrarensede produkter kan isoleres. Disse produkter er spesielt egnet for anvendelse i øyekirurgi.

Molekylultrafiltreringen gjennomføres på i og for seg kjent måte. Det vil si at det anvendes membraner som fanges inn f.eks. difraksjoner som har høyere molekylvekter, f.eks. over 200000 og om ønsket kan de separerte fraksjoner gjenvinnes både fra det filtrerte produkt og fra membranen. En særlig interessant måte til å gjennomføre fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse er å kombinere de foran nevnte kjemiske renseoperasjoner med molekylultrafiltrering som eliminerer hyaluronsyrefraksjoner med lave molekylvekter. Slike fraksjoner anses å være ansvarlige for utvikling av inflamatoriske virkninger i produkter for terapeutiske formål, som rapportert med hensyn til de fraksjoner som er beskrevet i foran nevnte EPO patent nr. 0138572, gitt den 25. juli 1990.

Et annet foretrukket formål ifølge den foreliggende oppfinnelse er derfor den foran nevnte fremgangsmåte som gjelder en detaljert kombinasjon av rense-operasjonene hvori molekylultrafiltrering, i den valgfrie del, blir gjennomført for å eliminere molekylfraksjoner med lav molekylvekt, spesielt fraksjoner med molekylvekter på mindre enn 30000. Ved denne fremgangsmåte, eller mer presist, ved å følge detaljene beskrevet i de illustrerende eksempler 1 og 2, blir det oppnådd en fraksjon av natriumhyaluronat som er svært verdifull fra et terapeutisk synspunkt og, som det ble nevnt til å begynne med, bærer navnet HA-1. Den er spesielt interessant for sin anvendelse i øyekirurgi.

Anvendelse av produkter i ø<y>ekirurgi

Hyaluronsyrene beskrevet i litteraturen og anbefalt for anvendelse i øyeoperasjoner, vil ikke tilfredsstille kriteriene på absolutt perfeksjon, spesielt siden de ikke kan etterlates på stedet etter det kirurgiske inngrep, f.eks. etter katarakt.kirurgi, på grunn av tilstedeværelse av både rester og/eller spor av inflammatoriske substanser og komponenter med molekylvekter som er for høye og som derfor har altfor høy viskositet. Dessuten kan de som nevnt tidligere forårsake en uønsket og farlig økning i øyetrykket.

Den eksogene HA som innføres i det fremre kammer under kirurgi, skal ikke ha negative virkninger på det postkirurgiske intraokulare trykk, og heller ikke utløse inflammatoriske sekvenser i det intraokulare miljø. Førstnevnte skadelige virkning er gjentatt blitt beskrevet i litteraturen etter anvendelse av HA med svært høye molekylvekter, med en ekstremt høy grad av viskositet (Binkhorst C.D.: Inflammation and intraocular pressure after the use of Healon in intraocular lens surgery. Am. Intra-Ocular Implant. Soc, J., 6, (4), 340-341, 1980; Pape L.G.: Intracapsular and extracapsular technique of lens implantation with Healon. Am. Intra-Ocular Implant. Soc. J., 6, (4), 342-343, 1980; Passo M.S. et al.: Intraocular pressure following cataract surgery using Healon. ARVO abstracts, 10, 10:45, 1981; Percival P.: Experiences with the Boberg Ans lens and sodium hyaluronate (Healonid). Trans. Ophthal. Soc. UK, 102, (2), 294-297, 1982; McRae S.M. et al.: The effects of sodium hyaluronate, chondroitin suphate, and methylcellulose on the corneal endothelium and intraocular pressure. Ann. J. Ophthalmol., 95, 332-341, 1983).

Denne erfaring førte til en anbefaling om å fjerne substansen ved skylling med fysiologisk saltløsning etter operasjonen. Berson et al (Berson F.G. et al.: Obstructions of aqueous outflow by sodium hyaluronat in enucleate human eyes. Am. J. Ophthalmol., 95, 668-672, 1983) studerte mekanismen ved denne skade i post mortem utskrapt menneskeøye og antydet at den underliggende årsak var mekanisk obstruksjon av fysiologiske drenerings-muligheter i det fremre kammer, på grunn av den ekstreme viskositet av den innførte substans.

Natrium hyaluronatfraksjonen beskrevet i US patentet til Balazs, nr. 4 141 973, og som har en molekylvekt på 1 586 000 (se spalte 13 i samme patent) er et produkt som, i betraktning av dets angitte fysiske-kjemiske og biologiske egenskaper, synes å være det beste øyeprodukt på markedet. Det er kjent under navnet "Healon" og er ikke immunt for den foran nevnte ulempe. Det vil si at dets molekylvekt er i alt vesentlig for høy, og at det derfor har utilfredsstillende viskositet for visse operasjoner i øyet.

Selv om den test som anvendes i dette patent (for måling av den anti-flogistiske effekt) i virkeligheten ga gode data, kan Healon ikke etterlates in situ etter kirurgi, f.eks. etter kataraktoperasjoner, siden det ville forårsake postoperative komplikasjoner, såsom en økning i øyetrykket.

I US-PS nr. 4 920 104 til Dale P. De Vore (overdratt til Med Chem Products, Inc. Acton, Mass.) er det beskrevet og krevet en viskoelastisk løsning av natriumhyaluronat i fysiologisk saltløsning som har en kinematisk viskositet på mellom 45000 og 64000 cSt og inneholder et natriumhyaluronat med en midlere molekylvekt i området 1000000 til 2000000 Daltons. Dette produkt er også deklarert for anvendelse i kirurgiske operasjoner på øyet, hvor det kan anvendes mer fordelaktig enn andre preparater, på grunn av sine mindre postoperative sidevirkninger, særlig ettersom stigningen i postoperativt øyetrykk er begrenset.

Dette produkt må imidlertid også elimineres etter kirurgi, hvilket kan ses fra

tabellene 2 og 3 i spalte 4 i patentet, mens tabell 1 viser at det er en stigning i øyetrykket etter kirurgi dersom produktet etterlates in situ.

En annen fraksjon av natriumhyaluronat for anvendelse i ophthalomologien er beskrevet i europeisk patent nr. 0138572 og har en midlere molekylvekt som varierer mellom 500000 og 730000 Daltons (HYALECTIN). Det kan anvendes beleilig til å erstatte de endobulbære væske, og blir også anvendt i øyeoperasjoner, såsom for katarakt- og øyeimplantater. Det var imidlertid et behov for produkter med høyere viskoelastisitet, som var i stand til å opprettholde de korrekte avstander inne i det fremre kammer under kirurgi, og motvirke glasslegemevæskens aksjon, og ha en effektiv beskyttende virkning på den endookulare struktur uten at de måtte fjernes etter inngrepet. Som vi har sett måtte produktene med høye molekylvekter beskrevet i litteraturen og anvendt i foran nevnte operasjoner på øyet, alltid bli fjernet etter kirurgi. Fordelen ved den foreliggende oppfinnelse ligger i det faktum at det er blitt utviklet en original fremgangsmåte for å oppnå fraksjoner av natriumhyaluronat med en relativt høy molekylvekt, oppnådd ved tilsetning av gelateringsmidler for jernioner til ekstraksjonsløsningen, for således å forhindre depolymerisering til lavmolekylære fraksjoner, fri for disse urenheter eller fraksjoner som gjorde det umulig å etterlate produktet i organismen. Den nye fraksjon HA-1 ifølge den foreliggende oppfinnelse representerer derfor en interessant nyhet og et langt skritt fremover på dette området.

Fraksjonen "HA-1" ifølge den foreliggende oppfinnelse, som kan oppnås ved fremgangsmåten beskrevet i eksemplene 1 og 2 har følgende egenskaper: - Viskositet: et grenseviskositetstall i området mellom 14,5 og 21 dl/g, bestemt ved 25°C i 0,15M NaCl med pH 7,0 ved anvendelse av et Ubbelhodeviskosimeter med hengenivå. Dette tilsvarer en gjennomsnittelig molekylvekt i området mellom 750000 D og 1230000 D (fortrinnsvis mellom 925000 og 1230000 D). - Proteininnhold: et proteininnhold som ikke overskrider 0,2 % uttrykt som albumin, bestemt ved Lowrytesten (Lowry J. et al.: Protein Measurement with the folin phenol reagent. J. Biol., Chem. 193, 265-275, 1951). - UV: en UV absorbans ved 257 nm og ved 280 nm som ikke overskrider 1,0 AU, målt på en 1 % W/V vandig løsning. - Dynamisk viskositet: en dynamisk viskositet av en 1 % løsning w/v i 0,15M NaCl ved pH = 7,0, som ikke overskrider de følgende grenser ved de definerte skjærpåkjenninger, ved anvendelse av et rotasjonsviskosimeter såsom de som er beskrevet i U.S. Pharmacopea XXII ed. (1911) side 1619, ved en temperatur på 20°C. - Sulfatert mucopolysakkarid: et innhold som ikke overskrider 0,07 % som svovel, bestemt på et induktivt koblet plasmainstrument (I.C.P.), ved anvendelse av en egnet referansesubstans. - Jern: et jerninnhold som ikke overskrider 10 ppm, bestemt ved atom-absorpsjon eller I.CP. teknikk. - Stabilitet: en stabilitet av bufrede isotoniske løsninger med fysiologisk pH av fraksjonen HA-1, naturlig aldret og varmesterilisert, bestemt ved å fast-legge grenseviskositetstallet og uttrykt med den tilsvarende nedsettelsen av midlere molekylvekt, og som ikke overskrider følgende grenser:

-97 % av den opprinnelige verdi (lagring ved 25°C i 6 måneder)

-75 % av den opprinnelige verdi (sterilisering ved 118°C i 32 min)

-80 % av den opprinnelige verdi (sterilisering ved 121°C i 16 min)

-90 % av den opprinnelige verdi (sterilisering ved 124°C i 8 min).

De overlegne kvaliteter av hyaluronsyrefraksjonen HA-1 ifølge den foreliggende oppfinnelse kan vises ved følgende eksperimenter:

Intraokular toleranseevne for HA-1 fraksjon hos aper.

FORMÅL

Denne test ble utført for å vurdere øyets toleranseevne hos aper etter injeksjon av HA-1 i glassvæsken i øyet.

MATERIALER OG METODER

1. Forsøksdyr

Seks unge voksne cynomolgus (Macaca fascicularis) hun aper ble anvendt for dette studium. De var ved god helse og hadde ingen påvisbar øyeskade.

Primater ble valgt til denne undersøkelse fordi de anses å være de beste arter til studier av øyets toleranseevne for viskoelastiske produkter som anvendes til øyekirurgi.

Cynomolgus apen ble valgt fordi Douroucoulis apen, som tidligere ble anvendt til studier av øyets toleranseevne, nå er en truet art og kommer under lovens beskyttelse.

2. Eksperimentelle grupper og relative behandlin<g>er:

Gruppebetegnelse og dosenivå

Apene ble behandlet en gang etter følgende program:

3. Forberedelse og administrasjon av forbindelsen:

På operasjonsdagen ble apene anestetisert med ketamin hydroklorid, supple-mentert med natrium pentobarbital. Pupillene ble deretter utvidet med lokalt 1,0 % tropikamid (Mydriacyl, Alcon Laboratories). Cornea, konjunktiva, adnexa og fremre segment ble undersøkt med lysbiomikroskop og bakre segment med indirekte oftalmoskop. Den peripalpebrale hud ble forbredt på kirurgi ved anvendelse av to vaskinger og skyllinger med 0,5 % povidon jod og steril saltoppløsning. En steril gardin og lokkspeil ble plassert, og øyeeplet stabilisert med en liten tannet tang. Skarp og butt disseksjon ble anvendt til å utvikle en limbalbasert konjunktival flapp, ca. 10 mm fra og parallelt med den øvre limbus, ca. 10-15 mm i lengde. Disseksjonen ble utført gjennom konjunktiva og Tenons kapsel til episclera. Flappen ble behandlet ved å dissekere i forkant til limbus og derved eksponere underliggende sclera overliggende pars plana. Ca. 5-6 mm fra limbus ble det plassert en intrascleral madrass sutur av 7-0 Vicryl (Ethicon) med stingene ca. 3 mm fra hverandre.

En 25-gauge nål ble anvendt til å suge ut 0,5 ml glasslegemevæske (i to dyr var det mulig å suge ut bare 0,4 ml); glasslegemevæsken ble erstattet med et like stort volum av HA-1 (12 mg/ml) eller steril saltløsning. Madrassuturen ble sikret for å forhindre lekkasje, og konjunktivalflappen ble satt på plass igjen. Antibiotisk salve ble påført lokalt. Glassvæskecelletellinger ble utført på utsuget glassvæske ved anvendelse av et hemacytometer før administra-sjonen og ca. 48 timer postadministrasjon.

4. Observasjoner og registreringer:

Ca. 48 timer etter det kirurgiske inngrep ble dyrene anestetisert og en oftalmoskopisk undersøkelse gjennomført. Anestesien, dilatasjon og under- søkelsen ble gjennomført som tidligere beskrevet. Undersøkelsen ble gjennomført på blind måte med hensyn til hvorvidt det aktuelle øyet var injisert med HA-1 eller kontrollmaterialet. Okkulære parametre ble gradert som vist i standardnøkkelen med okkulære poengtall som vist nedenfor.

Konjunktivt ødem, injeksjon og utflod: koraealt ødem, heme, celler, og hissighet:

0 = normal

+1 = mild

+2 = moderat

+3 = alvorlig eller utstrakt

Klarhet av glasslegemevæske:

0 = klar

1 = svak sløring - fundus synlig

2 = moderat sløring - fundus knapt synlig

3 = sløring - rød fundus refleks

4 = haze - grå fundus refleks

5 = gundus ikke synlig

Øynene ble klargjort for aspirasjon ved anvendelse av en povidon jodløsning som tidligere beskrevet. Et lokk-spekulum ble plassert, og øyeeplet stabilisert med en liten tannet nålholder. Glasslegemevæske (0,1-0,2 ml) ble suget ut direkte gjennom konjunktiva og sclera, 6 mm fra limbus i den øvre temporale kvadrant. Det ble omhyggelig sørget for å unngå stedet for de opprinnelige kirurgiske inngrep. Inflammatoriske celler ble tellet ved anvendelse av hemacytometeret. Antibiotisk salve ble igjen påført lokalt.

RESULTATER

Disse data (tabell 1) viser at HA-1 ble svært godt tolerert og ga ingen signifikant øyeirritasjon sammenlignet med kontrollen (saltløsning).

To dyr i saltløsningsgruppen viste svak vandig celleinfiltrering og hissighet. Kontrolltellinger av hvite celler i glassvæsken lå i området fra 10 til 60 celler/mm^. Et HA-1 injisert øye viste svak vandig celleinfiltrasjon og hissighet. Tellinger av hvite celler i glasslegemevæsken lå i området fra 0-30 celler/mm^ i testøyer. Sammenlignet med saltløsningskontrollene kan det derfor konkluderes med at HA-1 blir svært godt tolerert av øyevevene etter intravitreal erstatning.

Kliniske studier for å fastslå effektiviteten av HA-1 vs Healon i kirurgi for ekstrakapsulær kataraktekstraksjon med intraokkulær linseimplantering i bakre kammer.

FORMÅL

Eksperimentene beskrevet i det følgende evaluerte effektviteten og sikkerheten for HA-1 sammenlignet med det ledende markedsførte viskoelastiske materiale (Healon) ved kataraktekstraksjon og intraokulær linseimplantering i to kliniske studier. I den første kliniske studie ble HA-1 og Healon testet under de samme eksperimentelle betingelser (begge aktivert etter kirurgi). Den andre studie fokuserte spesielt på sikkerheten for HA-1 med hensyn til stigningen i postoperativt intraokulært trekk og endoteliale celletellinger: i denne andre studie (hvori, i motsetning til den første, begge de viskoelastiske materialer ble aktivert etter kirurgi) ble HA-1 ikke fjernet ved avslutnigen av operasjonen, i motsetning til Healon, som ble aspirert fra øyet.

MATERIALER OG METODER

1. Utforming av studien:

Utformingen av begge studier var randomisert evaluering i parallelle grupper med maskert observatør (særskilte observatører gjorde oppfølgingen), av HA-1 versus Healon i ekstrakapsular kataraktekstraksjon med intraokkulær linseimplantering i bakre kammer. I hver studie ble det valgt pasienter med primærdiagnose av senile katarakter og over 18 års alder.

Spesielt:

I den første studie ble 217 pasienter rekruttert og randomiseringen ble utført ifølge et forhold på ca. 3:1 (HA-1 161 pasienter, Healon 56 pasienter).

Begge viskoelastiske materialer ble aspirert etter det kirurgiske inngrep.

Studieperioden omfattet prekirurgisk evaluering, den operative prose-dyre og den umiddelbare postkirurgiske oppfølgingsperiode. I denne studie ble det målt intraokkulært trykk etter tre timer postoperativt og oppfølgingsundersøkelser ved 1, 7 og 30 dager postoprativt.

I den andre kliniske studie ble 91 pasienter rekruttert og randomisert til HA-1 (45) eller Healon (46), etter et forhold på ca. 1:1.1 denne studie ble HA-1 ikke aspirert etter kirurgi, i motsetning til Healon som ble aspirert som i den første studie.

Studieperioden (og det relative studiemateriale for HA-1) var som tidligere beskrevet for den første studie. I dette studie ble den postoperative intraokkulære trykk målt ved 1, 3, 6 og 9 timer postoperativt (mer hyppig enn i den første studie) og oppfølgingsundersøkelsene ved 1, 7, 30 og også 90 dager postoperativt. Studien omfattet også speilmikroskopi ved basislinjen og 90 dager postoperativt.

2. Dataanalyse og statistiske metoder:

Statistisk analyse ble gjennomført for å evaluere senter- og behandlings-gruppen komparabilitet (alfa = 0,10) og sikkerhet og effektivitet (alfa = 0,05). Fishers eksakte test, t-test og deskriptiv statistikk ble anvendt til evaluering av disse data.

3. Studiepopulasjon og - karakteristika:

Tilsammen 308 pasienter ble studert, hvorav:

Det var ingen vesentlige forskjeller mellom de to behandlingsgrupper i noen av studiene, med hensyn til de fleste demografiske, medisinske eller kataraktegenskaper.

4. Kirurgi:

Forberedelser og metoder: kirurgien ble gjennomført ved forskerens standard kirurgiske teknikk for ukomplisert, ekstrakapsulær kataraktekstraksjon med intraokulær linsetransplantering i bakre kammer hos senile/voksne. Preoperativ (profylaktisk) medisinering, anestesi og andre intraoperative medisineringer ble anvendt ifølge forskerens standard teknikk, men uten anvendelse av okulære antihypertensiva. Pre-insision intraokulært trykk ble senket så mye som mulig ved anvendelse av en Honan intraokulær trykk-reduser, en "Super Pinky" eller manuelt trykk. De viskoelastiske substanser (HA-1 og Healon) ble anvendt som beskrevet i det følgende.

Produktene ble fjernet etter kirurgi, med unntak av HA-1 anvendt i den andre kliniske undersøkelse som ble etterlatt på stedet. Både HA-1 og Healon ble ført inn i fremre kammer for å lette det kirurgiske inngrep og beskytte okulære vev, spesielt:

1. studie:

Gjennomsnittsmengden av HA-1 som ble anvendt (0,568 ml ved en konsentrasjon på 12 mg/ml) var signifikant høyere enn den anvendte mengde av Healon (0,439 ved en konsentrasjon på 10 mg/ml), selv om forskjellen var bare 0,129 ml.

2. studie:

Det var ingen signifikant forskjell i den anvendte gjennomsnitts -

mengde av viskoelastisk materiale: i dette tilfellet var gjennomsnitts-mengdene 0,957 (HA-1) og 0,833 ml (Healon).

5. Vurdering:

Følgende tester ble gjennomført før, under og etter det kirurgiske inngrep:

a) prekirurgisk evaluering, f.eks. for å fastslå

visuell skarphet (beste angivelse), tonometri, metode for pakymetri

(for tykkelsen av cornea) og resultater av undersøkelse med

spaltelampe og optalmoskopisk undersøkelse,

speilmikroskopi (bare den 2. studie): endoteliale celletellinger ble

utført ved anvendlse av speilmikroskopet på 10 utvalgte sentrale steder i cornea. Hver telling ble justert med den hensiktsmessige faktor for å gi celletallet pr. mm^ og gjennomsnittet ble tatt for å gi en

representativ celletelling pr. mm^.

b) Postkirurgisk evaluering, såsom:

intraokulært trykk (ved tonometri) ble målt ved:

3 timer postoperativt (1. studie),

1-3-6-9 timer postoperativt (2. studie),

oftalmoskopiske og spaltelameundersøkelser, pakymetri, tonometri,

speilmikroskopi (sistnevnte bare for den 2. studie for endoteliale celletellinger) og måling av visuell skarphet (ved oppfølgingsundersøk-elser), ble gjennomført ved:

1-7-30 dager i 1. studie,

1-7-30-90 dager i 2. studie.

RESULTATER

1. Operativ evaluering - håndteringskarakteristika for de anvendte visko elastiske materialer: De viskoelastiske materialer ble vurdert til å lette linseimplantering i sammenlignbare andeler i hver behandlingsgruppe i begge de kliniske studier.

2. Postoperative komplikasjoner:

2a) Første kliniske studie

Som det kan ses av tabell 2:

Den høyeste prosent av komplikasjoner (i 7,9 % av alle pasienter)

forekom mellom kirurgi og dag 1, mens mindre prosenter ble

rapportert ved dag 7 og 30.

Ved dag 1 postoperativt var andelen av Healon-behandlede pasienter (14,3 %) som led av komplikasjoner, 2,5 ganger høyere enn for HA-1 behandlende pasienter (5,7 %). Denne forskjell var statistisk signifikant (p=0,079y ved Fishers tohalede eksakte test). Forskjellen ved dag 7 og dag 30 var ikke statistisk signifikant (p>0,6 ved Fishers tohalede eksakte test).

Komplikasjonene omfattet stigning av intraokulært trykk til 30 mmHg eller mer (7/158 = 4,4 % av HA-1 behandlede pasienter, 5/56 = 8,9 % av Healon-behandlede pasienter) og cornealt ødem, irittis, konjunktivit, hyfema, makulært ødem, sårlekkasje, cyklitisk membran og subkonjunktiv blødning.

Som det kan ses av tabell 3, hvor det er rapportert tonometridata oppnådd prekirurgisk og postoperativt (ved 3 timer og 1-7-30 dager): Ingen signifikant forskjell i gjennomsnittlig intraokulært trykk fore kom mellom behandlingsgruppene; Healon-behandlede pasienter hadde imidlertid høyere gjennomsnittlig intraokulær trykkstigning ved både 3 timer og 1 dag, og hadde et signifikant høyere standard avvik av intraokulært trykk enn HA-1 behandlede pasienter ved dag 1.

Undersøkelser med spaltelampe, pakymetri (for cornea-tykkelse) og oftalmoskopiske undersøkelser åpenbarte ingen forskjeller mellom de to grupper.

2b) Andre kliniske studie

En noe høyere andel av Healon-behandlede pasienter (37,0 %) enn HA-1 behandlede pasienter (28,6 %) rapporterte postoperative komplikasjoner (tabell 4). Komplikasjonene omfattet stigning i intraokulært trykk (5/42 = 11,9 % av HA-1-behandlede pasienter, 11/46 = 23,9 % av Healon-behandlede pasienter) og tilfeller av hyfema, sårlekkasje, blødning i glasslegemevæsken, opakifisering av

bakre kapsel, kolloidal løsriving, irisatrofi og makulært ødem.

De to behandlingsgrupper adskilte seg ikke statistisk med hensyn til hverken gjennomsnittelig intraokulært trykk eller variabilitet av det intraokulære trykk ved basislinje eller på hvilket som helst tidspunkt fra dag 1 til dag 90 (tabell 5). Under de første 9 timer etter kirurgi

fremgår det at Healon (fjernet fra øyet) og HA-1 (etterlatt på plass) ga en postoperativ fordeling av intraokkulært trykk som adskilte seg først og fremst med hensyn til standard avvik. Healon-behandlede pasienter hadde høyere standard avvik og en signifikant høyere gjennomsnitts-verdi ved 1 time postoperativt og HA-1-behandlede pasienter hadde høyere, men bare marginalt signifikant standard avvik, ved 6 og 9

timer postoperativt. Ved 1 time postoperativt hadde 22,7 % av Healon-behandlede pasienter og 10 % av HA-1-behandlede pasienter intraokkulært trykk på 21 mmHg eller mer. Ved 6 timer og 9 timer postoperativt hadde sammenlignbare andeler av HA-1-behandlede (73,2 % ved 6 timer og 65,0 % ved 9 timer) og Healon-behandlede (68,2 % ved 6 timer og 71,4 % ved 9 timer) pasienter trykkavlesninger på 21

mmHg eller høyere.

Ingen annen forskjell ble åpenbart mellom de to grupper med hensyn til observasjonene rapportert i den første studie. På tilsvarende måte åpenbarte speilmikroskopi (telling av endotelceller) ingen signifikante forskjeller (tabell 6).

3. Kvantitative resultater:

Bestemmelse av visuell skarphet viste at effektiviteten av de to viskoelastiske substanser var sammenlignbare, spesielt:

første kliniske studie:

Det var ingen signifikant forskjell mellom andelene av Healon-behandlede (77,8 %) og HA-1-behandlede (84,7 %) pasienter som

oppnådde 20/40 visuell skarphet ved dag 30.

andre kliniske studie:

Det var ingen signifikant forskjell mellom andelen av Healon-behandlede (73,9 %) og HA-1-behandlede (71,4 %) pasienter som oppnådde 20/40 eller bedre visuell skarphet ved dag 30. Ved dag 90 var andelene nesten identiske.

KONKLUSJONER

Resultatene av de to kliniske studier beskrevet heri viser en verdifull effektivitet ved anvendelse av HA-1 i kataraktekstraksjon og implantering av intraokulære linser. Spesielt er det blitt vist at HA-1 blir godt tolerert. Produktet gir i virkeligheten mindre postoperative komplikasjoner (ca. 2,5 ganger mindre) enn Healon testet under de samme eksprimentelle betingelser, dvs. med fjerning av substansen etter kirurgi (som beskrevet for den første kliniske studie). Blant de postoperative komplikasjoner bør økningen i intraokulært trykk betraktes spesielt.

Det bør bemerkes at, i begge studier, det postoperative forløp hos pasienter behandlet med HA-1 og hos pasienter behandlet med Healon var forskjellig med hensyn til intraokulært trykk. I den første studie, hvori både HA-1 og Healon ble fjernet etter kirurgi, var det en høyere andel av Healon-behandlede pasienter som viste økning av intraokulært trykk på over 21 mmHg ved dag 1, sammenlignet med HA-1-behandlede pasienter. I den andre studie, når HA-1 ikke ble fjernet etter kirurgi, i motsetning til Healon, var de postoperative intraokulære trykkprofiler for HA-1 sammenlignbare.

Det kan følgelig konkluderes at noen aspekter av de to viskoelastiske produkter er sammenlignbare, mens de er forskjellige med hensyn til postoperative komplikasjoner: Healon fjernet fra øyet synes å være forbundet med større økning i intraokulært trykk enn HA-1 fjernet fra øyet, og HA-1 etterlatt på stedet gir en postoperativ intraokulær profil som er sammen-lignbar med den for Healon fjernet etter kirurgi.

På basis av disse resultater er det viktig å understreke muligheten for å etterlate HA-1 på stedet uten å forårsake postkirurgiske komplikasjoner. Denne mulighet tilbyr følgende verdifulle fordeler: 1. Det forenkler den kirurgiske fremgangsmåte, siden man unngår trinnet for fjerning av produktet etter kirurgi. 2. Det minsker risikoen for komplikasjoner på grunn av håndtering (dvs. under aspirasjon). Eksempler på slik risiko er trauma på grunn av kirurgiske operasjoner og deres relative konsekvenser.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også farmasøytiske preparater inneholdende som aktiv bestanddel den nye molekylfraksjon av hyaluronsyre i form av dens natriumsalt, HA-1, spesielt i form av saltløsninger med nøytral pH. Den valgte konsentrasjon av HA-1 er slik at den ønskede grad av viskositet blir oppnådd, f.eks. en viskositet på ca. 300 mPa x s (ved 350 s"<l>) og ca. 10000 mPa x s (ved 1 s~<l>).

Oppfinnelsen vedrører også anvendelsen av den nye natrium hyaluronat-fraksjon HA-1 i øyekirurgi, spesielt i kataraktoperasjoner eller linseimplantering.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen:

Eksempel 1 - fremgangsmåte for å oppnå HA- 1 fraksjon og dens relative karakterisering

Hønekammer, enten friske eller frosne (3000 g) blir hakket opp i en kjøtt-hakker og deretter omhyggelig homogenisert i en mekanisk homogenisator. Den resulterende pasta overføres til en glassbeholder med 10 volumer vannfri aceton eller etanol inneholdende 0,1 % w/v av et spesielt jerngelateringsmiddel.

1,10-fenantrolin (C.A.R.N. 66-71-7) eller dets dimetylderivater er eksempler på gelateringsmidler som kan anvendes. Glassbeholdere og spesielle jerngelateringsmidler anvendes for å unngå depolymeriseringsprosessen av natriumsaltet av hyaluronsyre, som ellers kunne forårsakes av jernioner fra stålbeholdere eller blodrester.

Hønekammene behandles inntil fullstendig ekstraksjon av jernionene. Instrumentkontroll: absorbans av kompleks jerngelateringsmiddel i aceton eller etanolbase i 1 cm celler ved en bølgelengde for maksimum absorbsjon (510 nm, i tilfelle 1,10-fenantrolin, og ikke mer enn 0,005 A.U.).

En ytterligere vaskeprosess gjennomføres ved anvendelse av de samme volumer av vannfri aceton (eller etanol) for å fjerne eventuelle rester av gelateringsmiddel. Disse behandlinger utføres inntil følgende test "A" gir negative resultater.

Test "A": 5 ml aceton (eller etanol)fase inndampes ved hjelp av moderat nitrogenstrøm. Resten løses i 5 ml vann og absorbansen måles ved bølgelengden til gelateringsmidlets maksimale absorpsjon.

Denne test betraktes som negativ når absorbansen er mindre enn 0,1 A.U.

Det endelige reaksjonsprodukt blir omrørt i 6 timer ved en hastighet på 50 opm, og etterlates for separasjon i 12 timer, hvoretter løsningsmidlet trekkes av med hevert og kastes.

Denne ekstraksjonsprosess gjentas inntil det kastede løsningsmiddel har nådd det korrekte fuktighetsnivå (Karl-Fischer metode).

Den resulterende substans sentrifugeres deretter og vakuumtørkes ved egnet temperatur i 5-8 timer. Utbyttet av denne prosess er ca. 500-600 g tørt pulver.

300 g av det tørre pulver underkastes deretter en enzymatisk spaltingsprosess med 0,2 g egnet proteolyttisk middel (papain, pepsin, trypsin eller pronase) ved hjelp av et bufret vandig medium med en fosfatbuffer ved anvendelse av en mengde cystein hydroklorid til å gi et forhold på 20:0,01 til 20:1 med hensyn til tørt pulver. Denne blanding omrøres deretter i 24 timer ved 60 opm ved en konstant temperatur på 60-65°C. Hele massen avkjøles til 25°C under tilsetning av 60 g Celite® og omrøringen fortsettes i ytterligere en time.

Den resulterende blanding filtreres inntil det oppnås en klar væske.

Den vandige løsning, fortynnet til 2 mg/ml med destillert vann, påsettes på en kolonne fylt med en makromolekylær ionebytterharpiks DOWEX M-15 oppnådd i tetrabutylammoniumformen (TBA+) ved hjelp av behandling med tetrabutylammoniumhydroksid.

Løsningen eluert fra kolonnen inndampes, og den tørkede rest løses i et passende volum av N-metylpyrrolidon (eller dimetylsulfoksid) for å oppnå en konsentrasjon på 2 mg/ml.

Den oppnådde løsning filtreres, avkjøles ved 4°C og et like stort volum vann blir tilsatt. Tre påfølgende vaskinger gjennomføres ved anvendelse av metylenklorid, og den undre fase blir kastet hver gang. Den øvre fase behandles deretter med natriumbromid (NaBr anvendes i et molforhold på 3:1 med hyaluronsyre) ved 4°C, den vandige løsning felles ved tilsetning tre volumer etanol og bunnfallet vaskes flere ganger med etanol.

Bunnfallet solubiliseres i vann og den resulterende løsning underkastes dialyse. Løsningen gjøres 1,0M ved tilsetning av natriumklorid og temperaturen bringes opp til 50°C. 45 g cetylpyridinklorid blir tilsatt mens produktet blir omrørt ved 60 o/min. Denne blanding omrøres i 60 min, hvoretter 50 g Celite® blir tilsatt. Under omrøringen blir temperaturen av produktet redusert til 25°C og det dannede bunnfall blir oppsamlet ved hjelp av sentrifugering. Det således oppnådde bunnfall blir slemmet opp i en 0,0IM løsning av natriumklorid (5 1) inneholdende 0,05 % cetylpyridinklorid. Den omrøres i ytterligere 60 min ved 50°C. Temperaturen senkes til 25°C og bunnfallet sentrifugeres ut.

Vaskeprosessen gjentas deretter tre ganger, og bunnfallet oppsamles til slutt i beholderen inneholdende 3 1 av en 0,05M løsning av natriumklorid innehold-nde 0,05 % cetylpyridinklorid. Denne omrøres ved 60 o/min i 60 min og holdes ved en konstant temperatur på 25°C i 2 timer. Supernatanten elimineres ved hjelp av sentrifugering.

Denne fremgangsmåte gjentas flere ganger med en 0,1M natriumklorid-løsning inneholdende 0,05 % cetylpyridinklorid. Blandingen sentrifugeres og supernatanten kastes. Bunnfallet dispergeres i en 0,30M natriumkloridløsning inneholdende 0,05 % cetylpyridinklorid (3:1).

Blandingen omrøres og både bunnfallet og den klare væsken blir oppsamlet. Ekstraksjonen gjentas på bunnfallet ytterligere tre ganger, hver gang ved anvendelse av 0,5 1 av den samme vandige løsning.

Restbunnfallet elimineres, og de klare væsker oppsamles i en enkelt beholder. Temperaturen på væsken økes til 50°C under omrøring. Væsken bringes deretter til 0,23 molar med natriumklorid. 1 g cetylpyridinklorid blir tilsatt og omrøringen fortsatt i 12 timer. Blandingen avkjøles til 25°C og filtreres deretter, først gjennom Celite® pakninger og deretter gjennom et filter (lum).

Den oppnådde løsning undergår deretter molekylultrafiltrering gjennom membraner med en molekylutelukkelsesgrense på 30000, ultrafiltrering av tre opprinnelige volumer ved tilsetning av en 0,33M natriumkloridløsning. Tilsetningen av natriumkloridløsningen blir stanset, og volumet av væsken redusert til en fjerdedel av dens opprinnelige volum.

Løsningen konsentrert på denne måte blir fylt under omrøring (60 o/min) ved en temperatur på 25°C med tre volumer etanol (95 %). Bunnfallet oppsamles ved sentrifugering og supernatanten kastes. Bunnfallet løses i 1 1 av 0,IM natriumkloridløsning, og utfellingen gjentas med tre volumer av 95 % etanol.

Bunnfallet oppsamles og vaskes, først med 75 % etanol (tre ganger), deretter med absolutt etanol (tre ganger) og for det tredje med absolutt aceton (tre ganger).

Det således oppnådde produkt (HA-1 fraksjon) har en gjennomsnittelig molekylvekt i området mellom 750000 D og 1230000 D (fortrinnsvis mellom 925000 og 1230000).

Utbyttet av hyaluronsyre er lik 0,6 % av det opprinnelige friske vev.

Sluttproduktet, oppnådd ved den tidligere beskrevne fremgangsmåte, har følgende egenskaper:

molekvlvekten er 1000000 D.

grenseviskositetstallet ligger i området mellom 14,5 og 21 dl/g,

bestemt ved 25°C i 0,15M NaCl ved pH 7,0 ved anvendelse av et Ubbelhode viskosimeter med opphengt nivå. Dette tilsvarer en gjennomsnittelig molekylvekt i området mellom 750000 D og 1230000

D (fortrinnsvis mellom 925000 og 1230000).

et proteininnhold som ikke overskrider 0,2 % uttrykt som Albumin,

bestemt ved Lowry-testen (Lowry J. et al.; Protein Measurement with

the folin phenol reagent. J. Biol., Chem. 193, 265-275, 1951).

U. V. absorbans ved 257 nm og ved 280 nm som ikke overskrider 1,0

A.U., målt på en 1 % w/v vandig løsning.

dynamisk viskositet av en 1 % løsning w/v i 0,15M NaCl ved pH lik 7,0, som ikke overskrider følgende grenser ved de definerte skjærpåkjenninger, ved anvendelse av et rotasjonsviskosimeter såsom de som er beskrevet i U.S. Pharmacopea XXII utgave (911) side 1619, ved en temperatur på 20°C.

Skiærpåkjenning Dynamisk viskositet ( mPa- s ved 20°C)

et innhold av sulfater: mucopolvsakkarid som ikke overskrider 0,07 %

som svovel, bestemt på et induktivt koblet plasmainstrument (I.CP),

ved anvendelse av en egnet referansesubstans;

et jerninnhold som ikke overskrider 10 ppm, bestemt ved atom-absorpsjon eller I.CP. teknikk.

En sammenligningsstudie ble utført mellom HA-1 fraksjonen og andre hyaluronsyre natriumsaltløsninger oppnådd kommersielt, med hensyn til deres jerninnhold.

De oppnådde resultater (tabell 7) angir klart forskjellige jerninnhold: HA-1 fraksjonen har et jerninnhold som er mye lavere enn jerninnholdet i de andre produkter.

hvori:

Prøve A tilsvarer SODICHIM (parti 154)

Prøve B tilsvarer BIOCHEMO (parti 542)

Prøve C tilsvarer BIOTECHNOLOGY GENERAL (parti B-25) innholdet av jernioner ble bestemt på ca. 0,5 g substans som var blitt

kalsinert i en platinadigel og resten løst om igjen i HN03 0,1M. stabilitet av isotonisk buffrede løsninger med en fysiologisk pH av fraksjonen HA-1, naturlig aldret og varmesterilisert, bestemt ved fastsettelse av grenseviskositetstallet og uttrykt med den tilsvarende nedsettelse av midlere molekylvekt, som ikke overskrider følgende

grenser:

97 % av den opprinnelige verdi (lagring ved 25°C i 6 mnd)

75 % av den opprinnelige verdi (sterilisering ved 118°C i 32 min) 80 % av den opprinnelige verdi (sterilisering ved 121°C i 16 min) 90 % av den opprinnelige verdi (sterilisering ved 124°C i 8 min).

En sammenligningsstudie ble utført mellom isotonisk bufret løsning med fysiologisk pH av HA-1 og tilsvarende løsninger av hyaluronsyre, oppnådd

kommersielt, for å bestemme stabiliteten under betingelser av:

naturlig aldring (lagring i 6 mnd ved romtemperatur) varmesterilisering under forskjellige betingelser.

Materialer for farmasøytisk anvendelse og utstyr som allerede hadde vist seg pålitelig for det beskrevne formål ble anvendt.

Disse var spesielt:

fargeløse glassbeholdere med følgende egenskaper:

glass: type-1 borsilikatglass (ifølge Ph. Eur. II ed.)

minimum veggtykkelse: 0,90 mm

maksimum veggtykkelse: 1,0 mm

propper laget av halogenbutylgummi med følgende egenskaper:

-elastomertype: klorbutyl

-inert fyllstoff: kaolin

-pigmenter: titandioksid og kjønnrøkk

-vulkaniseringsmiddel: zinkoksid

-frigjøringsegenskaper: ifølge Ph. Eur. II ed. VI.2.3.1

-aluminium flipp-off lukning

-vann for injeksjon (ifølge Ph. Eur. II ed.).

De anvendte reagenser var av analyttisk kvalitet.

En Fedegari autoklav, modell FOF5 Superspectra, ble anvendt for sterilisering.

Grenseviskositetstallet ble bestemt med et viskosimeter av Ubbelhodetypen med opphengt nivå ved 25°C i 0,15M NaCl ved pH 7,0.

Den tilsvarende midlere molekylvekt ble beregnet ved hjelp av Mark-Houwink ligningen (H. Mark: Z. Elektrochemie 40, 499, 1923; R. Houwink: J. Prakt. Chem. 157, 15, 1940).

De midlere molekylvektverdier ble uttrykt som prosentsatser av utgangs-verdien for bedre å bestemme depolymeriseringstendenser. De oppnådde resultater (tabellene 8 og 9) viser at HA-1 har større stabilitet (minst to ganger så høy) som referanseprøvene (se tabell 7) som har et signifikant høyere jerninnhold enn HA-1.

hvori:

Prøvene A, B og C er de samme som de som ble anvendt for å

bestemme jerninnholdet.

Løsninger med ca. 10 mg/ml av hvert produkt i en 0,9 % w/v løsning

av en NaCl i fosfatbuffer 0,002M pH 7,5 undergitt:

a) naturlig aldring ved lagring i 6 måneder ved romtemperatur (25°C), i mørke, med tre måneders kontroller (se tabell 8).

b) sterilisering i en autoklav under følgende betingelser:

- T = 118°C i 32 min (angitt som Ic)

- T = 121°C i 16 min (angitt som lic)

- T = 124°C i 8 min (angitt som Ille)

med kontroller ved start og slutt av hver betingelse.

Eksempel 2 - fremgangsmåte til å oppnå HA- 1 fraksjon og dens relative karakterisering

Hønekammer, enten friske eller frosne (3000 g) blir hakket opp i en kjøtt - hakker og deretter omhyggelig homogenisert i en mekanisk homogenisator. Den resulterende pasta behandles i en glassbeholder med 4 volumer av 95 % etanol inneholdende 0,1 % w/v av et spesifikt jerngelateringsmiddel.

1,10-fenantrolin (C.A.R.N. 66-71-7) eller dets dimetylderivater er eksempler på gelateringsmidler som kan anvendes.

Glassbeholdere og spesielle jerngelateringsmidler blir anvendt for å unngå depolymeriseringen av hyaluronsyre natriumsalt, som ellers kunne forårsakes av jernioner fra stålbeholdere eller blodrester.

Hønekammene blir behandlet inntil fullstendig ekstraksjon av jernionene (Instrumentkontroll: absorbans av kompleks jerngelateringsmiddel i aceton eller etanolfase i 1 cm celler ved bølgelengden for maksimum absorpsjon (510 nm, i tilfellet 1,10-fenantrolin, ikke mer enn 0,005 A.U.).

En ytterligere vasking gjennomføres ved anvendelse av de samme volumer av vannfri aceton (eller etanol) for å fjerne eventuelle rester av gelateringsmiddel. Disse behandlinger utføres inntil følgende test "A" gir negative resultater.

Test "A": 5 ml aceton (eller etanol) fase blir inndampet ved hjelp av moderat nitrogenstrøm. Resten løses i 5 ml vann og absorbansen måles ved bølgelengden for maksimal absorpsjon av gelateringsmidlet.

Testen anses som negativ når absorbansen er mindre enn 0,1 A.U.

Det endelige reaksjonsprodukt blir omrørt i 6 timer ved en hastighet på 50 opm og etterlates for separasjon i 12 timer, hvoretter løsningsmidlet trekkes av med hevert og kastes.

Den resulterende substans sentrifugeres deretter og vakuumtørkes ved passende temperatur i minst 8 timer. Utbyttet av denne prosess er ca. 500-600 g tørt pulver.

300 g av det tørre pulver underkastes deretter en enzymatisk spaltingsprosess med 0,2 g av egnet proteolyttisk middel (papain, pepsin, trypsin eller pronase) ved hjelp av et bufret vandig medium med en fosfatbuffer ved anvendelse av en mengde cystein hydroklorid til å gi et forhold på 20:0,01 til 20:1 med hensyn til tørt pulver. Denne blanding omrøres deretter i 24 timer ved 60 opm ved en konstant temperatur på 60-65°C. Ved slutten av reaksjonen tilsettes 60 g Celite® og det hele omrøres i ytterligere 1 time. Den resulterende blanding filtreres inntil det oppnås en klar væske. 45 g cetylpyridinklorid tilsettes under omrøring med 60 opm. Blandingen omrøres i 60 min, hvoretter det tilsettes 50 g Celite®.

Det således dannede bunnfall blir oppsamlet ved sentrifugering og slemmet opp i en løsning av 0,0IM NaCl (5 1) inneholdende 0,05 % cetylpyridinklorid.

Det omrøres i 60 min ved 50°C og bringes deretter til en temperatur på 25°C og bunnfallet sentrifugeres fra.

Vaskingen gjentas tre ganger. Bunnfallet oppsamles i beholderen som inneholder 3 1 av en 0,05M løsning av natriumklorid inneholdende 0,5 % cetylpyridinklorid.

Den omrøres ved 60 opm i 60 min og holdes deretter ved en konstant temperatur på 25°C i to timer. Den klare øvre fase elimineres ved sentrifugering.

Fremgangsmåten gjentas to ganger med løsningen av 0,1M natriumklorid inneholdende 0,05 % cetylpyridinklorid. Blandingen sentrifugeres, og den øvre fase blir kastet. Bunnfallet slemmes opp i en løsning av 0,30M natriumklorid inneholdende 0,05 % cetylpyridinklorid (3 1).

Blandingen omrøres og sentrifugeres og både bunnfallet og den klare væsken blir oppsamlet. Bunnfallet ekstraheres for andre gang ved anvendelse av 1,5 1 av den samme vandige løsning.

De klare væsker blir oppsamlet i en enkelt beholder og underkastet molekylultrafiltrering gjennom membraner med en molekyl utelukkelsesgrense på 30000 Daltons, som gir en konsentrering til en tredel av dets opprinnelige volum.

Den konsentrerte løsning behandles med Dowex® M-l5 makromolekylær ionebytterharpiks oppnådd i form av tetrabutylammonium (TBA<+>) over natten.

Et passende volum av N-metylpyrrolidon blir tilsatt til oppslemmingen inntil det nås et forhold av NMP-H2O på 70/30 v/v. Blandingen filtreres deretter og harpiksen elimineres.

En passende mengde av NaCl tilsettes deretter til løsningen som bringes til pH > 7,5 med IM NaOH og deretter vaskes to ganger med metylenklorid (CH2CI2) idet den undre fase blir kastet hver gang. Den øvre fase felles under omrøring ved 60 opm ved en temperatur på 25°C med tre volumer etanol (95 %).

Bunnfallet oppsamles ved sentrifugering og den øvre fase blir kastet.

Bunnfallet blir oppsamlet og vasket, først med 75 % etanol, deretter med absolutt etanol og til sist med aceton.

Det vaskede produkt blir deretter vakuumtørket i minst 20 timer ved en temperatur på 25°C. Det tørkede produkt solubiliseres i vann ved invers osmose slik at det oppnås en løsning med > 1 mg/ml. En passende mengde natriumklorid blir tilsatt for å oppnå en molaritet på mellom 0,1 og 0,4, og løsningen gjøres deretter alkalisk med IM NaOH. Løsningen filtreres deretter gjennom steriliserende filtre.

Løsningen felles under omrøring (60 opm) ved en temperatur på 25°C med tre volumer etanol (95 %).

Bunnfallet blir oppsamlet ved sentrifugering og den øvre fase blir kastet.

Bunnfallet blir oppsamlet og vasket, først med 75 % etanol, deretter med absolutt etanol og til slutt med aceton.

Det vaskede produkt blir vakuumtørket i minst 50 timer ved en temperatur på 25°C.

Det således oppnådde produkt har en molekylvekt på 1180000.

EKSEMPLER PÅ FARMASØYTISKE PREPARATER

Følgende eksempler er gitt her for å beskrive, utelukkende for illustrasjons-formål, de mulige farmasøytiske preparater for terapeutisk anvendelse av fraksjonen HA-1.

Formulerin<g>1: 2 ml ampuller som hver inneholder:

Formulerin<g>2: steril, ferdigfylte, 1,1 ml sprøyter som hver inneholder:

Formulering 3: 0,2 ml, enkeltdosebeholdere som hver inneholder:

Formulering 4: 0,2 ml, enkeltdosebeholdere som hver inneholder:

Formulering 5: 5 ml flasker som hver inneholder:

Claims

1. Hyaluronsyrefraksjon, eller et salt derav, som har en midlere molekylvekt i området 750000 D til 1230000 D, karakterisert vedfølgende egenskaper: a) et grenseviskositetstall i området mellom 14,5 og 21 dl/g, bestemt ved 25°C i 0,15 molar NaCl ved pH 7,0 ved anvendelse av et Ubbelhode viskosimeter med opphengt nivå; b) et proteininnhold som ikke overskrider 0,2 % uttrykt som Albumin; c) en U.V. absorbans ved 257 nm og ved 280 nm som ikke overskrider 1,0 A.U., målt på en 1 % w/v vandig løsning; d) en dynamisk viskositet av en 1 % løsning w/v i 0,15M NaCl ved pH = 7,0, som ikke overskrider følgende grenser ved de definerte skjærpåkjenninger, ved anvendelse av et rotasjonsviskosimeter ved en temperatur på 20°C, Skiærpåkjenning Dynamisk viskositet' ( mPa- s ved 20°C) e) et innhold av sulfatert mucopolysakkarid som ikke overskrider 0,07 % som svovel; f) et jerninnhold som ikke overskrider 10 ppm; og g) en stabilitet av isotonisk bufrede løsninger med en fysiologisk pH av fraksjonen, naturlig aldret og varmesterilisert, bestemt ved fastsettelse av grenseviskositetstallet og uttrykt med den tilsvarende nedsettelse av midlere molekylvekt, som ikke overskrider følgende grenser: -97 % av den opprinnelige verdi (lagring ved 25°C i 6 mnd) -75 % av den opprinnelige verdi (sterilisering ved 118°C i 32 min) -80 % av den opprinnelige verdi (sterilisering ved 121°C i 16 min) -90 % av den opprinnelige verdi (sterilisering ved 124°C i 8 min).

2. Hyaluronsyrefraksjon ifølge krav 1, karakterisert vedat nevnte midlere molekylvekt er mellom 925000 og 1230000.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av en fraksjon av hyaluronsyre,karakterisert ved: a) ekstraksjon av hyaluronsyre fra et dyreorgan med et første organisk løsningsmiddel i nærvær av et jerngelateringsmiddel for å oppnå et hyaluronsyreholdig ekstrakt som er i alt vesentlig fritt for jernioner; b) behandling av nevnte hyaluronsyreholdig ekstrakt med et proteolyttisk middel; c) å bringe det således behandlede hyaluronsyreholdige ekstrakt i kontakt med en syreionebytter i form av et kvaternært ammoniumsalt; d) oppløsning av ekstratet fra ionebytteren i et andre organisk løsnings-middel som er i stand til å løse et kvaternært ammoniumsalt av hyaluronsyre; e) behandling av blandingen fra trinn (d) med et natriumhalogenid for omdanning av det kvaternære ammoniumsalt av hyaluronsyre til det tilsvarende natriumsalt; og f) isolering av det ønskede natriumsalt av hyaluronsyre.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert vedat en vandig løsning av nevnte natriumsalt av hyaluronsyre blir underkastet molekylfiltrering for å oppnå en ønsket molekylvektfraksjon av nevnte natriumsalt av hyaluronsyre.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert vedat nevnte hyaluronsyreholdige ekstrakt blir underkastet molekylfiltrering for å oppnå en ønsket molekylvektfraksjon av hyaluronsyre.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 3 eller 4, karakterisert vedat det anvendes en syreionebytter som er en sulfonsyreharpiks i form av et kvaternært ammoniumsalt.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert vedat det anvendes et kvaternært ammoniumsalt som er et tetraalkylammoniumsalt som har en alkylgruppe med et maksimum på 6 karbonatomer.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert vedat det anvendes et tetraalkylammoniumsalt som er et tetrabutylammoniumsalt.

9. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 3-8,karakterisert vedat det anvendes et første organisk løsnings-middel som er etanol eller aceton; og at nevnte jerngelateringsmiddel er 1,10-fenantrolin.

10. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 3-9,karakterisert vedat nevnte natriumsalt blir behandlet med et steriliseringsmiddel.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert vedat det anvendes et steriliseringsmiddel som er cetylpyridinklorid.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller 5, karakterisert vedat nevnte natriumsalt av hyaluronsyre blir underkastet molekylfiltrering med en membran som har en molekylutelukkelsesgrense på 30000 D.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av en fraksjon av natriumhyaluronat,karakterisert ved: a) ekstraksjon av organisk materiale fra hønekammer med et ekstrak-sjonsmiddel omfattende aceton eller etanol og som dessuten inneholder fenantrolin eller et dimetylderivat derav for fremstilling av et ekstrakt som i alt vesentlig er fritt for jernioner; b) behandling av nevnte ekstrakt med et proteolyttisk middel valgt fra gruppen bestående av papain, pepsin, trypsin, pronase og cystein-hydroklorid; c) å bringe det således behandlede ekstrakt i kontakt med en kolonne fylt med en sulfonsyreharpiks i form av tetrabutylammoniumsaltet; d) eluering av kolonnen for å oppnå en løsning inneholdende tetrabutylammoniumsaltet av hyaluronsyre; e) tørking av løsningen for å oppnå en rest omfattende tetrabutylammoniumsaltet av hyaluronsyre; f) oppløsning av nevnte rest i et aprotisk løsningsmiddel; g) filtrering av løsningen fra trinn (f); h) vasking av løsningen fra trinn (g) med metylenklorid; i) behandling av løsningen fra trinn (h) med et natriumhalogenid for å gi natriumhyaluronat; j) utfelling av nevnte natriumhyaluronat; k) å solubilisere bunnfallet i vann og underkaste løsningen dialyse; 1) behandling av den dialyserte løsning for utfelling av natriumhyaluronat; m) å underkaste nevnte bunnfall en molekylfiltrering med en membran som har en molekylutelukkelsesgrense på 30000 D, for å gi en løsning inneholdende natriumsaltet av hyaluronsyre som har en molekylvekt på mellom 750000 og 1230000.

14. Fraksjon av natriumhyaluronat, karakterisert vedat det er fremstilt ifølge fremgangsmåten i krav 13.

15. Farmasøytisk preparat, karakterisert vedat det som den aktive bestanddel inneholder hyaluronsyrefraksjonen ifølge krav 1.

16. Hyaluronsyrefraksjon ifølge krav 1, karakterisert vedat den er tilpasset anvendelse i øyekirurgi.

17. Hyaluronsyrefraksjon ifølge krav 1, karakterisert vedat den er tilpasset anvendelse innenfor oftalmologien.

18. Hyaluronsyrefraksjon ifølge krav 1, karakterisert vedat den er tilpasset anvendelse i kataraktoperasjoner eller implantering av øyelinser.